CN116179545A - LncRNA Gm20257在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用 - Google Patents

LncRNA Gm20257在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及LncRNA Gm20257在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用。本发明首先确定lncRNA Gm20257在病理性心肌肥厚中的改变，及其抑制病理性心肌肥厚的作用，发现lncRNA Gm20257在病理性心肌肥厚中表达升高，属于一种应激性的升高。抑制lncRNA Gm20257的表达可诱导心肌细胞肥大，离体过表达lncRNA Gm20257可明显抑制心肌细胞肥厚，在体过表达lncRNA Gm20257可明显抑制小鼠病理性心肌肥厚；然后并将其作为一种新的药物或药物靶点，应用于预防和治疗病理性心肌肥厚疾病中。

Description

LncRNA Gm20257在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及LncRNA Gm20257在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用。
背景技术
病理性心肌肥厚是多种心血管疾病(如高血压、糖尿病、心肌梗死、心肌炎等)的共同表型。然而随着社会发展及老龄化的加剧，心血管疾病的发病率逐年攀升。心血管疾病等基础性疾病不仅严重影响人们的生活质量，还会加剧其他疾病的危害程度。因此，防治心血管疾病是医疗领域的重要任务，而抑制病理性心肌肥厚有助于多项心血管疾病的治疗。
然而，目前的医疗手段并不能明显抑制病理性心肌肥厚的发展，随着程度的不断加深，患者的健康状况急剧下降，直至出现心力衰竭甚至猝死。那么，这就迫切要求寻找新的治疗靶点从而开发相应的药物进而开展行之有效的治疗，来抑制这种不可逆的恶性重构。
病理性心肌肥厚的发病机制复杂，心肌细胞内能量缺乏是病理性心肌肥厚发生发展的关键环节。随着细胞内能量代谢的逐渐失代偿，引起大量心肌细胞死亡，心脏产生不可逆的恶性损伤。因此，纠正能量生成障碍对病理性心肌肥厚的治疗具有重大作用。虽然目前临床使用的治疗药物中个别对细胞能量代谢具有一定的影响，但是其作用并不明显。在许多心血管疾病中，lncRNA的表达发生改变并且广泛参与到这些疾病的发生发展过程中，有些lncRNA甚至已经可作为心血管疾病诊断和治疗的靶点。越来越多的证据显示在病理性心肌肥厚中，lncRNA也起到了不可替代的调控作用。尽管越来越多的能够调控病理性心肌肥厚的lncRNA被发现，但能明显且稳定抑制病理性心肌肥厚的lncRNA仍没有确定，故寻找能够有有效且稳定抑制病理性心肌肥厚的lncRNA仍是医药研发领域的重中之重。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供LncRNA Gm20257在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用，为一种内源性的长链非编码RNA的医药用途，本发明首先证明了在病理性心肌肥厚模型小鼠及离体心肌细胞中LncRNA Gm20257显著升高，是一种应激性升高，这一点对于其应用于诊断标志物非常重要；进一步发现离体心肌细胞中采用si-Gm20257抑制心肌细胞内LncRNAGm20257的表达，明显引起病理性心肌肥厚相关表型；最后通过腺相关病毒-9(AAV-9)包裹实现在体过表达LncRNA Gm20257或质粒转染实现离体水平过表达LncRNAGm20257，发现可明显抑制病理性心肌肥厚，证实LncRNA Gm20257具有明显且稳定的抗肥厚作用。本发明证实LncRNA Gm20257作为一种新的药物或药物靶点，能够应用于预防和治疗病理性心肌肥厚疾病中。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供LncRNA Gm20257在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明的一个实施方式中，LncRNA Gm20257在病理性心肌肥厚中表达升高；抑制lncRNA Gm20257的表达可诱导病理性心肌肥厚。
