CN110013484A - 一种虎杖苷在制备治疗和预防宫腔粘连药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种虎杖苷在制备治疗和预防宫腔粘连药物中的应用,该虎杖苷是指从蓼科植物虎杖的干燥根茎和根中采用醇提法获得的提取物，其在治疗和预防宫腔粘连药物的各种剂型中至少包含有该虎杖苷。本发明所述虎杖苷作为活性成分，具有良好的抗炎、抗纤维化作用，并且其功效显著、作用机理清楚、靶点明确，符合药物制剂开发的要求。

Description

一种虎杖苷在制备治疗和预防宫腔粘连药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种虎杖苷在制备治疗和预防宫腔粘连药物中的应用。

背景技术

宫腔粘连（IUA）又被称作Asherman综合征，是由于多种因素导致的子宫腔或子宫颈形成粘连带，使患者常出现月经异常、慢性盆腔痛及生殖系统障碍。宫腔粘连严重影响育龄期女性身心健康。该疾病多是因为人流、刮宫所导致。随着诊疗技术的不断发展提高，宫腔粘连的检出率也相应上升，育龄期女性中患宫腔粘连约占90%。然而，临床中并没有针对宫腔粘连疾病很好的治疗措施。最常见的是宫腔镜下粘连松解术，但是发现仍有很高的复发率；除了手术治疗外，还有术后服用雌激素、术后球囊支撑治疗及防粘连膜等治疗措施。

宫腔粘连发病机制复杂，目前为止具体的机制仍不清楚。其中炎症和纤维化的形成是宫腔粘连的原因之一。TGF-β是重要的促纤维化因子之一，其不仅在肺脏纤维化、肝脏纤维化、心脏纤维化等器官组织纤维化中发挥着重要作用，许多实验证实TGF-β通过调节下游基因的表达，也参与宫腔粘连的生成。NF-κB在炎症疾病中发挥着重要作用，其可刺激粘附因子的表达，导致宫腔粘连的发生。

虎杖苷（Polydatin，PD）是从干的中药虎杖根茎中提炼出来的一种单体成分，又称为白藜芦醇苷，它是由白藜芦醇与葡萄糖组成的化合物 ，属芪类化合物，化学名为：3,4,5-三羟基芪-3β-单-D-葡萄糖苷（3,4,5-trihydrox-stilbene-3-β-mono-D-glucoside），分子式如下：

。

虎杖苷与白藜芦醇可在体内相互转换，两者具有相似的药理作用，但是，白藜芦醇的抗氧化和稳定性没有虎杖苷的作用强【WANG H L, GAO J P, HAN Y L, et al.Comparative studies of polydatin and resveratrol on mutual transformation andantioxidative effect in vivo [J]. Phytomedicine, 2015, 22(5): 553-9.】。虎杖苷分布广，不仅存在于中药虎杖中，葡萄、花生、可可、红酒等一些食品中也包含该成分。虎杖苷的传统药理功效是：利湿去黄、清热祛毒、活血化瘀等，常用于黄疸、风湿、咳嗽等疾病的治疗【中草药学(中册) [M]. 1976.】。近年来的研究发现，虎杖苷还有其他的药理作用，除发现虎杖苷在抗炎、抗氧化、抗休克等方面有生物学作用外，它还在抗组织纤维化方面也发挥着积极的作用，但是几乎未发现虎杖苷在宫腔粘连方面的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种虎杖苷在制备治疗和预防宫腔粘连药物中的应用。

为解决上述问题，本发明所述的一种虎杖苷在制备治疗和预防宫腔粘连药物中的应用,其特征在于：该虎杖苷是指从蓼科植物虎杖的干燥根茎和根中采用醇提法获得的提取物，其在治疗和预防宫腔粘连药物的各种剂型中至少包含有该虎杖苷。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明所述虎杖苷是一种纯天然的、植物源的、无毒无刺激的可显著抑制炎症因子及降低纤维化的表达的活性成分。

