JP6341859B2 - がんマーカーおよびその用途 - Google Patents
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Description
本発明のがんマーカーは、前述のように、プロレニン受容体であることを特徴とする。本発明のがんマーカーによれば、例えば、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定することで、前記被検者のがんの罹患危険度を試験できる。
ctggacgagtccgagcgcgtcacctcctcacgctgcggctgtcgcccgtgtcccgccggcccgttccgtgtcgccccgcagtgctgcggccgccgcggcaccatggctgtgtttgtcgtgctcctggcgttggtggcgggtgttttggggaacgagtttagtatattaaaatcaccagggtctgttgttttccgaaatggaaattggcctataccaggagagcggatcccagacgtggctgcattgtccatgggcttctctgtgaaagaagacctttcttggccaggactcgcagtgggtaacctgtttcatcgtcctcgggctaccgtcatggtgatggtgaagggagtgaacaaactggctctacccccaggcagtgtcatttcgtaccctttggagaatgcagttccttttagtcttgacagtgttgcaaattccattcactccttattttctgaggaaactcctgttgttttgcagttggctcccagtgaggaaagagtgtatatggtagggaaggcaaactcagtgtttgaagacctttcagtcaccttgcgccagctccgtaatcgcctgtttcaagaaaactctgttctcagttcactccccctcaattctctgagtaggaacaatgaagttgacctgctctttctttctgaactgcaagtgctacatgatatttcaagcttgctgtctcgtcataagcatctagccaaggatcattctcctgatttatattcactggagctggcaggtttggatgaaattgggaagcgttatggggaagactctgaacaattcagagatgcttctaagatccttgttgacgctctgcaaaagtttgcagatgacatgtacagtctttatggtgggaatgcagtggtagagttagtcactgtcaagtcatttgacacctccctcattaggaagacaaggactatccttgaggcaaaacaagcgaagaacccagcaagtccctataaccttgcatataagtataattttgaatattccgtggttttcaacatggtactttggataatgatcgccttggccttggctgtgattatcacctcttacaatatttggaacatggatcctggatatgatagcatcatttataggatgacaaaccagaagattcgaatggattgaatgttacctgtgccagaattagaaaagggggttggaaattggctgttttgttaaaatatatcttttagtgtgctttaaagtagatagtatactttacatttataaaaaaaaatcaaattttgttctttattttgtgtgtgcctgtgatgtttttctagagtgaattatagtattgacgtgaatcccactgtggtatagattccataatatgcttgaatattatgatatagccatttaataacattgatttcattctgtttaatgaatttggaaatatgcactgaaagaaatgtaaaacatttagaatagctcgtgttatggaaaaaagtgcactgaatttattagacaaacttacgaatgcttaacttctttacacagcataggtgaaaatcatatttgggctattgtatactatgaacaatttgtaaatgtcttaatttgatgtaaataactctgaaacaagagaaaaggtttttaacttagagtagccctaaaatatggatgtgcttatataatcgcttagttttggaactgtatctgagtaacagaggacagctgttttttaaccctcttctgcaagtttgttgacctacatgggctaatatggatactaaaaatactacattgatctaagaagaaactagccttgtggagtatatagatgcttttcattatacacacaaaaatccctgagggacattttgaggcatgaatataaaacatttttatttcagtaacttttccccctgtgtaagttactatggtttgtggtacaacttcattctatagaatattaagtggaagtgggtgaattctactttttatgttggagtggaccaatgtctatcaagagtgacaaataaagttaatgatgattccaaaaaaaaaa
MAVFVVLLALVAGVLGNEFSILKSPGSVVFRNGNWPIPGERIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATVMVMVKGVNKLALPPGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRKRLFQENSVLSSLPLNSHSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDEIGKRYGEDSEQFRDASKILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSLIRKTRTILEAKQAKNPASPYNLAYKYNFEYSVVFNMVLWIMIALALAVIITSYNIWNMDPGYDSIIYRMTNQKIRMD