在本发明的一个实施方式中，离体过表达LncRNA Gm20257可明显抑制心肌细胞肥大；在体过表达LncRNA Gm20257可明显抑制病理性心肌肥厚。
本发明的第二个目的是提供一种病理性心肌肥厚的诊断试剂盒，包括上述LncRNAGm20257。
本发明的第三个目的是提供LncRNA Gm20257在筛选病理性心肌肥厚的诊断药物中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第四个目的是提供LncRNA Gm20257在筛选病理性心肌肥厚的诊断试剂盒中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第五个目的是提供LncRNA Gm20257在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第六个目的是提供LncRNA Gm20257在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第七个目的是提供LncRNA Gm20257激活剂在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第八个目的是提供LncRNA Gm20257激活剂在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明的一个实施方式中，离体心肌细胞中采用si-Gm20257抑制心肌细胞内LncRNA Gm20257的表达，明显引起病理性心肌肥厚相关表型。
在本发明的一个实施方式中，通过腺相关病毒-9(AAV-9)包裹实现在体过表达LncRNA Gm20257或质粒转染实现离体水平过表达LncRNA Gm20257，可明显抑制病理性心肌肥厚。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明为病理性心肌肥厚的发生发展提供了一个新的病理生理机制，证实lncRNAGm20257具有明显且稳定的抗肥厚作用，并提供了一种可用于病理性心肌肥厚疾病的预防与治疗的长链非编码RNA。
附图说明
图1为实施例1中检测病理性心肌肥厚时lncRNA Gm20257变化。图1A为小动物超声检测TAC手术组和Sham组小鼠心肌收缩力及左心室后壁的厚度的代表图；图1B为小鼠左心室后壁厚度统计图；图1C为心重/体重比、肺重/体重比及心重/胫骨长比值，n＝3，*P<0.05vs.Sham；图1D为小鼠心脏中肥厚标志物ANP、BNP及β-MHC的mRNA相对表达水平；图1E为β-MHC的蛋白含量在Sham组小鼠和TAC组小鼠代表图及相应统计图，GAPDH作为内参，n＝3，*P<0.05vs.Sham；图1F为Real-time PCR检测TAC组和Sham组中lncRNA Gm20257的表达差异，n＝3，*P<0.05vs.Sham。
图2为实施例2中抑制lncRNA Gm20257的表达可诱导病理性心肌肥厚。图2A为Real-time PCR检测si-lncRNA Gm20257和si-NC组中lncRNA Gm20257的表达，n＝6，*P<0.05vs.si-NC；图2B为α-actinin标记心肌细胞骨架显示心肌细胞大小，心肌细胞培养48h后转染si-lncRNA Gm20257或si-NC48 h后孵育α-actinin标记心肌细胞骨架显示心肌细胞大小，两个组分细胞都孵育α-actinin染细胞骨架和DAPI染细胞核(蓝色：细胞核，红色：α-actinin，放大倍数为400×；*P<0.05vs.si-NC，每个组分n＝10个细胞)；图2C为Real-timePCR检测心肌细胞转染si-lncRNA Gm20257或si-NC后心肌细胞中肥厚标志物ANP、BNP及β-MHC的mRNA相对表达水平；图2D为Western blot检测心肌细胞转染si-lncRNA Gm20257或si-NC后细胞中β-MHC的蛋白含量代表图及相应统计图，GAPDH作为内参，n＝6，*P<0.05vs.si-NC。