2、本发明通过机械损伤和炎症刺激成功建立IUA小鼠模型，利用此模型研究虎杖苷对其宫腔粘连的治疗作用及其可能的作用机制。本发明研究发现，本发明所述虎杖苷与对照组比较，1）Masson染色提示：IUA小鼠子宫内膜中胶原蛋白沉积显著增加，子宫内膜被纤维瘢痕取代，并且在经过药物干预后沉积的胶原纤维明显减少，提示治疗组的细胞外基质的沉积也有所减轻；2）RT-PCR结果表明：IUA小鼠子宫组织中纤维标记物和炎症因子TGF-β1、NF-κB、MSK及P38在mRNA水平上均升高，且与粘连程度相关；3）免疫组化结果显示：α-SMA、TGF-β1、NF-κB及Smad2/3中在IUA小鼠子宫内膜均为阳性表达，并且这几种蛋白的表达与药物浓度及纤维化的严重程度呈负性相关；4）子宫内膜腺体数量：IUA小鼠的内膜腺体数量明显减少，除低剂量治疗组外，其他治疗组的腺体数增加，这可能与药物剂量有关，低剂量时药物浓度可减轻纤维化情况，但并不足以改善腺体数目。以上结果提示：IUA的发生过程可能有TGF-β1、NF-κB、MSK、α-SMA及P38的参与。因此，本发明所述虎杖苷作为活性成分，具有良好的抗炎、抗纤维化作用，并且其功效显著、作用机理清楚、靶点明确，符合药物制剂开发的要求。

下述所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述所用材料、试剂、仪器等参见表1~2。

表1 材料及试剂

表2 仪器

⑴实验动物的购买及饲养

本动物实验严格遵守兰州大学实验动物中心规范进行操作。48只C57BL/6雌性小鼠，10W大小，购于北京维通利华实验动物中心，饲养于兰州大学医学院动物实验室，温度控制在22±2℃内，湿度为70%，光周期为12h的环境下饲养整个实验过程小鼠自由饮食饮水。

⑵相关溶液的配制

① 6mg/L脂多糖溶液的配制：

称取0.6mg脂多糖，溶于10ml的生理盐水中，即配成浓度为60mg/L的脂多糖溶液，取出2ml 60mg/L的脂多糖溶液稀释10倍，即配成该实验所需6mg/L的脂多糖溶液。

② 虎杖苷溶液的配制:

PD20mg/Kg高剂量组小鼠8只，每只按照30g计算给药量，给药剂量为20mg/Kg，总计每日给药量为:0.03Kg×20mg/Kg×8=4.8mg；

PD10mg/Kg中剂量组小鼠8只，每只按照30g计算给药量，给药剂量为10mg/Kg，总计每日给药量为：0.03Kg×10mg/Kg×8= 2.4mg；

PD5mg/Kg低剂量组小鼠8只，每只按照30g计算给药量，给药剂量为5mg/Kg，总计每日给药量为：0.03Kg×5mg/Kg×8=1.2mg；

因此，高中低剂量3组小鼠每日给药总量为：4.8mg+2.4mg+1.2mg=8.4mg；

术后小鼠给药周期为2周，每日给药1次，总共给药14次，因此整个给药过程中总药量为：8.4mg×14=117.6mg，为了避免因配制药物过程中损耗，因此我们称取药物125mg。将称取的125mg药物溶解于DMSO中（原则上DMSO的量不超过药物总体积的1%），待药物完全溶解于DMSO中，再用生理盐水将药物按照实验所需，稀释成给药浓度，最后将各浓度药物分别分装到已灭菌好的EP管中，封口、打标，并置于-20℃保存备用。

