CN108187029B - 白细胞免疫球蛋白样受体亚家族b成员4在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物的应用。选用心脏特异性Cre小鼠和心脏特异性LILRB4基因敲除小鼠，手术组给予主动脉弓缩窄手术，对各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，表明敲除LILRB4基因所致的LILRB4缺陷显著恶化心肌肥厚、纤维化及心功能。通过重组腺病毒构建AdshLILRB4及AdLILRB4感染SD乳鼠原代心肌细胞，予以Ang II刺激构建心肌细胞肥大模型，LILRB4过表达病毒显著抑制心肌细胞肥大，心肌细胞表面积减小，LILRB4干扰病毒的结果则相反。LILRB4具有抑制心肌肥厚及其纤维化，改善心功能的作用。

Description

白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4在制备预防、缓解和/ 或治疗心肌肥厚药物的应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(leukocyte immunoglobulin like receptor B4，LILRB4)在治疗心肌肥厚中的功能和应用，具体是在制备抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。

背景技术

心肌肥厚是心肌细胞应对神经体液因子刺激及机械应力负荷改变所做出的适应性代偿反应，是一个复杂并伴有众多因素参与调节的动态过程，同时也是高血压病、瓣膜病、心肌梗死、心肌病等大多数心血管疾病发生发展中所需要共同经历的病理过程[1]。心肌肥厚是心脏对血流动力学负荷、血管紧张素、生长因子以及激素等多种心血管刺激因素所做出的适应性代偿反应，能够使心室壁压力降低，维持甚至能够提高心脏排血量；然而长期的应激将会导致持续性病理性心肌肥大，并伴随有心脏形态和功能上的恶化，表现出炎症、纤维化及异常基因表达等变化。持续的心肌肥厚能导致扩张型心肌病、心力衰竭甚至猝死，因此心肌肥厚明显增加了心力衰竭的发病率和病死率，已经成为了心力衰竭等心血管疾病的独立危险因素及不良预后的信号[2]。近几十年来，随着我国人民生活水平的提高，饮食习惯随之改变，高血压、冠心病等常见心血管疾病的发病率不断提高，心肌肥厚继而导致的室性心律失常、心源性猝死、心肌缺血及心力衰竭等心血管事件的发生率正在逐年上升，较之前提高了6-10倍[3-5]。近年来，全世界众多学者对心肌肥厚的发生发展机制开展了大量研究，发现了一些参与心肌肥厚病理生理过程的关键基因及重要信号传导通路，并且对其中的可干预因素进行了深入研究[6-8]。然而，心肌肥厚的发生发展机制至今仍未完全明确，现有的研究及发现在临床实践中仍具有一定的局限性，尚不能形成真正有效的针对心肌肥厚的防治措施。因此，发现参与心肌肥厚的特异性分子及信号传导通路，对进一步系统阐明心肌肥厚发生发展机制，从细胞分子水平对心肌肥厚进行调控，探索新的防止心肌肥厚的治疗靶点，具有非常重要的理论和实践意义。

免疫球蛋白超家族(IgSF)受体是巨噬细胞表面的一类重要受体，参与了多种巨噬细胞诱导的免疫性疾病，并在移植排斥反应中发挥重要作用。IgSF受体可传导抑制性或兴奋性信号，使巨噬细胞的功能上调或下调，从而保持免疫系统的内稳态及产生有效的免疫应答[9]。细胞免疫球蛋白样受体(LILR)属于IgSF家族，可与主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类或相关分子结合，表达于淋巴细胞及骨髓细胞膜表面。LILR含有5个抑制性受体(LILRB1-LILRB5)、3个兴奋性受体(LILRA1-LILRA3)，这些受体在胞外有2-4个IgSF结构域，而胞质区含有酪氨酸残基，可磷酸化并发挥生物学作用[10]。LILRB4也称为ILT3、LIR-5、CD85k，由染色体19q 13.4编码。既往的研究报道，LILRB4主要参与免疫调节，并且与器官移植排异，肿瘤以及自身免疫性疾病发生发展密切相关[11]。但目前为止，尚未见LILRB4在病理性心肌肥厚中作用的相关报道。

参考文献

1.Heineke J,Molkentin JD.Regulation of cardiac hypertrophy byintracellular signalling pathways.Nat Rev Mol Cell Biol.2006；7(8):589-600.