图3为实施例3中离体过表达lncRNA Gm20257可明显抑制心肌细胞肥厚。图3A为Real-time PCR检测lncRNA Gm20257和Vector组中lncRNA Gm20257的表达，n＝6，*P<0.05vs.Vector；图3B为α-actinin标记心肌细胞骨架显示心肌细胞大小，心肌细胞培养48h后转染lncRNAGm20257过表达质粒或Vector质粒后采用Ang II或PBS作用48h后孵育α-actinin染细胞骨架和DAPI染细胞核(蓝色：细胞核，红色：α-actinin，放大倍数为400×；n＝4次独立实验，*P<0.05vs.Control，#P<0.05vs.Ang II+Vector，每个组分n＝10个细胞)；图3C为Real-time PCR检测心肌细胞转染lncRNA Gm20257质粒或Vector质粒后加入Ang II或PBS处理48h，检测心肌细胞中肥厚标志物ANP、BNP及β-MHC的mRNA相对表达水平(n＝6，*P<0.05vs.Control+Vector，#P<0.05vs.Ang II+Vector)；图3D为细胞转染lncRNA Gm20257质粒或Vector质粒后加入Ang II或PBS处理48h，心肌细胞中肥厚标志物β-MHC的蛋白含量代表图及相应统计图(n＝6，*P<0.05vs.Control+Vector，#P<0.05vs.Ang II+Vector)。
图4为实施例4中在体过表达lncRNA Gm20257可明显抑制小鼠病理性心肌肥厚。图4A为尾静脉注射腺相关病毒-9(AAV-9)包裹的lncRNA Gm20257过表达质粒或AAV-9包裹的Vector对照质粒后，检测小鼠体内lncRNA Gm20257的表达量；图4B为小鼠在体转染lncRNAGm20257过表达质粒或Vector质粒后进行TAC或Sham手术后小动物超声检测各组中小鼠心肌收缩力及左心室后壁的厚度的代表图；图4C为小鼠左心室后壁厚度统计图，n＝6，*P<0.05vs.Sham+Vector，#P<0.05vs.TAC+Vector；图4D为小鼠在体转染lncRNA Gm20257过表达质粒或Vector质粒后进行TAC或Sham手术后心重/体重比、肺重/体重比及心重/胫骨长比值，n＝6，*P<0.05vs.Sham+Vector，#P<0.05vs.TAC+Vector；图4E为小鼠在体转染lncRNAGm20257过表达质粒或Vector质粒后进行TAC或Sham手术后采用麦胚凝集素染色(WGA)检测小鼠心脏心肌细胞的横截面积；图4F为小鼠在体转染lncRNA Gm20257过表达质粒或Vector质粒后进行TAC或Sham手术后小鼠心脏中肥厚标志物ANP、BNP及β-MHC的mRNA相对表达水平，n＝6，*P<0.05vs.Sham+Vector，#P<0.05vs.TAC+Vector；图4G为小鼠在体转染lncRNAGm20257过表达质粒或Vector质粒后进行TAC或Sham手术后β-MHC的蛋白含量在各组小鼠代表图及相应统计图，GAPDH作为内参，n＝6，*P<0.05vs.Sham+Vector，#P<0.05vs.TAC+Vector。
具体实施方式
本发明提供LncRNA Gm20257在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明的一个实施方式中，LncRNA Gm20257在病理性心肌肥厚中表达升高；抑制lncRNA Gm20257的表达可诱导病理性心肌肥厚。
在本发明的一个实施方式中，离体过表达LncRNA Gm20257可明显抑制心肌细胞肥大；在体过表达LncRNA Gm20257可明显抑制病理性心肌肥厚。
本发明提供一种病理性心肌肥厚的诊断试剂盒，包括上述LncRNA Gm20257。
本发明提供LncRNA Gm20257在筛选病理性心肌肥厚的诊断药物中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA Gm20257在筛选病理性心肌肥厚的诊断试剂盒中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA Gm20257在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA Gm20257在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，所述LncRNAGm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA Gm20257激活剂在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA Gm20257激活剂在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明的一个实施方式中，离体心肌细胞中采用si-Gm20257抑制心肌细胞内LncRNA Gm20257的表达，明显引起病理性心肌肥厚相关表型。
