CN117106894A - Nkrf在病理性心脏重构诊治中的应用 - Google Patents

Nkrf在病理性心脏重构诊治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于疾病诊治和分子生物学技术领域，具体涉及NKRF在病理性心脏重构诊治中的应用。本发明研究证明NKRF在病理性心脏重构中的表达下调，NKRF能够保护免受心脏重构的影响，并在体内增加心肌梗死后小鼠的存活率。NKRF在成纤维细胞中抑制了MMP2和MMP9的表达，减少了细胞的侵袭和迁移。在机制上，NKRF通过NF‑κB依赖途径抑制了HuR的转录表达，从而降低了MMP2和MMP9mRNA的稳定性。总之，NKRF可能成为抑制心肌梗死等心血管疾病介导的心脏重构和功能障碍的潜在治疗靶点，这为心脏重构干预提供了一个有前景的途径，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

NKRF在病理性心脏重构诊治中的应用
技术领域
本发明属于疾病诊治和分子生物学技术领域，具体涉及NKRF在病理性心脏重构诊治中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
心脏重构是几乎所有导致心功能障碍、增加心力衰竭和死亡率的心血管疾病的共同病理结果。缺血性心脏病和由心肌梗死(MI)引起的心力衰竭仍然是全球主要的死因。MI后的瘢痕形成在早期阶段起着防止心室破裂和在晚期阶段维持泵血功能的重要作用。在生理条件下，细胞外基质(ECM)作为机械支架传递信号，并在病理条件下参与瘢痕形成、心脏重构和心脏功能维持。ECM的稳态是通过胶原的分泌和基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的激活的平衡变化来维持的。心脏成纤维细胞(CFs)是所有心脏细胞类型中最丰富的，对调节ECM起着重要作用。
MI后的心脏修复是一个精细协调且复杂的一系列事件，大致可以分为早期炎症/坏死阶段和晚期纤维化/增殖阶段。在早期炎症/坏死阶段，许多炎症细胞(包括中性粒细胞和巨噬细胞)释放许多炎症因子，并激活并分泌MMPs以消化和清除受损细胞和ECM组织。释放的MMPs通过破坏ECM中的胶原纤维和支架影响ECM的稳态。许多CFs迁移到梗死区域，在晚期纤维化/增殖阶段分化为肌成纤维细胞，并分泌大量前胶原以促进瘢痕形成和梗死修复。在早期炎症/坏死阶段适当且及时地限制炎症程度和持续时间是决定晚期纤维化/增殖阶段梗死愈合质量的因素。大多数先前的研究仅关注了早期炎症/坏死阶段的巨噬细胞和心肌细胞(CMs)，或者关注了MI后晚期纤维化/增殖阶段CFs对心脏重构的影响。然而，炎症如何通过CFs来源的ECM重构的分子决定因素影响MI后的心脏功能，知之甚少。
NF-κB抑制因子(NKRF)是由X染色体上的基因编码的转录抑制因子，在包括心脏、大脑、肺、肝脏、肾脏和肠道在内的许多组织中表达。内源性NKRF主要直接结合NF-κB，抑制部分NF-κB靶基因的表达，如干扰素-β(IFN-β)、白细胞介素-8(IL-8)和诱导型一氧化氮合酶(iNOs)。慢性阻塞性肺疾病患者的外周血单个核细胞(PBMCs)中的氧化应激增加抑制NKRF的表达并损害其负性调控机制，进一步加重了IL-8的产生。在肺结核患者中观察到PBMCs和肺泡巨噬细胞中NKRF的上调表达。NKRF结合IP-10和IL-8启动子的负性调控元件(NRE)，抑制NF-κB和RNA聚合酶II的结合。这导致IP-10和IL-8表达的下调。NKRF还抑制内脏脂肪细胞中单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的表达。这些结果表明NKRF通过NRE在各种特定基因的转录抑制中发挥作用。近期研究突显了NKRF在各种病理条件下的多方面作用。在三阴性乳腺癌中，高表达的长链非编码RNA Uc003xsl.1直接结合NKRF，破坏了其对NF-κB响应基因IL-8的负性调控，促进肿瘤的进展和转移。此外，在人类胃癌中，miRNA-301a-3p通过靶向NKRF增强了肿瘤的侵袭和迁移，导致NF-κB信号的激活，影响患者的预后。这些发现强调了NKRF作为关键转录调节因子在不同疾病背景下的重要性，并进一步强调了在MI诱导的心脏重构中探索其作用的必要性。然而，目前尚不清楚NKRF是否参与调节心脏成纤维细胞的功能。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供NKRF在病理性心脏重构诊治中的应用。本发明研究证明NKRF在病理性心脏重构中的表达下调，NKRF能够保护免受心脏重构的影响，并在体内增加心肌梗死后小鼠的存活率。NKRF在成纤维细胞中抑制了MMP2和MMP9的表达，减少了细胞的侵袭和迁移。在机制上，NKRF通过NF-κB依赖途径抑制了HuR的转录表达，从而降低了MMP2和MMP9 mRNA的稳定性。基于上述研究成果，从而完成本发明。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供检测NKRF编码基因及其表达产物的试剂在制备用于病理性心脏重构诊断和/或预后产品中的应用。
所述产品能够通过检测NKRF编码基因和/或NKRF编码基因表达产物的表达水平从而(早期或辅助)诊断、检测、监测或预测病理性心脏重构的进展；试验证明，NKRF在心脏成纤维细胞(CFs)中的表达受到下调调控，对于调控病理性心脏重构和纤维化具有重要作用。因此，所述NKRF编码基因及其表达产物可作为病理性心脏重构诊断和/或预后生物标志物。
本发明的第二个方面，提供一种病理性心脏重构诊断和/或预后评估的系统，所述系统至少包括：
获取单元，其被配置为：获取受试者所述生物标志物的表达水平；
评估单元，其被配置为：根据获取单元获得的所述生物标志物的表达水平对受试者的患病情况进行评估；
其中，所述生物标志物为NKRF编码基因和/或NKRF编码基因表达产物(如NF-κB抑制因子)。
本发明的第三个方面，提供NKRF作为靶点在病理性心脏重构相关疾病防治和/或筛选病理性心脏重构相关疾病药物中的应用。
需要说明的是，心脏重构是几乎所有导致心功能障碍、增加心力衰竭和死亡率的心血管疾病的共同病理结果，本发明中，虽然主要是以心肌梗死(MI)介导的病理性心脏重构和功能障碍为例，但是显然，其他心血管疾病(如糖尿病性心脏病、高血压性心脏病)介导的病理性心脏重构以及因病理性心脏重构进一步恶化导致的诸如心力衰竭等均属于病理性心脏重构相关疾病的范畴，因此均在本发明的保护范围之内。
本发明的第四个方面，提供促进NKRF编码基因及其表达产物的表达和/或使其活性提高的物质在如下(a1)-(a4)中至少一种的应用；
(a1)制备预防和/或治疗病理性心脏重构和功能障碍的产品；
(a2)抑制心脏成纤维细胞的迁移和侵袭或制备抑制心脏成纤维细胞的迁移和侵袭的产品；
(a3)抑制HuR表达进而抑制MMP2和MMP9 mRNA的稳定性或制备抑制HuR表达进而抑制MMP2和MMP9mRNA的稳定性的产品；
(a4)通过NF-κB依赖性机制与HuR启动子结合从而抑制HuR的转录或制备通过NF-κB依赖性机制与HuR启动子结合的产品。
上述第四方面中的产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用，从而给为病理性心脏重构相关基础研究提供保障。
本发明的第五个方面，提供一种预防和/或治疗病理性心脏重构的方法，所述方法包括向受试者施用促进NKRF编码基因及其表达产物的表达和/或使其活性提高的物质。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次证明了NKRF在成纤维细胞中作为转录抑制因子，对心脏梗死后的心脏重构具有保护作用。在机制上，NKRF通过在HuR启动子中的NRE结合NF-κB的方式来抑制HuR的转录，从而抑制了MMP2和MMP9mRNA的稳定性。上述技术方案研究表明，在心肌梗死后，及早靶向NKRF对于预防晚期心脏重构是一种有效的策略。这些结果为治疗心脏梗死后的心脏重构提供了新的思路。
总之，NKRF可能成为抑制心肌梗死等心血管疾病介导的心脏重构和功能障碍的潜在治疗靶点，这为心脏重构干预提供了一个有前景的途径，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1.心肌梗死(MI)边缘区心脏成纤维细胞(CFs)中NKRF表达下调。
(A-C)雄性C57BL/6J小鼠(8周龄)经过左前降支冠状动脉结扎诱导心肌梗死(MI)，并在MI后28天安乐死。(A)小鼠分组图示。(B)从小鼠MI边缘区域提取的蛋白质进行Westernblot分析和NKRF定量分析(n＝6)。(C)小鼠MI边缘区域内NKRF(红色)和FSP1(绿色)的免疫荧光共染色(比例尺＝20μm)。(D)免疫荧光染色显示原代CFs中NKRF(绿色)的定位(比例尺＝100μm)。(E)ST段抬高型MI患者和正常健康个体的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。(F-H)原代CFs在不同时间接受TNF-α(10ng mL-1)诱导。(F)NKRF的Western blot和定量分析(n＝5)。(G)CFs中亚细胞组分细胞核和细胞质中NKRF的Western blot和定量分析(n＝6)。(H)TNF-α诱导24小时后CFs中的NKRF的免疫荧光染色(比例尺＝100μm)。数据以均值±SEM表示。NS，非显著；*P<0.05；****P<0.0001(未配对双尾Student’s t-test检验)。LAD，左前降支冠状动脉；NKRF，NF-κB抑制因子；FSP1，成纤维细胞特异性蛋白1。