2.Hill JA,Olson EN.Cardiac plasticity.N Engl J Med.2008；358(13):1370-1380.

3.Zile MR,Gottdiener JS,Hetzel SJ,McMurray JJ,Komajda M,McKelvie R,Baicu CF,Massie BM,Carson PE.Prevalence and significance of alterations incardiac structure and function in patients with heart failure and a preservedejection fraction.Circulation.2011；124(23):2491-2501.

4.Mudd JO,Kass DA.Tackling heart failure in the twenty-firstcentury.Nature.2008；451(7181):919-928.

5.van Berlo JH,Maillet M,Molkentin JD.Signaling effectors underlyingpathologic growth and remodeling of the heart.J Clin Invest.2013；123(1):37-45.

6.Maillet M,van Berlo JH,Molkentin JD.Molecular basis ofphysiological heart growth:fundamental concepts and new players.Nat Rev MolCell Biol.2013；14(1):38-48.

7.Shah AM,Mann DL.In search of new therapeutic targets and strategiesfor heart failure:recent advances in basic science.Lancet.2011；378(9792):704-712.

8.Song K,Nam YJ,Luo X,Qi X,Tan W,Huang GN,Acharya A,Smith CL,Tallquist MD,Neilson EG,Hill JA,Bassel-Duby R,Olson EN.Heart repair byreprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.Nature.2012；485(7400):599-604.

9.Katz HR.Inhibition of pathologic inflammation by leukocyte ig-likereceptor b4and related inhibitory receptors.Immunological reviews.2007；217:222-230.

10.Cheng H,Mohammed F,Nam G,Chen Y,Qi J,Garner LI,Allen RL,Yan J,Willcox BE,Gao GF.Crystal structure of leukocyte Ig-like receptor lilrb4(ilt3/lir-5/cd85k):A myeloid inhibitory receptor involved in immunetolerance.The Journal of biological chemistry.2011；286:18013-18025.

11.Hudson LE,Allen RL.Leukocyte Ig-like receptors-a model for MHCclassⅠdisease associations.Frontiers in immunology.2016；7:281.

发明内容

为解决临床防治心肌肥厚疾病现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是确定LILRB4基因的表达与心肌肥厚疾病之间的相互关系。提供一个用于治疗心肌肥厚疾病的靶基因LILRB4的新用途，进而把LILRB4基因应用于心肌肥厚疾病的治疗。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明第一方面提供了白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4在制备保护心脏功能的药物中的应用。

本发明第二方面提供了白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4在制备抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。

本发明涉及的白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4在制备抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用，所述的药物的活性成分是白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4。

本发明涉及的白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4在制备预防、缓解和/治疗糖尿病心肌病的药物中的应用，具体的是白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4作为药物靶点筛选抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用，所述药物是提高白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4表达量的试剂。

优选地，提高白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4表达量的试剂，给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。

所述的LILRB4，包括基因、蛋白。所述的LILRB4基因在对象体内经转录翻译为白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4蛋白产物。

本发明通过试验确定了LILRB4的表达与心肌肥厚疾病之间的关系：

1、LILRB4基因敲除显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能

本发明选用心脏特异性Cre小鼠α-MHC-Cre(命名WT)和心脏特异性LILRB4基因敲除小鼠(LILRB4-KO)进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术(AB)，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究LILRB4基因敲除对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除LILRB4基因所致的LILRB4缺陷显著恶化心肌肥厚、纤维化及心功能。

2、LILRB4干扰(AdshLILRB4)及过表达(AdLILRB4)腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响

本发明通过重组腺病毒构建AdshLILRB4及AdLILRB4感染SD乳鼠原代心肌细胞，予以Ang II刺激构建心肌细胞肥大模型，对照组则予以PBS，经免疫荧光监测及心肌细胞表面积统计表明，在Ang II刺激下LILRB4干扰病毒明显促进心肌细胞肥大，心肌细胞表面积增大；LILRB4过表达病毒显著抑制心肌细胞肥大，心肌细胞表面积减小。

