CN107699616B - Fibulin-3作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用 - Google Patents

Fibulin-3作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Fibulin‑3作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用，所述的药物是在基因水平和/或蛋白水平以Fibulin‑3作为药物靶点。Fibulin‑3与银屑病的发展呈正相关，采用适当浓度的Fibulin‑3抗体治疗咪喹莫特所诱导的银屑病鼠模型，能够改善红斑、鳞屑和皮损厚度，并且可通过减少血管内皮细胞表达VEGF，减少血管内皮细胞增殖和迁移来达到抑制银屑病发展以及促进皮损恢复的作用；Fibulin‑3抗体相比其它治疗银屑病药物，干预靶点更加明确，即针对银屑病发病初期真皮浅层血管迂曲抗张，血管增殖等病理改变。

Description

Fibulin-3作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及Fibulin-3在制备防治银屑病中的应用。
背景技术
银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，发病率高，病程长，以青壮年为主要发病对象，临床表现以红斑鳞屑为主，易反复发作。该病影响了全世界1～3％左右的人口，近年来随着气候、环境、饮食等变化，发病率仍在不断上升。除了经济上的负担，病情严重的患者更造成了社会劳动力的丧失，因此银屑病对患者的身心健康、日常生活都产生了极大的负面影响。银屑病主要病理改变为表皮角质形成细胞过度增殖，异常分化，真表皮炎性细胞浸润，真皮浅层血管迂曲增生。由于银屑病病因未明确，发病机理复杂，目前银屑病的治疗仅能缓解临床症状，达到短期治疗效果。针对表皮增殖，分化不良，临床常采用维A酸类、抗肿瘤等药物调节表皮细胞过度增殖与分化，调节免疫功能，糖皮质激素类药物可以促使真皮血管收缩，达到抗炎等治疗效果。这些药物虽对缓解临床症状有一定疗效，但多数药物的毒性作用可对人体造成明显且严重的伤害。目前临床缺乏针对银屑病中血管增生这一病理特征的药物。
Fibulin家族成员广泛分布于全身的各种组织，对细胞外基质的构成和稳定起着重要作用。B.Lecka-Czernik等，最早发现在Werner综合征以及衰老的和休眠的人成纤维细胞中有种表达增高的蛋白，可以调节DNA的合成。后来人们发现，这种蛋白属于fibulin家族的成员，即fibulin-3，编码fibuin-3的基因是EFEMP1。已有研究证明，EFEMP1基因由于R345W的突变而激活非折叠蛋白信号通路，从而促使VEGF表达增高，引起视网膜上脉络膜大量新生血管生成，最终导致黄斑变性。在体外，Fibulin-3的表达拮抗血管增生。有研究发现在内皮细胞，fibulin家族蛋白能够减少由bFGF所引起的血管新生，抑制基质金属蛋白酶的表达和活性，促进金属蛋白酶组织抑制剂的表达。近年来已有多数有关Fibulin-3在肿瘤发生发展中的生物学研究，据报道，EFEMP1基因启动子的甲基化可以使Fibulin-3表达降低，从而使肿瘤组织中血管增生，肿瘤预后不良。这种Fibulin-3表达的减少或者EFEMP1基因启动子的甲基化可以发生在如肺、肝、乳房、前列腺及鼻咽部等许多部位的肿瘤组织中。但也有研究发现，Fibulin-3的高表达在体外促进了组织中VEGF的表达，间接促使血管增生从而促进胰腺癌肿瘤组织的生长。这种差异可能与肿瘤组织来源不同有关，据统计，Fibulin-3高表达于37％的肿瘤，低表达于10％的肿瘤。
发明内容
本发明解决的问题在于提供Fibulin-3作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用，以Fibulin-3作为干预靶点对防治银屑病作用更加明确，而且安全性良好。
本发明是通过以下技术方案来实现：
Fibulin-3作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用。
所述的药物是在基因水平和/或蛋白水平以Fibulin-3作为药物靶点。
所述的药物是针对Fibulin-3的抗体。
所述的药物是阻碍Fibulin-3表达或转录的DNA或RNA。