图2.NKRF保护心肌梗死后心脏重构和功能障碍。(A)示意图显示了NKRFF/F和NKRF-CKO小鼠MI诱导的心脏重构和功能障碍的时间过程。(B)NKRFF/F和NKRF-CKO小鼠的超声心动图和测量的LVIDd、LVIDs、EF％和FS％(n＝6)。(C)NKRFF/F和NKRF-CKO小鼠的左室舒张末期相(LVED)和收缩末期相(LVES)心脏磁共振(CMR)成像。(D)来自NKRFF/F和NKRF-CKO小鼠心脏横断面的Masson染色(MT)和天狼猩红染色(PSR)，以及梗死面积定量(比例尺＝1000μm，n＝7)。(E)MI后28天小鼠的心脏重量与体重比(HW/BW)(n＝10)。(F)来自MI边缘区蛋白的MMP2、MMP9、Collagen I和Collagen III的免疫印迹和定量分析(n＝6)。(G)NKRF-CKO(n＝40)和NKRFF/F小鼠(n＝20)在MI或模拟手术后的Kaplan-Meier生存分析。(H)MI后死亡的小鼠；a.显示了由心脏破裂引起的胸腔积血，b.显示了肺水肿的发展。数据以均值±SEM表示。NS，非显著；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，由双向方差分析(ANOVA)和Bonferroni多重比较检验(B、D、E和F)以及log-rank检验(G)确定。NKRFF/F和NKRF-CKO，NKRFflox/flox和NKRFflox/flox:CreS100a4小鼠；LAD，左前降支冠状动脉；MI，心肌梗死；LVIDd，左室内舒张期内径；LVIDs，左室内收缩期内径；EF，左室射血分数；FS，短缩分数；MMP2，基质金属蛋白酶2；MMP9，基质金属蛋白酶9。
图3.NKRF通过下调MMP2和MMP9表达抑制CF迁移和侵袭。(A)Transwell侵袭实验示意图。(B-H)原代CFs转染Ad-Nkrf或Ad-Vector 24小时后，继续用TNF-α(10ng mL-1)处理24小时。(B)Transwell侵袭染色和相对迁移率计算(比例尺＝50μm，n＝7)。(C)划痕愈合实验和指示时间点的迁移率定量(比例尺＝200μm，n＝7)。(D-F)分别是Nkrf、Mmp2和Mmp9的相对mRNA表达(n＝5)。(G)NKRF(n＝8)、MMP2(n＝7)和MMP9(n＝6)的免疫印迹和定量分析。(H)培养上清中MMP2和MMP9活性的明胶酶谱分析和定量分析(n＝4)。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001(双向ANOVA和Bonferroni多重比较检验)。Ad-Nkrf，NKRF腺病毒。
图4.NKRF通过抑制HuR表达抑制MMP2和MMP9 mRNA的稳定性。(A)NKRF抑制MMP2(n＝6)和MMP9(n＝6)的mRNA稳定性。在12小时时观察到显著差异。(B和C)NKRF抑制CFs中TNF-α诱导的HuR表达，包括mRNA(B，n＝5)和蛋白质(C，n＝7)水平。(D和E)NKRF敲除增强了CFs中TNF-α诱导的HuR表达，包括mRNA(D，n＝5)和蛋白质水平(E，n＝4)。(F)NKRFflox/flox小鼠和NKRFflox/flox:CreS100a4小鼠MI边缘区域提取的HuR蛋白的免疫印迹和定量分析(n＝6)。(G和H)HuR抗体富集的MMP2(G，n＝4)和MMP9(H，n＝4)mRNA的琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR结果在RIP实验中。(I和J)HuR解救了NKRF抑制的MMP2(I，n＝4)和MMP9(J，n＝4)mRNA稳定性。在12小时时观察到显著差异。数据以均值±SEM表示。NS，非显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001(无配对的双尾学生t检验(A)，双向ANOVA和Bonferroni多重比较检验(B-F)，以及单向ANOVA和Bonferroni多重比较检验(G-J)。Ad-Nkrf，NKRF过表达腺病毒；Ad-HuR，HuR过表达腺病毒；SiR-Nkrf，Nkrf小干扰RNA(siRNA)；NKRFF/F，NKRFflox/flox小鼠；NKRF-CKO，NKRFflox/flox:CreS100a4小鼠；MI，心肌梗死；Anti-HuR，HuR抗体。
图5.NKRF通过NF-κB依赖机制结合HuR启动子抑制HuR转录。(A)HuR启动子区域的负调控元件(NRE)。(B和C)在染色质免疫沉淀(ChIP)实验中使用NKRF抗体富集的HuR启动子区域中的NRE作为模板，进行的琼脂糖凝胶电泳(B)和RT-PCR结果(C，n＝4)。(D)使用带有野生型HuR启动子(WT，pGL3-WT-HuR启动子)和删除了NRE序列的HuR启动子(DEL，pGL3-DEL-HuR启动子)的萤火虫荧光素表达质粒进行构建图示。(E)双荧光素酶报告(DLR)实验用于分析NKRF对HEK293T细胞中萤火虫荧光素活性的影响(n＝6)。(F)HEK293T细胞中的相对荧光素mRNA表达水平(n＝6)。(G和H)琼脂糖凝胶电泳(G)和RT-PCR结果(H，n＝4)，使用NKRF抗体富集的HuR启动子区域中的NRE作为模板。(I)DLR实验用于分析TNF-α对CFs中萤火虫荧光素活性的影响(n＝3)。(J和K)对在mRNA(J，n＝6)和蛋白质水平(K，n＝6)验证CFs中TNF-α诱导的HuR表达需要NF-κB通路参与。(L)琼脂糖凝胶电泳，使用p65和p50抗体富集的HuR启动子区域中的NRE作为模板。(M和N)CFs中在mRNA(M，n＝6)和蛋白质水平(N，n＝6)验证NF-κB通路介导NKRF调控HuR的表达。(O)共免疫沉淀(Co-IP)实验中NKRF，p65和p50的免疫印迹分析(n＝3)。(P)CFs经TNF-α(10ng mL-1)或PBS处理24小时后，NKRF(绿色)和p50(红色)的免疫荧光染色(放大倍率＝10μm)。(Q)琼脂糖凝胶电泳，使用NKRF，p65和p50抗体富集的HuR启动子区域中的NRE作为模板。(R和S)Co-IP实验中NKRF，p65和p50的免疫印迹分析。(R)CFs经TNF-α(10ng mL-1)或PBS处理24小时。(S)CFs经TNF-α(10ng mL-1)处理24小时后，经Ad-Nkrf或Ad-Vector转染48小时。数据以均值±SEM表示。NS，非显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001(单向ANOVA与Bonferroni多重比较检验(C和O)，双向ANOVA与Bonferroni多重比较检验(J，K，M和N)，以及非配对Student’s t检验(E，F，H和I)。NRE，负调控元件；Anti-NKRF，NKRF抗体；Luc，荧光素；WT，pGL3-WT-HuR启动子质粒；DEL，pGL3-DEL-HuR启动子质粒；pcDNA3.1-NKRF，NKRF过表达质粒；pcDNA3.1-Vector，空载体对照质粒；IMD，NF-κB通路抑制剂IMD 0354；SiR-Nkrf，Nkrf小干扰RNA(siRNA)；Ad-Nkrf，NKRF过表达腺病毒；Ad-Vector，空载体对照腺病毒；DAPI，4',6-diamidino-2-phenylindole；Anti-p65，p65抗体；Anti-p50，p50抗体。
图6.HuR通过上调MMP2和MMP9逆转NKRF对CF迁移和侵袭的抑制作用。(A和B)HuR在CFs中逆转了NKRF对TNF-α诱导的MMP2和MMP9表达在mRNA(A，n＝5)和蛋白质(B，至少n＝6)水平上的抑制作用。(C)明胶酶谱图显示HuR在培养的CFs上清液中逆转了NKRF对TNF-α诱导的MMP2和MMP9增强活性的抑制作用。(D)Transwell侵袭染色和相对迁移率计算(放大倍率＝50μm，n＝7)。(E)划痕愈合实验和在指定时间点的迁移率定量(放大倍率＝200μm，n＝7)。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001(单向ANOVA与Bonferroni多重比较检验)。Ad-Nkrf，NKRF过表达腺病毒；Ad-HuR，HuR过表达腺病毒。图7.在NKRF-CKO小鼠中HuR敲降保护MI后恶化的心脏重构和功能障碍。(A)示意图展示了NKRF-CKO小鼠接受AAV-shRNA-HuR或AAV-shRNA-Scr后，MI诱导的心脏重构和功能障碍的时间进程。(B)在NKRF-CKO小鼠中超声心动图和测量的LVIDd，LVIDs，EF％和FS％(n＝6)。(C)NKRF-CKO小鼠的左室舒张末期(LVED)和收缩末期(LVES)的心脏磁共振成像。(D)NKRF-CKO小鼠心脏组织横截面的Masson染色(MT)和天狼猩红染色(PSR)，以及心脏横断面心脏组织的梗死面积计量(放大倍率＝1000μm，n＝7)。(E)NKRF-CKO小鼠MI后28天的心脏重量与体重比(HW/BW)(n＝10)。(F)NKRF-CKO小鼠MI病灶区的MMP2和MMP9的免疫印迹和定量分析(n＝6)。(G)NKRF-CKO小鼠MI后接受AAV-shRNA-Scr(n＝40)和AAV-shRNA-HuR(n＝19)处理的Kaplan-Meier生存分析。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001(不配对的双侧学生t检验(B，D，E和F)和log-rank检验(G))。NKRF-CKO小鼠，NKRFflox/flox:CreS100a4小鼠；MI，心肌梗死；LAD，左前降支冠状动脉；AAV-shRNA-HuR，腺相关病毒短发夹RNA-HuR；
