CN111474364A

CN111474364A - 人rab22a的用途及相关产品

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Publication number: CN111474364A
Application number: CN202010188680.XA
Authority: CN
Inventors: 彭军; 沈阿灵; 褚剑锋; 程瑛; 林晓英
Original assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2040-03-17
Also published as: CN111474364B

Abstract

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及人RAB22A在制备高血压治疗产品或者在制备高血压诊断产品中的用途。本发明首次发现RAB22A可作为诊断高血压的诊断标志物，首次发现干扰RAB22A表达可降低高血压，RAB22A可以作为一个潜在的靶位点应用在制备治疗高血压的药物中。RAB22A基因及其表达产物作为诊断高血压的标志物，使高血压诊断更加准确、快速，作为制备治疗高血压药物的靶基因为治疗高血压提供了新的治疗靶点和治疗途径。

Description

人RAB22A的用途及相关产品

技术领域

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及人RAB22A的用途及相关产品。

背景技术

原发性高血压(primary hypertension)是以体循环动脉压升高为主要临床表现的心血管综合征，通常简称为高血压，在其发展过程中，以头晕头痛、耳鸣健忘、失眠多梦、全身乏力为主要临床症状。在我国，高血压定义为未使用降压药物的情况下诊室收缩压≥140mmHg和(或)舒张压≥90mmHg。高血压是目前世界上最常见的心血管疾病之一，其患病率高达40％，导致全球心血管疾病死亡率为55％，并被认为是“21世纪可持续发展最严峻的挑战”。高血压是引起心脑血管疾病最重要的危险因素，如中风、心肌梗死和心力衰竭，每年全球约有940万人死亡。据预测，2000年至2025年间，全球高血压患病率将以每年10％的速度增长，截至2016年底，我国高血压患者已达2.45亿，我国高血压患者人数众多，其知晓率和治疗率近年来有明显提高，但总体仍处于较低的水平，2018年最新的流行病学调查研究表明，我国18岁以及以上居民高血压患病率为23.2％(约244.5百亿人)，相反，高血压患者的血压控制率仅有15.3％，严重危害人类的健康。预计到2025年，全球高血压患者人数将达到15.6亿，其中大约75％的患者分布在发展中国家。高血压危险因素包括遗传因素、年龄以及多种不良生活方式等多方面。人群中普遍存在危险因素的聚集，随着高血压危险因素聚集的数目和严重程度增加，血压水平呈现升高的趋势，高血压患病风险增大，且血压水平与心血管风险呈连续、独立、直接的正相关关系，收缩压(SBP)每升高20mmHg或舒张压(DBP)每升10mmHg，心脑血管病发生的风险倍增。高血压是引起心脑血管疾病最重要的危险因素，循环血压持续升高导致心，脑和肾脏等靶器官的功能和结构的损伤。在2016年GBD(GlobalBurden of Disease)研究中心血管疾病致死率高居榜首。据我国人群监测数据显示，心脑血管疾病死亡占总死亡人数的40％以上，高血压作为心脑血管疾病的最重要危险因素，其防治刻不容缓，迫在眉睫。

高血压作为一种复杂的进行性疾病，可由多种遗传和致病因素引起，与遗传、环境、代谢异常、肥胖等均有关，在其治疗过程中应持续用药、不可间断，方能有效控制血压升高、缓解高血压临床症状。临床治疗高血压病现多分为利尿剂，β受体阻滞剂、钙通道拮抗剂、血管紧张素抑制剂和血管紧张素II受体阻滞剂五大类，虽然西医治疗药物种类虽多，然而高血压发病机制复杂，且长期用药会引起多种毒副作用，患者依从性减低，这些药物的联合应用能在一定程度上控制血压持续升高，且仍存在心、脑、肾等靶器官损害，因此寻找更加安全、有效的治疗方式至关重要。比如“依那普利”广泛应用于降压治疗，虽然可以有效降压，发挥出逆转和抑制心室重构的作用。但是与此同时，依那普利治疗高血压所导致的不良反应也越来越多，其中以肾功能损害以及呼吸系统反应最为常见，部分患者出现消化系统疾病以及皮肤不良反应，严重者导致过敏性体克。因此高血压患者渴望更佳的降压方案。

目前还未有RAB22A用于高血压诊断或治疗的相关报道。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供人RAB22A的用途及相关产品。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供人RAB22A在制备高血压治疗产品或者在制备高血压诊断产品中的用途。

本发明第二方面提供特异性识别RAB22A的物质在制备高血压诊断产品中的用途。

本发明第三方面提供RAB22A抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：RAB22A抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：