⑶动物分组及给药方案

48只10周大的C57BL/6雌性小鼠按照分组，于宫腔粘连术后第一天开始给药，分别是：高剂量组（8只）：IUA+PD20mg/Kg；中剂量组（8只）：IUA+PD10mg/Kg；低剂量（8只）：IUA+PD5mg/Kg；模型组及假手术组（8只）：每日按照相应体重经腹腔注射生理盐水；正常组正常饲养，不予任何特殊处理。给药过程中每日观察小鼠生命体征的变化，并于给药周期2周结束后取材进行后续生物实验。

⑷小鼠分组及造模

在实验室内经过一个星期的适应性喂养后，随机分成6组，3组术后给药组（PD-5mg/Kg、PD-10mg/Kg、PD-20mg/Kg），1组术后给予生理盐水，1组假手术组，1组正常对照组。

①假手术组 8只

②生理盐水组 8只

③PD-5mg/Kg组 8只

④PD-10mg/Kg组 8只

⑤PD-20mg/Kg组 8只

⑥正常对照组 8只

选取检疫合格的C57BL/6小鼠48只，雌性，体重约25g，随机分为6组，分别为：IUA+生理盐水组（n=8），假手术组（n=8），IUA+PD5mg/Kg（n=8）, IUA+PD10mg/Kg组（n=8），IUA+PD20mg/Kg组（n=8）， 正常对照组（n=8）。经过一周环境平衡后，在术前24h给每只小鼠腹腔注射20IU的孕马血清促性腺激素，保证每只小鼠的子宫内膜处以同一发育期。在动物实验中心施行手术，每只小鼠腹腔注射适量30mg/Kg巴比妥钠溶液，剃去小鼠腹部毛发。模型鼠打开腹腔，找出子宫，观察子宫形态，排除异常形态的小鼠（如子宫水肿、子宫畸形等）。在两侧子宫中下1/3处分别剪开约0.2cm大小一切口，将自制的子宫刮勺伸进子宫内，相同力度各个方向来回反复刮3~4次，感到内膜有平滑转为粗糙，即刮宫完成。刮宫完成后用预先48h处理的脂多糖（LPS）处理好的2-0缝合线放置于子宫内，3-0手术线缝合子宫，腹腔滴200ul双抗，预防感染，关闭腹腔。术后48h将埋于宫腔中的脂多糖缝合线取出，术后第二天开始给于各浓度药物干预，连续给药，给药周期结束后（14d）收集小鼠双侧子宫，进行下一步生物实验。

⑸子宫组织苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色

Ⅰ.子宫组织石蜡切片制备：

①子宫组织固定：剔除子宫组织周围脂肪以及其他组织，取大约5mm长短的子宫组织后，置于4%多聚甲醛溶液中室温过夜；

②子宫组织脱水：50%酒精脱水1.5h、70%酒精脱水1.5h、85%酒精脱水1.5h、95%酒精脱水1.5h，100%酒精脱水1h，100%酒精脱水1h；

③子宫组织透明：相同体积的酒精溶液与相同体积的二甲苯溶液充分混匀后，先将子宫组织置于该混合液中1h，再置于二甲苯溶液中1h，最后再放置于新的二甲苯溶液中作用1h；