AAV-shRNA-Scr，腺相关病毒短发夹RNA-随机对照；CMR，心脏磁共振；LVIDd，左室内舒张期直径；LVIDs，左室内收缩期直径；LVEF，左室射血分数；FS，心脏缩短分数。
图8.HuR逆转了NKRF在MI后心脏重构和功能障碍中的保护效应。(A)示意图展示了接受AAV-Nkrf/AAV-Vector(NKRF)和AAV-HuR/AAV-Vector(HuR)的C57BL/6J小鼠中MI诱导的心脏重构和功能障碍的时间进程。(B和C)免疫荧光染色和免疫印迹分析显示，在经过AAV-Nkrf处理14天后，心脏横截面中NKRF(红色)显著过度表达，并与FSP1(绿色)共定位(B)，在分离的CFs中过度表达(C)。(D-F)经过AAV-Nkrf和AAV-HuR处理的C57BL/6J小鼠MI后28天，超声心动图和测量的LVIDd，LVIDs，EF％和FS％(D，n＝7)，心脏横截面的MT和PSR染色(E，放大倍率＝1000μm，n＝7)，以及心脏重量与体重比(HW/BW)(F，n＝7)。(G)来自MI梗死区蛋白质的NKRF，HuR，MMP2和MMP9的免疫印迹和定量分析(n＝7)。(H)经过AAV-Nkrf和AAV-HuR处理的C57BL/6J小鼠MI后的Kaplan-Meier生存分析。数据以均值±SEM表示。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001(单向ANOVA和Bonferroni多重比较检验(D，E，F和G)和log-rank检验(H)。AAV-Nkrf和AAV-Vector(NKRF)，腺相关病毒NKRF和对照；AAV-HuR和AAV-Vector(HuR)，腺相关病毒HuR和对照；DAPI，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；FSP1，成纤维细胞特异性蛋白1；LAD，左前降支冠状动脉；MI，心肌梗死；LVIDd，左室内舒张期尺寸；LVIDs，左室内收缩期尺寸；EF，左室射血分数；FS，心脏缩短分数；MT，Masson染色；PSR，天狼猩红染色。
图9.心肌梗死后不同心脏细胞类型中NKRF的表达。缺血小鼠心脏中分离出心脏成纤维细胞(CFs)，心肌细胞(CMs)和巨噬细胞，结果显示，与假手术组相比,MI组中CFs的NKRF表达显著下调(n＝6)。而在CMs(n＝6)和巨噬细胞(n＝6)中未观察到显著差异。数据以均值±SEM表示。通过未配对的双侧学生t检验来确定P值。NS表示不显著，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
图10.NKRF在高血压小鼠模型的心脏纤维细胞中表达下调。A，Ang II诱导的C57BL/6J高血压小鼠模型示意图。B，天狼猩红染色显示，与对照组相比，经Ang II(400ngkg-1min-1)处理4周的高血压小鼠心脏肌间质基质(ECM)中胶原显著增加(放大倍数＝50μm)。C，免疫荧光共定位染色显示，NKRF(红色)与FSP1(绿色)在经Ang II处理的C57BL/6J小鼠心脏横截面中呈现共定位(放大倍数＝20μm)。ECM，细胞外基质；CFs，心脏成纤维细胞；Ang II，血管紧张素II；CTL，对照组；HT，高血压组；FSP1，成纤维细胞特异性蛋白1。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供检测NKRF编码基因及其表达产物的试剂在制备用于病理性心脏重构诊断和/或预后产品中的应用。
所述产品能够通过检测NKRF编码基因和/或NKRF编码基因表达产物的表达水平从而(早期或辅助)诊断、检测、监测或预测病理性心脏重构的进展；试验证明，NKRF在CFs中的表达受到下调调控，对于调控病理性心脏重构和纤维化具有重要作用。因此，所述NKRF编码基因及其表达产物可作为病理性心脏重构诊断和/或预后生物标志物。
其中，所述NKRF编码基因及其表达产物可为人源和非人源哺乳动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等)；所述NKRF编码基因的表达产物显然可以为NKRF蛋白即NF-κB抑制因子，其直接结合NF-κB，抑制部分NF-κB靶基因的表达。
所述检测NKRF编码基因及其表达产物的试剂包括基于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测NKRF编码基因转录的试剂，和/或基于免疫检测方法检测NKRF表达产物(如NF-κB抑制因子)情况的试剂。
所述产品包括但不限于检测待测样本中所述NKRF表达水平的引物、探针、(基因或蛋白)芯片、核酸膜条、检测试剂盒、检测装置或设备。
所述待测样本为人源或非人源样本，包括但不限于受试者心肌成纤维细胞和心脏组织。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种病理性心脏重构诊断和/或预后评估的系统，所述系统至少包括：
获取单元，其被配置为：获取受试者生物标志物的表达水平；
评估单元，其被配置为：根据获取单元获得的所述生物标志物的表达水平对受试者的患病情况进行评估。
其中，所述生物标志物为NKRF编码基因和/或NKRF编码基因表达产物(如NF-κB抑制因子)。
所述对受试者的患病情况进行评估包括对受试者病理性心脏重构的诊断、病理性心脏重构的恶性程度进行评估。
所述病理性心脏重构的恶性程度包括但不限于心脏功能的恶化、心脏重量和梗死面积的增加、心脏破裂引起的血胸发生率。
本发明的又一具体实施方式中，提供NKRF作为靶点在病理性心脏重构相关疾病防治和/或筛选病理性心脏重构相关疾病药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述筛选病理性心脏重构相关疾病相关药物的方法包括：
1)采用候选物质处理表达和/或含有NKRF的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；
2)完成步骤1)后，检测体系中NKRF的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述NKRF的表达量显著提高，所述候选物质可作为候选的病理性心脏重构药物。
本发明的又一具体实施方式中，所述体系可为细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
同时，需要说明的是，心脏重构是几乎所有导致心功能障碍、增加心力衰竭和死亡率的心血管疾病的共同病理结果，本发明中，虽然主要是以心肌梗死(MI)介导的病理性心脏重构和功能障碍为例，但是显然，其他心血管疾病(如糖尿病性心脏病、高血压性心脏病)介导的病理性心脏重构以及因病理性心脏重构进一步恶化导致的诸如心力衰竭等均属于病理性心脏重构相关疾病的范畴，因此均在本发明的保护范围之内。
本发明的又一具体实施方式中，提供促进NKRF编码基因及其表达产物的表达和/或使其活性提高的物质在如下(a1)-(a4)中至少一种的应用；
(a1)制备预防和/或治疗病理性心脏重构和功能障碍的产品；
(a2)抑制心脏成纤维细胞的迁移和侵袭或制备抑制心脏成纤维细胞的迁移和侵袭的产品；
(a3)抑制HuR表达进而抑制MMP2和MMP9 mRNA的稳定性或制备抑制HuR表达进而抑制MMP2和MMP9mRNA的稳定性的产品；
(a4)通过NF-κB依赖性机制与HuR启动子结合从而抑制HuR的转录或制备通过NF-κB依赖性机制与HuR启动子结合的产品。
本发明的又一具体实施方式中，所述促进NKRF编码基因及其表达产物表达和/或使其活性提高的物质包括但不限于采用人工合成NKRF的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，或上调NKRF表达的启动子或者慢病毒等；同时也可包括化合物类促进剂。
本发明的又一具体实施方式中，上述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用，从而给为病理性心脏重构相关基础研究提供保障。