治疗高血压；

抑制血压升高；

改善高血压导致的血管功能障碍；

改善高血压导致的血管病理改变。

本发明第四方面提供一种降低生物体中RAB22A表达的核酸分子，所述核酸分子包含：

a.双链RNA，所述双链RNA中含有能够与RAB22A杂交的核苷酸序列；或者

b.shRNA，所述shRNA中含有能够与RAB22A杂交的核苷酸序列；

其中，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与RAB22A中的靶序列相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与RAB22A中的靶序列相同。

本发明第五方面提供一种RAB22A干扰核酸构建体，含有编码前述核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

本发明第六方面提供RAB22A干扰病毒，由前述干扰核酸构建体在病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

本发明第七方面提供前述核酸分子，或前述RAB22A干扰核酸构建体，或前述RAB22A干扰病毒的用途，为：用于制备治疗高血压的药物，或用于制备降低生物体中RAB22A表达的试剂盒。

本发明第八方面提供一种用于预防或治疗高血压的组合物，其有效物质含有：前述的核酸分子；和/或，前述RAB22A干扰核酸构建体；和/或，前述RAB22A干扰病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现RAB22A可作为区别诊断高血压和非高血压的新型诊断标志物，RAB22A可以作为一个潜在的靶位点应用在制备治疗高血压的药物中。RAB22A基因及其表达产物作为诊断高血压的标志物，使高血压诊断更加准确、快速，作为制备治疗高血压药物的靶基因为治疗高血压提供了新的治疗靶点和治疗途径。

附图说明

图1人和大鼠血清外泌体中RAB22A的表达情况。

图2大鼠腹主动脉中RAB22A的表达情况(上图为免疫组化图，下图为统计图)。

图3敲除RAB22A对小鼠收缩压的影响。

图4敲除RAB22A对小鼠鼠舒张压的影响。

图5敲除RAB22A对小鼠平均动脉压的影响。

图6-1敲除RAB22A对小鼠脉冲波的影响的超声图。

图6-2敲除RAB22A对小鼠脉冲波的影响的超声结果统计图。

图7敲除RAB22A对小鼠血管病理形态的影响。

图8尾静脉注射AAV-sh-RAB22A对大鼠收缩压的影响。

图9尾静脉注射AAV-sh-RAB22A对大鼠舒张压的影响。

图10尾静脉注射AAV-sh-RAB22A对大鼠平均动脉压的影响。

图11-1尾静脉注射AAV-sh-RAB22A对SHR大鼠脉冲波的影响的超声图。

图11-2尾静脉注射AAV-sh-RAB22A对SHR大鼠脉冲波的影响的超声结果统计图。

图12尾静脉注射AAV-sh-RAB22A对SHR大鼠血管病理形态的影响。

具体实施方式

高血压是多因素，多环节，多阶段和个体差异性较大的疾病，发病机理包含遗传因素，环境因素和神经内分泌体液因素，发病机制复杂，其中较为明确的因素是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RASS)的激活。该系统在调节水盐平衡，血管收缩性和血压方面具有重要作用。该系统中最重要的效应物质为血管紧张素II(Angiotensin II，AngII)。肾小球入球动脉的球旁细胞分泌的肾素，激活由肝脏产生的血管紧张素原(AGT)，生成血管紧张素I(Angiotensin I，AngI)，然后经肺循环的转换酶(ACE)生成AngII。AngII作用于血管紧张素受体(AT1R)，使得小动脉平滑肌收缩，刺激肾上腺皮质球状带分泌醛固酮，进一步导致水钠潴留，促使高血压的发生和维持。AT1R是一个分子量为40kDal左右的7次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)，广泛分布于肝脏、脑部、肺脏、心脏和血管等脏器。作为AngII的效应受体，AT1R在与AngII作用后，有一套能调节其在细胞膜上分布的机制，以此控制AngII对各个组织的调节作用。目前有多种蛋白被报导与AT1R的转运相关，包括β-arrestins、G蛋白介导磷脂酶D2和Rab家族。其中Rab家族起到不可缺少的作用。