本发明人的研究证明了：在主动脉缩窄术及Ang II刺激造成的心肌肥厚模型中，LILRB4具有抑制心肌肥厚及其纤维化，改善心功能的作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现LILRB4基因的新功能，即LILRB4基因具有抑制心肌肥厚及其纤维化，改善心功能的作用。

(2)基于LILRB4抑制心肌肥厚疾病发生的作用，其可以用于制备抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物或相关药物的靶点。由于LILRB4是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。

附图说明

图1是构建心脏特异性LILRB4基因敲除小鼠的打靶策略图。

图2是WT和LILRB4-KO小鼠AB模型4W后心重体重比(HW/BW)、肺重体重比(LW/BW)及心重胫骨长度比(HW/TL)的统计柱状图，结果显示LILRB4敲除显著升高HW/BW、LW/BW及HW/TL(*：p＜0.05)。

图3是WT和LILRB4-KO小鼠AB模型4W后心脏组织HE染色和心肌细胞横截面积统计柱状图，结果显示LILRB4敲除显著促进心肌细胞肥大(*：p＜0.05)。

图4是WT和LILRB4-KO小鼠AB模型4W后心脏组织天狼猩红染色图，结果显示LILRB4敲除显著促进心肌的纤维化(*：p＜0.05)。

图5是WT和LILRB4-KO小鼠AB模型4W后心脏组织中心肌肥厚标志物Anp，Bnp，Myh7以及心肌纤维化标志物Collagen1，Collagen3，Ctgf的mRNA水平。结果表明LILRB4敲除显著增加心肌肥厚标志物Anp，Bnp，Myh7以及心脏纤维化标志物Collagen1，Collagen3，Ctgf的mRNA水平(*：p＜0.05)。

图6是WT和LILRB4-KO小鼠AB模型4W后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示LILRB4敲除显著促进AB手术诱导的心室扩张和心功能恶化；其中，LVEDd为左室舒张末期内径、LVESd为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率(FS＝(LVEDd-LVESd)/LVEDd)(*：p＜0.05)。

图7是SD乳鼠原代心肌细胞用腺病毒AdshRNA、AdshLILRB4、AdGFP和AdLILRB4感染，经AngⅡ刺激后的免疫荧光染色图及心肌细胞面积统计结果。结果表明LILRB4的干扰腺病毒促进Ang II诱导的心肌细胞肥大，LILRB4的过表达腺病毒抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大(*：p＜0.05)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。

实验用动物及饲养：

实验动物：选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，雄性，心脏特异性Cre小鼠(α-MHC-Cre(命名WT)，背景为C57BL/6，购自Jackson Laboratory，货号005650)、心脏特异性LILRB4基因敲除小鼠(LILRB4-KO)为实验对象。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级实验动物中心。SRF级小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

【实施例1】心脏特异性LILRB4基因敲除小鼠的构建：

利用CRISPR-Cas9技术构建心脏特异性LILRB4基因敲除小鼠(构建策略见图1)。首先，通过在线CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu)分别在小鼠LILRB4基因外显子1前端非编码区和内含子2中各设计一个CRISPR的打靶位点，靶序列分别为：

LILRB4sgRNA1：ggTAGGATGTCAGAGTTGCAGCG TGG，

LILRB4sgRNA2：ggATTCCTCAAAATGGTGATGGG GGG。

此外还设计了一个用于同源修复的供体载体(Donor Vector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子1、2以及两个同向的loxp序列。

(1)打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。

(2)条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp的构建：

分别合成4条寡聚单链核苷酸序列：

loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，

loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；

loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，

loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；

上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2两条双链。将pBluescript II SK(+)载体用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)双酶切后连接入loxp1退火双链，再将测序正确的载体用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)双酶切，连接入loxp2退火双链，得到条件性敲除骨架载体，命名为pBluescript SK(+)-2loxp。

(3)供体载体的构建：根据引物设计原则，设计如下引物(表1)用于扩增供体载体的左右同源臂(LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。扩增得到的产物经表1中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp中，得到Donor Vector。