本発明のがんの罹患危険度の試験方法は、前述のように、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。
本発明の試験試薬は、前記本発明のがんの罹患危険度の試験方法に使用する試験試薬であって、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする。本発明の試験試薬によれば、前記本発明のがんの罹患危険度の試験方法を簡便に行える。本発明は、がんの罹患危険度の試験をプロレニン受容体の発現の測定に基づいて行うことが特徴であり、プロレニン受容体の発現が測定できればよく、前記発現測定試薬の種類は、特に制限されない。前記プロレニン受容体の発現測定試薬は、例えば、プロレニン受容体タンパク質の発現測定試薬でもよく、プロレニン受容体遺伝子のmRNAの発現測定試薬でもよい。
本発明のがんの診断方法は、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。また、本発明のがんの診断試薬は、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする。なお、本発明は、前記本発明の試験方法および試験試薬の説明を援用できる。
本発明のがんターゲットは、プロレニン受容体であることを特徴とする。本発明は、プロレニン受容体を前記がんターゲットとし、例えば、プロレニン受容体遺伝子のmRNAまたはプロレニン受容体タンパク質の発現を抑制すること、または、プロレニン受容体タンパク質の機能を阻害もしくは中和すること等により、がんを治療できる。
本発明のスクリーニング方法は、がん治療薬候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、プロレニン受容体に結合する結合物質またはプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質を、前記治療用候補物質として選択することを特徴とする。本発明は、がん治療薬候補物質のターゲットがプロレニン受容体であることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
膵臓がん患者の血漿中のプロレニン受容体の濃度上昇を確認した。
膵臓がん細胞株のプロレニン受容体の発現を抑制し、前記細胞株の増殖能力を確認した。
センス鎖(配列番号8)
5’−UAUAGGGACUUGCUGGGUUCUUCGC−3’
アンチセンス鎖(配列番号9)
5’−GCGAAGAACCCAGCAAGUCCCUAUA−3’
転移がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質およびmRNAの発現上昇を確認した。
原発巣が膵臓であるがん患者から、肝臓の正常組織(コントロール)、肝臓の転移がん組織および腹膜の転移がん組織を採取した。各組織2gにLysis buffer 1mLを添加し、4,000rpmで5分間、ホモジェナイズを行い、被検サンプルを作製した。試薬(商品名 Bio−Rad Protein Assay、Bio−Rad社)を用いて、前記被検サンプル中のタンパク質量を測定した。
前記(1)で採取した肝臓の正常組織(コントロール)、肝臓の転移がん組織および腹膜の転移がん組織を使用した。各組織2gにISOGEN(Nippon Gene) 1mLを添加し、4,000rpmで5分間、ホモジェナイズを行い、被検サンプルを作製した。前記被検サンプルにエタノールを加え、RNAを沈殿させた後、前記RNAをRNase free waterに溶解し、RNA溶液を作製した。分光光度計により、前記RNA溶液の濃度およびOD260/OD280(純度)を計測した。そして、RNA濃度300ng/μL、純度1.8以上の前記RNA溶液を、以下の定量的リアルタイム(qRT)−PCRに使用した。
(配列番号1)5’-GGCGTTGGTGGCGGGTGTTT-3’
(配列番号2)5’-AGCCCATGGACAATGCAGCCAC-3’
β−アクチン遺伝子増幅用プライマーセット
(配列番号3)5’-CACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’
(配列番号4)5’-ACGAGCGCGGCGATATCATCATC-3’
胃がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質およびmRNAの発現上昇を確認した。
胃がん患者4名から、それぞれ胃の正常組織(n=4)およびがん組織(n=4)を採取し、前記実施例3(1)と同様にして、プロレニン受容体タンパク質の発現量を測定した。そして、患者4名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。
前記(1)で採取した胃の正常組織およびがん組織を使用し、前記実施例3(2)と同様にして、プロレニン受容体遺伝子のmRNAの発現量を測定した。そして、患者4名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。
大腸がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質およびmRNAの発現上昇を確認した。
大腸がん患者4名から、大腸の正常組織(n=4)およびがん組織(n=4)を採取し、前記実施例3(1)と同様にして、プロレニン受容体タンパク質の発現量を測定した。そして、患者4名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。
前記(1)で採取した大腸の正常組織およびがん組織について、前記実施例3(2)と同様にして、プロレニン受容体遺伝子のmRNAの発現量を測定した。そして、患者4名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。
膵臓がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現上昇を免疫組織化学染色により確認した。