当上述产品为药物时，所述药物还可包含一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。粉剂及片剂可包含约0.1％至约99.9％的活性成分。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，其实施例为非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种预防和/或治疗病理性心脏重构的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的促进NKRF编码基因及其表达产物的表达和/或使其活性提高的物质。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等，优选指人。所述“有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1、实验方法
动物：使用Cre/LoxP系统生成心脏成纤维细胞(CF)特异性NKRF基因敲除(NKRF-CKO)小鼠。简而言之，通过交叉配对NKRFflox/flox品系(上海模型生物中心，上海，中国)与S100a4-Cre品系(编号：012641；杰克逊实验室)获得NKRF-CKO小鼠。同窝小鼠(NKRFflox/flox[NKRFF/F])作为对照。本研究使用8周龄的雄性NKRF-CKO和NKRFF/F小鼠。8周龄的雄性C57BL/6J小鼠由北京维特里实验动物技术有限公司购买。通过数字编码对实验和分组进行遮盖。特定编码了NKRF(AAV-Nkrf)、HuR(AAV-HuR)和HuR短发夹RNA(AAV-shRNA-HuR，5′-GCACAGAGATTCAGGTTCT-3′)的血清型9腺相关病毒(AAVs)在CFs中进行了转染，这些AAVs来自于中国济南的WZ生物科技公司。AAVs(每种AAV的转染效率为2.8×1011vg/小鼠)的转染效率在尾静脉注射后的14天得到验证。
这些8周龄的雄性C57BL/6J、NKRFF/F和NKRF-CKO小鼠经历了左前降支(LAD)冠状动脉结扎手术，如先前所述。简而言之，LAD冠状动脉在左心房附属部的2-3mm处用7-0线结扎，在2％异氟醚麻醉下进行。假手术组小鼠经历了类似的手术步骤，但没有结扎。高血压小鼠模型通过皮下植入渗透泵(Alzet Model 2002，美国加利福尼亚州)将生理盐水或盐酸缩血管素II(400ng kg-1min-1；目录号：HY-13948；美国新泽西州蒙茅斯朱纳克)输送给小鼠，持续4周。在4周的建模结束后，通过腹腔注射戊巴比妥钠(50mg kg-1)安乐死小鼠，收集它们的血样和心脏，同时测量体重和心脏重量。在左室腔内使用肝素作为抗凝剂，采集血样。通过在4℃下以1,000×g离心15分钟离心血液样本，得到血清，存储在-80℃下。组织学研究包括用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗心脏，用4％福尔马林固定，用石蜡包埋。心脏在液氮中急速冷冻，存储在-80℃下，用于分子生物化学研究。在进行本研究之前，我们首先探究了S100a4-Cre和NKRFF/F小鼠在心脏梗死后的心脏功能变化、梗死面积和心脏重量/体重(HW/BW)比之间的差异。比较这两组之间的心脏梗死后参数，没有观察到显著差异。因此，NKRFF/F小鼠被用作对照组。山东大学齐鲁医院动物实验伦理委员会(DWLL-2020-082)批准了本研究中的所有动物实验方案。所有动物实验都按照美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南的要求进行。我们尽一切努力减少动物的痛苦。
超声心动图检查：在4周的建模结束时，使用胸骨超声心动图(VisualSonic VeVo2100成像系统，加拿大多伦多)评估小鼠的心脏结构和功能。小鼠用2％异氟醚吸入麻醉，放置在保持在37±1℃的加热平台上，并连接到心电图仪(ECG)。左心室内舒张期内径(LVIDd)和左心室内收缩期内径(LVIDs)通过M模式超声心动图在胸骨长轴视图中记录。左心室射血分数和心脏短缩分数将自动计算。
小鼠心脏磁共振(CMR)成像：按照先前的报道[9f]进行了小鼠CMR成像。使用带有心电图(ECG)和呼吸门控(SA Instruments，纽约州斯托尼布鲁克)的4.7T MRI系统(BioSpec 47/40；Bruker，德国埃廷根)进行了体内CMR成像。小鼠用2％异氟醚麻醉，并放置在加热平台上，以保持体温在37±1℃。针电极固定在前肢和后肢上以获得心电图信号，R波用于生成图像采集的触发脉冲。在轴向方向上进行了T1W-CMR黑血成像，使用FLASH短时序列来覆盖左心室。成像参数如下：视野(FOV)＝25×25mm2，矩阵大小＝192×192，切片厚度＝1.0mm，切片数＝6，TR＝38.3ms，TE＝2.8ms，翻转角度＝15°，平均次数＝5，总扫描时间＝7分21秒。
组织学、免疫荧光、Masson染色和天狼星红染色：心脏缝线和心尖之间的部分被用作梗死区。梗死边缘区域被定义为横截面上梗死和非梗死区域之间的界面区域。心脏组织(在结扎下方1毫米处)使用显微切片机(RM2235；Leica Microsystems，Inc.，德国曼海姆)切成4微米厚的横截面，沿水平长轴切割。MT和PSR染色采用连续切片，用于评估心肌纤维化和胶原沉积。梗死面积的计算公式为梗死周长除以整个切片视野内左室总周长。
NKRF和FSP1的免疫荧光染色包括脱脂切片，随后进行抗原修复(Cat.No.C1034；Solarbio，北京，中国)，在PBS中加入0.1％Triton X-100(Cat.No.GC204003；Servicebio，武汉，中国)处理10分钟。切片在室温(23-27℃)下与PBS中的2.5％正常山羊血清(Cat.No.G1208；Servicebio)一起孵育30分钟，然后在4℃过夜与抗NKRF抗体(Cat.No.sc-365568；Santa Cruz，德克萨斯州，美国)和FSP1抗体(Cat.No.16105-1-AP；Proteintech，武汉，中国)。随后，切片用PBS洗涤三次，然后在黑暗中37℃孵育1小时，与Alexa Fluor 594(Cat.No.ab150120；Abcam，马萨诸塞州剑桥)和Alexa Fluor 488(Cat.No.ab150081；Abcam)二级抗体(1：200)一起。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，Cat.No.ab104139；Abcam)标记。使用Zeiss 73447共聚焦激光扫描显微镜(Oberkochen，德国)观察梗死边缘区域的免疫荧光染色。从每个组中随机选择代表性图像。
免疫荧光染色涉及用4％甲醛固定主要的心脏成纤维细胞，用0.1％Triton X-100(Cat.No.GC204003；Servicebio)渗透，用2.5％正常山羊血清(Cat.No.G1208；Servicebio)在室温(23-27℃)下进行阻断，然后在4℃过夜与抗NKRF抗体(Cat.No.ab168829；Abcam)、p50抗体(Cat.No.66992-1-Ig；Proteintech)、FSP1抗体(Cat.No.16105-1-AP；Proteintech)、维门蛋白抗体(Cat.No.ab92547；Abcam)、CD31抗体(Cat.No.ab28364；Abcam)和cTnI抗体(Cat.No.ab47003；Abcam)孵育过夜。随后，使用荧光二级抗体、DAPI染色和上述描述的共聚焦显微镜进行孵育。从每个组中随机选择代表性图像。
细胞因子测定：我们在山东大学齐鲁医院连续招募了11名ST段抬高型心肌梗死患者，他们在症状发作后的12小时内入组。我们还招募了12名与年龄和性别相匹配的健康志愿者作为对照组。所有参与者均签署了知情同意书，研究得到了山东大学齐鲁医院伦理委员会的批准(批准号2021-151)，并按照赫尔辛基宣言的原则进行了研究。人体血清样本被收集并储存在-80℃。根据制造商的说明书，使用酶联免疫荧光分析试剂盒来测定TNF-α(Cat.No.DTA00D；RD Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)、IL1B(Cat.No.DLB50；RDSystems)和IL6(Cat.No.D6050；RD Systems)水平。
试剂和抗体：重组小鼠TNF-α蛋白(Cat.No.315-01A)由PEPROTECH(美国新泽西州Rocky Hill)购买。IMD 0354试剂由Selleck(中国上海)购买。其他试剂和抗体在具体方法中已提及。
