CN110613847B

CN110613847B - 一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用

Info

Publication number: CN110613847B
Application number: CN201911013253.1A
Authority: CN
Inventors: 秦彦文; 杨云云
Original assignee: BEIJING INSTITUTE OF HEART LUNG AND BLOOD VESSEL DISEASES
Current assignee: BEIJING INSTITUTE OF HEART LUNG AND BLOOD VESSEL DISEASES
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2039-10-23
Also published as: CN110613847A

Abstract

本申请提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用，包括：一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备预防或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病的产品中的应用。本申请提供的抑制血管生成素样蛋白8物质的应用，通过抑制主动脉瘤患者、主动脉夹层患者血清或组织中血管生成素样蛋白8的表达来抑制炎症的产生及发展，抑制平滑肌细胞的凋亡，维持血管管壁的稳态，从而减轻主动脉瘤、主动脉夹层的形成，达到预防及治疗主动脉瘤、主动脉夹层的目的。

Description

一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用

技术领域

本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用。

背景技术

主动脉夹层是指主动脉腔内的血液从主动脉内膜撕裂处进入主动脉中膜，使中膜分离，沿主动脉长轴方向扩展形成主动脉壁的真假两腔分离状态。主动脉病理性的扩张，超过正常血管直径的50％，称之为主动脉瘤。主动脉夹层和主动脉瘤均是严重的心血管疾病，具有起病急、发展快、发病率高、死亡率高的特点。

胸主动脉夹层(thoracic aortie dissection，TAD)是胸主动脉内膜撕裂、动脉腔内的高压血流冲入动脉壁造成的剥离性血肿，可引起致死性的动脉破裂，或脊髓、肾脏等器官严重缺血等并发症，发病急，预后极差。胸主动脉瘤是指发生在主动脉窦、升主动脉、主动脉弓或降主动脉的动脉瘤，是退行性变，胸部主动脉部分异常扩张，变形，呈瘤样突出。

目前对于主动脉夹层、主动脉瘤、胸主动脉夹层、胸主动脉瘤的治疗方法通常为手术治疗，但患者的主动脉夹层、主动脉瘤的发生率和死亡率依旧居高不下。

发明内容

有鉴于此，本申请实施例提供了一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用，以解决现有技术中存在的技术缺陷。

本申请提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备预防或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病的产品中的应用。

进一步地，其中所述预防或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病的产品为预防或治疗胸主动脉瘤和/或胸主动脉夹层相关疾病的产品。

进一步地，其中所述抑制血管生成素样蛋白8的物质通过抑制炎症预防或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病。

进一步地，其中所述抑制血管生成素样蛋白8的物质与其他治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病的药物在所述产品中联合使用。

进一步地，其中所述抑制血管生成素样蛋白8的物质包括血管生成素样蛋白8抑制剂。

进一步地，其中所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括在体内或体外与血管生成素样蛋白8结合或相互作用，以抑制血管生成素样蛋白8生物学功能的制剂。

进一步地，所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括血管生成素样蛋白8抗体、小分子血管生成素样蛋白8拮抗剂、基于核酸的血管生成素样蛋白8表达或活性抑制剂、基于肽的与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的分子、与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的受体分子、包含低密度脂蛋白受体的配体结合部分的蛋白质、结合血管生成素样蛋白8的支架分子、基于纤连蛋白的支架构建体、其他基于天然存在性重复序列蛋白的支架分子和抗血管生成素样蛋白8适配体中的任意一种或几种的组合。

本申请还提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制主动脉瘤和/或主动脉夹层形成的产品中的应用。

本申请还提供一种抑制血管生成素样蛋白8表达的物质在制备抑制主动脉瘤和/或主动脉夹层形成的产品中的应用。

本申请还提供一种敲除血管生成素样蛋白8表达基因的物质在制备抑制主动脉瘤和/或主动脉夹层形成的产品中的应用。

本申请提供的抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备预防或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病的产品中的应用，通过抑制主动脉瘤患者、主动脉夹层患者血清或组织中血管生成素样蛋白8的表达来抑制炎症的产生及发展，抑制平滑肌细胞的凋亡，维持血管管壁的稳态，从而减轻主动脉瘤、主动脉夹层的形成，达到预防及治疗主动脉瘤、主动脉夹层的目的。

附图说明

图1是本申请一实施例所述的血管生成素样蛋白8含量对比图；

图2是本申请一实施例所述的血管生成素样蛋白8含量对比图；

图3是本申请一实施例所述的血管生成素样蛋白8、巨噬细胞以及平滑肌细胞的共定位染色图；

图4是本申请一实施例所述的小鼠血管组织中血管生成素样蛋白8示意图；

图5是本申请一实施例所述的小鼠生存率折线图；

图6是本申请一实施例所述的小鼠饮水量折线图；

图7是本申请一实施例所述的小鼠解剖示意图；

图8是本申请一实施例所述的小鼠血管组织超声成像图；

图9是本申请一实施例所述的小鼠血管组织HE染色图；

图10是本申请一实施例所述的小鼠血管组织弹力染色图；

图11是本申请一实施例所述的小鼠血管组织中IL-1B分布情况示意图；

图12是本申请一实施例所述的小鼠血管组织中的细胞核和凋亡细胞共定位染色图；

图13是本申请一实施例所述的巨噬细胞炎症因子表达示意图；

图14是本申请一实施例所述的平滑肌细胞凋亡因子表达示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

血管生成素样蛋白(Angiopoietin-like protein，ANGPTL)：是一族不仅与血管生成相关，且与脂类代谢、葡萄糖代谢、能量代谢和胰岛素敏感性等密切相关的分泌性蛋白因子。ANGPTLs家族包含8个成员，是一类分泌蛋白。除血管生成素样蛋白5(Angiopoietin-like protein5,ANGPTL5)只在人体表达，其他ANGPTLs成员在人体和小鼠中均有表达。

血管生成素样蛋白8(Angiopoietin-like protein8,ANGPTL8)：是ANGPTLs家族的成员之一。ANGPTL8又名GM6484、RIFL、Lipasin和Betatrophin，由198个氨基酸构成，分子量为22kDa，基因位于染色体19p13.2 a。生理情况下，在人体中，ANGPTL8由肝脏特异性表达分泌，而在小鼠中，ANGPTL8主要由肝脏和脂肪组织分泌。

酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)：是一种检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，其原理为让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。

4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)：是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。

苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)：简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