④渗透：将相同体积的二甲苯溶液与相同体积的石蜡溶液充分混合后，再将组织放置在该溶液中1.5h后，再置于62℃石蜡中2h，最后再换到新的62℃石蜡中2h；

⑤包埋：在模具中盛满热的石蜡溶液，再将子宫组织横切面置入液体石蜡的中央，将组织固定好之后，置于冷台上冷却；

⑥切片、捞片、烤片：先用切片机修片，修好之后，再切成厚度为5um的石蜡切片；烤片机烤片；最后置于60℃烘箱中烘5h。

Ⅱ.小鼠子宫组织石蜡切片H&E染色：

H&E染色液的配制：

①伊红染液：伊红 1g；蒸馏水 90ml；苦味酸饱和溶液 10ml；

②苏木染液：苏木素 3g；无水乙醇 20ml；硫酸铝钾 20g；氧化汞 1g；冰醋酸 20ml；蒸馏水定容至500ml；

③盐酸乙醇分化液：浓盐酸 1ml；75%乙醇 99ml；

染色方法：①60℃烘箱烤片1h；②脱蜡：二甲苯I 20min→二甲苯II 20min→无水酒精I15min→无水酒精II 15min→95%酒精10min→90%酒精5min→80%酒精5min→水洗5min；③染色：苏木素染色7~8min，水冲洗→盐酸乙醇分化2s→自来水返蓝5min→伊红染色25~30s→水洗10s；④脱水：75%酒精2s→85%酒精2s→95%酒精2s→100%酒精2s→二甲苯I 2min→二甲苯II 2min；⑤通风橱晾干；⑥封片：切片组织部位滴加适量中性树脂，将盖玻片缓慢覆于组织上，避免出现气泡；⑦晾干、拍照；

Ⅲ. 子宫组织Masson三色染色：

Masson染色液的配制：

① Bouin液：苦味酸饱和液75ml；福尔马林液 25ml；冰醋酸5ml；

②丽春红品红溶液：丽春红 0.7g；酸性品红 0.3g；蒸馏水 99ml；冰醋酸 1ml；

③磷钼酸溶液：磷钼酸1g；蒸馏水 100ml；

④2%苯胺蓝：苯胺蓝 2g；冰醋酸 2ml；蒸馏水 100ml；

染色步骤：①石蜡切片在烘箱中放置60min后，泡入Bouin液，于室温作用一晚进行媒染，第二日流水冲洗，直到切片上的黄色消失；②将组织切片泡入天青石蓝染色中，作用2~3min，稍水洗；③组织切片入Mayer苏木素染色液中染2~3min，稍水洗；④酸性乙醇分化液分化切片2s，自来水冲洗10min；⑤将组织切片置于丽春品红染液缸中10min，蒸馏水冲洗数次；⑥磷钼酸溶液处理约10min；⑦甩掉上液，切片不水洗，直接置入苯胺蓝染液缸中5min；⑧弱酸溶液处理2min；⑨95%酒精迅速脱水，无水酒精脱水3次，每次约5~10s；⑩二甲苯中透明3次，每次约1~2min，切片风干后，中性树胶封片。

Ⅳ. 子宫组织免疫组化染色：

①烘片、脱蜡：同上述HE染色；②脱蜡后ddH2O中浸泡5min；③修复：烧杯中盛入约占烧杯体积的已配好的柠檬酸缓冲液2/3（0.4g柠檬酸+3.0g柠檬酸钠+ddH₂O定容→1L），将切片固定在切片架上，放入烧杯中，烧杯用锡纸避光包裹，高温高压下处理15min后，即刻降压后，取出烧杯后静置到室温；④用浓度为3%H₂O₂浸泡约10min（清除内源性过氧化物酶活性），然后再用1×PBS洗涮洗3次，每次约5min；⑤封闭：1%BSA湿盒内室温孵育1h，孵育完成后甩掉载玻片上的BSA，并用纸巾擦干子宫组织周围多余的液体；⑥孵育一抗：用1%BSA冰上配制一定比例的一抗（α-SMA: 1%BSA=1:1000；TGF-β1：1%BSA=1:1000；NF-κB: 1%BSA=1:1000；Smad2/3: 1%BSA=1:1000）,在组织上滴加20ul一配好的一抗，置于冰箱4℃过夜；⑦复温：将湿盒从冰箱取出，放置于室温复温1h；⑧孵育二抗：用1×PBS洗涮切片3次，每次约5min，甩片后纸巾小心擦干子宫组织周围液体，滴加提前配制好的相应二抗（二抗：1%BSA=1:800），37℃条件下，湿盒内孵育约1h后取出切片，1×PBS清洗3次，每次5min；⑨DAB显色：冰上配制DAB显色液，反应缓冲液：A液：B液=1000:50:50，配制过程中应注意避光操作，每个子宫组织上滴加20ul DAB显色液，使其完全覆盖子宫组织，使用显微镜观察组织显色程度，所有组织切片显色时间均为30s；显色完成后用ddH₂O涮洗切片5~10次，再置于苏木素染缸中染色约25s、自来水冲洗5min、1%盐酸分化2s、再自来水冲洗5min；⑩脱水、封片：操作同上述HE染色一致。