在本发明的一个实施方式中，通过腺相关病毒-9(AAV-9)包裹实现在体过表达LncRNA Gm20257或质粒转染实现离体水平过表达LncRNA Gm20257，可明显抑制病理性心肌肥厚。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
下列实施例中，所述试剂若无特殊说明均为市售试剂，所用检测手段及方法若无特殊说明均为本领域常规技术手段及方法。
实施例1
本实施例采用主动脉弓横断面缩窄手术(TAC)构建病理性心肌肥厚小鼠模型。选取6-8周成年健康C57BL/6小鼠，2％阿福靪麻醉后，开胸，采用27G钢针作为垫针，7-0可降解手术线进行结扎，结扎后抽出垫针，关胸。对照组(Sham)只开胸，不进行结扎。4周后形成小鼠病理性心肌肥厚模型。超声检测小鼠左心室壁厚度，发现模型组小鼠心脏收缩力明显降低，心室壁厚度明显增加(图1A、图1B)。同时，TAC模型小鼠心重/体重、肺重/体重及心重/胫骨长与对照组小鼠相比明显升高(图1C)。提取RNA进行PCR检测心肌肥厚标志物ANP、BNP、β-MHC的mRNA及Western blot检测β-MHC的蛋白表达，发现TAC模型小鼠明显增加(图1D、图1E)。表明病理性心肌肥厚模型小鼠构建成功。
在此基础上，通过qRT-PCR检测发现，lncRNA Gm20257在病理性心肌肥厚在体模型中表达升高，结果如图1F所示。
具体方法如下：
(1)小鼠主动脉弓横断面缩窄手术(TAC)
选取6-8周成年健康雄性C57BL/6小鼠(体重20-25g)，2％阿福靪腹腔注射麻醉。胸部脱毛后仰卧位固定于鼠台后用碘伏消毒皮肤。钝性分离气管周围组织暴露出气管后于胸部正中切口，将第一肋剪断，寻找主动脉弓；用7-0丝线将主动脉弓与27gauge的针头一起结扎，待丝线系好后立即抽出针头。观察左右颈总动脉搏动，当观察到右侧颈总动脉搏动的幅度高于左颈总动脉后，证明主动脉弓结扎成功。随后，逐层缝合胸腔及胸部皮肤，待小鼠意识恢复。对照组(Sham)只开胸，不进行结扎主动脉弓。手术结束后，将模型组及对照组小鼠在同等条件下悉心照顾4周，经心动超声检测主动脉弓血流速度及心功能验证小鼠心肌肥厚模型建立成功。确定模型构建成功后进行取材。将小鼠称重后，麻醉处死，取出心脏，放入预冷的PBS缓冲液中洗去残血，随后置于分析天平上称量全心重量，计算心脏指数。称重后将心脏转移至新鲜冰PBS中剪取左心室组织，并迅速转移至液氮中，于-80℃冰箱保存待用。
(2)心动超声
取C57BL/6鼠，称重后使用2％的阿福汀溶液(160mg/kg)进行麻醉，小鼠麻醉，眨眼反射消失后用脱毛膏脱去胸部的毛，胸前涂抹耦合剂后，将超声探头放置于动物心脏位置上。采用
Figure SMS_1
2100高分辨率成像系统的传感器得到小动物二维心动超声图，调整探头方向获得相应M型检测曲线，进行测量。测量在心动超声仪上根据超声图像计算左室舒张期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in diastole，LVPWd)。发现模型组小鼠心脏收缩力明显降低，心室壁厚度明显增加(图1A、图1B)。
(3)心脏指数检测心肌肥厚指标：TAC模型小鼠心重/体重、肺重/体重及心重/胫骨长与对照组小鼠相比明显升高(图1C)。
(4)RT-PCR检测心肌肥厚标志物ANP、BNP、β-MHC的mRNA含量
(4.1)提取细胞或组织总RNA