心脏成纤维细胞(CFs)的分离、细胞培养和转染：如先前所述，从出生后1-3天的小鼠心脏中分离原代新生儿小鼠CFs。简单来说，将小鼠用异氟醚(0.5％)麻醉后，用70％乙醇清洗，并取出心脏。将心室组织切成1mm3的小块，然后在4℃(旋转50rpm)的条件下，使用含有0.0125％胶原酶II(Cat.No.LS004176；Worthington，美国新泽西州Lakewood)的D-Hank溶液进行消化，过夜。第二天废弃上清液，然后将组织在37℃水浴中，使用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.0125％胰蛋白酶(Gibco，美国纽约州大岛)的D-Hank溶液中进行进一步消化，低速旋转2分钟。将细胞悬液收集起来，通过100μm的聚丙烯细胞过滤网(Cat.No 15-1100；Biologix，中国济南)过滤，然后与含有10％胎牛血清(FBS)(Cat.No.10100147C；ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州瓦尔瑟姆)的Dulbecco改良的鹰嘴豆培养基(DMEM；Gibco BRL，美国盖瑟斯堡)的等体积混合，以终止消化。重复此过程，直到所有组织被消化。将样本以1,000rpm离心5分钟，废弃上清液，将细胞沉淀重新悬浮在含有10％ FBS、1％青霉素和链霉素(Cat.No.10378016；Thermo Fisher Scientific)的DMEM中，在37℃，5％ CO2下孵育1.5小时(Thermo Model 371，美国俄亥俄州马里埃塔市)。附着在培养皿上的细胞即为CFs。
使用Lipofectamine RNAi MAX转染试剂(Cat.No.13778150，Thermo FisherScientific)，根据制造商的说明对CFs进行小干扰RNA(siRNA)转染。NKRF、HuR和乱序对照的siRNA商业合成由Ribobio(中国广州)执行。针对NKRF和HuR的siRNA的靶序列如下：SiR-Nkrf-1，5′-CCGGTTCCAAATTCCATGT-3′；SiR-Nkrf-2，5′-CCAGCATGCCAAGAAACTT-3′；SiR-Nkrf-3，5′-CCTGTAGCAACCAACATGT-3′；SiR-HuR-1，5′-CCAAGAGGAACTACGAAGT-3′；SiR-HuR-2，5′-CAAGCTCAGAGGTCATCAA-3′；SiR-HuR-3，5′-GCACAGAGATTCAGGTTCT-3′。
Nkrf腺病毒(Ad-Nkrf)和HuR腺病毒(Ad-HuR)由WZ Biosciences Inc.(中国济南)获得。根据制造商的说明进行Ad-Nkrf和Ad-HuR的转染。在CFs中进行腺病毒转染(MOI＝200)，48小时后进行后续过表达实验。当细胞达到70％至80％的密度时，CFs(第1-3代)在用TNF-α(10ng mL-1)处理之前，在无血清的DMEM中孵育过夜。
从梗死小鼠心脏中分离不同的心脏细胞群：根据先前的描述，于心肌梗死后的4周进行了从梗死小鼠心脏中分离不同心脏细胞群的操作。采用既定的方案分离心肌细胞。使用骨骼肌解离试剂盒(Miltenyi Biotech，中国上海)对心脏进行分离，用于分离心脏成纤维细胞和巨噬细胞的单细胞悬浮液。使用抗F4/80磁珠(Cat.No.130-110-443；MiltenyiBiotech)根据制造商的指示，从成纤维细胞中阳性选择巨噬细胞。然后通过在4℃下以300×g离心5分钟的方式，收集纯化细胞，以进行后续的蛋白质提取。
蛋白质提取与Western印迹分析：采集的心脏样本和成纤维细胞以放射免疫沉淀试剂缓冲液(Sigma-Aldrich，美国圣路易斯)进行裂解，加入1X蛋白酶抑制剂混合物(Cat.No.04693132001；Roche，美国印第安纳波利斯)。样本在组织匀浆器(FLUKO，中国上海)中充分裂解。将样本在4℃下以10000×g离心10分钟，上清液用于蛋白质定量和变性处理。核与细胞质蛋白的分离通过商业MinuteTM Cytoplasmic&Nuclear Extraction Kit(Cat.No.SC-003；INVENT，美国明尼苏达州普利茅斯)按照制造商的说明进行。提取的蛋白质浓度使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行测量，并使用提取试剂将其调整到类似的浓度。提取的蛋白质使用4-10％梯度Bis-Tris SDS凝胶(Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫尔克里斯)分离，然后转移到硝酸纤维膜(Millipore，美国马萨诸塞州比勒里卡)。膜在室温(23-27℃)下的5％脱脂奶中孵育1小时，随后用主要抗体与NKRF(Cat.No.14693-1-AP；Proteintech)、HuR(Cat.No.11910-1-AP；Proteintech)、MMP2(Cat.No.10373-2-AP；Proteintech)、MMP9(Cat.No.10375-2-AP；Proteintech)、GAPDH(Cat.No.2118；Cell Signaling Technology，美国丹弗斯)、histone-H3(Cat.No.17168-1-AP；Proteintech)、collagen I(Cat.No.66761-1-Ig；Proteintech)、collagen III(Cat.No.22734-1-AP；Proteintech)、p65(Cat.No.ET1603-12；HUABIO，中国杭州)、以及p50(Cat.No.66992-1-Ig；Proteintech)在4℃过夜进行孵育。第二天，膜用三次Tris缓冲盐水和Tween 20(TBST)洗涤，然后在室温(23-27℃)下与辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗(Cat.No.ab6721用于兔子；ab6728用于小鼠；Abcam)一起孵育1小时。然后，膜用TBST三次洗涤，使用ECL西方印迹检测试剂盒(Millipore，美国加利福尼亚州特梅库拉)将蛋白质条带可视化(AMERSHAM ImageQuant 800，GE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典)，并使用ImageJ(美国国立卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达)定量条带的强度。蛋白质表达水平被归一化为GAPDH或histone H3的表达水平。
总RNA提取与实时荧光聚合酶链式反应(RT-PCR)分析：根据制造商的方案，使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)从细胞中提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒(Takara Biomedical Technology)将RNA(1μg)逆转录成cDNA。在Bio-Rad CFX96TM实时荧光PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories Inc.)上使用SYBR PCR混合物(Roche，德国曼海姆)和引物进行RT-PCR扩增。实时PCR扩增程序在95℃下进行10分钟，然后进行35个连续的扩增循环(95℃下30秒的变性，60℃下30秒的退火，72℃下30秒的延伸)。Actin RNA被用作内部对照。使用ΔCt方法计算表达水平，使用2^-ΔΔCt方法进行比较。
细胞迁移和侵袭实验：侵袭迁移实验使用具有8μm孔径的聚碳酸酯膜滤器的24孔Transwell透过性支架(Costar，美国缅因州肯尼邦克)。在Transwell侵袭系统的聚碳酸酯膜的上部区域涂有一层Matrigel(Corning，美国纽约州)以在体外模拟细胞外基质。处理后，CFs(70％至80％的密度)被放置在含无血清DMEM的上腔中，并孵育24小时。化学引诱物(10％FBS在DMEM中)被装入系统的下井并孵育。用棉签移除滤器上表面的CFs，将滤器下表面的CFs固定在4％甲醛中，并用结晶紫染色(Cat.No.G1014；Servicebio)。随后，经过用双蒸馏水冲洗多余染料后，染色的CFs在自然通风下晾干30分钟。通过倒置显微镜(Olympus，日本东京)在光场下计数滤膜下表面的迁移的CFs。
CF迁移是通过划痕愈合实验来确定的。处理后，CFs单层在6孔板中培养。在附着于板上后，使用1mm宽的尖端沿着孔的直径划破，以创建创口空间。使用完整的DMEM(10％FBS)冲洗掉脱落的细胞。然后，在孵化器中以37℃和5％CO2条件下，将CFs在完整的DMEM培养基中培养0小时、6小时、12小时和24小时。在不同的时间点，使用倒置显微镜(Olympus)获得迁移的显微图像。使用Image J测量创口的距离。在每个图像中，三个测量的平均值被用作平均距离。迁移率计算如下：
明胶凝胶电泳：使用明胶凝胶电泳法评估了MMP2和MMP9的活性。处理后的CFs上清液被收集，与5倍的加载缓冲液混合，并在含有0.1％明胶的8％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中以120伏电压分离，持续3小时。凝胶在2.5％Triton X-100溶液中洗涤和摇动两次，持续30分钟，然后在50毫升的反应缓冲液中孵育(40毫MTris-HCl，pH 8.0，10毫MCaCl2，0.01％NaN3)，在37℃下孵育12小时。然后，凝胶在50％甲醇和10％乙酸中加入0.25％孔雀蓝R-250(Cat.No.ST031；Beyotime，中国上海)染色1小时。MMP9和MMP2在去染色后(10％乙酸，20％甲醇)两次持续30分钟后显示出清晰的条带。