表1构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点

引物名称	引物序列	酶切位点
			LILRB4LA-F	GGGGTACCGTTCTTGTGTTGCTCTATGCTTTT	KpnⅠ
LILRB4LA-R	GCGTCGACTGCAACTCTGACATCCTAATTCTT	SalI
			LILRB4M-F	TCTACCGGTGCGTGGTGTAGCACACATAAC	AgeI
LILRB4M-R	GACCTTAAGATCACCATTTTGAGGAATTGACAC	AflII
			LILRB4RA-F	CGACGCGTGGGGGGTTGACATTTATGGG	MluI
LILRB4RA-R	ATAAGAATGCGGCCGCACAGTGCTCCCTCCCTTTTA	NotI

(4)打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分(负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA)分别进行转录。对于Cas9蛋白，将其表达载体pST1374-Cas9(Addgene 44758)用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGE mMACHINE试剂盒(AM1345，Ambion)进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒(Ambion)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscript^TMKit(AM1354，Ambion公司)进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)进行纯化。

(5)LILRB4-flox条件性敲除小鼠的制作

将上述成熟的mRNA产物与供体载体一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得LILRB4-flox纯合小鼠。

(6)心脏特异性LILRB4基因敲除小鼠的制作

将上述LILRB4-flox小鼠与心脏特异性α-MHC-Cre(购自Jackson Laboratory，货号005650)转基因小鼠交配，筛选得到LILRB4^flox/flox/α-MHC-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到心脏细胞特异性LILRB4基因敲除小鼠。

【实施例2】小鼠心肌肥厚模型的建立

1.实验动物分组：雄性背景C57BL/6心脏特异性Cre小鼠(α-MHC-Cre(WT)、心脏特异性LILRB4基因敲除小鼠(LILRB4-KO)，通过主动脉缩窄术建立心肌肥厚模型。随机分为4组，分组如下：C57BL/6背景野生型小鼠假手术组(WT Sham)及AB术组(WT AB)、LILRB4基因敲除小鼠假手术组(LILRB4-KO Sham)及AB术组(LILRB4-KO AB)。

2.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄(AB)手术，模型操作流程：

2.1术前准备

(1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药(3％戊巴比妥钠)量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间)。

(2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。

(3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。

2.2主动脉弓降支结扎术

取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75％酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。假手术组(Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚模型组。

2.3术后护理

主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。LILRB4基因敲除小鼠及野生型小鼠术后4周分别进行各项指标的检测。

【实施例3】小鼠心肌肥厚模型心肌肥厚及纤维化评价

1.取材

(1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10％甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10％KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。

(2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10％KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

(3)相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值(HW/BW)，肺重与体重的比值(LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值(HW/TL)。

2.病理学检测

2.1制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

2.2苏木精-伊红(HE)染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70％酒精充分混合均匀)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水)1min→水洗1min→伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-Pro Plus 6.0软件圈细胞面积。

2.3天狼猩红(PSR)染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2％磷钼酸2min→0.1％天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

3.分子生物学检测

实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测心肌肥厚相关指标：

3.1提取RNA：

(1)预冷离心机，自-80℃冰箱将待提取RNA的样本取出，液氮充分预冷冻存管后，使用显微剪将冻存管中组织样本剪碎并转移至1.5ml EP管。向每管心脏组织样品中加入1ml Trizol，静置10min。

(2)按照200μl/1ml Trizol的量向每个EP管加入三氯甲烷，上下颠倒混15-30sec后室温静置5min。4℃离心15min(12000g)。

(3)RNA沉淀：将上层水相小心转移至新的EP管中(一般300-400μl)，加入等量体积的异丙醇，混匀后，室温静置10min，12000g的转速4℃离心10min。配制75％乙醇(用25％DEPC处理过的去离子水配制)。

(4)离心后管底及管壁可见白色絮状沉淀(RNA)，去掉上清，加入1ml的75％乙醇，使用振荡器使RNA沉淀重悬，并颠倒EP管，充分漂洗RNA沉淀。并用7500g的转速4℃离心5min。

