CN110694068A

CN110694068A - 一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用

Info

Publication number: CN110694068A
Application number: CN201911077747.6A
Authority: CN
Inventors: 秦彦文; 焦晓璐
Original assignee: BEIJING-CITY INST OF CARDIOPULMONARY VASCULAR DISEASES
Current assignee: BEIJING-CITY INST OF CARDIOPULMONARY VASCULAR DISEASES
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2020-01-17

Abstract

本申请提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用，包括：一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制血管生成素样蛋白8的物质在预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用。本申请提供的抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用，其中抑制血管生成素样蛋白8的物质通过抑制泡沫细胞的形成，减轻动脉粥样硬化斑块，从而抑制动脉粥样硬化性心血管疾病的发生及发展，对于预防和治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的效果好，应用前景佳。

Description

一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用

技术领域

本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。动脉粥样硬化性心血管疾病是严重危害人类健康的常见病，其发病率和死亡率均呈不断上升的趋势。动脉粥样硬化的病变形成主要与三个过程有关，其一为内皮细胞损伤、淋巴细胞及巨噬细胞浸润、释放炎症及趋化因子，其二为平滑肌细胞分泌胶原纤维、弹性纤维蛋白等结缔组织基质，其三为巨噬细胞吞噬脂质变成泡沫细胞，其中，巨噬细胞吞噬脂质变成泡沫细胞是动脉粥样硬化的病变形成中尤为重要的一环。

尽管现在有很多控制与治疗的方法，如他汀药物的使用，颈动脉斑块剥脱手术，经皮冠状动脉介入术等，但是动脉粥样硬化性心血管疾病的发生率和死亡率依然居高不下。

发明内容

有鉴于此，本申请实施例提供了一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用，以解决现有技术中存在的技术缺陷。

本申请提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制血管生成素样蛋白8的物质在预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用。

进一步地，其中所述抑制血管生成素样蛋白8的物质通过抑制泡沫细胞的形成预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病。

进一步地，其中所述抑制血管生成素样蛋白8的物质与其他预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物在所述产品中联合使用。

进一步地，其中所述抑制血管生成素样蛋白8的物质包括血管生成素样蛋白8抑制剂。

进一步地，其中所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括在体内或体外与血管生成素样蛋白8结合或相互作用、以抑制血管生成素样蛋白8生物学功能的制剂。

进一步地，其中所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括血管生成素样蛋白8抗体、小分子血管生成素样蛋白8拮抗剂、基于核酸的血管生成素样蛋白8表达或活性抑制剂、基于肽的与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的分子、与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的受体分子、包含低密度脂蛋白受体的配体结合部分的蛋白质、结合血管生成素样蛋白8的支架分子、基于纤连蛋白的支架构建体、其他基于天然存在性重复序列蛋白的支架分子和抗血管生成素样蛋白8适配体中的任意一种或几种的组合。

本申请还提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品中的应用。

本申请还提供一种抑制血管生成素样蛋白8表达的物质在制备抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品中的应用。

本申请还提供一种敲低或敲除血管生成素样蛋白8表达基因的物质在制备抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品中的应用。

本申请提供的抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用，其中抑制血管生成素样蛋白8的物质通过抑制巨噬细胞中的脂质沉积和巨噬细胞的增加，抑制泡沫细胞的形成，抑制动脉粥样硬化斑块的增加，从而抑制动脉粥样硬化性心血管疾病的发生及发展，对于预防和治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的效果好，应用前景佳。

附图说明

图1是本申请一实施例所述的小鼠肝脏组织血管生成素样蛋白8表达的对比图；

图2是本申请一实施例所述的小鼠血管组织血管生成素样蛋白8表达的对比图；

图3是本申请一实施例所述的小鼠血管生成素样蛋白8与巨噬细胞的共定位染色图；

图4是本申请一实施例所述的人颈动脉斑块中血管生成素样蛋白8表达示意图；

图5是本申请一实施例所述的人颈动脉斑块中血管生成素样蛋白8与巨噬细胞的共定位染色图；

图6是本申请一实施例所述的小鼠肝脏组织血管生成素样蛋白8表达的对比图；

图7是本申请一实施例所述的小鼠血管组织血管生成素样蛋白8表达的对比图；

图8是本申请一实施例所述的小鼠血管组织油红O染色图；

图9是本申请一实施例所述的小鼠主动脉根部油红O染色图；

图10是本申请一实施例所述的小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的变化对比图；

图11是本申请一实施例所述的小鼠动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的变化对比图；

图12是本申请一实施例所述的小鼠动脉粥样硬化斑块中胶原沉积的变化对比图；

图13是本申请一实施例所述的巨噬细胞中脂质沉积的变化对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

血管生成素样蛋白(Angiopoietin-like protein，ANGPTL)：是一组不仅与血管生成相关，且与脂类代谢、葡萄糖代谢、能量代谢和胰岛素敏感性等密切相关的分泌性蛋白因子。ANGPTLs家族包含8个成员，是一类分泌蛋白。除血管生成素样蛋白5(Angiopoietin-like protein5,ANGPTL5)只在人体表达，其他ANGPTLs成员在人体和小鼠中均有表达。

血管生成素样蛋白8(Angiopoietin-like protein8,ANGPTL8)：是ANGPTLs家族的非典型成员。ANGPTL8又名GM6484、RIFL、Lipasin和Betatrophin，由198个氨基酸构成，分子量为22kDa，基因位于染色体19p13.2 a。生理情况下，在人体中，ANGPTL8由肝脏特异性表达分泌，而在小鼠中，ANGPTL8主要由肝脏和脂肪组织分泌。

小干扰RNA(siRNA)：还可以称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，并且在RNA干扰(RNAi)途径内操作。它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。