Rab家族属于Ras超家族中的最大亚族，约由180-200个氨基酸组成，是一类与细胞膜转运包括囊泡形成，囊泡运输和细胞膜融合相关的极度保守蛋白家族，相对分子质量约20-30kDal，目前已经发现70余种蛋白属于Rab家族成员，几乎存在于真核细胞所有的与膜相关的细胞器中，常见的成员Rabs 4、5、7、9、11、14、21和22，它们多共定位于内小体系统中，主要参与GPCRs的转运。AT1R作为GPCR的一员，其在膜上的分布遵循GPCRs的调节机制。研究报导，AngII与AT1R结合后，使得AT1R胞内端被磷酸化，磷酸化的AT1R能与β-arrestins形成复合体，并与Rab5a相结合，形成稳定的早期内体，被内吞的AT1R受体，一部分在Rab7的作用下介导进入溶酶体进行降解，另一部分在Rab11的作用下重新回到细胞膜，但AT1R具体的转运机制尚未完全明确。近期也有研究报导，Rab4与Rab11具有协同作用帮助AT1R回到细胞膜上。Rab蛋白家族位于生物合成、分泌等细胞器胞质面，每个Rab蛋白都发挥其特定功能，既有运输蛋白的基本功能，又有调控作用，Rab蛋白在调节信号转导，细胞增殖、分化，细胞核组装、囊泡运输，细胞骨架形成，胞吞作用等方面发挥着重要作用。作为调控囊泡运输的关键因子，Rab蛋白结构和功能的缺失常会导致细胞各种功能的紊乱。参与早期内体形成的Rab家族的蛋白还有一个成员是Rab22A。Rab22A是一个分子量为22kDal的蛋白，在外泌体的形成，运输和代谢中起重要作用，并且与多种人类癌症的发生和发展有关。在肿瘤研究中，Rab22A被报导在不同的癌症类型中过表达，包括肝癌、恶性黑素瘤、卵巢癌和骨肉瘤。有研究表明Rab22A的沉默阻断CD147再循环并促进CD147降解，从而抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。另外利用miRNA调节RAB22A介导的外泌体功能，可以抑制乳腺癌细胞、非小细胞肺癌、结直肠癌等多种癌症的增殖、侵袭和迁移。也有研究报道降低Rab22A表达干扰CD147和Hook1之间的相互作用后，外泌体中缺氧诱导的Abeta积累被显着抑制，与阿尔茨海默病(AD)的发病机理有关。Rab22a也被报导能够参与缺氧诱导因子1α的转运从而参与乳腺癌细胞的转移。同时，Rab22A也参与了多种免疫功能。其中内质网(ER)组分向树突细胞(DC)吞噬体和内体的募集是实现外源抗原的有效交叉呈递的关键事件，Rab22A是DC的MHC-I运输和抗原交叉呈递的关键调节剂，在DC中对内吞和吞噬途径的重要性。Rab22A也是recyclingendosome(RE)生物发生过程中的关键参与者，Rab22A促进了RE上BLOC-1-BLOC-2-KIF13A复合物的组装，以产生维持细胞和细胞器稳态的RE功能与组分。Rab22A属于GTP酶，可调节细胞膜运输的所有环节如运输物的分类、转运、固定和融合等。它主要有无活性GDP结合形式，和有活性的GTP结合形式，在无活性构象下，辅助因子可以促使Rab22A的C端区域结合细胞膜，进而提高了Rab22A结合底物GTP的概率，促使其转变为活性构象。激活的Rab22A可以通过结合不同效应分子如脂激酶，马达蛋白等行驶各种功能。研究表明Rab22A参与内吞受体返回细胞膜上的生理过程，也有研究报导Rab22A能够参与神经生长因子介导的信号通路参与神经发育过程。更为重要的是，多种研究报导Rab22A能与Rab4，Rab5，Rab7和Rab11一起参与树突状细胞膜上受体MHC-I的转运，能够帮助被内吞的MHC-I回到细胞膜上。而Rab22A是否参与Rab4，Rab5，Rab7和Rab11对AT1R的转运从而在调节血压方面起作用尚未见任何报导。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明一实施例提供人RAB22A在制备高血压治疗产品或者在制备高血压诊断产品中的用途。

所述人RAB22A在制备高血压治疗药物的用途具体是指：将RAB22A作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制人RAB22A表达的药物作为高血压治疗备选药物。如本发明所述的RAB22A干扰RNA(shRNA)即是以人RAB22A为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制高血压作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将RAB22A作为作用对象。

进一步的，在制备高血压诊断产品中的用途中，RAB22A为生物标志物。

所述将人RAB22A在制备高血压诊断药物的用途具体是指：将RAB22A表达产物作为一项高血压诊断指标应用于高血压诊断药物的制备。

通过western blot方法检测RAB22A在健康人、高血压患者血清外泌体中的表达水平。研究发现：RAB22A在高血压患者的血清外泌体中的表达量显著高于健康人。提示RAB22A的表达水平可能成为高血压诊断的标志。

所述高血压诊断产品用于高血压的判断、诊断。

RAB22A的genbank号为：

人(Human):57403；

大鼠(rat):366265；

小鼠(mus):19334。

所述高血压治疗药物为能够特异性抑制RAB22A的转录或翻译，或能够特异性抑制RAB22A蛋白的表达或活性的分子，从而降低生物体中RAB22A的表达水平，达到抑制高血压的目的。

所述通过RAB22A制备获得的高血压治疗产品或者高血压诊断产品可以为但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述核酸可以为但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。

所述高血压治疗产品的施用量为足够降低人RAB22A的转录或翻译，或者足够降低人RAB22A蛋白的表达或活性的剂量。以使人RAB22A的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。

采用前述高血压治疗产治疗高血压的方法，主要是通过降低人RAB22A的表达水平来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人RAB22A表达水平的物质给药于患者。