弹力纤维染色：简称弹力染色。弹力纤维是结缔组织发生形成较晚的一种纤维，在创伤修复中一般在4—5周才有较明显的弹力纤维形成。弹力纤维坚固、较小而弹性较大，容易伸展，在结缔组织起弹性作用。弹力纤维由弹性蛋白组成，新鲜时呈黄色又称黄纤维。弹力纤维的纤维分枝连成网，折光性强，含量多时在HE染片上呈折光性强的粉红色，量少的不显色。故量多时与胶原纤维不易区别，量少则不能观察。弹力纤维染色主要用于观察弹力纤维有无增生、肿胀、断裂、破碎及萎缩或缺如等病变。

转染：是指真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)：还可以称为短干扰RNA(shortinterfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。

血管紧张素II(Angiotensin II，AngII)：是由血管紧张素I在血管紧张素转化酶的作用下，水解产生的多肽物质。人体的血管平滑肌、肾上腺皮质球状带细胞以及脑的一些部位、心脏和肾脏器官的细胞上存在有血管紧张素受体。血管紧张素II与血管紧张素受体结合，引起相应的生理效应，包括使全身微动脉、静脉收缩，血压升高，回心血量增多；增加交感缩血管纤维递质释放量；使交感缩血管中枢紧张；刺激肾上腺合成和释放醛固酮以及引起或增强渴觉、导致饮水行为。通常用放免法测定血浆中血管紧张素II。

Western免疫印迹(Western Blot)：是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。其中，对已知表达蛋白可以用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物可以通过融合部分的抗体检测。

Western Blot技术包括如下所述的步骤：

1.清洗玻璃板

清水清洗1.5mm和1.0mm玻璃板后，洗洁精擦洗，再用清水进行二次清洗，清水冲干净后立起来，使用D2H2O冲洗干净，将玻璃板固定在配胶底架上。

2.配胶

分离胶：10％的分离胶适合分子量大的分子，12％的分离胶适合分子量小的分子。

浓缩胶：

配制分离胶，在分离胶的配置过程中先加入其它成分，最后加入TEMWD，然后充分混匀，迅速加入玻璃板中，用酒精喷液面以压平液面(30min)。

配制浓缩胶，待分离胶凝固倒出酒精，将浓缩胶加入玻璃板中，立即插入提前准备好的梳齿，静置1h。

3.电泳

1)配1X电泳缓冲液(1000ml)：采用D2H2O 900ml加10X电泳缓冲液配置100ml，在配置时先加水后加电泳缓冲液以免有气泡。

2)将胶板夹好，短板(梳子)朝内，胶板要置于架子的最底，力度适中(防止小板破裂)向中心挤胶板，同时扣上两侧绿色夹子。

3)将两块板置于电泳槽中，向两块板之间加入配好的1X电泳缓冲液，且两板之间的空间必须保证加满液体，否则电泳不冒泡。若只跑一块胶，那另一侧就用透明胶板(假板)插里面。

4)平拔出梳子(两手分别捏住梳子的两侧竖直向上轻轻将其拔出)

5)加样

i、先加蛋白maker：3/5/7/10ul均可(视加样情况灵活选择辨明左右的方法，左右加不同的量的maker以区分左右)。

ii、确定上样量

a、以原液上样：根据浓度计算出上30ug(或15ug/20ug/25ug)蛋白样品的体积来上样。

b、稀释原液：将不同样本蛋白稀释为同一浓度的体系，等体积上样。

iii、吸取样品时，先吹打混匀，不要吸进气泡，将枪头插入加样孔中缓慢加入样品，加样太快会使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。

6)盖盖子，黑对黑，红对红。

7)先恒压80V/90V使样品在浓缩胶中跑；跑出分离胶时，将电压改为100V/120V。

8)当蓝色蛋白液跑至胶底部时，结束电泳，关闭电源。

4.转膜

1)配1X电转液(1000ml)，配好电转液后在-80℃的环境下使其迅速冷却或提前配好置于4℃使冷却。

其中，D2H2O：甲醇：10X电转液＝7:2:1(700ml，200ml，100ml)

2)将转膜夹子、膜分别泡在电转液中。

3)将玻璃板撬掉剥下胶，除去小玻璃板后，将胶的上、下、左右轻轻适度切去一些，避免把分离胶刮破，小心剥下分离胶盖于膜上。

4)擀去夹子白板侧滤纸下的气泡，将膜和胶一同转移到白板侧的滤纸上(白膜黑胶)，调整使其与滤纸对齐，轻轻擀去气泡；在胶上盖3张滤纸并除去气泡；最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。

顺序依次为：黑板-棉-3/4层滤纸-胶-膜(硝酸纤维素膜)-3/4层滤纸-海绵-白板。

5)盆中装冰，将夹子放入电转槽中，夹子端朝上，黑面对槽的黑面，白面对槽的红面；倒入电转液；设置：300mA，75min/60min。

5.染色

将膜放入丽春红染色液中，短时间观察是否转膜成功，观察完毕，自来水冲洗染料。

6.封闭

1)转膜完成后，立即将膜放入1X TBST漂洗1-2min，洗去膜上的转膜液。

2)将膜放入牛奶(5％脱脂奶粉2.5g+1X TBST加至50ml，先加少量TBST将牛奶溶解，再加TBST至50ml)，摇床震荡60min，使其完全均匀。

3)1X TBST洗膜3次，5-10min/次。

7.一抗孵育：

i.稀释一抗：共3ml，用一抗稀释液或1X TBST稀释。

ii.剪膜：按照不交叉孵育一抗的原则，讲不同的目的蛋白，内参所在条带的膜剪开，分别孵育一抗或内参。

iii.孵育一抗的方法：①装在50ml离心管中；②封在杂交袋中(不留气泡)；③装在分格的盒子里。4℃摇床过夜。

8.孵育二抗

i.第二天取出膜，加入1X TBST(浸没膜)，摇床洗涤5-10min X4次，一抗回收放入-20℃。

ii.稀释二抗，用1X TBST(1:10000)。

iii.二抗孵育1.5-2h。

iv.1X TBST洗10min X 4次。

9.显影。

本申请提供下述抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用。

本实施例提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备预防或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病的产品中的应用。

具体地，抑制血管生成素样蛋白8的物质为具有抑制血管生成素样蛋白8作用的抗体、病毒、化合物、组合物、制剂、试剂盒和/或仪器等物质，其中，制剂可以为口服制剂、注射制剂等，也可以为液体制剂、冻干粉制剂、片剂、颗粒剂等，本申请对此不做限制。