所述的药物是阻碍或抑制Fibulin-3所导致的VEGF增加的药物。
针对Fibulin-3的抗体在制备防治银屑病的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提示Fibulin-3与银屑病的发展呈正相关，采用适当浓度的Fibulin-3抗体治疗咪喹莫特所诱导的银屑病鼠模型，能够改善皮损的红斑、鳞屑和皮损厚度，并且通过减少VEGF的表达来阻止银屑病的进展以及促进皮损愈合，因此提出制备防治银屑病的药物时新的药物作用靶点-Fibulin-3。
Fibulin-3抗体相比其它治疗银屑病药物，早期即通过调节VEGF的表达而对银屑病产生干预作用，且干预靶点更加明确。
Fibulin-3抗体安全性良好，Fibulin-3抗体特异性结合Fibulin-3，可以来源于鼠的单克隆抗体，以及其辅料PBS都对身体无毒副作用，具有良好的安全性。
附图说明
图1为不同给药方式以及不同浓度的Fibulin-3抗体外用治疗咪喹莫特小鼠的临床照片，其中三组阴性对照分别为PBS，同型对照IgG，0.1％叠氮钠，治疗组Fibulin-3抗体剂量分别为2.5，5，10ng/ml。
图2为两种不同给药方式下Fibulin-3抗体治疗咪喹莫特小鼠皮损和对照组小鼠皮损中VEGFmRNA的表达水平，其中三组阴性对照分别为PBS，同型对照IgG，0.1％叠氮钠，治疗组Fibulin-3抗体剂量分别为2.5，5，10ng/ml。
图3为两种不同给药方式下Fibulin-3抗体治疗咪喹莫特小鼠皮损和对照组小鼠皮损中VEGF蛋白的表达水平，其中三组阴性对照分别为PBS，同型对照IgG，0.1％叠氮钠，治疗组Fibulin-3抗体剂量分别为2.5，5，10ng/ml。
图4为人体正常皮肤组织和银屑病皮损组织中Fibulin-3的免疫组化及半定量对比图。
图5为人体正常皮肤组织和银屑病皮损组织中Fibulin-3的蛋白表达水平。
图6为用不同浓度的LL-37刺激HEK-a细胞，孵育24小时后，分别提取细胞总RNA和总蛋白，并分别采用real-timePCR法及western blotting法检测Fibulin-3的mRNA和蛋白的相对表达变化。
图7为用20μg/ml浓度的LL-37刺激HEK-a细胞，分别孵育12，24，48小时后，提取细胞总RNA和总蛋白，并分别采用real-timePCR法及western blotting法检测Fibulin-3的mRNA和蛋白的相对表达变化。
图8为HEK-a细胞与血管内皮细胞EAhy 926细胞共培养，并加入Fibulin-3抗体后HEK-a细胞中VEGF mRNA和蛋白质的表达变化。
图9为HEK-a细胞与血管内皮细胞EAhy 926细胞共培养，并加入Fibulin-3抗体后，EAhy 926细胞的增殖活力与迁移能力的变化。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明发现在银屑病患者皮损和咪喹莫特诱导的银屑病鼠模型皮损中Fibulin-3表达升高，应用LL-37刺激HEK-a细胞模拟银屑病细胞环境后，Fibulin-3表达升高；这些提示Fibulin-3与银屑病的发展呈正相关，下面对本发明进一步详细的说明。
1.银屑病鼠模型的建立
购买6-7周大小BALB/c雌性小鼠，实验前给予小鼠5％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.1ml/10g)，背部去毛，面积约1.5cm×2cm大小，去毛后后单笼饲养。小鼠背部每日涂抹5％咪喹莫特乳膏50mg，单指轻压按摩30次，连续7天。
2.Fibulin-3抗体的治疗
将小鼠分为两大组，分别为涂抹组和皮下注射组，造模第八天开始上午继续外用5％咪喹莫特乳膏维持炎症状态，下午将不同浓度(2.5ng/ml，5ng/ml和10ng/ml)的Fibulin-3抗体(catalog number：sc-33722)50ul，涂抹于小鼠背部皮肤或注射于小鼠背部皮下，每天一次，每天拍照并进行PASI评分，共7天，第14天脱颈椎处死小鼠后，取皮损，一部分做病理切片，一部分提蛋白做WB，另一部分提RNA做RT-PCR。不同浓度的Fibulin-3抗体外用治疗银屑病鼠模型的临床照片结果如图1所示，其中3种阴性对照为PBS，0.1％叠氮钠，同型对照IgG；治疗组分别为2.5，5，10ng/ml的Fibulin-3抗体。
实验结果表明：两种不同的给药方式下Fibulin-3抗体对小鼠皮损均有治疗作用，小鼠皮损症状均明显改善。