所述高血压诊断产品包括特异性识别RAB22A的物质。

在一种实施方式中，所述特异性识别RAB22A的物质选自RAB22A抗体。

需要说明的是，所述高血压诊断产品并不限定为必须为液体形式。

本发明一实施例为特异性识别RAB22A的物质在制备高血压诊断产品中的用途。

可选的，所述特异性识别RAB22A的物质选自RAB22A抗体。

本发明一实施例为高血压诊断试剂盒，所述试剂盒中包括特异性识别RAB22A的物质。

本发明一实施例为RAB22A抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：

治疗高血压；

抑制血压升高；

改善高血压导致的血管功能障碍；

改善高血压导致的血管病理改变。

所述血管病理改变是指，与健康的血管相比，高血压导致的血管壁增厚。

所述RAB22A抑制剂是指对于RAB22A具有抑制效果的分子。对于RAB22A具有抑制效果包括但不限于：抑制RAB22A的表达或活性。

抑制RAB22A活性是指使RAB22A活力下降。优选地，相比抑制前，RAB22A活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制RAB22A表达具体的可以是抑制RAB22A的转录或翻译，具体的，可以是指：使RAB22A的基因不转录，或降低RAB22A的基因的转录活性，或者使RAB22A的基因不翻译，或降低RAB22A的基因的翻译水平。

本领域技术人员可以使用常规方法对RAB22A的基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

RAB22A的基因表达的抑制可以通过qRT-PCR检测表达量验证。

优选地，与野生型相比，RAB22A表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地RAB22A完全没有表达。

所述产品必然包括RAB22A抑制剂，并以RAB22A抑制剂作为前述功效的有效成分。

所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为RAB22A抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。

亦即，RAB22A抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。

所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。

所述RAB22A抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。

小分子化合物在本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。

如本发明实施例列举的，所述RAB22A抑制剂可以为降低生物体中RAB22A表达的核酸分子。具体的，可以是双链RNA或shRNA。

本发明一实施例为一种治疗高血压的方法，为向对象施用RAB22A抑制剂。

所述的对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述对象可以是罹患高血压的患者或者期待治疗的高血压的个体。

所述RAB22A抑制剂可以在接受高血压治疗前、中、后向对象施用。

本发明一实施例为降低降低生物体中RAB22A表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链RNA或shRNA。

其中，所述双链RNA中含有能够与RAB22A杂交的核苷酸序列；

所述shRNA中含有能够与RAB22A杂交的核苷酸序列。

进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与RAB22A中的靶序列相同。

所述RAB22A中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默RAB22A表达时，被所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的RAB22A中的片段。

进一步的，所述shRNA或双链RNA的靶序列如SEQ ID NO：1所示。具体的cgccgattccattcatgccat

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。

所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与RAB22A中的靶序列相同。

所述shRNA经酶切加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默生物体内源RAB22A表达的作用。

进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。

如本发明实施例所述，所述shRNA为shRAB22A，其正义链片段核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明一实施例为RAB22A干扰核酸构建体，含有编码前述核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

所述的RAB22A干扰核酸构建体可以是将编码前述人RAB22A shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。

进一步的，所述RAB22A干扰核酸构建体为RAB22A干扰腺相关病毒载体。

本发明公开的RAB22A干扰核酸构建体是将编码前述RAB22AshRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为腺相关病毒载体，所述RAB22A干扰核酸构建体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染生物体，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默RAB22A的表达。

进一步的，所述RAB22A干扰核酸构建体载体还含有启动子序列和/或编码生物体中被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。

进一步的，所述腺相关病毒载体可以为AAV病毒。

本发明的RAB22AsiRNA可用于抑制高血压，进一步地可以用作治疗高血压的药物或制剂。RAB22A干扰核酸构建体可用于制备所述RAB22AsiRNA。当用作治疗高血压的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明一实施例为RAB22A干扰病毒，由前述RAB22A干扰核酸构建体在病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该病毒可感染生物体并产生针对RAB22A的小分子干扰RNA，从而抑制高血压。该RAB22A干扰病毒可用于制备预防或治疗高血压的药物。

所述病毒可以为腺相关病毒。如AAV。

本发明一实施例为前述核酸分子，或前述RAB22A干扰核酸构建体，或前述RAB22A干扰病毒的用途，为：用于制备治疗高血压的药物，或用于制备降低生物体中RAB22A表达的试剂盒。

可以利用降低生物体中RAB22A表达的核酸分子；和/或，RAB22A干扰核酸构建体；和/或，RAB22A干扰病毒，作为有效成分，制备治疗高血压的药物。通常，所述药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

所述预防或治疗高血压的药物的应用为高血压的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内高血压的方法，包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。

进一步的，所述药物用于预防或治疗对象体内高血压时，需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法，所述高血压被抑制。所述方法的对象可以为人。