预防或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病的产品包括预防主动脉瘤的产品、预防主动脉瘤相关疾病的产品、预防主动脉夹层的产品、预防主动脉夹层相关疾病的产品、治疗主动脉瘤的产品、治疗主动脉瘤相关疾病的产品、治疗主动脉夹层的产品、治疗主动脉夹层相关疾病的产品中的一种或几种的任意组合。其中，相关疾病是主动脉瘤和/或主动脉夹层形成过程中产生的疾病、或主动脉瘤和/或主动脉夹层引起的并发症、后遗症等与主动脉瘤和/或主动脉夹层具有一定相关性的疾病，本申请对此不做限制。产品是具有相关预防和/或治疗作用的药物、制剂、试剂盒和/或仪器等，药物可以是药物化合物、药物组合物、药物配方等，制剂可以是液体制剂、冻干粉制剂，也可以是口服制剂、注射制剂等，本申请对此不做限制。

具体地，预防或治疗胸主动脉瘤和/或胸主动脉夹层相关疾病的产品包括预防胸主动脉瘤的产品、预防胸主动脉瘤相关疾病的产品、预防胸主动脉夹层的产品、预防胸主动脉夹层相关疾病的产品、治疗胸主动脉瘤的产品、治疗胸主动脉瘤相关疾病的产品、治疗胸主动脉夹层的产品、治疗胸主动脉夹层相关疾病的产品中的一种或几种的组合。其中，相关疾病是胸主动脉瘤和/或胸主动脉夹层形成过程中产生的疾病、或胸主动脉瘤和/或胸主动脉夹层引起的并发症、后遗症等与胸主动脉瘤和/或胸主动脉夹层具有一定相关性的疾病，本申请对此不做限制。产品是具有相关预防和/或治疗作用的药物、制剂、试剂盒和/或仪器等，药物可以是药物化合物、药物组合物、药物配方等，制剂可以是液体制剂、冻干粉制剂，也可以是口服制剂、注射制剂等，本申请对此不做限制。

具体地，其他治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病的药物可以是如降压药、消炎药等的对于主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病具有一定治疗作用的药物，可以为药物化合物、药物组合物等，也可以为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等各种剂型的药物，本申请对此不做限制。

具体地，血管生成素样蛋白8抑制剂是特异性结合血管生成素样蛋白8抗体或其抗原结合片段。血管生成素样蛋白8可以通过口服、静脉或皮下内施用于患者。

进一步地，其中所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括在体内或体外与血管生成素样蛋白8结合或相互作用、以抑制血管生成素样蛋白8生物学功能的制剂。

进一步地，其中所述血管生成素样蛋白8抗体抑制剂包括血管生成素样蛋白8抗体、小分子血管生成素样蛋白8拮抗剂、基于核酸的血管生成素样蛋白8表达或活性抑制剂、基于肽的与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的分子、与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的受体分子、包含低密度脂蛋白受体的配体结合部分的蛋白质、结合血管生成素样蛋白8的支架分子、基于纤连蛋白的支架构建体、其他基于天然存在性重复序列蛋白的支架分子和抗血管生成素样蛋白8适配体中的任意一种或几种的组合。

具体地，所述基于核算的血管生成素样蛋白8表达或活性抑制剂包括小干扰RNA(siRNA)、反义RNA等，基于肽的与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的分子包括肽体(peptibody)等，结合血管生成素样蛋白8的支架分子包括锚蛋白重复蛋白(DARPin)、HEAT重复序列蛋白，ARM重复序列蛋白、三角形四肽重复序列蛋白(tetratricopeptiderepeatproteins)等，抑制血管生成素样蛋白8的物质还包括Sh-RNA序列的血清型9型腺相关病毒等。

本实施例还提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制主动脉瘤和/或主动脉夹层形成的产品中的应用。

具体地，抑制主动脉瘤和/或主动脉夹层形成的产品是抑制主动脉瘤和/或主动脉夹层的发生或发展的药物、制剂、试剂盒和/或仪器等。

本实施例还提供一种抑制血管生成素样蛋白8表达的物质在制备抑制主动脉瘤和/或主动脉夹层形成的产品中的应用。

具体地，抑制血管生成素样蛋白8表达的物质为具有抑制血管生成素样蛋白8表达作用的抗体、病毒、化合物、组合物、制剂、试剂盒和/或仪器等物质。

具体地，敲除血管生成素样蛋白8表达基因是抑制血管生成素样蛋白8的一种具体实现方式，敲除血管生成素样蛋白8表达基因的物质为具有敲除血管生成素样蛋白8表达基因作用的抗体、病毒、化合物、组合物、制剂、试剂盒和/或仪器等物质。

本实施例还提供一种预防和/或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病的方法，包括通过抑制血管生成素样蛋白8预防和/或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层相关疾病。

下面结合具体的实验对本实施例进行进一步说明。

一、病例对照研究

选择研究对象，在就诊于某医院血管科的患有急性胸主动脉夹层且术前计算机断层扫描(CT)后接受常规心内直视手术治疗的162名患者中，根据CT评估升每一位患者主动脉的最大轴向主动脉直径，排除存在先天性遗传性疾病、严重心血管疾病、自身免疫性疾病、严重器官衰竭、传染病、恶性肿瘤、血液系统疾病的患者，排除患有结缔组织疾病如马凡综合征、先天性结缔组织发育不全综合征、主动脉缩窄或任何其他主动脉疾病的患者，排除家族性急性胸主动脉夹层的患者，且排除患有家族性急性胸主动脉夹层的患者后，剩余78名患者，作为第一处理组。另外选取72名未患有任何疾病的受试者作为第一对照组。

使用酶联免疫吸附测定试剂盒(#EK-051-60Phoenix Pharmaceuticals,Inc,Burlingame,California 94010Range:0-100ng/ml)采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法分别测定处理组78名患者及第一对照组72名受试者血液中的血管生成素样蛋白8水平。具体测定方法如下：用抗人血管生成素样蛋白8抗体(#EK-051-60Phoenix Pharmaceuticals,Inc,Burlingame,California 94010Range:0-100ng/ml)包被于酶标板(#EK-051-60Phoenix Pharmaceuticals,Inc,Burlingame,California 94010Range:0-100ng/ml)上，实验时患者及受试者的样品(150例患者血清，用量每孔50ul)或标准品(#EK-051-60Phoenix Pharmaceuticals,Inc,Burlingame,California 94010Range:0-100ng/ml，200ul 1000ng/ml)中的人血管生成素样蛋白8与包被抗体结合，游离的成分被洗去，依次加入生物素化的抗人血管生成素样蛋白8抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，抗人血管生成素样蛋白8抗体与结合在包被抗体上的人血管生成素样蛋白8结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测吸光度(O.D.值)，人血管生成素样蛋白8浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中人血管生成素样蛋白8的浓度。