RNA免疫沉淀(RIP)实验和mRNA稳定性实验：使用Magna RIP试剂盒(Cat.No.17-701；Millipore)按照制造商的说明进行RIP实验。简要地说，全细胞裂解物与兔IgG(Cat.No.2729；Cell Signaling Technology)或HuR抗体(Cat.No.11910-1-AP；Proteintech)在4℃孵育过夜，抗体预先与磁性蛋白A/G珠(Cat.No.CS203178；Millipore)共结合。下拉的蛋白质-RNA复合物被洗涤，并与蛋白酶K缓冲液(55℃30分钟；Cat.No.CS203218；Millipore)孵育。使用苯酚：氯仿：异戊醇(125:24:1，Solarbio)提取RNA，然后使用PrimeScript RT试剂盒(Takara Biomedical Technology)合成cDNA。产物经过PCR、琼脂糖凝胶电泳和使用SYBR PCR mix(Bio-Rad)的RT-PCR。
MMP2和MMP9 mRNA稳定性实验在处理了TNF-α(10ng mL-1)的初级CFs中进行。在TNF-α处理(10ng mL-1)后，将心脏成纤维细胞培养在含有放线菌素D(5μg mL-1；Cat.No.129935；Sigma-Aldrich)的新鲜DMEM中。在0小时、4小时、8小时和12小时时从这些CFs中提取mRNA，然后进行逆转录和RT-PCR。
染色质免疫沉淀(ChIP)实验：使用Magna ChIPTM HiSens染色质免疫沉淀试剂盒(Cat.No.0025；Millipore)按照制造商的建议进行ChIP实验。简要地说，每个免疫沉淀样本使用在10厘米培养皿中培养的大约2×106个原代CFs。CFs在室温(23-27℃)固定10分钟，并在Bioruptor UCD-200TM-EX上以高功率进行16个周期的30秒ON和30秒OFF超声处理。结合于NKRF、p65和p50的DNA使用抗-NKRF(Cat.No.14693-1-AP；Proteintech)、抗-p65(Cat.No.ET1603-12；HUABIO，杭州，中国)和抗-p50(Cat.No.14220-1-AP；Proteintech)沉淀。兔IgG(Cat.No.2729；Cell Signaling Technology)被用作对照。沉淀的DNA在琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR之后进行PCR，使用特定的HuR启动子引物计算ChIP DNA的倍增富集。
双荧光素酶报告(DLR)实验：野生型HuR启动子(pGL3-WT-HuR启动子)和删除的负调控元件(NRE)序列HuR启动子(pGL3-DEL-HuR启动子)被亚克隆到荧光素酶表达载体pGL3-Basic质粒中，使用DLR Assay System(Cat.No.E1910；Promega，麦迪逊，WI，美国)在HEK293T细胞中执行DLR实验。HEK293T细胞(Cat.No.CRL-11268，ATCC，马纳萨斯，VA，美国)在添加了10％ FBS的DMEM中培养。Renilla荧光素控制报告载体质粒被用作内部对照，以监测转染效率。质粒使用Lipofectamine 3000转染试剂(Cat.No.L3000001；Thermo FisherScientific)按照制造商的说明转染到HEK293T细胞中。相对荧光素酶活性通过使用CentroXS3 LB 960微板发光仪(Berthold Technologies，Bad Wildbad，德国)在转染后48小时，以荧光素酶和Renilla荧光素酶的活性比值表示。
共免疫沉淀(Co-IP)分析：对于Co-IP实验，处理后的CFs在包含哺乳动物细胞特异性蛋白酶抑制剂混合物的IP缓冲液(150mM盐水，50mM Tris-HCl，1％ NP-40，pH 7.8)中裂解。使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测定提取的蛋白质浓度，并使用提取试剂将其调整到相似的浓度(在提取物之间)。简要地说，1mg蛋白质与磁性蛋白A/G珠(Cat.No.HY-K0202；MedChemExpress，上海，中国)共孵育，这些珠子预先涂覆了5μg兔IgG(Cat.No.2729；Cell Signaling Technology)、抗-NKRF(Cat.No.14693-1-AP；Proteintech)、抗-p65(Cat.No.ET1603-12；HUABIO)或抗-p50(Cat.No.14220-1-AP；Proteintech)抗体，以恒定的旋转速度在4℃过夜。然后，用PBST洗涤珠子五次(136.89mMNaCl，2.67mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4和0.5％ Tween 20)。从磁性珠子中洗脱出沉淀的蛋白质使用2x加载缓冲液(Cat.No.P0015F；Beyotime)煮沸5分钟。免疫沉淀的蛋白质被用于西方印迹分析。
统计分析：所有数据均以均值±均值标准误差(SEM)表示。所有分析均使用GraphPad Prism 9(GraphPad Software，圣地亚哥，CA，美国)执行。每个实验至少独立重复三次以进行统计分析。所有数据均使用Shapiro-Wilk正态性检验进行正态性检验。正态性检验中的每组(P>0.05)表示数据近似正态分布。对于正态分布数据，使用未配对的双尾学生t检验来确定两组之间的统计显著性差异。对于具有一个变量和正态分布的多个组，执行单向方差分析(ANOVA)，然后使用Bonferroni多重比较检验(使用不同数量的每个条件的重复混合模型)来确定统计差异。对于具有多个变量的多个组，使用双因素方差分析，然后使用Bonferroni多重比较检验来比较多个组。使用非参数统计的Kruskal-Wallis检验来分析非正态分布数据，然后使用Dunn的事后检验进行多重比较。创建Kaplan-Meier曲线以说明MI后的累积生存情况。累积生存的差异使用log-rank检验进行分析。统计显著性设置为P<0.05，除非另有说明。用于评估显著性的测试在图例中有详细说明。
2、实验结果
2.1NKRF在病理性心脏重构中的表达下调
我们首先依据之前的报告建立了一个8周龄的雄性C57BL/6J小鼠心肌梗死模型，以研究临床相关模型中病理性心脏重构的机制(图1A)。MI后4周，NKRF在MI边界区域的表达显著降低(图1B)。我们按照既定的方案从缺血小鼠心脏中分离出心脏成纤维细胞(CF)、心肌细胞(CM)和巨噬细胞群体，以研究NKRF在MI后不同心脏细胞类型中的作用。结果发现，MI组中CF的NKRF表达显著低于假手术组，而在CM和巨噬细胞中没有明显差异(图9)。
免疫荧光染色显示，在MI边界区域的CFs中，NKRF表达明显下调(图1C)。因此，我们将研究方向集中在了解NKRF在MI后CFs中的特定作用。我们将含有Ang II的渗透泵皮下植入C57BL/6J小鼠(8周龄)，以进一步阐明NKRF在CFs中在病理性心脏重构中的作用，模拟高血压状态下的病理性心脏重构和纤维化模型，持续4周(图10A)。天狼猩红染色(PSR)显示，高血压小鼠心脏肌肉的ECM胶原水平显著增加(图10B)。此外，在高血压小鼠中，CFs中NKRF的表达也有所降低(图10C)。这些结果表明，NKRF在CFs中的表达受到下调调控，对于调控病理性心脏重构和纤维化具有重要作用。
以前的研究表明，在C243细胞系中，在核仁中检测到NKRF表达，在核质和细胞质中也检测到部分表达。然而，原代CFs中NKRF的定位仍然未知。通过按照先前报道的方法从新生C57BL/6J小鼠(1-3天龄)中分离原代CFs，免疫荧光染色显示，大多数分离的原代CFs表达FSP1(CF标记蛋白)，这表明了分离CFs的特异性。此外，免疫荧光染色显示，几乎所有分离的原代CFs表达vimentin(另一个CF标记)，没有CD31(内皮细胞标记)或cTnI(心肌细胞标记)的表达。此外，在原代CFs中，NKRF主要在细胞核中表达(主要是在核仁中)，而在细胞质中也有一些表达，这一发现通过免疫荧光染色得到了证实(图1D)。这与C243细胞系的研究结果相一致。
急性炎症反应中会释放许多炎性因子，这些炎性因子会对修复和增殖阶段产生重要影响。我们测量了ST段抬高心肌梗死(STEMI)患者发病症状起12小时内的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。与健康对照组相比，STEMI患者的TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高(图1E)。此外，在MI后3天，与假手术组相比，C57BL/6J小鼠心脏梗死边缘区的TNF-αmRNA水平显著升高。我们使用TNF-α(10ng mL-1)、IL-1β(10ng mL-1)和IL-6(20ng mL-1)来模拟体外炎症环境，以阐明炎症因子对CFs中NKRF的影响。免疫印迹显示，在12小时内，TNF-α导致NKRF的表达逐渐下调(图1F)。与此同时，IL-1β并没有产生类似的影响。IL-6在24小时内显著降低NKRF的表达。此外，通过分离CFs的细胞核和细胞质亚细胞组分进行蛋白质印迹分析，证实NKRF的表达下降主要反映在细胞核中，在TNF-α诱导下，CFs的细胞质没有显著变化(图1G)。免疫荧光染色进一步验证了这一发现(图1H)。总之，这些结果表明，在病理性心脏重构中，NKRF的表达受到显著下调。此外，我们在原代CFs中鉴定了NKRF主要定位于细胞核(主要是在核仁中)，并且其在体外对TNF-α的诱导下被下调。这些发现强调了NKRF在调控病理性心脏重构和纤维化，尤其是涉及CFs介导病理性心脏重构和纤维化方面的潜在重要性。