(5)RNA沉淀的溶解：去除上清，室温干燥10min直至白色沉淀变为无色即可。提前解冻RT-buffer、dT primer、一支PCR等级水、dNTP。用适量体积(20μl)的DEPC水溶解RNA沉淀，将EP管放至55℃水浴，持续10min促进RNA溶解。

3.2测定RNA浓度：

使用NanoDrop 2000测定每个样品的RNA浓度。

3.3反转录(PCR)：

(1)逆转录反应体系(总体积13μl)，1μl的dT primer、2μl的Random primer、根据测定的RNA浓度通过加不同量的PCR等级的水将总RNA浓度校正至2μg。

(2)混匀后将上述反应体系置于PCR仪中(70℃，10min)，反应结束后将PCR反应管取出后冰浴5min。

(3)将以上PCR反应管置于冰盒上并加以下试剂，最终体积为20ul。4μl5×RT-buffer、2μl的dNTP、0.5μl的inhibitor、0.5μl的RTase

(4)按以下程序进行反转录：a 25℃，10min；b 50℃，60min；c 90℃，5min；d 4℃，1min，待程序结束，取出反应管，保存于-80℃冰箱。

3.4实时荧光定量PCR(RT-PCR)：

(1)PCR反应体系，总体积20μl：10μl的

480SYBR Green I Maste(2X)、1μl的primer(10μm)、8μl的PCR等级的水、1μl的cDNA模板。

(2)按照上述体系配混合液(每个基因三复孔)：25.6μl的PCR等级的水，32μl的

480SYBR Green I Maste(2X)，3.2μl的引物。

(3)向上述混合液中加入cDNA模板：每管3.2μl。

(4)混匀后在96孔板上点样，每管点三个复孔，将96孔板3,000rpm离心2min。

(5)将离心的96孔板置于检测仪上，按设定程序检测。

RT-PCR所用引物序列如下表2：

WT和LILRB4-KO小鼠AB模型后的表型结果见图2、图3、图4、图5。Sham(假手术)组中WT小鼠和LILRB4-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；WT小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，LILRB4-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较WT小鼠升高(图2)。HE染色可观察到：Sham组心脏和心肌细胞无明显差异，AB组较Sham组的心脏和心肌细胞面积均增大，AB组LILRB4-KO小鼠的心脏心肌细胞面积统计结果明显大于WT组小鼠(图3)。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质及血管周围的胶原含量较Sham组增加，胶原增粗，排列紊乱成网络状；AB术后LILRB4-KO小鼠心肌间质及血管周围胶原含量大于WT组小鼠(图4)。图5是WT和LILRB4-KO小鼠AB模型4周后心脏组织中心肌肥厚标志物Anp，Bnp，Myh7以及心脏纤维化标志物Collagen1，Collagen3，Ctgf的mRNA水平。结果表明LILRB4敲除显著上调心肌肥厚标志物Anp，Bnp，Myh7以及心肌纤维化标志物Collagen1，Collagen3，Ctgf的Mrna表达水平。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚及纤维化，LILRB4-KO小鼠的心肌肥厚及纤维化程度大于WT小鼠。

【实施例4】心肌肥厚模型小鼠超声检测心功能

1前期准备

(1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

(2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0％异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

2心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司)。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd)及短轴缩短率(FS)。

本实施例运用M型超声心动图检测评价心肌肥厚和心功能。图6是WT和LILRB4-KO小鼠AB模型后心功能检测结果图。与WT Sham组相比，WT小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVEDd、LVESd均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，LILRB4-KO小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度比WT小鼠明显。说明和对照组相比，AB手术4周，LILRB4-KO小鼠的心腔扩张更为明显，心功能恶化更为显著。

【实施例5】LILRB4干扰(AdshLILRB4)及过表达(AdLILRB4)腺病毒对Ang II刺激的原代心肌细胞肥大的影响

1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养

(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部以下75％酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mL DMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。

(2)用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1-2mm³的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。

(3)加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用20％小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

(4)将收集好的心肌细胞悬液，以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。

(5)将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu(终浓度0.1mM)，混匀之后，加入到用0.1％明胶包被的器皿中。

(6)轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5％CO₂孵育48小时用PBS清洗1次，更换培养基。

2.LILRB4干扰(AdshLILRB4)及过表达(AdLILRB4)腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响

AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作对照)、AdshLILRB4(含靶向LILRB4的shRNA的腺病毒)、AdGFP(含GFP(绿色荧光蛋白)的腺病毒，用作对照)及AdLILRB4(表达LILRB4的腺病毒)。

2.1重组腺病毒构建

从美国InvivoGen公司购得LILRB4的表达载体(Open Biosystems，MMM4769-202762389)，应用腺病毒表达系统AdenoVec构建重组AdGFP、AdLILRB4；从美国SuperArray公司购得shRNA、shLILRB4的表达载体，然后应用腺病毒表达系统AdenoVec构建重组AdshRNA、Adsh LILRB4。

2.2重组腺病毒的鉴定

取病毒粗提液加入裂解液，经混匀、离心后取上清液作为模板进行PCR扩增，产物通过凝胶电泳鉴定。

2.3重组腺病毒的扩增：

转染前接种HEK293T细胞，待细胞达到50-70％汇合时换液，加入含有重组腺病毒载体的新鲜培养液，培养90分钟后再填加新鲜培养液，培养至大约有50％的细胞从培养板上脱落时，收集细胞悬液。反复冻融以制备病毒粗提液，通过CsCl密度梯度超速离心法纯化病毒液。

2.4重组腺病毒滴度测定：

在96孔板中接种HEK293T细胞，24小时后加入倍比稀释的病毒液，1-10列加入稀释的病毒液，每个浓度8个重复孔，11-12列加入无病毒完全培养液，培养10天后在显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，计算每个浓度的阳性率。病毒滴度采用Spearman-Karber Method计算：滴度(pfu/ml)＝10(x+0.8)，x＝各浓度阳性率总和。前提条件：阴性对照无CPE和生长抑制现象；最小稀释浓度组均有CPE；最大稀释浓度组均无CPE。

2.5重组腺病毒作用的鉴定：

用2×10⁸pfu/virus浓度的AdLILRB4和AdGFP及AdshLILRB4和AdshRNA感染6孔培养板中培养心肌细胞(约80％汇合度)，24小时后收集细胞，加入蛋白裂解液裂解50分钟后收集上清，取50μg样品经10％SDS-PAGE电泳分离后，用LILRB4特异性抗体做Western Blot分析。根据LILRB4蛋白的表达，确定腺病毒Ad LILRB4和AdGFP及AdshLILRB4和AdshRNA是否能发挥预期作用。

腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12小时后用1μM血管紧张素II(Ang II)(购自Sigma公司，A9525)或对照PBS刺激48小时，然后进行免疫荧光试验。结果表明，AdshLILRB4腺病毒感染后的心肌细胞表面面积较AdshRNA对照组增加，而经AdLILRB4腺病毒感染的心肌细胞表面面积则比对照组AdGFP明显降低(图7)。即LILRB4的干扰腺病毒促进心肌细胞肥大，LILRB4的过表达腺病毒抑制心肌细胞肥大。

由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，LILRB4基因缺陷显著促进了心肌肥厚、心肌纤维化，心功能恶化。在Ang II诱导的体外心肌肥大模型中，敲低LILRB4促进心肌细胞肥大，过表达LILRB4抑制心肌细胞肥大。因此LILRB4基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是LILRB4基因能够抑制心肌肥厚相关疾病发生的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtaggatgt cagagttgca gcgtgg 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggattcctca aaatggtgat gggggg 26

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcaccggta taaattgcta taatgtatgc tatacgaagt tatgacgtca 50

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatcccttaa gataacttcg tatagcatac attatagcaa tttatacgcg ta 52

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggtaccgt tcttgtgttg ctctatgctt tt 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgtcgactg caactctgac atcctaattc tt 32

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tctaccggtg cgtggtgtag cacacataac 30

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaccttaaga tcaccatttt gaggaattga cac 33

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgacgcgtgg ggggttgaca tttatggg 28

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ataagaatgc ggccgcacag tgctccctcc ctttta 36

Claims (1)

1.白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4作为药物靶点在筛选抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用，其特征在于，所述药物是提高白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4表达量的药物，所述的应用是非诊断和非治疗的。

Images