如图1所示，图1是通过student t检验(Student's t test，T检验)以及Prism5绘制得到的。其中，图1中“第一对照组”对应的柱形表示第一对照组72名受试者血液中血管生成素样蛋白8的浓度即含量水平的平均值，柱形顶端的横线表示第一对照组72名受试者血液中血管生成素样蛋白8的标准差；“第一处理组”对应的柱形表示第一处理组78名患者血液中血管生成素样蛋白8的浓度的平均值，柱形顶端的横线表示的第一处理组78名患者血液中血管生成素样蛋白8浓度的标准差，星号表示具有统计学意义。

在图1中可以看出，第一处理组患者血液中血管生成素样蛋白8的水平明显高于第一对照组受试者血液中的血管生成素样蛋白8水平。故可以证明对于主动脉瘤及相关疾病患者、主动脉夹层及相关疾病患者血管生成素样蛋白8的表达明显增加。

在手术期间解剖上述第一处理组中患者的主动脉夹层组织作为第二处理组，取某医院排除了患有胶原病或主动脉瘤、主动脉夹层的心脏移植供体的主动脉样本作为第二对照组。将第二处理组的主动脉夹层组织以及第二对照组的主动脉样本分别固定在10％福尔马林中，并包埋在石蜡中，以5-μm厚度切片。

对第二处理组及第二对照组切片中的血管生成素样蛋白8进行免疫组织化学染色，观察血管生成素样蛋白8的活性水平，即取出两组切片，室温晾10min后，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍，每遍5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS洗3遍，每遍5min，血清封闭30min，吸干血清后，一抗(血管生成素样蛋白8,购自Abcam)4℃过夜。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DAPI显色液染色后，苏木素复染30s-1min左右，水洗后用1％的盐酸酒精分化，再用自来水水洗返蓝。将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-无水乙醇I-无水乙醇II-二甲苯I-二甲苯II中脱水透明，每个试剂中放置2min，最后在通风橱中风干切片后中性树胶封片。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图2。

如图2所示，图2-A为第二对照组切片血管生成素样蛋白8染色显微图，图2-B为第二处理组切片血管生成素样蛋白8染色纤维图，其中，400×表示显微镜的倍数为400倍，图2-A及图2-B中的点表示血管生成素样蛋白8，基于图2-A及图2-B采用Prism 5绘制柱形图，得到图2-C。图2-C中，“第二对照组”对应的柱形表示第二对照组切片即主动脉组织样本中的血管生成素样蛋白8的活性水平，柱形顶端的横线表示第二对照组切片即主动脉组织样本中血管生成素样蛋白8活性水平的标准差；“第二处理组”对应的柱形表示第二处理组患者切片即主动脉夹层组织样本中血管生成素样蛋白8的活性水平，柱形顶端的横线表示第二处理组患者切片即主动脉夹层组织样本中血管生成素样蛋白8活性水平的标准差。

在图2中可以看出，第二处理组中血管生成素样蛋白8的活性水平明显高于第二对照组中血管生成素样蛋白8的水平，故可以证明对于主动脉瘤患者、主动脉夹层患者血管生成素样蛋白8的表达明显增加。

将第二处理组中患者的主动脉夹层组织样本中的血管生成素样蛋白8、巨噬细胞以及平滑肌细胞进行共定位染色，即取出第二处理组切片，室温晾10min后，采用4％多聚甲醛固定30min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3遍，每遍清洗5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS清洗3遍，每遍清洗5min，血清封闭30min，吸干血清后一抗4℃过夜。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DIPA封片，4℃保存1h后，通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图3。

如图3所示，图3-A为平滑肌细胞的标志蛋白α-SMC的染色图，其中红色点状部分表示标志蛋白α-SMC，图3-B为平滑肌细胞的血管生成素样蛋白8的染色图，其中绿色点状部分表示血管生成素样蛋白8，图3-C为平滑肌细胞的细胞核染色图，其中蓝色点状部分表示平滑肌细胞的细胞核，图3-D为平滑肌细胞中标志蛋白α-SMC、血管生成素样蛋白8及平滑肌细胞的细胞核的共定位染色图，其中黄色点状部分表示平滑肌细胞标志蛋白α-SMC、细胞核与血管生成素样蛋白8的重叠部分。图3-E为巨噬细胞的标志蛋白Mac-2的染色图，其中红色点状部分表示标志蛋白Mac-2，图3-F为巨噬细胞的血管生成素样蛋白8的染色图，其中绿色点状部分表示血管生成素样蛋白8，图3-G为巨噬细胞的细胞核染色图，其中蓝色点状部分表示巨噬细胞的细胞核，图3-H为巨噬细胞中标志蛋白Mac-2、血管生成素样蛋白8及巨噬细胞的细胞核的共定位染色图，其中黄色点状部分表示巨噬细胞标志蛋白Mac-2、细胞核与血管生成素样蛋白8的重叠部分。

由此可见，在患者的主动脉夹层组织中血管生成素样蛋白8与平滑肌细胞及巨噬细胞均共定位，即血管生成素样蛋白8与平滑肌细胞、巨噬细胞在主动脉夹层组织中同样的位置均有表达。

二、抑制血管生成素样蛋白8对小鼠胸主动脉瘤/主动脉夹层发生率与生存率的影响

选择66只C57BL小鼠并分为四组，分别为：空白对照组10只、ANGPTL8-/-处理组6只、BAPN(β-aminopropionitrile，β-氨基丙腈)处理组30只和BAPN+ANGPTL8-/-处理组20只。

将每日新配的10gBAPN(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)溶解于蒸馏水，用量筒分别量取100ml倒入BAPN处理组和BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠的饮水瓶中，保证饮水瓶不漏水、渗水，次日测量小鼠饮水量，四组小鼠的其余生存环境完全相同，培养四周后观察结果，需要说明的是，每天给小鼠服用药物的剂量是：每千克小鼠体重1g药物，一共服用4周。

为ANGPTL8-/-处理组和BAPN+ANGPTL8-/-处理组的小鼠注射血管生成素样蛋白8抑制剂(Sh-RNA序列的血清型9型腺相关病毒)以抑制其体内的血管生成素样蛋白8。