2.2、NKRF保护心肌梗死后心脏重构和功能障碍
我们构建了成纤维细胞特异性NKRF基因敲除雄性小鼠(NKRFflox/flox:CreS100a4[NKRF-CKO])以研究CF中NKRF在MI诱导的心脏重构中的功能重要性。将NKRF-CKO小鼠和其同窝对照小鼠(NKRFflox/flox[NKRFF/F])接受MI模型处理(图2A)。这些小鼠中，NKRF蛋白在CFs中被特异性敲降，但在心肌细胞和其他组织中未受影响。MI后，NKRF-CKO小鼠表现出较低的心脏功能(左室射血分数LVEF和缩短分数FS)，左室舒张末内径(LVIDd)和收缩末内径(LVIDs)比NKRFF/F小鼠更大(图2B)。心脏磁共振成像也显示了同样的结果(图2C)。NKRF-CKO小鼠MI后显示出更大的梗死面积(图2D)。与NKRFF/F小鼠相比，NKRF-CKO小鼠的心重/体重(HW/BW)比增加(图2E)。我们在MI边界区域分析了MMP2、MMP9、胶原I和胶原III的表达，以探索与纤维化相关蛋白质的变化。与NKRFF/F小鼠相比，NKRF-CKO小鼠中MMP2和MMP9的表达在MI诱导增加的基础上进一步增加，但胶原I和胶原III的蛋白质水平没有显著变化(图2F)。相应地，MI后28天，NKRF-CKO小鼠的存活率(35％，40只小鼠中26只死亡)较NKRFF/F小鼠(75％，20只小鼠中5只死亡)低(P＝0.03；图2G)。此外，几乎所有死亡事件发生在MI后的10天之内，其中大部分死亡事件发生在造模后的7天之内。对所有死亡小鼠的尸检结果显示，NKRFF/F小鼠中有2例死亡(40％)是由心脏破裂引起的血胸，而NKRF-CKO小鼠中有19例死亡(73.1％)出现相同情况(P＝0.30，图2H.a)。其余死亡小鼠出现肺水肿；因此，我们推测死因是因为心脏衰竭导致的循环功能障碍(图2H.b)。总之，小鼠中CF特异性的NKRF基因敲除加剧了MI后的心脏重构，导致心脏功能受损、梗死面积增加和存活率下降。这些发现表明，在MI后，NKRF在心脏重构和功能障碍方面具有保护作用。
2.3NKRF通过下调MMP2和MMP9的表达抑制CF的迁移和侵袭
我们在Transwell侵袭系统的聚碳酸酯膜上层涂上一层Matrigel，以在体外模拟ECM。这种ECM的模拟要求CFs分泌MMPs来降解ECM，促进它们迁移到下层(图3A)。TNF-α显著增加了CF向下层的侵袭，但NKRF的过表达抑制了这种效应(图3B)。类似地，划痕愈合实验显示，随着时间的推移，TNF-α显著增强了CF的迁移，而NKRF的过表达抑制了这种增强效应(图3C)。
MMP2和MMP9的增加促进了CF的迁移。在体内失活MMP9和MMP2可防止小鼠MI后心脏破裂，减轻胶原蛋白的积累、左心室扩大和心脏功能障碍。实时聚合酶链反应(RT-PCR)显示，TNF-α诱导后NKRF的mRNA水平显著降低(图3D)。MMP2和MMP9的mRNA水平在TNF-α诱导后显著增加，而NKRF的过表达显著抑制了这种效应(图3E和3F)。蛋白质水平的变化与mRNA水平的变化一致(图3G)。明胶酶凝胶酶谱显示，TNF-α显著增加了MMP2和MMP9的活性，但NKRF显著抑制了这种增加效应(图3H)。此外，我们构建了三个NKRF的小干扰RNA(siRNA)用于反向敲低验证；第三个siRNA在CFs中的敲低效率最高。敲低实验中，TNF-α诱导后NKRF mRNA水平的下降与过表达实验中观察到的一致。在mRNA水平上，NKRF的敲低进一步增强了TNF-α诱导的MMP2和MMP9水平的增加效应。蛋白质水平的变化与mRNA水平的变化一致。NKRF的敲低显著放大了TNF-α诱导的MMP2和MMP9活性的增加。
总之，NKRF的过表达通过下调MMP2和MMP9的表达及其活性来抑制CF的迁移和侵袭。这表明在病理性心脏重构背景下，NKRF在调节ECM重构和CF行为方面可能具有潜在作用。
2.4NKRF通过抑制HuR表达进而降解MMP2和MMP9的mRNA稳定性
NKRF在MMP2和MMP9的mRNA和蛋白水平上进行调控。这表明NKRF参与了MMP2和MMP9的转录或转录后调控。NKRF可以通过与IFN-β和IL-8的启动子中的一个NRE(AATTCCTCTGA)结合来发挥作用，从而抑制它们的转录。然而，在NCBI Gene中，我们没有在MMP2和MMP9的启动子中找到NRE序列。我们设计了覆盖MMP2和MMP9基因启动子区域的引物进行染色质免疫沉淀(ChIP)实验，以确认NKRF是否通过直接结合基因启动子来进行转录负调控。不幸的是，NKRF没有富集任何MMP2和MMP9基因启动子区域的片段。随后，我们通过阿克拉霉素D阻断mRNA合成，观察在TNF-α刺激下活化的CFs中不同时间点的MMP2和MMP9的剩余mRNA水平。在放线菌素D处理后，所有组剩余的mRNA水平逐渐下调。在放线菌素D处理12小时后，NKRF的过表达显著降低了MMP2和MMP9的剩余mRNA水平(图4A)。上述结果表明，NKRF通过抑制其mRNA稳定性在转录后水平上调控MMP2和MMP9。
HuR(也称为胚胎致命异常视觉样1，ELAVL1)是一种广泛存在的RNA结合蛋白，通过转录后途径调节基因表。它通过影响TGF-β、P53和MMP9 mRNA的稳定性，在各种病理机制中发挥作用。此外，我们先前发现HuR在MMP2和MMP9 mRNA的3'非翻译区(3'UTR)结合腺嘌呤尿苷富含元素，从而增加了MMP2和MMP9 mRNA的稳定性。我们检查了NKRF是否在CFs中调控HuR表达，以验证NKRF是否通过HuR调控MMP2和MMP9的表达。根据RT-PCR和免疫印迹实验，TNF-α显著增加了HuR的转录(图4B)和翻译(图4C)，而NKRF的过表达显著抑制了这一效应，但在基线情况下未观察到对HuR的影响。相反，当NKRF被敲低时，TNF-α诱导的HuR转录(图4D)和翻译(图4E)进一步增加。此外，在未施加TNF-α的情况下，NKRF敲低显著增加了HuR转录(图4D)和翻译(图4E)。在NKRFF/F小鼠的MI边界区域，MI显著诱导了HuR的表达，并在NKRF-CKO小鼠中进一步增加了HuR的表达(图4F)。此外，RNA免疫沉淀(RIP)实验显示，通过HuR抗体富集的MMP2(图4G)和MMP9(图4H)mRNA水平在NKRF过表达时显著降低；然而，当过表达HuR时，这种效应被逆转。通过RT-PCR获得的结果与琼脂糖凝胶电泳获得的结果一致。在放线菌素D阻断mRNA合成后，NKRF抑制的MMP2(图4I)和MMP9(图4J)mRNAs的稳定性被HuR的过表达所恢复。总之，NKRF通过抑制HuR表达来降解MMP2和MMP9的mRNA稳定性。
2.5NKRF通过NF-κB依赖性机制与HuR启动子结合从而抑制HuR的转录
我们在HuR启动子的转录起始位点上游的-1493到-1485位点处发现了类似的NRE序列(AATTCCTGA)。我们设计了正向和反向引物，间隔长度为197bp，横跨预测的HuR启动子中的NRE序列，用于进行染色质免疫沉淀(ChIP)实验，以验证NKRF是否与HuR启动子中的NRE序列结合(图5A)。ChIP显示，NKRF抗体显著富集了一个197bp长度的条带，而在CFs的负对照IgG通道中未发现相同位置的条带(图5B)。RT-PCR实验使用下拉DNA片段作为模板，结果与ChIP结果相似(图5C)。通过将野生型(WT)HuR启动子和带有已删除(DEL)NRE序列的HuR启动子亚克隆到荧光素酶表达载体pGL3-Basic中，对HEK293T细胞进行双荧光素酶报告(DLR)实验来验证NKRF在调控HuR转录中的作用(图5D)。NKRF显著抑制了WT组中荧光素酶活性，但在DEL组中未观察到这种差异(图5E)。根据RT-PCR实验，荧光素酶mRNA的表达与DLR结果一致(图5F)。ChIP琼脂糖凝胶电泳显示，在TNF-α处理期间，NKRF对预测的NRE序列的富集在CFs中下调(图5G)。NKRF抗体或IgG富集的DNA片段的RT-PCR结果与ChIP琼脂糖凝胶电泳结果一致(图5H)。构建的WT和DEL荧光素酶报告质粒被转染到CFs中，DLR证明TNF-α显著促进了WT组中荧光素酶活性，但DEL组中未观察到这种效应(图5I)。
