CN114432332B - circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物。本发明通过实验证明了circUTRN制备的治疗心力衰竭药物可以治疗或改善心力衰竭，尤其是对缺血再灌注损伤引起的心力衰竭有很好治疗效果；具体包括circUTRN具有改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全的作用；另外，circUTRN还可以减小急性心肌缺血再灌注损伤的梗死面积；过表达circUTRN能够抑制氧糖剥夺/恢复所诱导的心肌细胞凋亡。

Description

circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治 疗心力衰竭的药物
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物。
背景技术
心脏病的危害极大，几乎所有的心血管疾病最终都会导致心力衰竭的发生，心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等任何原因引起的心肌损伤，均可造成心肌结构和功能的变化，最后导致心室泵血和/或充盈功能低下，严重威胁着人类的生命。其中，缺血性心肌病是危害我国国民健康的重大疾病之一，及时进行再灌注是挽救缺血心脏的必需步骤，然而该过程伴随着严重的心肌缺血/再灌注(I/R)损伤，临床仍缺乏有效的干预手段。目前临床上治疗缺血性心肌病的手段主要由溶栓治疗、介入治疗及手术治疗。但是治疗过程多引起各种并发症，例如出血、空气栓塞、穿刺点出血、感染等。
环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，与传统的线性RNA(linear RNA，含5’-和3’-末端)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受核糖核酸外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，circRNA可以作为微小RNA或蛋白质的海绵体，从而实现对下游分子和信号通路的调控；部分circRNA还具有编码潜能，能够翻译成蛋白质或小肽发挥功能。越来越多的证据，circRNA在疾病的发生发展中发挥着重要的调控作用。在心血管领域，已有研究表明，circZNF292在心肌发育过程中促进内皮细胞的增殖；circANRIL在动脉粥样硬化疾病中促进细胞凋亡；circHRCR通过上调心脏保护蛋白ARC从而抑制病理性心肌肥厚和心力衰竭的发生；circFOXO3在心肌病中起到蛋白质海绵的作用，调控心脏衰老等。因此，需要找到一种普遍的缺血再灌注损伤相关的调节基因，并对其进行干预，才能够广泛实现对缺血再灌注损伤引起的心力衰竭的治疗。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物。本发明利用circUTRN制备的治疗心力衰竭药物可以治疗或改善心力衰竭，尤其是对缺血再灌注损伤引起的心力衰竭有很好治疗效果。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用，所述circUTRN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述心力衰竭包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭。
本发明还提供了一种表达circUTRN的重组载体，所述重组载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的circUTRN和成环载体。
优选的，所述成环载体包括含有启动子CMV的成环载体。
优选的，所述成环载体包括慢病毒过表达载体或腺病毒过表达载体。
优选的，所述circUTRN序列位于慢病毒过表达载体的EcoRI和NdeI酶切位点之间。
优选的，所述circUTRN序列位于AAV过表达载体的EcoRI和BamHI酶切位点之间。
本发明还提供了一种治疗心力衰竭的药物，所述药物包括：上述重组载体。
优选的，所述药物还包括慢病毒载体系统或腺病毒载体系统。
优选的，所述心力衰竭包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭。
有益效果：
本发明提供了circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用，所述circUTRN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过实验证明了circUTRN制备的治疗心力衰竭药物可以治疗或改善心力衰竭，尤其是对缺血再灌注损伤引起的心力衰竭有很好治疗效果；具体包括circUTRN具有改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全的作用；另外，circUTRN还可以减小急性心肌缺血再灌注损伤的梗死面积；过表达circUTRN能够抑制氧糖剥夺/恢复所诱导的心肌细胞凋亡。
附图说明
图1为荧光定量PCR检测尾静脉注射腺相关病毒9(AAV9)包装的circUTRN后心肌组织中circUTRN的表达明显上调；