siRNA(P)RRで処理したヒト膵臓がん細胞株をヌードマウスに移植し、ヌードマウスにおける前記膵臓がん細胞株の成長の抑制および血漿中の可溶性プロレニン受容体タンパク質の発現量の低下を確認した。
PK−1に代えて、ヒト膵臓がん細胞株であるPANC−1を用いた以外は前記実施例2と同様にして、siRNA(P)RRを導入し、siRNAを導入したPANC−1(siRNA(P)RR群)を回収した。つぎに、5×105細胞のPANC−1を、5週齢雄BALB/cヌードマウス(n=7)(日本クレア社製)の右上側腹部に皮下移植した。そして、前記移植後25および40日に、前記右上側腹部におけるPANC−1由来のがんの長径および短径を、電気ノギス(アズワン社製)を用いて測定した。前記がんの容積は、下記式から算出した。コントロールは、siRNA(P)RRに代えて、scrambled siRNAを導入したPANC−1(スクランブル群)用いた以外は同様にして、がんの容積を測定した。
[式1]
ガン容積(mm3)=長径×(短径)2×0.5
前記移植後25日の前記ヌードマウスの血液から血漿を採取した。前記血漿中のプロレニン受容体タンパク質の発現量の測定は、前記実施例3(1)と同様にして測定した。つぎに、コントロールの血漿のプロレニン受容体の発現量を1として、siRNA(P)RRを導入したPANC−1を移植した前記ヌードマウスの血漿のプロレニン受容体の発現量の相対値を求めた。
膵臓がんを移植したヌードマウスに抗プロレニン受容体抗体を投与することで、がんの成長を抑制できることを確認した。
前記ヒトプロレニン受容体タンパク質(配列番号6)の200−213番目のポリペプチド(配列番号7)を、スカシ貝ヘモシアニン(KLH)と結合し、抗原タンパク質とした。150−200μgの前記抗原タンパク質を、2週間毎に7−10回ウサギ皮内の数十箇所に免疫した(600−800μg/体重1kg)。前記免疫は、初回は、完全アジュバントと混合した前記抗原タンパク質を用いて行い、2回目以降は、不完全アジュバントと混合した前記抗原タンパク質を用いて行った。つぎに、前記ポリペプチドに対する抗体価の上昇を確認した後、前記ウサギより全血を採取し、さらに、血清を回収し、これを抗血清とした。前記抗血清におけるポリクローナル抗ヒトプロレニン受容体抗体(クローン名:PRR1)の濃度は、0.6μg/μLであった。なお、前記抗原タンパク質に用いたヒトプロレニン受容体タンパク質の全アミノ酸配列とマウスプロレニン受容体タンパク質の全アミノ酸配列(配列番号10)との相同性(異種間のアライメントスコア)は、92.29%であった。このことから、前記抗血清に含まれる前記ヒトプロレニン受容体抗体は、マウスプロレニン受容体にも結合するといえる。
MAVLVVLLFFLVAGALGNEFSILRSPGSVVFRNGNWPIPGDRIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATIMVMVKGVDKLALPAGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRNRLFQENSLLNSLPLNSLSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDELGKRYGEDSEQFRDASKILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSLVRKSRTILEAKQENTQSPYNLAYKYNLEYSVVFNLVLWIMIGLALAVIITSYNIWNMDPGYDSIIYRMTNQKIRID
1×106細胞のPK−1またはPANC−1、30μlの前記抗血清(前記抗体0.6μg/μl)および170μlのPBSを混合した。この混合液(全量)を、ヌードマウス(n=10)の右上側腹部に移植した。この際、前記マウスの体重1kgあたりの移植量は、前記細胞が50×106細胞であり、前記抗体0.9mgである。つぎに、前記移植後から3日毎に、10μlの前記抗血清(前記抗体0.6μg/μl)を、PK−1またはPANC−1由来のがん内に投与した、この際、1回の投与における、前記マウスの体重1kgあたりの前記抗体の投与量は、0.3mgである。そして、前記移植後15、18、21、24および27日に、前記右上側腹部におけるPK−1またはPANC−1由来のがんの容積を、前記実施例7と同様に測定した。コントロールは、前記抗プロレニン受容体抗体に代えて、マウスの体重1kgあたり1mgとなるように、ヒトIgG1抗体(WAKO社製)を投与した以外は同様にして、がんの容積を測定した。
ヒト膵管上皮細胞株およびヒト膵臓がん細胞株におけるプロレニン受容体タンパク質の発現およびこれらの細胞株の培養上清におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を確認した。
プロレニン受容体の発現を抑制することで、Wntシグナルが抑制されることを確認した。
前記実施例2と同様にして、PK−1にsiRNA(P)RRを導入した(siRNA(P)RR群)。前記導入後、150ng/mLとなるように組換えヒトWnt3aを加えた。前記添加後10分に、PK−1を回収し、Lysis Bufferで溶解し、被検サンプルを調製した。つぎに、実施例3(1)と同様にして、プロレニン受容体タンパク質とβ−アクチンタンパク質の発現を確認した。
前記(1)と同様にして、被検サンプルを調製した。つぎに、前記被検サンプルについて、抗プロレニン受容体抗体に代えて、抗活性型β−カテニン抗体(anti−ABC、Millipore社製)または抗Cyclin D1抗体を用いた以外は、前記実施例3(1)と同様にして、活性型β−カテニンタンパク質およびCyclin D1タンパク質の発現量を求めた。ネガティブコントロールは、siRNA(P)RRに代えて、scrambled siRNAを導入し、Wnt3aを加えなかった以外は、コントロールは、siRNA(P)RRに代えて、scrambled siRNAを導入した以外は同様にして、活性型β−カテニンタンパク質およびCyclin D1タンパク質の発現量を求めた。そして、前記ネガティブコントロールにおける活性型β−カテニンタンパク質およびCyclin D1タンパク質の発現量を1として、各サンプルにおける活性型β−カテニンタンパク質およびCyclin D1タンパク質の発現量の相対値を求めた。