⑹小鼠子宫组织总RNA的提取及Real time PCR

Ⅰ. 提取小鼠子宫组织总RNA：

①将小鼠子宫从-80℃冰箱中迅速取出，置于冰上，称量标记后即刻转移到用液氮提前预冷的研钵中，液氮淹没子宫组织，再研磨子宫组织直至组织研磨成粉末，在研磨期间避免冻伤及组织飞溅出来，研磨好后的组织粉末移入DEPC处理过的EP管中，然后每个样品中加入1mlTRIzol，用移液枪充分吹打混匀（暂时不用可保存在-80℃冰箱内）；

②每管再加入200ul氯仿，剧烈震荡1min后，室温下静置孵育3分钟，4℃离心机离心（转速12000r×15min），离心后样品被分为三层，底层粉色为有机层，上层为无色水相层及中间层，RNA主要集中在无色水相层内，移液器缓慢吸取无色水相层，该层约为TRIzol体积的50%，但是在吸取的同时遵循避免吸到下面的有机层污染RNA的原则；

③将吸取的水相层转移至新的DEPC水处理后的EP管中，并加入与无色水相层相同体积的异丙醇后混匀，室温静置孵育10min，再4℃离心机离心（转速12000r×10min）后，可在管壁或管底看到白色絮状沉淀，弃去上清，每管加入1ml 75%酒精（DEPC水：无水酒精=1:3），再用涡旋机剧烈震荡涡旋，洗涤白色沉淀，4℃离心机离心（转速12000r×5min）后，打开EP管盖，弃去上清，残余液体置于室温下蒸发晾干，最后加入20ulRNase-freeH₂O完全溶解沉淀，用于后续制备cDNA。

Ⅱ.RNA逆转录制备cDNA：

①将提取的RNA用Nanodrop 2000分光光度计测量浓度及吸光度值，保证A260/A280在1.80~2.00之间，确保RNA的纯度；

②将测量后的RNA用RNase-freeddH₂O调至同一浓度，用于后续使用；

③使用TIANGEN公司的FastKing RT Kit (With gDNA)：50ng~2ug总RNA可建立20ul反应体系。将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RTBuffer、RNase-Free ddH₂O在室温下解冻，解冻后迅速放置于冰上，使用前应注意将每种溶液涡旋器震荡混匀，减少实验过程中的误差，简短离心，收集贴附于管壁的液体。以下均应该在冰上操作进行，为了准确地配制反应液，应先将各液体配制成Mix，混匀后再以相同体积分装到每个反应管中；

④按照以下步骤及配比方案配制混合液目的是为了去除基因组DNA，彻底混匀、离心后置于42℃、孵育3min，然后置于冰上：

gDNA去除反应体系

Total RNA样品 2ul

5×gDNA Buffer 2ul

RNase-Free ddH₂O 补足到10ul

⑤混匀后置于冰上，按照以下方案配制反转录体系混合液2(10ul)：

反转录体系

FastKing RT Enzyme Mix 1ul

10×King RT Buffer 2ul

FQ-RT Primer Mix 2ul

RNase-Free ddH₂O 5ul

⑥将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，每管10ul，充分混匀后，42℃，孵育15min后；