3.Fibulin-3抗体治疗银屑病鼠模型后皮损中VEGF的mRNA及蛋白的检测
检测方法如下：
1)mRNA水平的检测
(1)组织总RNA的提取
a)提前用DEPC浸泡实验所需的枪头、枪头盒、EP管等过夜，以除去RNA酶；
b)称取100mg组织，放入1.5ml EP管中，加入1ml Trizol，匀浆，冰上放置5min；
c)加入200μl氯仿，上下颠倒10次，使其充分混匀呈乳白状，冰上放置5min，然后4℃12000rpm离心15min；
d)小心地将上层无色透明的上清液(约300μl)转移至新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，轻柔颠倒10次，然后冰上放置20min；
e)4℃12000rpm离心15min，可见管底有白色沉淀，小心弃去上清；；
f)加入预冷的75％乙醇1ml洗涤沉淀，然后4℃7500rpm离心5min；
g)弃去上清，室温干燥5-10min，可见底部白色沉淀物变为透明，加入适量的(30-50μl)DEPC水，弹匀并放置在55-60℃10min，使RNA充分溶解；
h)NA纯度和浓度的测定：吸取1μl提取的RNA加入99μl DEPC水中(稀释100倍)，于分光光度仪上测OD260nm和OD280nm值，OD260/OD280在1.9-2.0之间说明所提取的RNA纯度较高。总RNA浓度(μg/ml)＝A260nm×40×稀释倍数，以备其后反转录为cDNA实验所需，余RNA产物放于-80℃冰箱保存备用。
(2)反转录反应
a)在冰上向PCR管中按照如下反转录体系加入试剂，混匀之后短暂离心；
5×RT super mix 4μl
RNA 2μg
DEPC水 加至总体积20μl
b)放入PCR仪中，反转录条件：25℃，10min；42℃，30min；85℃，5min；
c)反转录产物放入-20℃保存备用。
(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
a)在冰上向PCR管中按照如下体系加入试剂，混匀之后短暂离心；
表1 PCR引物序列
b)放入实时定量PCR仪中，反应条件如下所示：
95℃ 10min
95℃ 30s
58℃ 30s 40个循环
72℃ 30s
60℃ 1min
95℃ 30s 熔解曲线
61.5℃ 15s
c)结果判定：用2-ΔΔCt的方法对CT值进行分析，计算该基因的相对表达量。real-time PCR测VEGF mRNA的相对表达变化，检测结果如图2所示。
2)蛋白水平的检测：
(1)组织总蛋白的提取：
a)提前按照100：1的比例将RIPA裂解液和PMSF混合均匀，放置于冰上；
b)称取100mg组织，放入1.5ml EP管中，加入配好的裂解液1ml，冰上匀浆，4℃12000rpm离心15分钟；
c)吸取上清液转移至另一新的EP管中，进行后续实验或-80℃保存。
(2)BCA法测蛋白浓度：
a)配BCA Buffer：将试剂盒中A液和B液按照50∶1的浓度混合均匀；
b)向96孔板的每个孔中加入100μl混合液，再加入2μl所提蛋白或者标准品(0μg/μl，0.25μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl)，振荡器上震荡混合均匀后，放入37℃恒温箱中孵育30min；
c)在分光光度仪上测定OD562nm的吸光值，根据标准曲线，计算出蛋白浓度。
d)蛋白内加入1/4体积的5×上样缓冲液，95℃煮5min后-20℃保存备用。
(3)SDS-PAGE电泳：
a)配制聚丙烯酰氨凝胶电泳的下层胶，待胶凝固后，倒入上层胶，插入洗净干燥的梳子，确保无气泡，静置20-30min待浓缩胶聚合；
b)将胶固定于蛋白电泳槽中，根据蛋白浓度，调整上样量，保证每孔上相同含量蛋白(约20-25μg)，同时加入预染蛋白分子量marker 5μl以确定待检蛋白的分子量；
c)电泳：加样后，于25mA电泳30min后用30mA电泳约90min，至溴酚兰至分离胶底部停止电泳；
d)取下凝胶，置于转膜缓冲液中。
(4)转膜：
a)准备2张滤纸和1张PVDF膜，尺寸和SDS-PAGE凝胶的大小相近；
b)PVDF膜需先在甲醇中浸泡1min，然后浸泡于转移缓冲液中备用；
c)转膜装置上从阴极向阳极依次放置滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸，注意各层间无气泡；