反义RNA：是指与mRNA互补后，能抑制与疾病发生直接相关基因的表达的RNA。反义RNA封闭基因表达，具有特异性强、操作简单的特点，可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病。

C57BL/6J小鼠：是小鼠品系中的一种。该品系的小鼠乳腺癌发病率较低，有眼睛缺损，口唇裂发生率达20％，淋巴细胞性白血病自发率为6％，对放射性损伤有抵抗力，对结核杆菌敏感，对鼠痘病毒有一定的抵抗力，干扰素产量高，对百日咳易感因子敏感，嗜酒精性高，常用于致癌研究，是肿瘤学、生理学、遗传学等方面研究常用的品系。

载脂蛋白E(ApoE)：是人体载脂蛋白之一。载脂蛋白是脂蛋白颗粒成分，参与脂蛋白合成、分泌、加工和代谢，在血液脂质代谢中有重要作用。

BCA蛋白浓度检测：是根据吸光值可以推算出蛋白浓度.碱性条件下，蛋白将Cu²⁺还原为Cu⁺，Cu⁺与聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate,BCA)试剂形成紫颜色的络合物，两分子BCA螯合一个Cu⁺。将该水溶性复合物在562nm处的吸收值，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

Western免疫印迹(Western Blot)：是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。其中，对已知表达蛋白可以用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物可以通过融合部分的抗体检测。

Western Blot技术包括如下所述的步骤：

1.清洗玻璃板

2.配胶

分离胶：10％的分离胶适合分子量大的分子，12％的分离胶适合分子量小的分子。

浓缩胶：

配制分离胶，在分离胶的配置过程中先加入其它成分，最后加入TEMWD，然后充分混匀，迅速加入玻璃板中，用酒精喷液面以压平液面(30min)。

配制浓缩胶，待分离胶凝固倒出酒精，将浓缩胶加入玻璃板中，立即插入提前准备好的梳齿，静置1h。

3.电泳

将两块板置于电泳槽中，向两块板之间加入配好的1X电泳缓冲液若只跑一块胶，那另一侧就用透明胶板(假板)插在里面。

1)平拔出梳子(两手分别捏住梳子的两侧竖直向上轻轻将其拔出)

2)加样

i、先加蛋白maker：3/5/7/10ul均可(视加样情况灵活选择辨明左右的方法，左右加不同的量的maker以区分左右)。

ii、确定上样量

a、以原液上样：根据浓度计算出上30ug(或15ug/20ug/25ug)蛋白样品的体积来上样。

b、稀释原液：将不同样本蛋白稀释为同一浓度的体系，等体积上样。

3)盖盖子，黑对黑，红对红。

4)先恒压80V/90V使样品在浓缩胶中跑；跑出分离胶时，将电压改为100V/120V。

5)当蓝色蛋白液跑至胶底部时，结束电泳，关闭电源。

4.转膜

1)配1X电转液(1000ml)，配好电转液后在-80℃的环境下使其迅速冷却或提前配好置于4℃使冷却。

其中，D2H2O：甲醇：10X电转液＝7:2:1(700ml，200ml，100ml)

2)将转膜夹子、膜分别泡在电转液中。

3)将玻璃板撬掉剥下胶，除去小玻璃板后，将胶的上、下、左右轻轻适度切去一些，避免把分离胶刮破，小心剥下分离胶盖于膜上。

4)擀去夹子白板侧滤纸下的气泡，将膜和胶一同转移到白板侧的滤纸上(白膜黑胶)，调整使其与滤纸对齐，轻轻擀去气泡；在胶上盖3张滤纸并除去气泡；最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。

5)盆中装冰，将夹子放入电转槽中，夹子端朝上，黑面对槽的黑面，白面对槽的红面；倒入电转液；设置：300mA，120min。

5.封闭

1)转膜完成后，立即将膜放入1X TBST漂洗1-2min，洗去膜上的转膜液。

2)将膜放入牛奶(5％脱脂奶粉2.5g+1X TBST加至50ml，摇床震荡60min，使其完全均匀。

3)1X TBST洗膜3次，5-10min/次。

6.一抗孵育：

i.稀释一抗：共3ml，用一抗稀释液稀释。

ii.剪膜：按照不交叉孵育一抗的原则，将不同的目的蛋白，内参所在条带的膜剪开，装在分格的盒子里，分别孵育一抗或内参，4℃摇床过夜。

7.孵育二抗

i.第二天取出膜，加入1X TBST(浸没膜)，摇床洗涤5-10min X4次，一抗回收放入-20℃。

ii.稀释二抗，用1X TBST(1:10000)。

iii.二抗室温，摇床震荡孵育1.5-2h，使其完全均匀。

iv.1X TBST洗10min X 4次。

8.使用ChemiDoc^TMTouch成像系统(Bio-Rad)显影。

免疫组织化学技术(immunohistochemistry)：也可称为免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究。

OCT包埋剂(optimal cutting temperature compound)：是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，目前已广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。

油红O脂肪染色法：简称油红O染色，是指在日常病理诊断和科研工作中为了显示组织内的脂肪常采用油红O进行染色的方法，油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。

胶原纤维染色(Masson染色)：是指用两种或三种阴离子染料混合，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，是用来显示组织中纤维的染色方法之一。

慢病毒(Lentivirus)：是逆转录病毒的一种，基因组为双链RNA。但区别于一般的逆转录病毒，慢病毒具有更广的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

本实施例提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制血管生成素样蛋白8的物质在预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用。

具体地，抑制血管生成素样蛋白8的物质为具有抑制血管生成素样蛋白8作用的抗体、病毒、化合物、组合物、制剂、试剂盒和/或仪器等物质，其中，制剂可以为口服制剂、注射制剂等，也可以为液体制剂、冻干粉制剂、片剂、颗粒剂等，本申请对此不做限制。