本发明一实施例为种用于预防或治疗高血压的组合物，其有效物质含有：

前述的核酸分子；和/或，前述RAB22A干扰核酸构建体；和/或，前述RAB22A干扰病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

所述组合物可以为药物组合物。

当所述组合物用于预防或治疗对象体内高血压时，需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。

所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

RAB22A基因及其表达产物作为诊断高血压的标志物，使高血压诊断更加准确、快速，作为制备治疗高血压药物的靶基因为治疗高血压提供了新的治疗靶点和治疗途径。

上述应用中，可特别针对高血压进行制备用于高血压的诊断试剂，也可制作用于治疗的药物和方法。

实施例1

一、实验材料与方法

1实验材料

1.1标本来源

收集2019年8月到2020年1月在福建省立医院金山分院确诊的早期高血压患者8例，年龄40-60岁。同时选取于该院体检的健康志愿者8例，平均年龄40-60岁。

1.2实验动物

本实验采用SPF级Wistar(WKY)和SHR雄性大鼠，体重160±20g。实验动物由上海斯莱克实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(闽)2014-0001。RAB22A敲除的C57BL/6小鼠委托赛业生物科技有限公司构建，并与我校SPF级动物中心饲养和繁育。动物实验按照国家科技部于2006年发布的《实验动物治疗指南》和美国国家卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》进行。置于福建中医药大学特定无致病性实验动物中心，SPF级实验室中饲养，自由活动进食、饮水，室内通风光照充足，室温控制在(25±1)℃，相对湿度60％左右，12h光照/黑暗循环，在实验前，老鼠被允许适应这些条件至少7天。保持饲养环境安静无打扰。

1.2实验药物及主要试剂

VEX Exosome分离试剂(Vazyme Biotech，R602，南京,中国)；Western及IP裂解液，PMSF，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)，30％丙烯酰胺，TMEMD，Western封闭液，一抗稀释液，二抗稀释液，超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Coaktail(MedChemExpress)；PBS缓冲液，电泳转移缓冲液，20×TBS，0.25％tween，苏木素和伊红染色液(北京索莱宝科技有限公司)；BCA蛋白定量分析试剂盒，蛋白marker(ThermoFisherScientific)；TSG101抗体(Signalway Antibody,#49270,MD,USA)；IgG二抗(CellSignaling Technology,#7074,Danvers,MA,USA)；RAB22A抗体(Abcam,ab137093,USA)；Angiotensin II(Abcam,ab120183)；渗透微型泵(Alzet模型2002D)；免疫组化试剂盒(福州迈新公司)；DAB显色试剂盒(福州迈新公司)；腺相关病毒(和元生物技术股份有限公司)；异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3实验主要仪器

Western-blot电泳仪，Western-blot转膜仪(美国Bio-Rad公司)；ELX800酶标仪(美国BioTek公司)；水平摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；化学发光成像系统(ChemiDocXRS美国Bio-Rad公司)；恒温金属浴(上海培青)；移液器(德国Eppendorf)；电子天平秤(上海奥豪斯仪器有限公司)；无创鼠尾血压计(奥尔柯特有限公司)；小动物超声成像系统Vevo2100(富士胶片投资有限公司)；吸入式小动物麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；病理切片机(德国莱卡公司)；石蜡包埋机(湖北孝感亚光医用电子技术有限公司)；生物组织自动脱水机(湖北孝感亚光医用电子技术有限公司)。

2实验方法

2.1标本采集

经研究对象知情同意后，用真空试管采集待检者外周静脉血5ml，在4℃，2000g离心10min，移去细胞或细胞碎片，小心吸取上层血清至新的离心管中，置于－80℃冰箱中保存备用；取大鼠腹主动脉血液，静置2小时后，按照患者血清收集方法相同处理以备用。

2.2提取血清外泌体

试剂使用前摇动10s，使其充分混合；样本在室温静置30min，待其充分融化后，置于4℃离心机(2000g，10min)离心以去除大的细胞碎片；取上清加入到新的无RNA酶且灭菌的1.5mlEP管内，加入外泌体沉淀试剂到EP管中，震荡混匀，置于4℃孵育30min后，室温下10000g离心30min，使粘度附在管壁的液体沉降后，小心取出试管内的残留液体，留在底部的沉淀既为外泌体。

2.3 Western blot方法检测外泌体中RAB22A的蛋白表达水平

2.3.1总蛋白的提取

外泌体在含有1mM的PMSF和Coaktail的Western及IP裂解液中被裂解，置于冰上充分裂解15-20min(期间每隔5min震荡一次)，将各样本置于4℃高速离心机中离心(14000rpm，15min)，将上清液转移到1.5ml离心管中，置于冰上待用。