d)恒流230mA转膜1.5h。
(5)封闭：
用TBST配置的5％脱脂奶粉或BSA的封闭液室温封闭PVDF膜1h。
(6)抗体孵育：
a)将PVDF膜按照抗体的分子量大小才成适当宽度的条带；
b)用TBST漂洗一下后，加入按要求浓度配制好的一抗，4℃孵育过夜；
c)回收一抗，用TBST将膜漂洗3次，每次10min；
d)加入按要求浓度配好的二抗，温孵育1h；
e)再用TBST将膜漂洗3次，每次10min，然后倒尽液体。
(7)显影：
a)取等体积的化学发光试液A液和B液，用前临时混合均匀；
b)将PVDF膜置于透明圆形玻璃皿中，滴加混合好的化学发光液，置于凝胶成像仪中；
c)将凝胶成像仪程序设为蛋白印迹，根据曝光效果手动调整曝光时间，并采图分析，检测结果如图3所示。
根据鼠模型皮损中VEGF mRNA和蛋白的表达水平，表明Fibulin-3抗体治疗鼠模型皮损后，皮损中VEGF的表达明显下调，从而说明Fibulin-3抗体可能通过下调VEGF的表达来抑制银屑病中血管的增生。
4.正常皮肤组织和银屑病皮损组织中Fibulin-3的检测，包括免疫组织化学染色和western blot
1)免疫组织化学染色
(1)临床标本的处理
将手术过程中得到的标本用生理盐水彻底冲洗，去除血液和污染物，随后将组织块置于4％多聚甲醛中，固定24h。
(2)载玻片的处理
a)将载玻片洗洁精超声清洗后，放入重铬酸钾-浓硫酸混合液中浸泡24h；
b)酸缸中取出后用自蒸馏水冲洗至完全干净，置于烤箱中60℃烘干过夜；
c)为防止组织掉片，载玻片需经3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(3-Aminopropyl-Triethoxysilane，APES)处理。将APES原液与丙酮1∶50稀释成工作液，将洗净的玻片放入新配置的APES工作液中停留30s后取出；
d)取出玻片，停顿10s钟，再放入丙酮溶液30s，涮去未结合的APES；
e)再置于烤箱中烘干2h，装盒后备用。
(3)石蜡包埋和组织切片
a)包埋组织：先在模具中加入一些液态石蜡，稍微冷却后，将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，冷却使其变成固态；
b)切片：将包埋好的组织从模具上取下来，置于石蜡切片机上，调节切片的厚度4μm，连续切片；
c)切片置于60℃烤箱中烤90min，然后转入37℃烤箱中过夜。
(4)免疫组织化学染色步骤
a)将组织切片置于二甲苯中脱蜡10min×2次；
b)再依次置于无水酒精、95％酒精、90％酒精、80％酒精、70％酒精各10min；
c)置于PBS中水化5min×3次；
d)滴加新鲜配制的3％H2O2，室温孵育20min，以阻断内源性过氧化物酶，然后用PBS洗5min×3次；
e)将切片放入盛0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)的高压锅中，加热至压力阀开始喷气时开始计时2min，然后离开热源，冷却后取下气阀，取出切片，蒸PBS洗5min×3次；
f)滴加5％山羊血清37℃封闭20min，甩除勿洗；
g)加一抗：滴加稀释好的一抗工作液(Fibulin-3抗体的稀释比例为1∶100)，4℃过夜；
h)室温复温30min，用PBS洗5min×3次；
i)加二抗：滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；
j)滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素，37℃孵育20min，PBS洗5min×3次；
k)按照说明书配制DAB显色液，滴加于切片上，显色3-5min，显微镜下观察显色反应；
1)清水冲洗后，用苏木素复染2min，再用清水冲洗；
m)将切片依次置于70％酒精、80％酒精、90％酒精、95％酒精、无水酒精各3min，二甲苯透明10min×2次；
n)中性树胶封片，阴性对照以PBS代替一抗，其余步骤相同，在显微镜下观察、拍照并对结果进行分析。
(5)免疫组化染色结果的判定