预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的产品包括预防动脉粥样硬化性心血管疾病的产品、治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的产品、预防及治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的产品。其中，动脉粥样硬化性心血管疾病包括冠心病、动脉粥样硬化性的脑卒中、短暂性脑缺血发作、外周动脉血管疾病、急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、腹主动脉瘤、动脉粥样硬化性肾动脉狭窄、颈动脉病等，以及其中任意一种或几种的形成过程的关联疾病或并发症、后遗症等，或与动脉粥样硬化性心血管疾病具有一定相关性的其他疾病。产品是具有相关预防和/或治疗作用的药物、制剂、试剂盒和/或仪器等，药物可以是药物化合物、药物组合物、药物配方等，制剂可以是液体制剂、冻干粉制剂，也可以是口服制剂、注射制剂等，本申请对此不做限制。

具体地，其他预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物可以是诸如阿司匹林、他汀类药物等对动脉粥样硬化性心血管疾病具有预防和/或治疗作用的药物，可以为药物化合物、药物组合物等，也可以为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等各种剂型的药物，本申请对此不做限制。

具体地，血管生成素样蛋白8抑制剂是特异性结合血管生成素样蛋白8抗体或其抗原结合片段。血管生成素样蛋白8可以通过口服、静脉、肌肉注射或皮下内施用于患者。

进一步地，所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括在体内或体外与血管生成素样蛋白8结合或相互作用、以抑制血管生成素样蛋白8生物学功能的制剂。

进一步地，所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括血管生成素样蛋白8抗体、小分子血管生成素样蛋白8拮抗剂、基于核酸的血管生成素样蛋白8表达或活性抑制剂、基于肽的与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的分子、与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的受体分子、包含低密度脂蛋白受体的配体结合部分的蛋白质、结合血管生成素样蛋白8的支架分子、基于纤连蛋白的支架构建体、其他基于天然存在性重复序列蛋白的支架分子和抗血管生成素样蛋白8适配体中的任意一种或几种的组合。

具体地，所述基于核酸的血管生成素样蛋白8表达或活性抑制剂包括小干扰RNA(siRNA)、反义RNA等，基于肽的与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的分子包括肽体(peptibody)等，结合血管生成素样蛋白8的支架分子包括锚蛋白重复蛋白(DARPin)、HEAT重复序列蛋白，ARM重复序列蛋白、三角形四肽重复序列蛋白(tetratricopeptiderepeatproteins)等。

本实施例还提供一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品中的应用。

具体地，抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品是抑制动脉粥样硬化性心血管疾病的发生或发展的药物、制剂、试剂盒和/或仪器等。

本实施例还提供一种抑制血管生成素样蛋白8表达的物质在制备抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品中的应用。

具体地，抑制血管生成素样蛋白8表达的物质为具有抑制血管生成素样蛋白8表达作用的抗体、病毒、化合物、组合物、制剂、试剂盒和/或仪器等物质。

本实施例还提供一种敲低或敲除血管生成素样蛋白8表达基因的物质在制备抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品中的应用。

具体地，敲低血管生成素样蛋白8和敲除血管生成素样蛋白8均为抑制血管生成素样蛋白8的方式，敲低或敲除血管生成素样蛋白8表达基因的物质为具有敲低或敲除血管生成素样蛋白8表达基因作用的抗体、病毒、化合物、组合物、制剂、试剂盒和/或仪器等物质。

本实施例还提供一种预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，包括通过抑制血管生成素样蛋白8预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病。

下面结合具体的实验对本实施例进行进一步说明。

一、血管生成素样蛋白8在小鼠动脉粥样硬化形成中被激活

分别设置对照组和处理组。其中，对照组设置8周龄C57BL/6J小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)10只，由于敲除血管载脂蛋白E的小鼠是动脉粥样硬化研究的公认且是最常见的动物模型，故处理组设置8周龄敲除载脂蛋白E的小鼠40只。

将上述处理组中的40只小鼠平均分为四份，每份10只。对其中一份的10只敲除载脂蛋白E的小鼠不做任何附加处理，并作为第一子处理组；对其中一份的10只敲除载脂蛋白E的小鼠采用西方饮食喂养四周，得到12周龄的10只敲除载脂蛋白E的小鼠，并将其作为第二子处理组；对其中一份的10只敲除载脂蛋白E的小鼠采用西方饮食喂养8周，得到16周龄的10只敲除载脂蛋白E的小鼠，并将其作为第三子处理组；对其中一份的10只敲除载脂蛋白E的小鼠采用西方饮食喂养12周，得到20周龄的10只敲除载脂蛋白E的小鼠，并将其作为第四子处理组。

对各组的小鼠腹腔注射1％戊巴比妥(60mg/kg)进行麻醉处理，待麻醉后，皮肤消毒开腹，迅速打开小鼠胸腔，心尖取血，生理盐水灌流后迅速取出肝脏组织，放入液氮中速冻；充分打开小鼠胸腹腔，剥离多余组织，充分暴露主动脉血管，在体式显微镜下充分分离血管周围组织后，将血管放入液氮中速冻，随后将肝脏组织与血管组织放入-80℃冰箱中待用。

提取小鼠的肝脏、血管组织总蛋白，BCA方法测量浓度(试剂盒购自美国Thermo公司)。即配置BCA工作液，将A液和B液摇晃混匀，按照A:B＝50：1的比例配置BCA工作液，充分混匀。配置不同浓度的标准蛋白液(BSA)，1ug/ul，2.5ug/ul，5ug/ul，7.5ug/ul。采用包含待测蛋白样品的溶液稀释标准蛋白液。取空白组(Oug/ulBSA)各浓度的标准蛋白液20ul加入96孔板中，另取待测的蛋白样品20ul，加入96孔板。向各孔的蛋白液中加入200ul的BCA工作液，混匀，37℃放置30分钟，静置结束后，冷却至室温，用酶标仪测定562nm出的吸光度，并制作标准曲线。根据待测样品的吸光度，比对标准曲线，计算蛋白的浓度。