从小鼠的升主动脉开始取样，取样范围是胸主动脉(升主动脉，主动脉弓，降主动脉)。麻醉小鼠后，使用肝素盐水进行血管灌注，以去除血管中的残留血液。将小鼠胸主动脉血管置于4％多聚甲醛中2小时，然后在4℃的环境下转移至30％蔗糖溶液中过夜。第二天，从蔗糖溶液中取出血管以吸收水，然后将其放在OCT中进行组织包埋。空白对照组和ANGPTL8-/-处理组小鼠主动脉从根部到胸降主动脉切成段，从升主动脉上取切片，对于BAPN处理组和BAPN+ANGPTL8-/-处理组，第一张切片始于主动脉夹层，并将切片置于载玻片中，对所有载玻片进行连续计数处理。

取出空白对照组小鼠和BAPN处理组小鼠的相同编号的主动脉血管组织切片进行免疫组织化学染色，即切片室温晾10min后，4％多聚甲醛固定30min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗3遍，每遍5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS洗3遍，每遍5min，血清封闭30min，吸干血清后，一抗(血管生成素样蛋白8,购自Abcam)4℃过夜。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DAPI显色液染色后，苏木素复染30s-1min左右，水洗后用1％的盐酸酒精分化，再用自来水水洗返蓝。将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-无水乙醇I-无水乙醇II-二甲苯I-二甲苯II中脱水透明，每个试剂中放置2min，最后在通风橱中风干切片后中性树胶封片。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图4。

如图4所示，图4-A为空白对照组小鼠血管组织染色显微图，图4-B为BAPN处理组小鼠的血管组织染色显微图，图4-A及图4-B中的点状物质为血管生成素样蛋白8，可以明显看出，BAPN处理组小鼠血管组织中血管生成素样蛋白8的面积明显大于空白对照组，由此可见，血管生成素样蛋白8在BAPN处理组小鼠的血管组织中的表达明显多于其在空白对照组小鼠血管组织中的表达。

对每只死亡的小鼠进行尸检，确定小鼠的死亡原因均为主动脉夹层破裂，并统计每个小组小鼠的生存率，得到小鼠生存率折线图，如图5所示，其中，横轴表示天数，纵轴表示小鼠生存率，可以看出，BAPN处理组的小鼠在10天后生存率呈逐步下降的趋势，而空白对照组和BAPN+ANGPTL8-/-处理组的小鼠在四周的时间内生存率均达到百分之百，由此可见，抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制BAPN诱导的小鼠主动脉瘤或主动脉夹层的发生以及主动脉瘤和主动脉夹层导致的死亡，提高小鼠生存率。

统计每个小组中小鼠每日的饮水量，得到小鼠饮水量折线图，如图6所示，其中，横轴表示天数，纵轴表示小鼠的饮水量(ml)，可以看出空白对照组、BAPN处理组、BAPN+ANGPTL8-/-处理组以及ANGPTL8-/-处理组小鼠的饮水量无太大差异，故可以排除抑制血管生成素样蛋白8给小鼠饮水量带来的影响，即排除小鼠由于饮水过多或过少造成BAPN给药量的影响。

在空白对照组、BAPN处理组、BAPN+ANGPTL8-/-处理组以及ANGPTL8-/-处理组的小鼠中，每组随机选出一只小鼠进行解剖，取其心脏、血管(主动脉)和肾脏进行观察，如图7所示，其中，图7-A为空白对照组小鼠的心脏、血管及肾脏解剖图，可以看出空白对照组小鼠血管周围几乎无主动脉瘤或主动脉夹层的形成，图7-B为ANGPTL8-/-处理组小鼠的心脏、血管及肾脏解剖图，可以看出抑制血管生成素样蛋白8的小鼠的血管周围同样几乎无主动脉瘤或主动脉夹层的形成，图7-C为BAPN处理组小鼠的心脏、血管及肾脏解剖图，可以看出BAPN处理组小鼠血管的管径明显大于其他三组小鼠血管的管径，BAPN处理组的小鼠血管周围明显有主动脉瘤、主动脉夹层的形成，说明BAPN可以诱导小鼠主动脉瘤及主动脉夹层的形成，图7-D为BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠的心脏、血管及肾脏解剖图，可以看出BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠的血管周围无主动脉瘤及主动脉夹层的形成。由此可见，BAPN处理组的小鼠血管组织上主动脉瘤、主动脉夹层的面积明显大于空白对照组、ANGPTL8-/-处理组以及BAPN+ANGPTL8-/-处理组，由此可见，相对于空白对照组而言，BAPN可以诱导小鼠主动脉瘤、主动脉夹层的形成，相对于BAPN处理组而言，抑制血管生成素样蛋白8可以显著减轻BAPN诱导的主动脉瘤、主动脉夹层的形成。

在空白对照组、BAPN处理组、BAPN+ANGPTL8-/-处理组以及ANGPTL8-/-处理组的小鼠中，每组随机选取一只小鼠进行超声(Vevo 2100,VisualSonics,Toronto,Canada)成像，如图8所示，图8-A为空白对照组小鼠的血管超声图，图8-B为ANGPTL8-/-处理组小鼠的血管超声图，图8-C为BAPN处理组小鼠的血管超声图，图8-D为BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠的血管超声图，基于上述四张图中小鼠的血管直径，采用单因素方差分析并绘制小鼠血管直径柱形对比图，如图8-E所示，其中横轴表示组别，纵轴表示小鼠血管直径，柱形顶端的横线表示小鼠血管直径的标准差，可以看出，BAPN处理组小鼠的血管直径明显大于其他三组。图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义，即在图8-E中，将ANGPTL8-/-处理组与BAPN处理组进行比较，BAPN处理组小鼠的血管直径明显大于ANGPTL8-/-处理组，说明BAPN可以诱导小鼠主动脉瘤、主动脉夹层血管增宽，再将BAPN+ANGPTL8-/-处理组与BAPN处理组进行比较，BAPN处理组小鼠的血管直径明显大于BAPN+ANGPTL8-/-处理组，说明抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制BAPN诱导的小鼠主动脉瘤、主动脉夹层血管增宽，且上述比较结果均具有统计学意义。