组织块加TRIzol研磨组织直至组织块消失后静止5min。继续在EP管中加入200μL的氯仿后，剧烈振摇20s，室温静置10min。静置后，将EP管置于4℃离心机中，13500r/min离心15min。离心后，取出EP管，可见管中液体分为三相：最上层的水相(RNA相)，中间乳白色的裙带样的蛋白相，以及最下层的TRIzol相(DNA相)。用移液器小心地吸取最上层(水层)上清液约500μL并转移至新的1.5mL EP管中。注意在吸取最上层上清液时不要吸到蛋白层或TRIzol层，以避免蛋白或DNA污染。在EP管中加入等体积异丙醇，缓慢颠倒EP管10次沉降RNA，室温静置10min。将EP管置于4℃离心机中，13500r/min离心10min。取出EP管，发现白色的RNA沉淀在EP管底部的侧面形成。小心弃去液体，避免将沉淀弃走，加入1mL DEPC水配制的75％乙醇轻轻晃动清洗RNA。将EP管置于4℃离心机中，10600r/min离心5min。移除75％乙醇，注意勿将沉淀弃去，将EP管倒置于干净的虑纸上，室温风干，15min。用20μL DEPC水溶解RNA(注：晾干RNA时，切忌过干，否则白色消失，不易于溶解)，测量RNA浓度及纯度。
(4.2)cDNA的制备
本实施例中普通RNA进行逆转录时采用ABM公司的5×Allinone ReverseTranscription试剂盒，并按照使用说明书进行逆转录操作，内参采用GAPDH进行相对标准化。实施例中用到的Gm20257的引物采用Primer 2.0设计，ANP、BNP、β-MHC、GAPDH具体引物序列如下(表1)。
表1.Real-time qPCR引物列表
Figure SMS_2
(4.3)Real-time qPCR
本实验采用SYBR Green I染料法，采用Applied Biosystems公司SYBR Green PCRMaster Mix试剂盒进行样本内mRNA水平的定量，各样本的检测目标(ANP、BNP、β-MHC)和内参(GAPDH)以及各样本的miRNA检测目标(miR-214)和内参(U6)分别进行SYBR Green Real-time PCR反应。反应体系配置于96孔板中，每孔分别加入SYBR混合试剂10μL，Nuclease-Free Water 7μL，上下游引物(R、F)各1μL以及cDNA 1μL补足至20μL。使用平板离心机低速1000r/min离心1min，以确保加入的反应物足量聚集到管底。将96孔板置于PCR仪中，编辑程序，首次检测时需建立PCR产物的溶解曲线。具体反应程序如表2所示。
表2.
Figure SMS_3
Green PCR Master Mix荧光染料Real-time RT-PCR反应程序
Figure SMS_4
/>
Figure SMS_5
(4.4)数据分析
应用循环值(Ct值)法计算目标基因的相对量2-ΔΔCT。
ΔΔCt＝(Ct目标基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目标基因-Ct管家基因)对照组。
(5)Western blot检测β-MHC的蛋白表达
(5.1)细胞或组织蛋白提取
在组织块中以每10mg/100μL体积的量加入组织裂解液(RIPA:10％SDS:proteaseinhibitor＝100:50:1)并研磨直至组织块消失。细胞或组织蛋白样本进行超声碎裂，每次超声10s，共超声3次，每次间隔10min。将蛋白样本置于4℃冰箱中静置2h以充分裂解。裂解后4℃离心机中13500r/min离心25min，吸取上清液至新的1.5mL EP管中，冻存于-80℃冰箱中待用。
(5.2)测定蛋白质浓度
采用BCA法检测样本蛋白浓度：配制新鲜的BCA工作液(A液:B液＝50:1)后并以BCA工作液:RIPA裂解液:蛋白样品溶液＝200:19:1的比例加入96孔板中，轻拍96孔板侧壁以使液体充分混合后将96孔板置于37℃孵箱中孵育30min使BCA工作液与蛋白充分反应。孵育结束后将96孔板置于酶标仪中，在562nm波长下读取吸光度值，将各组样品吸光度值代入蛋白浓度标准曲线方程式中计算出样本的蛋白浓度。
(5.3)蛋白质样品的处理
根据上一步中测定得的蛋白浓度，用RIPA补齐样品的浓度差，并在样本中加入等体积的5×loading buffer。将处理好的蛋白样品EP管置于加热器中100℃煮沸7min后置于小型离心机中瞬时离心后冻存于-80℃冰箱中待用。
(5.4)蛋白质电泳
12％分离胶和5％积层胶的配置如表3所示：
表3. 12％的分离胶和5％的积层胶
Figure SMS_6