采用Western Blot技术分别检测小鼠的肝脏组织和血管组织中血管生成素样蛋白8的表达水平，其中，Western Blot技术的检测步骤包括：清洗玻璃板；配胶；电泳；转膜；封闭；一抗孵育，其中一抗为血管生成素样蛋白8(购自美国Abcam公司)；孵育二抗(购自美国Abcam公司)；显影，详细内容可参见上述“Western免疫印迹”名词解释部分，并通过ChemiDoc^TMTouch成像系统(Bio-Rad)成像得到图1和图2。

如图1所示，图1-A是对照组、第一子处理组、第二子处理组、第三子处理组以及第四子处理组小鼠的肝脏组织中血管生成素样蛋白8的western-blot图，其中，β-actin为肌动蛋白即内部参照，黑色面积表示每组中血管生成素样蛋白8和β-actin的含量，黑色面积越大，则小鼠的肝脏组织中血管生成素样蛋白8及β-actin的含量越多，道尔顿(KD)为原子质量单位。图1-B为对照组、第一子处理组、第二子处理组、第三子处理组以及第四子处理组小鼠的肝脏组织中血管生成素样蛋白8含量的柱形图，其中，横轴表示组别，纵轴表示血管生成素样蛋白8以β-actin作为参照进行校正得到的含量水平，柱形顶端的横线表示小鼠肝脏组织中血管生成素样蛋白8含量水平的标准差，星号表示有统计学意义。

从图1-A和图1-B中可以看出，对照组小鼠的肝脏组织中血管生成素样蛋白8的含量水平明显低于处理组小鼠的肝脏组织中血管生成素样蛋白8的含量水平，处理组的四个子处理组中，第四子处理组小鼠肝脏组织中血管生成素样蛋白8的含量水平最高，其次为第三子处理组，再次为第二子处理组，第一子处理组小鼠肝脏组织中血管生成素样蛋白8的含量水平最低。所以，对于敲除载脂蛋白E的小鼠，其肝脏组织中血管生成素样蛋白8的含量及表达随着周龄的增加而增加。

如图2所示，图2-A是对照组、第一子处理组、第二子处理组、第三子处理组以及第四子处理组小鼠的血管组织中血管生成素样蛋白8的western-blot图，其中，β-actin为肌动蛋白即内部参照，黑色面积表示每组中血管生成素样蛋白8和β-actin的含量，黑色面积越大，则小鼠的血管组织中血管生成素样蛋白8及β-actin的含量越多，KD为原子质量单位。图2-B为对照组、第一子处理组、第二子处理组、第三子处理组以及第四子处理组小鼠的血管组织中血管生成素样蛋白8含量的柱形图，其中，横轴表示组别，纵轴表示血管生成素样蛋白8以β-actin作为参照进行校正得到的含量水平，柱形顶端的横线表示小鼠肝脏组织中血管生成素样蛋白8含量水平的标准差，星号表示有统计学意义。

从图2-A和图2-B中可以看出，对照组小鼠的血管组织中血管生成素样蛋白8的含量水平明显低于处理组小鼠的血管组织中血管生成素样蛋白8的含量水平，处理组的四个子处理组中，第四子处理组小鼠血管组织中血管生成素样蛋白8的含量水平最高，其次为第三子处理组，再次为第二子处理组，第一子处理组小鼠血管组织中血管生成素样蛋白8的含量水平最低。所以，对于敲除载脂蛋白E的小鼠，其血管组织中血管生成素样蛋白8的含量及表达随着小鼠周龄的增加而增加。

对各组小鼠进行麻醉处理后，使用肝素盐水对小鼠进行血管灌注，去除小鼠血管中的残留血液。将小鼠心脏和主动脉近端组织置于4％多聚甲醛中在4℃的环境下过夜，然后在4℃的环境下转移至30％蔗糖溶液中过夜，在上述的蔗糖溶液中取出血管组织，吸干水分，用OCT包埋，冰冻切片。收集每组小鼠从心室中部到主动脉弓的连续7μm厚的冰冻切片若干片，在-20℃的环境下保存。

对小鼠进行免疫共定位染色，即取出上述切片，室温晾10min后，采用4％多聚甲醛固定30min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3遍，每遍清洗5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS清洗3遍，每遍清洗5min，血清封闭30min，吸干血清后一抗4℃过夜(血管生成素样蛋白8一抗与MAC-2一抗1：1混匀，PBS1：200稀释，血管生成素样蛋白8与MAC-2一抗均购自美国Abcam公司)。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DIPA封片，4℃保存1h后，通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图3。

如图3所示，图3-A为小鼠动脉粥样硬化斑块的血管生成素样蛋白8的染色图，其中绿色点状部分表示血管生成素样蛋白8，图3-B为小鼠动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞标志蛋白Mac-2的染色图，其中红色点状部分表示巨噬细胞的标志蛋白Mac-2，图3-C为巨噬细胞的细胞核染色图，其中，蓝色点状部分表示巨噬细胞的细胞核，图3-D为血管生成素样蛋白8、巨噬细胞的标志蛋白Mac-2以及巨噬细胞细胞核的共定位染色图，由于红色与绿色以及蓝色的叠加得到黄色，故黄色点状部分表示血管生成素样蛋白8与巨噬细胞的标志蛋白Mac-2的重叠部分。可以看出，在小鼠的动脉粥样硬化斑块中，血管生成素样蛋白8与巨噬细胞在相同位置均有表达，血管生成素样蛋白8与巨噬细胞共定位。