由两位医师分别双盲阅片。阳性表达为细胞质和(或)细胞核内出现黄色、棕黄色或褐色颗粒。在400倍镜下随机挑选10个视野，观察细胞染色强度，计算阳性细胞百分率。阳性率≤5％为0分，6％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；染色强度分为4级，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。每个视野阳性细胞百分率与染色强度相乘为该视野得分，最终得分为5个视野得分的平均值。0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中等程度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。
2)蛋白检测western blot
步骤同银屑病鼠模型皮损中提取总蛋白和western blot。
检测结果分别如图4、图5所示，结果表明Fibulin-3在银屑病皮损中的表达明显高于正常皮肤组织。以上结果表明Fibulin-3与银屑病的发展呈正相关关系。
5.应用LL-37刺激HEK-a细胞模拟银屑病细胞环境的检测
应用不同浓度的LL-37刺激HEK-a细胞，并孵育不同时间，模拟银屑病细胞环境，然后提取Fibulin-3总RNA和总蛋白，进行qRT-PCR和western blot的检测；具体操作如下：
1)培养HEK-a细胞：
(1)细胞复苏
a)将细胞冻存管从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴箱中，使其在1min内迅速融化；
b)加入事先准备好的含有5ml 10％FBS的DMEM培养基的中，800rpm离心5min，弃去上清；
c)加入5ml含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，接种到25cm2培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中培养，次日更换培养基。
(2)细胞培养
细胞常规培养于37℃恒温、5％CO2培养箱中，每2d更换一次培养基。
(3)LL-37刺激HEK-a细胞
将LL-37配制成10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml三种浓度，分别加入到正在培养的HEK-a细胞中，再培养12h，24h，48h。
(4)细胞传代
a)当细胞覆盖率达到80％以上时，可以进行传代。先弃去旧的培养基，用PBS洗2次；
b)加入2ml 0.25％胰酶消化，37℃放置约5min，在倒置显微镜下观察，可见细胞变圆，细胞间隙变大，此时立刻加入4ml含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞悬液，转入离心管中；
c)将细胞悬液移至离心管，800rpm离心5min，弃去上清，加入新鲜的培养基重悬，重新接种于新的培养瓶中继续培养。一般传代比例为1∶2-4。
2)细胞总RNA的提取及反转录成cDNA
(1)细胞总RNA的提取
a)提前用DEPC浸泡实验所需的枪头、枪头盒、EP管等过夜，以除去RNA酶；
b)弃去六孔板或1.5cm培养皿中的培养基，用PBS洗两遍；
c)加入1ml Trizol静置2min，用加样枪吹打数下，转移至1.5ml EP管中，轻柔颠倒10次，冰上放置5min
d)其余步骤同组织中RNA的提取。
(2)反转录反应
同组织中提取RNA反转成cDNA的步骤。
(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
同组织中qRT-PCR的步骤
表2 PCR引物序列
3)蛋白检测western blot
(1)细胞总蛋白的提取
a)提前按照100∶1的比例将RIPA裂解液和PMSF混合均匀，放置于冰上；
b)弃去六孔板或1.5cm培养皿中的培养基，用PBS洗两遍；
c)每孔加入150μl的裂解液，冰上裂解5min；
d)使用塑料细胞刮刀冰上充分刮细胞，将所有液体转移至EP管中，4℃12000rpm离心5min；
e)小心吸取上清，转移至另一个EP管中，进行后续实验或-80℃保存。
(2)BCA法测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，抗体孵育及显影步骤，同组织中提取蛋白后的相关检测：
实验结果显示：Fibulin-3的表达，无论是mRNA水平还是蛋白水平，均随着LL-37浓度的增加而增加(检测结果如图6所示)，随着孵育时间的延长而增加(检测结果如图7所示)。证明LL-37刺激HEK-a细胞模拟银屑病细胞环境后，Fibulin-3的表达上调，而且具有剂量依赖性和时间依赖性。