2.3.2蛋白定量

采用BCA法测定蛋白的总浓度，根据试剂盒说明书配置BSA标准品，按照既定顺序依次加入96孔板中，每个标准品和样本重复两个复孔，根据数量按A液:B液＝50:1配制BCA工作液，每孔100ul。置于60℃孵育20min，用酶标仪570nm读取吸光度值，根据标准曲线计算各样本的蛋白浓度，并通过裂解液将各组蛋白稀释到相同浓度。

2.3.3 SDS-PAGE电泳

各样本按所需蛋白量变性后进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭1h，洗膜，加入TSG101一抗(1:1000)和RAB22A一抗(1:1000)，4℃孵育过夜，用含0.1％tween-20的TBS-T洗3次，每次5min，加入相应的辣根过氧化物酶标记的兔二抗(1:5000)，室温孵育1h，TBST洗3次，每次5min，加入1:1的ECL发光液，用凝胶成像系统扫描并进行数据分析。

2.4通过ES打靶构建RAB22A敲除小鼠

利用一个跨越RAB22A所有第三外显子的靶向结构产生RAB22A flox小鼠。简单地说，该结构包括内含子3中的loxP-neo-loxP盒式磁带，从而构建RAB22A的打靶载体。将构建好的RAB22A的打靶载体电穿孔进入胚胎干细胞构成ES克隆物，对ES克隆物进行PCR筛选。然后将正确的克隆物注射到C57BL/6囊胚中，随后注射入C57BL/6代孕母鼠体内，产生嵌合体小鼠(RAB22Aflox/flox)。将嵌合体小鼠(RAB22Aflox/flox小鼠)与表达Cre重组酶融合小鼠(带有cre酶的WT野生型小鼠)杂交，产生第一代杂合子小鼠(RAB22A+/-)。将杂合子小鼠(RAB22A+/-)自交，得到RAB22A-/-(KO)、RAB22A+/+(WT)和RAB22A+/-基因型。

2.5动物分组及干预

取8～10周龄的雄性WT小鼠随机分为WT+Saline组(n＝6)，WT+AngII组(n＝6)，8～10周龄的雄性KO小鼠随机分为KO+Saline组(n＝6)，KO+AngII组(n＝6)。手术前一天在超净台内，将渗透微型泵取出，AngII组的渗透微型泵经注射器注入200ul左右的AngII溶液(500ng/kg/min)，NS组的渗透微型泵经注射器注入200ul左右的Saline溶液，将所有渗透微型泵浸泡于生理盐水中，37℃细胞培养箱过夜，以使其释放速率稳定。手术当天，手术台进行常规的消毒，将小鼠用异氟烷麻醉，俯卧位，头颈部皮肤除毛，75％酒精棉球消毒，用剪刀剪开皮肤，钝性分离，AngII组小鼠皮下植入预置的含有AngII的渗透微型泵，NS组小鼠皮下植入预置的含有NS的渗透微型泵，缝合皮下，皮肤消毒。分别于处理1周、2周后测量各组血压，2周后终止实验。

健康SPF级WKY雄性大鼠6只，SHR雄性大鼠18只，采用尾静脉无创血压仪检测大鼠血压，并按血压采用随机数字表法随机分为4组，即WKY组(n＝6)、SHR组(n＝6)，SHR+sh-Ctrl组(n＝6)，SHR+sh-RAB22A组(n＝6)。参照pAAV-CMV-LUC-U6-spgRNA说明书的滴度/浓度数据，在细胞洁净操作台中配置好pAAV-CMV-LUC-U6-shRAB22A和pAAV-CMV-LUC-U6-sh-Ctrl(sh-Ctrl的序列如SEQ ID NO：2所示，具体为ttctccgaacgtgtcacgt)病毒悬液，保持无菌状态，每只通过尾静脉注射200ul进入大鼠体内。WKY组和SHR组尾静脉注射等体积的生理盐水。实验期间给予大鼠颗粒饲养，自由饮用普通水，观察各组大鼠的生长情况、血压情况等。

2.6血压测量

本实验动物血压检测采用无创鼠尾动脉血压检测方法监测血压改变，使用仪器为美国Kent无创血压仪，该设备使用了体积压力传感器技术(VPR)用于测量小动物尾动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)以及平均压(MAP)。使用该设备测量血压之前需保证实验动物处于平静状态，然后将其装入束缚器中，在距离鼠尾根部约1cm的位置装上闭塞套，然后套入容积压力传感器(VPR)，到达位置为传感器无法再往鼠尾根部方向推动为止，将小动物束缚器放置在加热板上，根据室内温度选择合适的加热档对鼠尾进行加热，在仪器启动之前需用一块黑色毛巾将小动物罩住并保证实验环境的安静，让其在黑暗状态下静息10min后，开始检测血压，闭塞套和VPR传感器循环充气与放气15次，设置电脑软件，测量15次取其平均值。