在空白对照组、BAPN处理组、BAPN+ANGPTL8-/-处理组以及ANGPTL8-/-处理组的小鼠中，选取相同编号的血管组织切片进行HE染色，即电吹风吹切片或烤切片至溶蜡；入二甲苯I中脱蜡15min，用吸水纸吸干液体；入二甲苯II中脱蜡15min，用吸水纸吸干液体；入二甲苯III中脱蜡15min，用吸水纸吸干液体；入100％酒精洗二甲苯5min，用吸水纸吸干液体；入95％酒精洗二甲苯5min，用吸水纸吸干液体；入80％酒精洗二甲苯5min，用吸水纸吸干液体；自来水冲洗2min，洗去酒精；苏木素(200ml苏木素+1.5ml冰醋酸)染色3-5min，自来水冲洗1min；盐酸分化液(400ml 75％酒精+3ml浓盐酸)分化2s(切片由蓝变红)，自来水冲洗(返蓝)5min；伊红染色2-3min，自来水冲洗30s；入80％酒精30s，用吸水纸吸干液体；入95％酒精3min，用吸水纸吸干液体；入100％酒精3min，用吸水纸吸干液体；入二甲苯I中5min，用吸水纸吸干液体；入二甲苯II中5min，用吸水纸吸干液体；中性树胶封片。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图9。

如图9所示，其中图9-A为空白对照组小鼠的血管HE染色图，图9-B为ANGPTL8-/-处理组小鼠的血管HE染色图，图9-C为BAPN处理组小鼠的血管HE染色图，图9-D为BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠的血管HE染色图，基于上述四张图中小鼠的血管管壁，采用单因素方差分析并绘制小鼠血管管壁厚度柱形对比图，如图9-E所示，其中横轴表示组别，纵轴表示小鼠血管管壁厚度，柱形顶端的横线表示小鼠血管管壁厚度的标准差，可以看出，BAPN处理组小鼠的血管管壁厚度明显大于其他三组。图中最上方的横线及星号表示将该横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义，即在图9-E中，将ANGPTL8-/-处理组与BAPN处理组进行比较，BAPN处理组小鼠的血管管壁厚度明显大于ANGPTL8-/-处理组，说明BAPN可以诱导小鼠主动脉瘤、主动脉夹层血管管壁增厚，再将BAPN+ANGPTL8-/-处理组与BAPN处理组进行比较，BAPN处理组小鼠的血管管壁厚度明显大于BAPN+ANGPTL8-/-处理组，说明抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制BAPN诱导的小鼠主动脉瘤、主动脉夹层血管管壁增厚，且上述比较结果均具有统计学意义。

在空白对照组、BAPN处理组、BAPN+ANGPTL8-/-处理组以及ANGPTL8-/-处理组的小鼠中，选取相同编号的血管组织切片进行弹力纤维染色，即电吹风吹切片或烤切片至溶蜡；入二甲苯I中脱蜡15min，用吸水纸吸干液体；入二甲苯II中脱蜡15min，用吸水纸吸干液体；入二甲苯III中脱蜡15min，用吸水纸吸干液体；入100％酒精洗二甲苯5min，用吸水纸吸干液体；入95％酒精洗二甲苯5min，用吸水纸吸干液体；入80％酒精洗二甲苯5min，用吸水纸吸干液体；自来水冲洗2min，洗去酒精；入碘液5min，自来水清洗3遍；入硫代硫酸钠5min，自来水清洗3遍；入70％酒精5s；入醛品红10s，酒精清洗2s；入橙黄G染液染色1s，自来水清洗3min；入二甲苯5min；中性树胶封片。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图10。

如图10所示，图10-A为空白对照组小鼠血管的弹力纤维染色图，图10-B为ANGPTL8-/-处理组小鼠的血管弹力纤维染色图，图10-C为BAPN处理组小鼠的血管弹力纤维染色图，图10-D为BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠的血管弹力纤维染色图，图10-E为各组小鼠主动脉血管弹力纤维断裂程度对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示弹力纤维断裂程度，柱形顶部的横线表示弹力纤维断裂程度的标准差，最上方的横线及星号表示将该横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义，即在图10-E中，将ANGPTL8-/-处理组与BAPN处理组进行比较，BAPN处理组小鼠的血管弹力纤维断裂程度明显大于ANGPTL8-/-处理组，说明BAPN可以诱导小鼠血管弹力纤维的断裂，再将BAPN+ANGPTL8-/-处理组与BAPN处理组进行比较，BAPN处理组小鼠的血管弹力纤维断裂程度明显大于BAPN+ANGPTL8-/-处理组，说明抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制BAPN诱导的小鼠血管弹力纤维的断裂，减轻BAPN引起的血管结构紊乱，且上述比较结果均具有统计学意义。

分别取空白对照组、BAPN处理组以及BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠的血管组织，对相同编号的血管组织切片中的IL-1B进行免疫组织化学染色，即取出各组小鼠相同编号的切片，室温晾10min后，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍，每遍5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS洗3遍，每遍5min，血清封闭30min，吸干血清后，一抗(IL-1B)4℃过夜。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DAPI显色液染色后，苏木素复染30s-1min左右，水洗后用1％的盐酸酒精分化，再用自来水水洗返蓝。将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-无水乙醇I-无水乙醇II-二甲苯I-二甲苯II中脱水透明，每个试剂中放置2min，最后在通风橱中风干切片后中性树胶封片。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图11，其中，IL-1B为白细胞介素、炎症介质之一。

如图11所示，图11-A为空白对照组小鼠血管组织染色显微图，图11-B为BAPN处理组小鼠血管组织染色显微图，图11-C为BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠血管组织染色显微图，其中，稀疏点状部分表示IL-1B。可以看出，在BAPN处理组小鼠的血管组织中，IL-1B数量最多且分布最广，空白对照组以及BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠血管组织中的IL-1B明显少于BAPN处理组。由此可见，BAPN可以诱导小鼠血管组织中炎症的产生，而抑制血管生成素样蛋白8可以显著减轻BAPN诱导的炎症。

分别对空白对照组、BAPN处理组以及BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠的血管组织中的细胞核和凋亡细胞进行共定位染色，即取出各组小鼠相同编号的切片，室温晾10min后，采用4％多聚甲醛固定30min，磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffer saline，PBS)清洗3遍，每遍清洗5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS清洗3遍，每遍清洗5min，血清封闭30min，吸干血清后一抗4℃过夜。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DIPA封片，4℃保存1h后，通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图12。其中，蓝色标记细胞核，绿色标记凋亡细胞。