6.HEK-a细胞与人血管内皮细胞EAhy 926细胞共培养
1)体系的建立：
(1)设实验组与对照组：
a)将20μg/ml浓度的LL-37孵育后的HEK-a细胞以5×105个/ml的密度接种于24孔板中，放在37℃5％CO2培养箱中培养12小时；
b)拿出细胞，实验组加入5ng/ml的Fibulin-3抗体，并放入Transwell小室，小室中接种1×105个人血管内皮细胞EAhy 926，对照组不加抗体，直接放入Transwell小室并接种细胞，将两组细胞放回培养箱，继续培养24小时。
2)EAhy 926细胞中VEGF的表达：
(1)取出Transwell小室，按照提取细胞中总RNA的方法提取EAhy 926细胞的RNA，并反转成cDNA，进行qRT-PCR，检测细胞中VEGF mRNA的表达水平；
表3 PCR引物序列
(2)取出Transwell小室，按照提取细胞中总蛋白的方法提取EAhy 926细胞的蛋白，并进行电泳、抗体孵育等步骤，检测细胞中VEGF蛋白质的表达水平；
由实验结果可知：将HEK-a细胞和EAhy 926细胞共培养后，HEK-a细胞中高表达的Fibulin-3可以促进EAhy 926细胞中VEGF表达的上调，而加入Fibulin-3抗体后，Fibulin-3的减少也降低了EAhy 926细胞中VEGF的表达，实验结果见图8所示。这一结果说明银屑病中高表达的Fibulin-3可以促进血管内皮细胞表达VEGF。
3)Fibulin-3对血管内皮细胞EAhy 926增殖和迁移的影响：
(1)检测EAhy 926的增殖：
a)取出Transwell小室，将细胞用含EDTA的0.25％胰酶消化下来，离心后重新制成细胞悬液；
b)将细胞接种于96孔板中(100μl细胞悬液)，500个细胞/孔，培养12小时；
c)每孔加入10μl 7Sea-Cell Counting Kit溶液，在细胞培养箱内继续培养2小时；
d)用酶标仪测定在450nm处波长的吸光值。
(2)检测EAhy 926的迁移：
a)取出Transwell小室，将细胞用含EDTA的0.25％胰酶消化下来，离心后用无血清的DMEM培养基重悬，调整细胞浓度为5×105个/ml；
b)24孔板内加入500μl含10％FBS的DMEM培养基，小心放入Transwell小室，确保下室培养基与小室间无气泡；
c)一边混匀一边向每个小室中加200μl细胞悬液；
d)放入37℃5％CO2培养箱中培养24小时，期间观察细胞状态；
e)取出小室，PBS淋洗两遍，棉签轻擦去小室内面未迁移的细胞；
f)无水甲醇固定15分钟，吸去甲醇，将小室翻转晾干10分钟；
g)0.1％结晶紫染色15分钟，吸去结晶紫，用PBS洗两遍，洗去未结合的结晶紫，自然干燥；
h)100倍显微镜下观察、拍照，每个小室选取上、下、左、右、中5个视野拍照并计数，计算平均值。
由EAhy 926细胞的增殖和迁移实验结果得出，HEK-a细胞中高表达的Fibulin-3可以促进血管内皮细胞EAhy 926的增殖和迁移，当加入Fibulin-3抗体后，这种促进作用明显减弱(实验结果见图9)，因此，提出银屑病中高表达的Fibulin-3可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移，并且这一作用，可通过Fibulin-3抗体得到抑制。
综上实验检测表明，Fibulin-3与银屑病的发展呈正相关，适当浓度的Fibulin-3抗体治疗咪喹莫特所诱导的银屑病鼠模型，能够改善红斑、鳞屑和皮损厚度，并且可通过减少血管内皮细胞表达VEGF，减少血管内皮细胞增殖和迁移来达到抑制银屑病发展以及促进皮损恢复的作用。
鉴于此，Fibulin-3可以作为制备防治银屑病药物的应用靶点。可以在基因水平和/或蛋白水平以Fibulin-3作为药物靶点。例如阻碍或抑制Fibulin-3表达或转录的DNA或RNA，或是阻断Fibulin-3所导致的VEGF表达上调等。
相应的针对Fibulin-3的抗体在制备防治银屑病的药物中的应用。
阻断Fibulin-3所导致的VEGF高表达在制备防治银屑病的药物中的应用。
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.针对Fibulin-3的抗体在制备治疗银屑病的药物中的应用。
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