5×104細胞/ウェルとなるよう6ウェルプレートにPK−1を播種した。つぎに、前記実施例2と同様にして、PK−1にsiRNA(P)RRを導入した(siRNA(P)RR群)。前記導入後、150ng/mLとなるように組換えヒトWnt3aを加え、48時間培養した。前記培養後、さらに、100μLの水溶性テトラゾリウム塩(WST−1)試薬を各ウェルに添加し、2時間インキュベートした。そして、各ウェルについて、プレートリーダーを用いて、450nmにおける吸光度を測定し、増殖能力を測定した。ネガティブコントロールは、siRNAを導入せず、またWnt3aを加えなかった以外は同様にして、コントロール1は、siRNAを導入しなかった以外は同様にして、コントロール2は、siRNA(P)RRに代えて、scrambled siRNAを導入した以外は同様にして、増殖能力を測定した。
プロレニン受容体の発現を抑制することで、アポトーシスが誘導されることを確認した。
前記実施例2と同様にして、PK−1にsiRNA(P)RRを導入した(siRNA(P)RR群)。前記導入後、150ng/mLとなるように組換えヒトWnt3aを加え、48時間培養した。つぎに、培養後のPK−1を遠心して回収し、0.5mLの氷冷70%エタノールに懸濁し、−20℃で24時間保存した。前記保存後のPK−1をPBSで洗浄後、10mg/mL RNase A(Macherey−Nagel社製)含有PBSに懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。そして、1mg/mL PI(Sigma−Aldrich社製)含有PBSを用いて、37℃で30分間、染色した。
前記(1)と同様にして、PK−1を培養し、回収した。カスパーゼ3の活性の測定は、APOPCYTE(Kit名:Caspase−3 Colorimetric Assay Kit、Medical & Biological laboratories社製)を用い、そのプロトコルに従って行った。コントロールは、siRNA(P)RRに代えて、scrambled siRNAを導入した以外は同様にして、カスパーゼ3の活性を測定した。また、BxPC−3およびPANC−1についても同様にして、カスパーゼ3の活性を測定した。
脳腫瘍患者の血漿中のプロレニン受容体の濃度上昇を確認した。
Claims (11)
- 被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含み、
前記生体試料が、血液試料であり、
試験対象のがんが、膵臓がんおよび脳腫瘍の少なくとも一方であることを特徴とする、がんの罹患危険度を試験する方法。 - 前記がんが、膵臓がんである、請求項1記載の試験方法。
- 前記脳腫瘍が、グリオーマ、アストロサイトーマ、中枢神経系原発悪性リンパ腫および海綿上血管腫からなる群から選択された少なくとも1つである、請求項1記載の試験方法。
- さらに、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を、基準値と比較することにより、前記被検者のがんの罹患危険度を試験する工程を含み、前記基準値が、健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量またはがん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量である、請求項1から3のいずれか一項に記載の試験方法。
- 前記試験工程において、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも高い場合、前記がん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と同じ場合または、前記がん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも高い場合に、前記被検者は、がんに罹患する危険性があるとする、請求項4記載の試験方法。
- プロレニン受容体の発現量が、そのmRNAの発現量およびタンパク質の発現量の少なくとも一方である、請求項1から5のいずれか一項に記載の試験方法。
- プロレニン受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、
前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒトプロレニン受容体タンパク質のアミノ酸配列(配列番号6)において、200−213番目のアミノ酸領域に結合することを特徴とする膵臓がん治療薬。 - 請求項7記載の膵臓がん治療薬を、ヒトを除く患者に投与する工程を含むことを特徴とする膵臓がんの治療方法。
- 膵臓がんの治療用候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、プロレニン受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を、前記治療用候補物質として選択し、
前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒトプロレニン受容体タンパク質のアミノ酸配列(配列番号6)において、200−213番目のアミノ酸領域に結合することを特徴とするスクリーニング方法。 - プロレニン受容体に前記被検物質を接触させる工程、プロレニン受容体と前記被検物質との結合を検出する工程、およびプロレニン受容体に結合した前記被検物質を、前記治療用候補物質として選択する工程を含む、請求項9記載のスクリーニング方法。
- ヒトプロレニン受容体タンパク質のアミノ酸配列(配列番号6)において、200−213番目のアミノ酸領域に結合することを特徴とする、抗体またはその抗原結合断片。
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