二、血管生成素样蛋白8在人动脉粥样硬化的形成中被激活

在某医院分别收集进行心脏移植手术的患者在手术中剥脱的正常血管组织以及进行劲动脉斑块剥脱术患者的人颈动脉斑块组织，将人颈动脉斑块组织和正常血管组织置于4％多聚甲醛中在4℃的环境下过夜，然后在4℃的环境下转移至30％蔗糖溶液中过夜，在上述的蔗糖溶液中取出人颈动脉斑块组织和正常血管组织，吸干水分，用OCT包埋，冰冻切片，在-20℃的环境下保存。

对人颈动脉斑块组织以及正常血管组织中的血管生成素样蛋白8进行免疫组织化学染色，观察血管生成素样蛋白8的活性水平，即取出人颈动脉斑块组织切片和正常血管组织切片，室温晾10min后，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍，每遍5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS洗3遍，每遍5min，血清封闭30min，吸干血清后，一抗(血管生成素样蛋白8,购自Abcam)4℃过夜。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DAB显色液染色后(棕色为染色阳性)，苏木素复染30s-1min左右，水洗后用1％的盐酸酒精分化，再用自来水水洗返蓝。将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明，每个试剂中放置2min，最后在通风橱中风干切片后中性树胶封片。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图4。

如图4所示，图4-A为正常血管组织中的血管生成素样蛋白8活性水平示意图，图4-B为人颈动脉斑块组织中的血管生成素样蛋白8活性水平示意图，图4-C为正常血管组织与人颈动脉斑块组织血管生成素样蛋白8活性对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示染色面积(％)。可以看出，人颈动脉斑块组织中的染色面积明显大于正常血管组织中的染色面积，所以，人颈动脉斑块组织中血管生成素样蛋白8的表达明显大于人体正常血管组织中的血管生成素样蛋白8的表达。

对人颈动脉斑块组织进行共定位染色，即取出上述切片，室温晾10min后，采用4％多聚甲醛固定30min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3遍，每遍清洗5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS清洗3遍，每遍清洗5min，血清封闭30min，吸干血清后一抗4℃过夜(血管生成素样蛋白8一抗与MAC-2一抗1：1混匀，PBS1：200稀释，血管生成素样蛋白8与MAC-2一抗均购自美国Abcam公司)。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DIPA封片，4℃保存1h后，通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图5。

如图5所示，图5-A是人颈动脉斑块组织中血管生成素样蛋白8的染色图，其中，绿色点状部分表示血管生成素样蛋白8，图5-B是人颈动脉斑块组织中巨噬细胞标志蛋白Mac-2的染色图，其中，红色点状部分表示巨噬细胞的标志蛋白Mac-2，图5-C是人颈动脉斑块组织中巨噬细胞细胞核的染色图，其中，蓝色点状部分表示细胞核，图5-D为人颈动脉斑块组织中的血管生成素样蛋白8、巨噬细胞标志蛋白Mac-2以及巨噬细胞细胞核的共定位染色图，由于红色与绿色、蓝色叠加得到黄色，故该图中的黄色点状部分表示人颈动脉斑块组织中血管生成素样蛋白8与巨噬细胞的标志蛋白Mac-2的重叠部分。可以看出，在人颈动脉斑块组织中，血管生成素样蛋白8与巨噬细胞在相同位置处均有表达，血管生成素样蛋白8与巨噬细胞共定位。

三、血管生成素样蛋白8对动脉粥样硬化的发生、发展产生的影响

在载脂蛋白E敲除鼠的基础上，分别设置载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8抑制组，且每组小鼠数量相同。其中，载脂蛋白E对照组的小鼠通过尾静脉注射阴性对照9型腺相关病毒(AAV-9，购自上海吉凯基因)，注射剂量为2E+10，并采用西方饮食喂养12周；血管生成素样蛋白8过表达组的小鼠尾静脉注射血管生成素样蛋白8过表达9型腺相关病毒(AAV-9，购自上海吉凯基因)，注射剂量为2E+10，并采用西方饮食喂养12周；血管生成素样蛋白8抑制组小鼠尾静脉注射靶向抑制血管生成素样蛋白8的Sh-RNA序列的血清型9型腺相关病毒(AAV-9，购自上海吉凯基因)，注射剂量为2E+10，并采用西方饮食喂养12周。

提取小鼠的肝脏、血管组织总蛋白，BCA方法测量浓度。即配置BCA工作液，将A液和B液摇晃混匀，按照A:B＝50：1的比例配置BCA工作液，充分混匀。配置不同浓度的标准蛋白液(BSA)，1ug/ul，2.5ug/ul，5ug/ul，7.5ug/ul。采用包含待测蛋白样品的溶液稀释标准蛋白液。取空白组(Oug/ulBSA)各浓度的标准蛋白液20ul加入96孔板中，另取待测的蛋白样品20ul，加入96孔板。向各孔的蛋白液中加入200ul的BCA工作液，混匀，37℃放置30分钟，静置结束后，冷却至室温，用酶标仪测定562nm出的吸光度，并制作标准曲线。根据待测样品的吸光度，比对标准曲线，计算蛋白的浓度。

采用Western Blot技术分别检测每一组小鼠的肝脏组织和血管组织中血管生成素样蛋白8的表达水平，其中，Western Blot技术的检测步骤包括：清洗玻璃板；配胶；电泳；转膜；封闭；一抗孵育，其中，一抗为血管生成素样蛋白8(购自美国Abcam公司)；孵育二抗(购自美国Abcam公司)；显影，详细内容可参见上述“Western免疫印迹”名词解释部分。并通过ChemiDocTMTouch成像系统(Bio-Rad)成像得到图6和图7。