将样品上入预先配好的SDS-PAGE凝胶中，两边各上一道Marker以指示蛋白质电泳位置。以70V恒压电泳30min待样品跑过积层胶并形成一条直线后将电压调至110V以分离不同分子量的蛋白，观察溴酚蓝指示剂到合适的位置后停止电泳。
(5.5)转膜
将提前准备好的大小合适的NC膜和滤纸在预冷的转膜液中平衡15min。打开转膜夹子后，在黑色夹子的一面依次放置滤纸、SDS-PAGE凝胶、NC膜，以及滤纸，注意在NC膜和凝胶之间不要产生气泡。将装好的夹子放入转膜槽内，并将转膜槽放在冰浴盆中，以300mA恒流转膜1-1.5h(取决于蛋白的分子量)。
(5.6)封闭及孵育一抗
待转膜结束后，在PBST中涮洗NC膜3次，每次5min以除去多余的转膜液，随后将NC膜置于PBS配置的5％脱脂牛奶中，并置于水平摇床上室温封闭2h。封闭结束后将NC膜正面向上放入封闭液稀释好的一抗溶液中4℃摇床过夜。
(5.7)孵育二抗
待一抗孵育结束后，将NC膜放于PBST中清洗3次，每次清洗10min，后在室温下避光孵育荧光二抗50min，孵育结束后采用PBST洗膜3次，每次10min。
(5.8)扫膜
将NC膜正面向下倒置于Odessey红外扫描成像仪上，扫描NC膜，并通过image J软件分析蛋白条带的相对灰度值。
实施例2
取出生3天内的C57BL/6乳鼠，取心脏后采用胰酶消化心肌细胞。心肌细胞稳定培养48h后，心肌细胞内转染si-NC或si-Gm20257，PCR检测检lncRNA Gm20257在si-Gm20257组明显降低(图2A)。检测心肌细胞面积，发现转染si-Gm20257抑制内源性Gm20257表达后，与si-NC组相比，心肌细胞面积明显增大(图2B)。PCR检测心肌肥厚标志物ANP、BNP、β-MHC发现si-Gm20257组明显增加(图2C)。同时，肥厚标志物β-MHC蛋白表达明显增加(图2D)。以上实验证实，敲减lncRNA Gm20257(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)可引起心肌细胞肥厚。
具体方法如下：
(1)原代乳鼠心肌细胞培养
取新生1-3d C57BL/6乳鼠，在超净台中采用75％酒精浸泡对其体表进行消毒后，以断头开胸法取出乳鼠心脏，置于预冷的无菌DMEM培养液中，使心脏泵出残留血液。将心脏组织在DMEM培养液中剪除心耳及大动脉后，转移至另一个新鲜预冷的无菌DMEM培养液中，将每个心脏剪成大小相同的两个组织小块，待所有心脏修剪完成后移入15mL离心管中，加入0.25％胰蛋白酶溶液以振摇的方式冲洗去除心脏中残余的血液直至胰蛋白酶溶液透明为止，而后加入新鲜的0.25％胰蛋白酶溶液消化心脏组织块，吸取浑浊的上层消化液置于含10％胎牛血清的DMEM培养基中终止消化。重复上述胰蛋白酶消化步骤直至心脏组织块消失。将收集到的细胞通过200目滤网过滤后在1500r/min离心6min，离心后缓慢弃掉上清液后向细胞中加入新鲜的含10％胎牛血清的DMEM，轻柔反复吹打直至细胞均匀分散悬浮于DMEM培养液中。将细胞转移至培养瓶中，放入37℃细胞孵育箱中培养2h之后成纤维细胞贴于细胞培养瓶底部而心肌细胞仍然悬浮于培养液中。移出细胞悬液至新的培养瓶中，添加DMEM培养液至所需体积后加入1％BrdU以抑制非心肌细胞增殖，于细胞培养板接种心肌细胞。48h后，观察心肌细胞状态，发现细胞贴壁状态良好且搏动明显有节律后进行后续实验。
(1.1)细胞加药
心肌细胞以每孔2×105的密度接种于6孔板中，并于37℃孵育48h后，在确定乳鼠心肌细胞状态良好且搏动有节律后进行转染的同时或直接加入血管紧张素Ⅱ(Ang II，1μmol/L)处理48h(每12h加药一次，共加4次)后收集细胞蛋白或RNA待用。
(1.1)细胞转染
心肌细胞以每孔2×105的密度接种于6孔板中，并于37℃孵育48h，通过观察确定细胞生长状态良好后，开始转染。首先将细胞培养液替换无血清无双抗的DMEM培养液。然后再配制转染体系：在适量的Opti-MEM低血清培养基中稀释寡聚物或质粒，用无菌枪头轻轻混匀；同时将lipo-2000Transfection Reagen与适量的Opti-MEM低血清培养基混匀，轻轻混匀后在室温下放置5min。最后将稀释的寡聚物或质粒和稀释的lipo-2000TransfectionReagen混合，在室温下放置20min，使其形成稳定的复合物后，将复合物加入到培养板中，轻轻震摇动培养板将其充分混合。放入37℃，5％CO2培养箱中孵育8h后换上完全培养液继续培养40h后进行后续处理。