2.7脉冲波传导速度参数测量

使用Vevo 2100动物超声仪进行腹主动脉的脉冲波速度检测。实验动物经2％异氟烷吸入麻醉下仰卧位固定于37℃恒温加热板上，腹部脱毛后，将探头平行置于腹部正中处，应用B模式超声记录腹主动脉，另将探头垂直于腹部正中处，应用M模式超声记录近心端和远心端传导情况，测量腹主动脉血管长度和末梢延迟时间来计算小鼠脉冲传播速度。

2.8 HE染色

取实验动物腹主动脉血管组织，置于4％多聚甲醛中固定24h后，采用低浓度至高浓度的无水乙醇进行组织脱水处理，再将组织块置于二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，在浸腊之后对血管组织进行石蜡包埋处理，冷却凝固成块即成。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成3μm薄片，切下的薄片放至37℃的水中烫平，再贴到载玻片上，置于60℃烘烤1h制成石蜡切片。组织切片在二甲苯I、II透明处理，在乙醇梯度中再水化。样品在苏木精溶液中染色1min，在伊红溶液中染色10s，晾干，中性树胶封片，于镜下观察心脏和血管组织的病理形态改变。

2.9免疫组化

4％多聚甲醛固定大鼠腹主动脉24h后，大鼠腹主动脉经脱水、透明、包埋、切片、粘贴、烘干制成石蜡切片。腹主动脉的石蜡切片进行二甲苯(I)、(II)脱蜡，无水乙醇(I)、(II)，95％、80％、70％乙醇中梯度脱水。用柠檬酸缓冲液(ph＝6.0)95℃水煮15分钟，冷却至室温2h，用PBS洗2-3次(每次5分钟)。3％H2O2孵育10min，PBS洗涤2～3次(每次5min)。封闭液(UltraSensitiveTM SP(Goat)IHC Kit)室温孵育1h，弃残液。一抗(RAB22A抗体1:100)4℃过夜孵育，PBS清洗2次～3次(每次5分钟)，二抗(UltraSensitiveTM SP(Goat)IHC Kit)在室温下孵育1h，PBS清洗2～3次(每次5分钟)，酶标亲和素三抗(UltraSensitiveTM SP(Goat)IHC Kit)在室温下孵育1h，最后用PBS洗涤2-3次(每次5分钟)。DAB(DAB Kit)染色1min，取棕色细胞质细胞，测定阳性。用自来水冲洗10分钟。苏木精复染色，酸性乙醇分化，用自来水洗净15分钟，中性胶密封，光学显微镜下观察。

2.10统计学分析

实验数据以平均值±标准差

表示，用SPSS 18软件分析，两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析检验，P<0.05视为有统计学意义。

二、实验结果

3.1人和大鼠血清外泌体中RAB22A的表达情况

通过western blot检测人和大鼠血清外泌体中RAB22A的表达情况。如图1所示，在人(human)血清外泌体中，与健康组比较，高血压患者RAB22A的表达显著升高；在大鼠(rats)血清外泌体中，与WKY组比较，SHR组大鼠的RAB22A的表达也显著升高。提示高血压的发展可能与RAB22A的生成相关。

3.2大鼠腹主动脉中RAB22A的表达情况

采用免疫组化检测大鼠腹主动脉平滑肌细胞中RAB22A的表达水平，结果如图2所示，与WKY组相比，SHR中的RAB22A的蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。该结果进一步提示高血压的发展可能与RAB22A的生成相关。

3.3敲除RAB22A基因对小鼠血压的影响

采用无创鼠尾动脉血压监测的方法检测RAB22A敲除对小鼠收缩压(图3)、舒张压(图4)以及平均动脉压(图5)的影响。手术前，四组小鼠的血压差异无统计学意义(P＞0.05)，分别于手术后第一周、第二周测量小鼠尾动脉血压，结果显示，与WT+Saline组相比，WT+AngII组收缩压、舒张压及平均动脉压均显著上升，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与WT+AngII组相比，KO+Saline组和KO+AngII组收缩压、舒张压及平均动脉压均显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示敲除RAB22A后显著抑制了血压的升高。

3.4敲除RAB22A对小鼠脉冲波的影响

小动物超声仪评估敲除RAB22A后对小鼠腹主动脉脉冲波传导速度的影响，如图6所示，与WT+Saline组比较，WT+AngⅡ组脉冲波传导速度明显升高；而与WT+AngⅡ组比较，WT+Saline组和KO+AngⅡ组小鼠的脉冲波传导速度明显降低，且各组之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。上述结果提示敲除RAB22A后明显改善高血压导致的血管功能障碍。

3.5敲除RAB22A对小鼠血管病理形态的影响

通过HE染色对比各组小鼠的腹主动脉病理改变，结果如图7所示，与WT+Saline组相比较，WT+AngII组腹主动脉显著增厚，而与WT+AngII组相比较，KO+AngII组腹主动脉厚度显著降低，与KO+Saline相近，提示RAB22A敲除能够改善高血压导致的血管病理改变。