⑦95℃，孵育3min后放于冰上，得cDNA用于后续实验，或低温保存备用。

Ⅲ. Real Time PCR：

建立Real-Time PCR反应体系：注意将2×SuperReal PreMix Plus和50×ROXReference Dye避光保存；溶解2×SuperReal PreMix Plus、50×ROX Reference Dye、模板、引物及RNase-free ddH₂O，将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀；再在冰上进行Real-Time PCR反应体系的配制。

20ul反应体系的配制

RNase-free ddH₂O 7ul

反向引物 0.5ul

正向引物 0.5ul

2×SuperReal PreMix Plus 10ul

cDNA模板 2ul

加好上述体系后，盖上反应管，轻柔混匀。离心机短暂离心，使所有成分均离心于反应管管底；将反应体系按照加样顺序放于Aglient Mx3000P荧光定量PCR仪中，进行反应。

利用三步法反应法：①预变性：95℃，15min，1个循环数（必须设定此温度及此时间，用以充分激活热启动酶）；②PCR反应：95℃，10s（变性），55℃ 20秒（退火），72℃ 20秒（延伸），共40个循环数。所用引物序列（上海生工）见表3。

表3 引物序列

⑺统计分析

本实验所有数据运用SPSS22.0，Graphpad Prism6.0，Image-pro Plus，Excel2011软件进行统计分析，结果均以平均值±标准差的形式。采用t检验进行组内比较，P<0.05认为数据具有统计学差异；P<0.01时，数据间统计学差异显著。

⑻实验结果

①虎杖苷对宫腔粘连小鼠影响的研究

【大体标本观察】小鼠宫腔粘连造模前观察子宫表面光滑、红润、粗细均匀、弹性好。机械损伤联合脂多糖埋线后子宫明显水肿、变粗、宫腔变大，颜色变白，内膜损伤不光滑。给药结束后（14天），脱颈处死小鼠后，解剖见：子宫苍白，部分宫腔水肿，弹性差、部分宫腔狭窄变小、闭锁。子宫组织与周围其他组织粘连明显，较难分离。而正常对照组：子宫表面光滑、红润、子宫粗细均匀一致、弹性好，与周围组织相互无粘连形成，容易分离。

【虎杖苷对宫腔粘连小鼠体重的影响】

比较各组之间体重的增长量，即从建模的第一天至虎杖苷治疗结束，第一天体重标记为第0天，治疗结束第14天，比较各组之间小鼠体重的相对增长量（参见表4）。对照组：0.6375±0.1819；假手术组：0.6263±0.1713；模型组：1.096±0.1655；虎杖苷低剂量组（5mg/kg）：1.435±0.365；虎杖苷中剂量组（10mg/kg）：1.039±0.07175；虎杖苷高剂量组（20mg/kg）：0.9525±0.2261；6组数据之间并未见统计学差异（P＞0.05）。

表4 小鼠体重与腺体数

注：虎杖苷对各组小鼠体重增量与子宫内膜腺体个数的影响及与正常组比较： * P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；##P＜0.01。

②虎杖苷在宫腔粘连小鼠子宫内膜修复方面的作用

【HE染色观察子宫内膜】

未行机械刺激及脂多糖埋线的小鼠：子宫内膜组织有完整的内膜层、肌层及浆膜层；内膜组织可见排列整齐的单层柱状上皮，间质均一无水肿，腺体分布均匀；间质细胞排列紧密，成卵圆状，核深染。IUA小鼠模型组：子宫内膜厚度变薄，皱襞减少，部分管腔变小甚至消失；腺体数量明显减少，腺体分布不均，密度减小；偶见白细胞浸润，间质水肿明显。虎杖苷低剂量治疗组（5mg/kg）：内膜组织较完整，内膜变薄；间质水肿，腺体分布不均。虎杖苷中剂量治疗组（10mg/kg）：子宫内膜组织完整，内膜较正常组薄，间质水肿减轻，管腔正常，可见皱襞及凹陷，腺体数目增加。虎杖苷高剂量治疗组（20mg/kg）：子宫内膜较正常组薄，上皮组织较完整，成单层柱状上皮，间质水肿较轻，管腔正常，可见皱襞及凹陷，腺体数明显增多。