(2)检测心肌细胞面积
原代乳鼠心肌细胞接种于铺有盖玻片的24孔板中进行培养，要求细胞达到刚好单层的密度。细胞培养48h贴壁后进行转染和加药处理后收获细胞进行荧光染色处理。首先弃去24孔板中的培养基，采用PBS轻柔地洗涤5次。随后每孔中加入1mL 4％多聚甲醛，室温摇床固定15min。之后用PBS洗涤5次，使用含1％BSA，0.4％Triton的PBS缓冲液在室温下穿透1h。1h后采用PBS洗涤5次，然后每孔中加入1mL山羊血清于37℃培养箱中封闭30min。而后再用PBS洗涤5次，吸干净PBS后向细胞中加入荧光一抗(α-actinin，1:200)4℃孵育过夜。次日，PBS洗5次后，加入二抗(Dylight 594，1:200)，在37℃培养箱中避光孵育1h，而后PBS洗涤5次，向细胞中加入DAPI(1:50)室温孵育5min，最后PBS洗涤5次，将未结合染料彻底清洗去除。荧光显微镜下随机挑选视野拍照并保存，采用Image-Pro Plus 6.0软件勾画出心肌细胞表面积，同时使用任意单位读取心肌细胞相对面积，进而作为评估心肌细胞肥大程度的依据。
(3)PCR检测心肌肥厚标志物ANP、BNP、β-MHC。方法同实施例1中步骤(3)。
(4)Western blot检测心肌细胞中β-MHC蛋白表达。方法同实施例1中步骤(4)。
实施例3
取出生3天内的C57BL/6乳鼠，取心脏后采用胰酶消化心肌细胞。心肌细胞稳定培养48h后，转染Vector(对照质粒)和lncRNA Gm20257过表达质粒后，采用PCR检测lncRNAGm20257的表达量，PCR结果显示与Vector组相比过表达组lncRNA Gm20257明显增多(图3A)。进一步，采用血管紧张素II(Ang II)作用于心肌细胞48h诱导心肌细胞肥厚，同时心肌细胞内转染Vector(对照质粒)和lncRNA Gm20257过表达质粒，具体分为四组：正常培养基+Vector组；正常培养基+lncRNA Gm20257过表达质粒；Ang II+Vector组；Ang II+lncRNAGm20257组。Ang II诱导后心肌细胞面积明显增加，而过表达lncRNA Gm20257可明显抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大(图3B)。Ang II作用48h可使心肌细胞内肥厚标志基因(ANP，BNP，β-MHC)表达明显升高，过表达lncRNA Gm20257可明显抑制Ang II引起的肥厚基因表达增加(图3C)。β-MHC的蛋白表达也显示出同样的趋势(图3D)。
具体方法如下：
(1)细胞培养、加药及lncRNA Gm20257过表达质粒转染。方法同实施例2中步骤(1)。
(2)心肌细胞面积检测。同实施例2中步骤(2)。
(3)PCR检测心肌肥厚标志物ANP、BNP、β-MHC。方法同实施例1中步骤(3)。
(4)Western blot检测心肌细胞中β-MHC蛋白表达。方法同实施例1中步骤(4)。
实施例4
选取6-8周成年健康C57BL/6小鼠，利用尾静脉注射腺相关病毒-9(AAV-9)包裹的lncRNA Gm20257过表达质粒实现在体过表达lncRNA Gm20257。注射病毒后3周进行TAC手术，Sham为对照手术。实验分为四个组分：Sham+Vector组；Sham+lncRNA Gm20257组；TAC+Vector组；TAC+lncRNA Gm20257。
LncRNA Gm20257过表达小鼠中其表达明显增加(图4A)。TAC手术后心脏收缩力明显降低，心室壁厚度明显增加(图4B、图4C)；心重/体重；肺重/体重；心重/经股长比值在TAC小鼠中明显增加(图4D)，过表达lncRNA Gm20257可明显抑制TAC引起的上述心脏功能和表型改变(图4B-图4D)。麦胚凝集素染色显示，TAC引起心肌细胞面积增大，而过表达lncRNAGm20257明显抑制TAC引起的心肌细胞面积增大(图4E)。TAC手术后肥厚标志物mRNA(ANP，BNP，β-MHC)及蛋白(β-MHC)表达明显增加，过表达lncRNA Gm20257可明显抑制肥厚标志基因表达增加(图4F、图4G)。
具体方法如下：
(1)尾静脉注射腺相关病毒9(AAV-9)