3.6尾静脉注射AAV-sh-RAB22A对SHR大鼠血压的影响

SHR大鼠尾静脉注射后连续8周用无创鼠尾动脉血压监测的方法检测大鼠收缩压(图8)、舒张压(图9)以及平均动脉压(图10)，第8周检测SHR组和SHR+sh-Ctrl组大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压与WKY组大鼠收缩压相比，血压明显升高，且具有显著性差异(P＜0.05)，而SHR+sh-RAB22A组大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压与SHR组和SHR+sh-Ctrl组大鼠相比明显降低，且具有显著性差异(P＜0.05)。上述结果显示SHR大鼠血压(收缩压、舒张压和平均动脉压)随周龄的升高而逐步升高，且尾静脉注射AAV-shRAB22A后具有显著缓解血压升高的作用。

3.7尾静脉注射AAV-shRAB22A对SHR大鼠心脏功能的影响

小动物超声检查评估尾静脉注射AAV-shRAB22A后对大鼠血管功能的影响，如图11所示，与WKY组比较，SHR组和SHR+sh-Ctrl组脉冲波传导速度明显升高；而SHR+sh-RAB22A组大鼠的脉冲波传导速度与SHR组和SHR+sh-Ctrl组大鼠相比明显降低，且具有显著性差异(P＜0.05)。上述结果显示尾静脉注射AAV-shRAB22A后对SHR血管具有保护作用。

3.8尾静脉注射AAV-sh-RAB22A对SHR大鼠血管病理形态的影响

通过HE染色对比各组大鼠的腹主动脉病理改变，如图12所示，SHR组和SHR+sh-Ctrl组较WKY组腹主动脉明显增厚，SHR+sh-RAB22A组的腹主动脉厚度明显下降，能够显著缓解高血压引起的腹主动脉增厚。

三、实验结论

1、RAB22A在高血压患者、大鼠血清中的表达显著升高，同时，在大鼠腹主动脉的表达也显著升高，具有潜在诊断价值。

2、RAB22A敲除能够显著逆转AngII引起的血压升高，具有降低AngII引起的腹主动脉病理改变的作用，提示RAB22A是治疗高血压对重要靶点。

3、AAV-sh-RAB22A注射敲减RAB22A表达，具有显著降低血压的作用，提示AAV-sh-RAB22A具有治疗高血压潜能。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 福建中医药大学

<120> 人RAB22A的用途及相关产品

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgccgattcc attcatgcca t 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttctccgaac gtgtcacgt 19

Claims

1.人RAB22A在制备高血压治疗产品或者在制备高血压诊断产品中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在制备高血压诊断产品中的用途中，RAB22A为生物标志物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

a.所述高血压诊断产品用于高血压的判断、诊断；

b.所述高血压诊断产品包括特异性识别RAB22A的物质；

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述特异性识别RAB22A的物质选自RAB22A抗体。

5.特异性识别RAB22A的物质在制备高血压诊断产品中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述特异性识别RAB22A的物质选自RAB22A抗体。

7.RAB22A抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：

治疗高血压；

抑制血压升高；

改善高血压导致的血管功能障碍；

改善高血压导致的血管病理改变。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述RAB22A抑制剂是指对RAB22A具有抑制效果的分子；

2)所述RAB22A抑制剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一；

3)所述RAB22A抑制剂选自双链RNA、shRNA、抗体或小分子化合物，所述双链RNA中含有能够与RAB22A杂交的核苷酸序列；所述shRNA中含有能够与RAB22A杂交的核苷酸序列；其中，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与RAB22A中的靶序列相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与RAB22A中的靶序列相同。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO：1所示；

2)所述shRNA的正义链片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

10.一种降低生物体中RAB22A表达的核酸分子，所述核酸分子包含：

b.shRNA，所述shRNA中含有能够与RAB22A杂交的核苷酸序列；

11.如权利要求10所述的降低生物体中RAB22A表达的核酸分子，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO：1所示；

2)所述shRNA的正义链片段核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

12.一种RAB22A干扰核酸构建体，含有编码权利要求10-11任一权利要求所述核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

13.一种RAB22A干扰病毒，由权利要求12所述干扰核酸构建体在病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

14.如权利要求10-11任一权利要求所述的核酸分子，或权利要求12所述RAB22A干扰核酸构建体，或权利要求13所述RAB22A干扰病毒的用途，为：用于制备治疗高血压的药物，或用于制备降低生物体中RAB22A表达的试剂盒。

15.一种用于治疗高血压的组合物，其有效物质含有：

权利要求10-11任一权利要求所述的核酸分子；和/或，权利要求12所述RAB22A干扰核酸构建体；和/或，权利要求13所述的RAB22A干扰病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。