典型的NF-κB途径的特点是由于TNF-α与TNFR1结合而导致的IκBα的诱导性磷酸化和降解。这进一步释放出成熟的p65:p50异二聚体复合物进入细胞核，导致下游靶基因的转录。NF-κB激活了人类胃癌细胞系中HuR的转录。我们使用抑制剂IMD 0354来研究NF-κB途径在初级CFs中调控HuR转录中的作用。这种抑制剂阻断IκB激酶，导致IκBα的磷酸化和降解被抑制，从而使p65:p50二聚体定位于细胞质。TNF-α在对照组中诱导了HuR的mRNA和蛋白表达，然而，在IMD 0354预处理后，这种效应消失了(图5J和5K)。这表明NF-κB途径在转录水平介导了TNF-α诱导的HuR表达。ChIP实验显示，p65和p50结合到HuR启动子，而在经过TNF-α处理后，这种结合显著增强(图5L)。此外，通过IMD 0354阻断NF-κB途径后，TNF-α诱导的p65和p50富集到HuR启动子的作用被抑制，但不影响NKRF富集到HuR启动子的下调趋势。这些结果表明，NF-κB途径通过p65和p50结合到HuR启动子介导了CFs中TNF-α诱导的HuR转录调控。接下来，我们通过抑制NF-κB途径来研究NKRF对HuR表达的影响。NKRF敲低在经过TNF-α处理的CFs中显著提高了HuR的mRNA和蛋白水平。然而，在CFs预先经过IMD 0354预处理时，未观察到这种效应(图5M和5N)。这个结果表明，NKRF对HuR的负转录调控需要NF-κB途径的参与。我们对NKRF通过NF-κB途径进行的负转录调控的研究揭示了NKRF与p50(而不是p65)在总CFs中的相互作用，这是根据共免疫沉淀(Co-IP)结果得出的(图5O)。免疫荧光染色证实了NKRF与p50的共定位(图5P，上)。ChIP分析证实，TNF-α处理后，NKRF过表达阻碍了p65和p50结合到TNF-α处理的CFs中的HuR启动子(图5Q)。此外，Co-IP(图5R)和免疫荧光染色(图5P)结果表明，在TNF-α诱导的NF-κB激活后，NKRF结合到p50上的能力显著降低。用p65和p50抗体进行的反向拉降实验显示，TNF-α处理后，p65-p50异二聚体复合物的形成显著增加(图5R)。此外，Co-IP显示，NKRF过表达增加了NKRF与p50的结合，而在TNF-α处理的CFs中，p50-p65在细胞核内的结合减少(图5S)。总之，TNF-α处理导致细胞核中NKRF表达下调，从而促使p50与p65结合形成p65:p50异二聚体复合物。随后，该复合物结合到HuR启动子，促进其转录。
2.6HuR通过上调MMP2和MMP9的表达逆转NKRF对CF迁移和侵袭的抑制作用
随后，我们探索了HuR是否能够在mRNA和蛋白水平上对抗NKRF对MMP2和MMP9表达的抑制作用。通过在NKRF的基础上过表达HuR腺病毒，我们观察到显著的逆转效应，即HuR逆转了NKRF对MMP2和MMP9mRNA水平的抑制作用(图6A)。此外，蛋白水平上的趋势与mRNA水平一致(图6B)。与此同时，第三个siRNA在三个HuR敲低候选者中被确定为最有效的siRNA。随后的反向验证表明，HuR敲低显著对抗了NKRF敲低对MMP2和MMP9 mRNA和蛋白水平促进作用。明胶酶凝胶酶谱分析显示，HuR显著恢复了NKRF对MMP2和MMP9活性的抑制作用(图6C)。类似的结果在HuR敲低恢复实验中也得到了证实。Transwell侵袭实验表明，HuR的过表达显著对抗了NKRF对CF侵袭的抑制作用，并促进了CF的迁移能力(图6D)。同样，划痕愈合实验表明，HuR显著逆转了NKRF随时间对CF迁移的抑制作用(图6E)。总之，HuR通过上调MMP2和MMP9的表达，其过表达逆转了NKRF对CF迁移和侵袭的抑制作用。这强调了在病理性心脏重构过程中，HuR在调节NKRF在CF中的调控功能方面的关键作用。
2.7.在NKRF-CKO小鼠中HuR敲降保护MI后恶化的心脏重构和功能障碍
我们开发了一个携带针对HuR的短发夹RNA的腺相关病毒(AAV-shRNA-HuR)，该病毒由CF中的FSP1启动子驱动，旨在研究HuR敲低是否能在体内改善NKRF-CKO小鼠的心脏功能。在MI造模前的14天内对NKRF-CKO小鼠进行了AAV-shRNA-HuR的尾静脉注射(图7A)。通过免疫印迹验证了模型建立前从两只NKRF-CKO小鼠中分离的CF中的HuR敲低效率。心脏超声揭示，HuR敲低显著改善了NKRF-CKO小鼠的心脏功能，表现为28天MI后LVIDd和LVIDs的减少，以及LVEF和FS的增加(图7B)。通过体内左心室短轴的心脏磁共振成像，得到了类似的结果(图7C)。HuR敲低减小了NKRF-CKO小鼠的梗死面积(图7D)和心重比(图7E)。HuR敲低显著抑制了MI边缘区域的MMP2和MMP9 mRNA和蛋白表达(图7F)。在NKRF-CKO小鼠中，HuR敲低部分恢复了MI后的存活率(68％，19只小鼠中6只死亡，而对照组为35％，40只小鼠中26只死亡，P＝0.04)(图7G)。总之，HuR敲低在NKRF-CKO小鼠中保护免受MI后恶化的心脏重构和功能障碍的影响。这提示了一种潜在的治疗策略，可以减轻NKRF缺乏对心脏功能的不良影响。
2.8.NKRF通过HuR抑制心脏重构和功能障碍，作为MI后的治疗靶点
在C57BL/6J小鼠中注射了AAV-Nkrf，并在14天后进行了MI手术，以突显NKRF在MI后心脏重构中的潜在治疗作用。AAV-Nkrf在CFs中特异性地利用FSP1启动子进行表达(图8A)。免疫荧光染色(图8B)和免疫印迹(图8C)显示，在手术之前，CFs中NKRF表达显著增加且特异性。心脏超声显示，NKRF过表达显著改善了MI引起的心脏功能恶化，且在MI后的28天内持续有效(图8D)。NKRF还保护免受MI引起的梗死面积增大(图8E)和心重比增加(图8F)的影响。此外，NKRF抑制了MI边缘区域内MMP2和MMP9蛋白的表达(图8G)。此外，NKRF过表达显著改善了MI后小鼠的存活率(93％，15只小鼠中1只死亡，而对照组为62％，26只小鼠中10只死亡，P＝0.03；图8H)。
我们还在接受AAV-Nkrf的小鼠中注射了AAV-HuR(在CFs中特异性表达)，以阐明HuR是否介导了NKRF在MI后的保护作用。HuR的过表达显著逆转了NKRF改善的心脏功能(图8D)、梗死面积(图8E)、心重比(图8F)、MI边缘区域内MMP2和MMP9的表达(图8G)以及存活率(63％，24只小鼠中9只死亡，而对照组为93％，15只小鼠中1只死亡，P＝0.04；图8H)。总之，NKRF可能成为MI后抑制心脏重构和功能障碍的潜在治疗靶点，其保护作用至少部分是通过HuR调控实现的。这为心脏重构干预提供了一个有前景的途径。
综上，NKRF在成纤维细胞中作为转录抑制因子，对心脏梗死后的心脏重构具有保护作用。在机制上，NKRF通过在HuR启动子中的NRE结合NF-κB的方式来抑制HuR的转录，从而抑制了MMP2和MMP9 mRNA的稳定性。我们的发现表明，在心脏梗死后，及早靶向NKRF对于预防晚期心脏重构是一种有效的策略。这些结果为治疗心脏梗死后的心脏重构提供了新的思路。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.检测NKRF编码基因及其表达产物的试剂在制备用于病理性心脏重构诊断和/或预后产品中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述检测NKRF编码基因及其表达产物的试剂包括基于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测NKRF编码基因转录的试剂，和/或基于免疫检测方法检测NKRF表达产物(包括NF-κB抑制因子)的试剂。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述产品包括检测待测样本中所述NKRF表达水平的引物、探针、(基因或蛋白)芯片、核酸膜条、检测试剂盒、检测装置或设备；
所述待测样本为人源或非人源样本，包括受试者心肌成纤维细胞和心脏组织。
4.一种病理性心脏重构诊断和/或预后评估的系统，其特征在于，所述系统至少包括：
获取单元，其被配置为：获取受试者生物标志物的表达水平；
评估单元，其被配置为：根据获取单元获得的所述生物标志物的表达水平对受试者的患病情况进行评估；
其中，所述生物标志物为NKRF编码基因和/或NKRF编码基因表达产物(如NF-κB抑制因子)。
5.如权利要求4所述系统，其特征在于，所述对受试者的患病情况进行评估包括对受试者病理性心脏重构的诊断、病理性心脏重构的恶性程度进行评估。
6.如权利要求5所述系统，其特征在于，所述病理性心脏重构的恶性程度包括心脏功能的恶化、心脏重量和梗死面积的增加、心脏破裂引起的血胸发生率。
7.NKRF作为靶点在病理性心脏重构相关疾病防治和/或筛选病理性心脏重构相关疾病药物中的应用。
8.促进NKRF编码基因及其表达产物的表达和/或使其活性提高的物质在如下(a1)-(a4)中至少一种的应用；
(a1)制备预防和/或治疗病理性心脏重构和功能障碍的产品；
(a2)抑制心脏成纤维细胞的迁移和侵袭或制备抑制心脏成纤维细胞的迁移和侵袭的产品；
(a3)抑制HuR表达进而抑制MMP2和MMP9 mRNA的稳定性或制备抑制HuR表达进而抑制MMP2和MMP9 mRNA的稳定性的产品；
(a4)通过NF-κB依赖性机制与HuR启动子结合从而抑制HuR的转录或制备通过NF-κB依赖性机制与HuR启动子结合的产品。
9.如权利要求8所述产品，其特征在于，产品为药物或者实验试剂，所述实验试剂供基础研究使用。
10.如权利要求9所述产品，其特征在于，所述促进NKRF编码基因及其表达产物表达和/或使其活性提高的物质包括采用人工合成NKRF的短发夹RNA，上调NKRF表达的启动子或者慢病毒；以及化合物类促进剂。
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