如图12所示，图12-A为空白对照组小鼠血管组织中细胞核和凋亡细胞共定位染色示意图，图12-B为BAPN处理组小鼠血管组织中细胞核和凋亡细胞共定位染色示意图，图12-C为BAPN+ANGPTL8-/-处理组小鼠血管组织中细胞核和凋亡细胞共定位染色示意图，可以看出，BAPN处理组凋亡细胞数量最多，说明BAPN可以诱导小鼠血管组织中细胞的凋亡，BAPN+ANGPTL8-/-处理组凋亡细胞数量明显减少，所以抑制血管生成素样蛋白8可以显著减轻BAPN诱导的细胞凋亡。

三、抑制血管生成素样蛋白8对于炎症的影响

设置AngII组，取若干平滑肌细胞(购自Shanghai Xinyu Biotech Co.,ChinaLtd.)和巨噬细胞(购自American Type Culture Collection,Manassas USA)接种在60mm培养皿中，生长至40％汇合，将AngII组的细胞分成四份，一份不做任何其他处理，另外三份分别采用25nmol/L，50nmol/L，100nmol/L的血管紧张素II(购自Sigma,A9625-50MG)进行处理，得到对照组、AngII25组、AngII50组和AngII100组。由于100nmol/L血管紧张素II刺激ANGPTL8作用最强，因此分别选取对照组和AngII100组中的部分细胞加入ANGPTL8siRNA进行转染。转染的具体步骤为：在六孔板细胞计数0.8×10⁵时开始转染，转染试剂为RNAIMAXinvitrogen 13778150；OPTI MEM，ANGPTL8 siRNA序列为5’-GAGAAUUUGAGGUCUUAAAtt-3’和antisense5’-UUUAAGACCUCAAAUUCUCgg-3’。配制溶液I:RNAIMAX9ul+OPTI MEM150ul混匀，配制溶液II：ANGPTL8 siRNA 3ul+OPTI MEM150ul。将溶液I和溶液II混匀后静置5min，每孔加入250ul混合液进行转染，得到ANGPTL8siRNA组和AngII100+ANGPTL8siRNA组。各组均采用10％的胎牛血清和1％的青霉素/链霉素在基础培养基(DMEM)以及常氧条件下(37℃，5％CO₂–95％空气混合气体)孵育箱培养24小时后，采用Western Blot技术测定各组的平滑肌细胞和巨噬细胞中各种炎症指标的水平，其中，Western Blot技术的检测步骤包括：清洗玻璃板；配胶；电泳；转膜；染色；封闭；一抗孵育，其中一抗为血管生成素样蛋白8；孵育二抗；显影，详细内容可参见上述“Western免疫印迹”名词解释部分。

如图13所示，图13-A为对照组、AngII25组、AngII50组和AngII100组巨噬细胞中血管生成素样蛋白8的western-blot图，其中，β-actin为肌动蛋白，黑色面积表示每组中血管生成素样蛋白8和β-actin的含量，黑色面积越大，则巨噬细胞中血管生成素样蛋白8及β-actin的含量越多，图13-B为对照组、AngII25组、AngII50组和AngII100组巨噬细胞中血管生成素样蛋白8含量水平的柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示血管生成素样蛋白8含量水平，并通过β-actin进行校正。从图13-A及图13-B中可以看出，随着各组巨噬细胞中血管紧张素II的浓度的升高，血管生成素样蛋白8的含量也随之升高。

图13-C为对照组、ANGPTL8siRNA组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组巨噬细胞中血管生成素样蛋白8的western-blot图，可以看出，其中，β-actin为肌动蛋白，黑色面积表示每组中血管生成素样蛋白8和β-actin的含量，黑色面积越大，则巨噬细胞中血管生成素样蛋白8及β-actin的含量越多，图13-D为对照组、ANGPTL8siRNA组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组巨噬细胞中血管生成素样蛋白8的含量水平的柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示血管生成素样蛋白8含量水平，并通过β-actin进行校正。从图13-C和图13-D中可以看出，AngII100组巨噬细胞中血管生成素样蛋白8的含量水平最高，ANGPTL8siRNA组和AngII100+ANGPTL8siRNA组巨噬细胞中血管生成素样蛋白8的含量水平均低于AngII100组，说明利用siRNA对血管生成素样蛋白8进行转染可以起到抑制血管生成素样蛋白8的作用。

图13-E为对照组、AngII25组、AngII50组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组巨噬细胞的血管生成素样蛋白8mRNA水平柱形对比图，其中横轴表示组别，纵轴表示各组巨噬细胞中血管生成素样蛋白8mRNA水平，并通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行校正。可以看出，经过AngII刺激后，各组巨噬细胞中血管生成素样蛋白8mRNA水平明显上升，而AngII100+ANGPTL8siRNA组经过转染处理后，可以显著降低巨噬细胞中血管生成素样蛋白8mRNA的水平。

图13-F为对照组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组巨噬细胞的MMP-9mRNA水平柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示各组巨噬细胞中MMP-9mRNA水平，并通过GAPDH进行校正。MMP-9基因位于染色体20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13个外显子和9个内含子，属于基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)家族，主要功能是降解和重塑细，胞外基质(extracellular matris)的动态平衡，是巨噬细胞的蛋白酶。可以看出，经过AngII的刺激后，巨噬细胞中的MMP-9mRNA水平明显上升，说明AngII的刺激会导致炎症的产生，通过转染抑制血管生成素样蛋白8后，巨噬细胞中的MMP-9mRNA水平又显著下降，说明抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制炎症。

图13-G为对照组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组巨噬细胞的IL-1BmRNA水平柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示各组巨噬细胞中IL-1BmRNA水平，并通过GAPDH进行校正。IL-1B是巨噬细胞的炎症指标，可以看出，经过AngII的刺激后，巨噬细胞中的IL-1BmRNA水平明显上升，说明AngII的刺激会导致炎症的产生，通过转染抑制血管生成素样蛋白8后，巨噬细胞中的IL-1BmRNA水平又显著下降，说明抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制炎症。

图13-H为对照组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组巨噬细胞的IL-6mRNA水平柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示各组巨噬细胞中IL-6mRNA水平，并通过GAPDH进行校正。IL-6即白介素-6，是活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，可以使B细胞前体成为产生抗体的细胞，以及和集落刺激因子协同，促进原始骨髓源细胞的生长和分化，增强自然杀伤细胞的裂解功能。IL-6是巨噬细胞的炎症指标，可以看出，经过AngII的刺激后，巨噬细胞中的IL-6mRNA水平明显上升，说明AngII的刺激会导致炎症的产生，通过转染抑制血管生成素样蛋白8后，巨噬细胞中的IL-6mRNA水平又显著下降，说明抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制炎症。