【各组之间子宫内膜腺体数】

在显微镜高倍镜下观察组织切片，每个切片按照从左到右，从上到下的顺序，观察子宫内膜腺体并计数，每张片子重复计数3次，最终求平均值（参见表4）。结果发现：正常组子宫内膜腺体数：55.71 ± 5.702；假手术组小鼠内膜腺体数：63.80 ± 7.499；IUA模型组：26.60 ± 5.732，与正常组比较，该组子宫内膜腺体数明显减少，且具有统计学意义（P＜0.05）；虎杖苷低剂量治疗组（5mg/kg）腺体数：32.86 ± 4.901，与模型组比较，该组小鼠的子宫内膜腺体数增加，但并没有统计学意义；虎杖苷中剂量治疗组（10mg/kg）腺体数：与模型组比较，该组子宫内膜腺体数明显增加（53.75 ± 4.820 vs 26.60 ± 5.732），并且具有显著性差异（P＜0.01）；虎杖苷高剂量治疗组（20mg/kg）腺体数：与模型组比较该组腺体数也明显增多（49.60 ± 5.183 vs 26.60 ± 5.732），并且具有统计学意义（P＜0.05）；而虎杖苷低、中、高剂量治疗组之间并无显著性差异（P＞0.05）。

③Masson染色

Masson染色可辨别出纤维组织中的胶原纤维，胶原纤维呈蓝色；肌纤维、角蛋白、纤维素及胞质等表现为红色；胞核为蓝褐色，其主要为胶原纤维和肌纤维的差别。根据胶原纤维组织着色从而判断纤维化程度。

Masson结果显示：在高倍镜下每个组织随意选取3个不同视野拍照，采用Excel2011，Graphpad Prism 6.0分析胶原纤维沉积严重程度。结果如图1所示：造模组子宫内膜中大部分呈蓝色，提示胶原纤维沉积增多，且明显多于正常对照组及假手术组，且有显著性差异（P＜0.001），子宫内膜被纤维瘢痕组织取代覆盖；各浓度梯度（5mg/Kg、10mg/Kg、20mg/Kg）虎杖苷治疗组：子宫内膜可见部分胶原纤维沉积，但是与模型组相比明显减少，且具有统计学意义，并且随着药物浓度的增加，胶原纤维沉积逐渐减少。

④对子宫组织蛋白表达的影响

为进一步研究IUA小鼠子宫组织中NF-κB、α-SMA、Smad2/3、TGF-β在蛋白的表达水平，收集各组小鼠子宫组织，给予对照组及虎杖苷各浓度梯度治疗组石蜡切片免疫组化分析比较NF-κB、α-SMA、Smad2/3、TGF-β这些蛋白在子宫组织的含量。所有切片在高倍镜下分析，每张切片随机选择3个视野，采用免疫组化分析软件（Image-Pro Plus 6.0）对染色阳性区域进行分析，计算光密度值（IOD），最终进行统计学分析。结果发现如图2：给予治疗后的宫腔粘连小鼠，子宫组织这些蛋白的表达量明显下降。α-SMA表达于间质细胞内，可在细胞质中表现出棕色阳性着色区，虎杖苷治疗组低、中、高三个剂量与模型组α-SMA的表达量均存在显著性差异（P＜0.001），但虎杖苷治疗这三组之间无明显差异；NF-κB在子宫内膜及腺上皮和间质细胞中呈阳性表达，虎杖苷治疗组低、中、高三个剂量组的表达量均降低，与模型组也存在明显差异（P＜0.01），治疗组之间也并无明显差异；Smad2/3位于细胞浆及细胞核中，在子宫内膜上皮及间质细胞中表达，虎杖苷治疗组低、中、高三个剂量组的表达量均降低，并且与模型组比较具有统计学差异（P＜0.05）；TGF-β位于细胞浆中，可在子宫内膜腺上皮和间质中发现其阳性表达，虎杖苷治疗组低、中、高三个剂量组的表达量显著降低，与模型组对比具有显著性差异（P＜0.0001）。