如图6所示，图6-A是载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8抑制组小鼠肝脏组织中血管生成素样蛋白8的western-blot图，其中，β-actin为肌动蛋白即内部参照，黑色面积表示每组中血管生成素样蛋白8和β-actin的含量，黑色面积越大，则小鼠的肝脏组织中血管生成素样蛋白8及β-actin的含量越多，KD为原子质量单位。图6-B为载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8抑制组小鼠的肝脏组织中血管生成素样蛋白8含量的柱形图，其中，横轴表示组别，纵轴表示血管生成素样蛋白8以β-actin作为参照进行校正得到的含量水平，柱形顶端的横线表示小鼠肝脏组织中血管生成素样蛋白8含量水平的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图6-A和图6-B中可以看出，血管生成素样蛋白8抑制组小鼠肝脏组织中血管生成素样蛋白8的含量最低，其次是载脂蛋白E对照组，血管生成素样蛋白8过表达组小鼠肝脏组织中血管生成素样蛋白8的含量最高。

如图7所示，图7-A是载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8抑制组小鼠血管组织中血管生成素样蛋白8的western-blot图，其中，β-actin为肌动蛋白即内部参照，黑色面积表示每组中血管生成素样蛋白8和β-actin的含量，黑色面积越大，则小鼠的血管组织中血管生成素样蛋白8及β-actin的含量越多，KD为原子质量单位。图6-B为载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8抑制组小鼠的血管组织中血管生成素样蛋白8含量的柱形图，其中，横轴表示组别，纵轴表示血管生成素样蛋白8以β-actin作为参照进行校正得到的含量水平，柱形顶端的横线表示小鼠血管组织中血管生成素样蛋白8含量水平的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图7-A和图7-B中可以看出，血管生成素样蛋白8抑制组小鼠血管组织中血管生成素样蛋白8的含量最低，其次是载脂蛋白E对照组，血管生成素样蛋白8过表达组小鼠血管组织中血管生成素样蛋白8的含量最高。

分别对载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8敲除组小鼠的血管组织进行油红O染色(油红O试剂购自Sigma-Aldrich，MO,USA)，其中，油红O染色的具体步骤包括：(1)取出小鼠主动脉弓至腹主动脉肾动脉分支处，剔除主动脉外的组织，并纵向剪开主动脉，多聚甲醛4℃过夜；(2)配制油红O储备液：100％异丙醇100mL+0.5g油红O干粉，充分溶解，过滤，得到油红O储备液并于4℃避光保存；(3)配制油红O工作液：实验前，将储备液与蒸馏水按3:2稀释，充分过滤后，得到酒红色且无沉淀的油红O工作液；(4)将小鼠的主动脉组织采用60％异丙醇浸洗2min；(5)将小鼠的主动脉组织放入油红O工作液中染色10min；(6)采用60％异丙醇调色，直至看到正常组织变成乳白色但是斑块仍为红色为止。采用索尼SONY DXC-970MD相机采集图像，得到图8。

如图8所示，图8-A为载脂蛋白E对照组小鼠主动脉血管油红O染色图，图8-B为血管生成素样蛋白8过表达组小鼠主动脉血管油红O染色图，图8-C为血管生成素样蛋白8抑制组小鼠主动脉血管油红O染色图，其中，红色点块状部分均表示小鼠血管组织上的动脉粥样硬化斑块，图8-D为上述三组小鼠血管组织动脉粥样硬化斑块面积柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示染色面积即小鼠血管组织动脉粥样硬化斑块面积(％)，柱形上方的横线表示小鼠血管组织动脉粥样硬化斑块面积的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图8中可以看出，血管生成素样蛋白8抑制组的小鼠血管组织动脉粥样硬化斑块面积最小，其次是载脂蛋白E组，血管生成素样蛋白8过表达组的小鼠血管组织动脉粥样硬化斑块面积最大，所以，血管生成素样蛋白8的过表达可以增加小鼠血管组织动脉粥样硬化斑块的面积，从而推动动脉粥样硬化的发生和发展，而抑制血管生成素样蛋白8则可以减少小鼠血管组织动脉粥样硬化斑块的面积，从而抑制动脉粥样硬化的发生和发展。

对小鼠进行麻醉处理后，使用肝素盐水对小鼠进行血管灌注，去除小鼠血管中的残留血液。将小鼠心脏和主动脉近端组织置于4％多聚甲醛中在4℃的环境下过夜，然后在4℃的环境下转移至30％蔗糖溶液中过夜，在上述的蔗糖溶液中取出血管组织，吸干水分，用OCT包埋，冰冻切片。收集每组小鼠从心室中部到主动脉弓的连续7μm厚血管组织的冰冻切片若干片，在-20℃的环境下保存。

分别对载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8抑制组小鼠的主动脉窦切片进行油红O染色(油红O试剂购自Sigma-Aldrich，MO,USA)，其中，油红O染色的具体步骤包括：(1)取出各组小鼠的主动脉窦切片，室温下晾5min后，采用4％多聚甲醛将上述切片固定30min；(2)配制油红O储备液：100％异丙醇100mL+0.5g油红O干粉，充分溶解，过滤，制得油红O储备液并于4℃避光保存；(3)配制油红O工作液：实验前，将储备液与蒸馏水按3:2稀释，充分过滤后，得到酒红色且无沉淀的油红O工作液；(4)60％异丙醇浸洗2min；(5)采用油红O工作液对各组小鼠的主动脉窦切片染色10min；(6)采用60％异丙醇调色，直至看到正常组织变成乳白色但是斑块仍为红色为止；(7)苏木素复染核，自来水返蓝，甘油明胶封片。染色后，脂肪滴呈红色，细胞核呈蓝色。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图9。