图13-I为对照组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组巨噬细胞的TNF-αmRNA水平柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示各组巨噬细胞中TNF-αmRNA水平。TNF-α是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，不耐热，70℃30min失活，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一。TNF-α是巨噬细胞的炎症指标，可以看出，经过AngII的刺激后，巨噬细胞中的TNF-αmRNA水平明显上升，说明AngII的刺激会导致炎症的产生，通过转染抑制血管生成素样蛋白8后，巨噬细胞中的TNF-αmRNA水平又显著下降，说明抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制炎症。

由此可见，抑制血管生成素样蛋白8可以对于炎症的抑制具有显著的作用。另外，需要说明的是，图13-B以及图13-D至图13-I中柱形顶端的横线均表示标准差，横线上方的星号均表示实验结果具有统计学意义。

如图14所示，图14-A为对照组、AngII25组、AngII50组和AngII100组平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8的western-blot图，其中，β-actin为肌动蛋白，黑色面积表示每组中血管生成素样蛋白8和β-actin的含量，黑色面积越大，则平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8及β-actin的含量越多，图14-B为对照组、AngII25组、AngII50组和AngII100组平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8含量水平的柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示血管生成素样蛋白8含量水平，从图14-A及图14-B中可以看出，随着各组平滑肌细胞中血管紧张素II的浓度的升高，血管生成素样蛋白8的含量也随之升高。

图14-C为对照组、ANGPTL8siRNA组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8的western-blot图，可以看出，其中，β-actin为肌动蛋白，黑色面积表示每组中血管生成素样蛋白8和β-actin的含量，黑色面积越大，则平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8及β-actin的含量越多，图14-D为对照组、ANGPTL8siRNA组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8的含量水平的柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示血管生成素样蛋白8含量水平，从图14-C和图14-D中可以看出，AngII100组平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8的含量水平最高，ANGPTL8siRNA组和AngII100+ANGPTL8siRNA组平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8的含量水平均低于AngII100组，说明利用siRNA对血管生成素样蛋白8进行转染可以起到抑制血管生成素样蛋白8的作用。

图14-E为对照组、AngII25组、AngII50组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组平滑肌细胞的血管生成素样蛋白8mRNA水平柱形对比图，其中横轴表示组别，纵轴表示各组平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8mRNA水平，并通过GAPDH进行校正。可以看出，经过AngII刺激后，各组平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8mRNA水平明显上升，而AngII100+ANGPTL8siRNA组经过转染处理后，可以显著降低平滑肌细胞中血管生成素样蛋白8mRNA的水平。

图14-F为对照组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组平滑肌细胞的Bcl2mRNA水平柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示各组平滑肌细胞中Bcl2mRNA水平，并通过GAPDH进行校正。Bcl2蛋白即B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白，是一种具有抑制细胞凋亡的作用蛋白。细胞凋亡的各种信号转导途径有一个共同的通路或交汇点，而该通路的交汇点受Bcl2调节。Bcl2是巨噬细胞的凋亡指标，Bcl2水平与平滑肌细胞的凋亡程度之间成反比。可以看出，经过AngII的刺激后，平滑肌细胞中的Bcl2mRNA水平明显下降，说明AngII的刺激会导致平滑肌细胞的凋亡，通过转染抑制血管生成素样蛋白8后，平滑肌细胞中的Bcl2mRNA水平又显著上升，说明抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制平滑肌细胞的凋亡。

图14-G为对照组、AngII100组和AngII100+ANGPTL8siRNA组平滑肌细胞的BimmRNA水平柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示各组平滑肌细胞中Bim mRNA水平，并通过GAPDH进行校正。Bim(Bcl-2interacting mediator of cell death)是Bcl-2家族中BH3-only亚家族的成员，是一种重要的凋亡调节蛋白，是平滑肌细胞的凋亡指标，Bim mRNA水平与平滑肌细胞的凋亡程度之间成正比。可以看出，经过AngII的刺激后，平滑肌细胞中的Bim mRNA水平明显上升，说明AngII的刺激会导致平滑肌细胞的凋亡，通过转染抑制血管生成素样蛋白8后，平滑肌细胞中的Bim mRNA水平又显著下降，说明抑制血管生成素样蛋白8可以显著抑制平滑肌细胞的凋亡。

由此可见，抑制血管生成素样蛋白8可以对于平滑肌细胞凋亡的抑制具有显著的作用。另外，需要说明的是，图14-B以及图14-D至图14-G中柱形顶端的横线均表示标准差，横线上方的星号均表示实验结果具有统计学意义。

综上所述，本申请实施例提供的抑制血管生成素样蛋白的物质，通过抑制人体血清或组织中血管生成素样蛋白8的表达，抑制炎症的产生和发展，抑制平滑肌细胞的凋亡，维持血管管壁的稳态，进而抑制主动脉瘤、主动脉夹层的形成。同时，将抑制血管生成素样蛋白的物质应用于预防或治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层的产品中，可以更加快速、高效、全方位的对主动脉瘤、主动脉夹层起到治疗作用，治疗效果好，应用前景佳。

在本文中，“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分，而非表示重要程度及顺序、以及互为存在的前提等。

在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。

除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。

上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本申请并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请构思的前提下做出各种变化。

Claims

1.一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备预防或治疗主动脉夹层相关疾病的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防或治疗主动脉夹层相关疾病的产品为预防或治疗胸主动脉夹层相关疾病的产品。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管生成素样蛋白8的物质通过抑制炎症预防或治疗主动脉夹层相关疾病。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管生成素样蛋白8的物质与其他治疗主动脉夹层相关疾病的药物在所述产品中联合使用。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的应用，其特征在于，所述抑制血管生成素样蛋白8的物质包括血管生成素样蛋白8抑制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括在体内或体外与血管生成素样蛋白8结合或相互作用，以抑制血管生成素样蛋白8生物学功能的制剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括血管生成素样蛋白8抗体、小分子血管生成素样蛋白8拮抗剂、基于核酸的血管生成素样蛋白8表达或活性抑制剂、基于肽的与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的分子、与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的受体分子、包含低密度脂蛋白受体的配体结合部分的蛋白质、结合血管生成素样蛋白8的支架分子、基于纤连蛋白的支架构建体、其他基于天然存在性重复序列蛋白的支架分子和抗血管生成素样蛋白8适配体中的任意一种或几种的组合。

8.一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制主动脉夹层形成的产品中的应用。

9.一种抑制血管生成素样蛋白8表达的物质在制备抑制主动脉夹层形成的产品中的应用。