通过对C57BL/6小鼠尾静脉注射包裹lncRNA Gm20257的腺相关病毒AAV9构建lncRNA Gm20257过表达的在体模型，其中采用AAV9-Vector作为对照组。将C56BL/6小鼠随机分为两组，分别尾静脉注射AAV9-lncRNA Gm20257和AAV9-Vector 3周后再将每组中小鼠随机分为Sham组和TAC组，并于手术后4周取材进行检测。
(2)主动脉弓横断面缩窄手术(TAC)。同实施例1中步骤(1)。
(3)心动超声。同实施例1中步骤(2)。
(4)心脏指数检测心肌肥厚指标。同实施例1中步骤(3)。
(5)麦胚凝集素染色
准备切好的石蜡片子，61℃烘箱30min(从放上开始计时)
(5.1)脱蜡
a.纯二甲苯I，15min；
b.纯二甲苯II，10min；
c.100％乙醇，10min；
d.96％乙醇，3min；
f.70％乙醇，3min；
g.ddH2O，3min；
(5.2)用PBS清洗玻片2次；
(5.3)孵育用PBS配制的WGA-FITC抗体，孵育时间为2h；
(5.4)孵育结束后用PBS清洗2遍以去除没有结合的WGA-FITC抗体；
(5.5)孵育DAPI；
(5.6)用防淬灭封片剂封片；
(5.7)4℃储存待用/荧光显微镜拍照。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.LncRNA Gm20257在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，其特征在于，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的LncRNA Gm20257在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，其特征在于，LncRNA Gm20257在病理性心肌肥厚中表达升高，属于一种应激性升高；抑制lncRNA Gm20257的表达可诱导病理性心肌肥厚。
3.根据权利要求1所述的LncRNA Gm20257在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，其特征在于，离体过表达LncRNA Gm20257可明显抑制心肌细胞肥大；在体过表达LncRNAGm20257可明显抑制病理性心肌肥厚。
4.一种病理性心肌肥厚的诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的LncRNAGm20257。
5.LncRNA Gm20257在筛选病理性心肌肥厚的诊断药物中的应用，其特征在于，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
6.LncRNA Gm20257在筛选病理性心肌肥厚的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
7.LncRNA Gm20257在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，其特征在于，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
8.LncRNA Gm20257在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，其特征在于，所述LncRNAGm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
9.LncRNA Gm20257激活剂在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，其特征在于，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
10.LncRNA Gm20257激活剂在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，其特征在于，所述LncRNA Gm20257的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
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