如图9所示，图9-A是载脂蛋白E对照组小鼠主动脉窦的动脉粥样硬化斑块的染色图，图9-B为血管生成素样蛋白8过表达组小鼠主动脉窦的动脉粥样硬化斑块的染色图，图9-C为血管生成素样蛋白8抑制组小鼠主动脉窦的动脉粥样硬化斑块的染色图，其中，红色部分均表示动脉粥样硬化斑块，图9-D为上述三组小鼠主动脉根部的动脉粥样硬化斑块面积柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示染色面积即小鼠主动脉根部的动脉粥样硬化斑块面积(％)，柱形上方的横线表示小鼠主动脉根部的动脉粥样硬化斑块面积的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图9中可以看出，血管生成素样蛋白8抑制组的小鼠主动脉窦动脉粥样硬化斑块面积最小，其次是载脂蛋白E组，血管生成素样蛋白8过表达组的小鼠主动脉窦动脉粥样硬化斑块面积最大，所以，血管生成素样蛋白8的过表达可以增加小鼠主动脉窦动脉粥样硬化斑块的面积，推动动脉粥样硬化的发生和发展，而抑制血管生成素样蛋白8则可以减少小鼠主动脉窦动脉粥样硬化斑块的面积，从而抑制动脉粥样硬化的发生和发展。

对载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8抑制组小鼠的动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的标志蛋白Mac-2进行免疫组织化学染色，即取出每组小鼠的血管组织切片，室温晾10min后，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍，每遍5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS洗3遍，每遍5min，血清封闭30min，吸干血清后，一抗(Mac-2,购自Abcam)

4℃过夜。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DAB显色液染色后(棕色为阳性)，苏木素复染30s-1min左右，水洗后用1％的盐酸酒精分化，再用自来水水洗返蓝。将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明，每个试剂中放置2min，最后在通风橱中风干切片后中性树胶封片。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图10。

如图10所示，图10-A为血管生成素样蛋白8抑制组的小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的标志蛋白Mac-2染色图，图10-B为载脂蛋白E对照组的小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的标志蛋白Mac-2染色图，图10-C为血管生成素样蛋白8过表达组的小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的标志蛋白Mac-2染色图，图10-D为上述三组小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的标志蛋白Mac-2的面积柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示染色面积(％)，且染色面积的大小即代表巨噬细胞数量的多少，染色面积大则巨噬细胞数量多，染色面积小则巨噬细胞数量少，柱形上方的横线表示小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的标志蛋白Mac-2面积的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图10中可以看出，血管生成素样蛋白8过表达组小鼠动脉粥样硬化斑块中染色面积最大，即巨噬细胞的数量最多，其次为载脂蛋白E对照组，血管生成素样蛋白8抑制组小鼠动脉粥样硬化斑块中染色面积最小，即巨噬细胞的数量最少。所以，血管生成素样蛋白8的过表达会导致小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞明显增加，而血管生成素样蛋白8的抑制会导致小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞明显减少，即抑制血管生成素样蛋白8可以有效抑制巨噬细胞的增加。

分别对载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8抑制组小鼠的动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的标志蛋白抗α-肌动蛋白(SMA)进行免疫组织化学染色，即取出每组小鼠的血管组织切片，室温晾10min后，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍，每遍5min，内源性过氧化物酶抑制剂孵育20min，PBS洗3遍，每遍5min，血清封闭30min，吸干血清后，一抗(SMA，购自ZSGB-BIO,Beijing,China)4℃过夜。第二天，室温晾30min后，对应的二抗孵育一小时后，DAB显色液染色后，苏木素复染30s-1min左右，水洗后用1％的盐酸酒精分化，再用自来水水洗返蓝。将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明，每个试剂中放置2min，最后在通风橱中风干切片后中性树胶封片。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图11。

如图11所示，图11-A为血管生成素样蛋白8抑制组的小鼠动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的标志蛋白抗α-肌动蛋白染色图，图11-B为载脂蛋白E对照组的小鼠动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的标志蛋白抗α-肌动蛋白染色图，图11-C为血管生成素样蛋白8过表达组的小鼠动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的标志蛋白抗α-肌动蛋白染色图，图11-D为上述三组小鼠动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的标志蛋白抗α-肌动蛋白的面积柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示染色面积(％)，且染色面积的大小即代表平滑肌细胞数量的多少，染色面积大则平滑肌细胞数量多，染色面积小则平滑肌细胞数量少，柱形上方的横线表示小鼠动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞的标志蛋白抗α-肌动蛋白面积的标准差。

从图11中可以看出，三组小鼠动脉粥样硬化斑块中染色的面积没有明显变化，即平滑肌细胞的数量并无明显变化，所以，血管生成素样蛋白8的过表达或抑制对小鼠动脉粥样硬化斑块中的平滑肌细胞并无明显影响。

分别对载脂蛋白E对照组、血管生成素样蛋白8过表达组以及血管生成素样蛋白8抑制组小鼠的动脉粥样硬化斑块进行胶原纤维染色，其中，胶原纤维染色使用的试剂盒，购自Sigma公司，胶原纤维染色的具体步骤包括：(1)取出每组小鼠的血管组织切片，室温晾10min后，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍，每遍5min(2)1％高锰酸钾氧化切片5min；(3)水洗，草酸漂白1min；(4)水洗，蒸馏水洗，天青石蓝染5min水洗；(5)摔去余液不用水洗，滴染Mayer氏苏木素3-5min；(6)流水冲洗5-10min；(7)丽春红苦味酸饱和液染5min；(8)1％醋酸水溶液洗；(9)1％磷钼酸分化切片约5min；(10)蒸馏水洗；(11)1％淡绿或者甲苯胺蓝滴染30s；(12)1％醋酸水溶液洗切片；(13)95％酒精分化，无水酒精脱水；(14)二甲苯透明，中性树胶封固。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图12。