⑤对子宫组织相关基因表达的影响

为研究正常小鼠、IUA小鼠、虎杖苷治疗组小鼠子宫组织中NF-κB、P38、MSK及TGF-β1基因水平的表达，收集各组小鼠子宫组织，提取组织总mRNA，采用RT-PCR方法检测宫腔粘连小鼠子宫组织中与纤维生成及炎症因子相关基因的表达水平（如图3）。同模型组对比，虎杖苷治疗组低、中、高三个剂量均可以抑制宫腔粘连小鼠体内NF-κB的表达，使该基因在小鼠组织内表达量下调，且这三组均具有统计学差异（P＜0.05）。炎症因子P38的表达量在虎杖苷各治疗组也明显降低，且与对照组相比均有明显差异（P＜0.05），但是不同给药组之间并无差异，并且与给药浓度没有关系。另一炎症因子MSK在虎杖苷治疗各组的表达量与模型组对比明显下降，且具有明显统计学差异（P＜0.01）；纤维生成因子TGF-β1在虎杖苷治疗组的表达量也降低，与模型组比较均具有统计学差异（P＜0.05），说明虎杖苷可抑制纤维相关因子基因的表达水平。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明虎杖苷对各组小鼠内膜纤维化的影响。A:子宫组织Masson染色，检测纤维化程度；B：检测纤维化沉积程度。与正常组比较， ^### P＜0.001；与模型组比较， ^* P＜0.05； ^** P＜0.01； ^*** P＜0.001。

图2为本发明虎杖苷对小鼠子宫组织内蛋白的影响。A：子宫组织IHC染色，比较各组子宫内各蛋白的表达水平；B：免疫组化分析各蛋白的表达量；与正常组比较： ^# P＜0.05； ^## P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05；**P＜0.01。

图3为本发明虎杖苷对小鼠子宫组织RNA表达量的影响。与正常组比较：#P＜0.05；##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05；**P＜0.01。

具体实施方式

一种虎杖苷在制备治疗和预防宫腔粘连药物中的应用,该虎杖苷是指从蓼科植物虎杖的干燥根茎和根中采用醇提法获得的提取物，其在治疗和预防宫腔粘连药物的各种剂型中至少包含有该虎杖苷。

虎杖苷的制备方法如下：称取虎杖粉末，按1g：6mL料液比采用体积浓度为95%的乙醇回流提取2次，2h/次，回收提取液，减压回收提取液至无醇味，再使用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯得二苯乙烯类，水相层酸水解经乙醚索氏提取至无色，乙醚层再经质量浓度为5%的NaOH溶液萃取，酸化得到蒽醌类，将二苯乙烯类与蒽醌类混合即得到虎杖苷。

实施例 一种虎杖苷在制备治疗和预防宫腔粘连药物中的应用：将125mg虎杖苷粉末溶解于2mL 二甲基亚砜（DMSO）中，待完全溶解后，再用生理盐水将其稀释成相应的给药浓度。最后将各浓度药物分别分装到已灭菌好的EP管中，封口、打标，并置于-20℃保存备用，即制得可治疗和预防宫腔粘连的虎杖苷注射液。

上述实施例是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段做出的各种替换方式或变更，均包含在本发明之内。

Claims (1)

1.一种虎杖苷在制备治疗和预防宫腔粘连药物中的应用,其特征在于：该虎杖苷是指从蓼科植物虎杖的干燥根茎和根中采用醇提法获得的提取物，其在治疗和预防宫腔粘连药物的各种剂型中至少包含有该虎杖苷。