如图12所示，图12-A为血管生成素样蛋白8抑制组小鼠动脉粥样硬化斑块的胶原纤维染色图，图12-B为载脂蛋白E对照组小鼠动脉粥样硬化斑块的胶原纤维染色图，图12-C为血管生成素样蛋白8过表达组小鼠动脉粥样硬化斑块的胶原纤维染色图，图12-A、图12-B及图12-C中的蓝色部分表示胶原纤维，红色部分表示肌纤维，图12-D为上述三组小鼠动脉粥样硬化斑块的胶原沉积面积柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示染色面积即小鼠动脉粥样硬化斑块的胶原沉积面积(％)，柱形上方的横线表示小鼠动脉粥样硬化斑块的胶原沉积面积的标准差。

从图12中可以看出，三组小鼠动脉粥样硬化斑块中胶原沉积面积无明显变化，所以，血管生成素样蛋白8的过表达或抑制对小鼠动脉粥样硬化斑块中的胶原沉积无明显影响。

四、血管生成素样蛋白8对巨噬细胞脂质沉积的影响

采用血管生成素样蛋白8过表达慢病毒(购自上海吉凯基因)转染RAW267.4巨噬细胞，构建血管生成素样蛋白8稳定过表达巨噬细胞系，并通过50ug/ml氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)分别刺激血管生成素样蛋白8过表达巨噬细胞与正常巨噬细胞24小时后，采用油红O染色并观察细胞内脂质沉积情况，其中，巨噬细胞购自Shanghai Xinyu biotech co.,Ltd.，油红O试剂购自Sigma-Aldrich，MO,USA，油红O染色的具体步骤包括：(1)在六孔板中放置盖玻片，将巨噬细胞接种到盖玻片上；(2)采用50ug/ml氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)(购自北京协和生物)分别刺激血管生成素样蛋白8过表达巨噬细胞与正常巨噬细胞24小时；(3)将上述血管生成素样蛋白8过表达巨噬细胞与正常巨噬细胞吸出培养基，PBS洗3次；(4)采用4％多聚甲醛37℃将上述血管生成素样蛋白8过表达巨噬细胞与正常巨噬细胞固定20min；(5)配制油红O储备液：100％异丙醇100mL+0.5g油红O干粉，充分溶解，过滤，制得油红O储备液并于4℃避光保存；(6)配制油红O工作液：实验前，将上述储备液与蒸馏水按3:2稀释，充分过滤后，得到酒红色且无沉淀的油红O工作液；(7)采用油红O工作液分别对上述血管生成素样蛋白8过表达巨噬细胞与正常巨噬细胞染色10min；(8)采用60％异丙醇调色，直至看到正常细胞变成乳白色但是细胞内脂质仍为红色为止；(9)DIPA封片。通过直立显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)观察并采集图像，得到图13。

如图13所示，图13-A是正常巨噬细胞通过氧化型低密度脂蛋白刺激后的细胞内脂质沉积情况染色图，图13-B是血管生成素样蛋白8过表达巨噬细胞通过氧化型低密度脂蛋白刺激后的细胞内脂质沉积情况染色图，可以看出，血管生成素样蛋白8过表达巨噬细胞中的脂质沉积明显多于正常巨噬细胞中的脂质沉积。所以，抑制血管生成素样蛋白8可以有效抑制巨噬细胞中的脂质沉积，且通过抑制巨噬细胞中脂质的沉积可以抑制巨噬细胞到泡沫细胞的转化，进而抑制动脉粥样硬化斑块的形成与进一步发展。

综上所述，在动脉粥样硬化斑块组织中，血管生成素样蛋白8的表达明显高于正常血管组织，且血管生成素样蛋白8与动脉粥样硬化斑块组织中的巨噬细胞共定位，抑制血管生成素样蛋白8可以有效抑制巨噬细胞的增加以及巨噬细胞内脂质的沉积，从而可以有效抑制泡沫细胞的形成，减轻动脉粥样硬化斑块，抑制动脉粥样硬化性心血管疾病的发生和发展，所以，将抑制血管生成素样蛋白8含量的物质应用于预防和/或治疗预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中，治疗效果好，且与预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物联合使用可以进一步地提升对于动脉粥样硬化性心血管疾病的预防和/或治疗作用，应用前景广，适用范围大，适于广泛推广应用。

在本文中，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等仅用于表示相关部分之间的相对位置关系，而非限定这些相关部分的绝对位置。

在本文中，“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分，而非表示重要程度及顺序、以及互为存在的前提等。

在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。

除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。

上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本申请并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请构思的前提下做出各种变化。

Claims

1.一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制血管生成素样蛋白8的物质在预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述抑制血管生成素样蛋白8的物质通过抑制泡沫细胞的形成预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述抑制血管生成素样蛋白8的物质与其他预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物在所述产品中联合使用。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其中所述抑制血管生成素样蛋白8的物质包括血管生成素样蛋白8抑制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括在体内或体外与血管生成素样蛋白8结合或相互作用，以抑制血管生成素样蛋白8生物学功能的制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述血管生成素样蛋白8抑制剂包括血管生成素样蛋白8抗体、小分子血管生成素样蛋白8拮抗剂、基于核酸的血管生成素样蛋白8表达或活性抑制剂、基于肽的与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的分子、与血管生成素样蛋白8特异性相互作用的受体分子、包含低密度脂蛋白受体的配体结合部分的蛋白质、结合血管生成素样蛋白8的支架分子、基于纤连蛋白的支架构建体、其他基于天然存在性重复序列蛋白的支架分子和抗血管生成素样蛋白8适配体中的任意一种或几种的组合。

7.一种抑制血管生成素样蛋白8的物质在制备抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品中的应用。

8.一种抑制血管生成素样蛋白8表达的物质在制备抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品中的应用。

9.一种敲低或敲除血管生成素样蛋白8表达基因的物质在制备抑制动脉粥样硬化性心血管疾病形成的产品中的应用。