图2为超声心动图检测静脉注射AAV9包装的circUTRN改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全；
图3为静脉注射AAV9包装的circUTRN后降低了急性心肌缺血再灌注损伤引起的心肌梗死严重程度；AAR/LV：Area at risk/Left ventricle weight，危险区/左心室；INF/AAR：Infarct size/Area at risk，梗死区/危险区；
图4为circUTRN能够抵抗OGD/R(氧糖剥夺/再恢复模型)诱导的新生小鼠心肌细胞凋亡(n＝6)；EV，对照载体；circUTRN，circUTRN过表达载体；TUNEL阳性指示心肌细胞凋亡阳性；图中白色箭头指示心肌细胞凋亡；α-Actinin，α-Actinin阳性表示该细胞是心肌细胞；DAPI，指示细胞核；
其中，Sham，假手术；IRI 3W，IRI后3周；AAV9-EV，AAV9对照病毒；AAV9-OE-circUTRN，circUTRN过表达AAV9；*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。
具体实施方式
本发明提供了circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用，所述circUTRN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：5’-TGGATCTCTTAGAGCTGAATACGACGAATGAAGTTTTCAAGCAGCACAAACTGAACCAAAATGATCAGCTCCTGAGTGTCCCAGACGTCATCAACTGTCTGACCACCACTTACGATGGGCTTGAGCAGCTGCACAAGGACTTGGTCAATGTTCCACTCTGCGTCGATATGTGTCTCAACTGGCTGCTCAACGTATACGACACGGGCCGGACTGGAAAAATTCGGGTACAGAGTCTGAAGATTGGATTGATGTCTCTCTCCAAAGGCCTCTTAGAAGAGAAATACAGATGTCTCTTTAAGGAGGTGGCAGGGCCAACAGAGATGTGTGACCAGCGGCAGCTTGGCCTGCTACTTCACGATGCCATCCAGATCCCTAGGCAGCTGGGGGAAGTAGCAGCCTTTGGGGGCAGTAACATTGAGCCCAGTGTCCGCAGCTGCTTCCAGCAGAATAACAACAAGCCAGAAATCAGTGTGAAGGAGTTTATAGACTGGATGCATTTGGAACCCCAGTCCATGGTGTGGTTGCCGGTTCTGCATCGGGTCGCAGCTGCTGAGACTGCAAAACATCAGGCCAAATGCAACATCTGCAAAGAATGCCCGATTGTTGGGTTCAGATACAGGAGCCTAAAGCATTTTAATTATGATGTCTGCCAGAGTTGCTTCTTTTCTGGAAGAACAGCAAAGGGCCACAAGTTACATTACCCGATGGTAGAATACTGCATACCG-3’。在本发明中，所述circUTRN的circAtlas ID为mmu-Utrn_0055。本发明通过实验证明了circUTRN制备的治疗心力衰竭药物可以治疗或改善心力衰竭，尤其是对缺血再灌注损伤引起的心力衰竭有很好治疗效果；具体包括circUTRN具有改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全的作用；另外，circUTRN还可以减小急性心肌缺血再灌注损伤的梗死面积；过表达circUTRN能够抑制氧糖剥夺/恢复所诱导的心肌细胞凋亡。
在本发明中，所述心力衰竭优选包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭，更优选包括缺血再灌注损伤引起的心力衰竭。
本发明还提供了一种表达circUTRN的重组载体，所述重组载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的circUTRN和成环载体。
在本发明中，所述成环载体优选包括含有启动子CMV的成环载体，进一步优选包括慢病毒过表达载体或腺病毒过表达载体，更优选包括慢病毒过表达载体pLO-ciR或腺病毒过表达载体pK5ssAAV-ciR。
在本发明中，所述circUTRN序列优选位于慢病毒过表达载体的EcoRI和NdeI酶切位点之间。本发明及实施例所述慢病毒过表达载体pLO-ciR优选购自广州吉赛生物科技股份有限公司，货号为GS0103。本发明提供的重组载体可以使目的基因(SEQ ID NO.1所示的序列)在真核细胞内表达为环状RNA circUTRN，从而发挥改善和/或治疗心力衰竭的作用。
在本发明中，所述circUTRN序列优选位于AAV过表达载体的EcoRI和BamHI酶切位点之间。本发明及实施例所述AAV过表达载体pK5ssAAV-ciR优选购自广州吉赛生物科技股份有限公司，货号为GS0109。本发明提供的重组载体可以使目的基因(SEQ ID NO.1所示的序列)在真核细胞内表达为环状RNA circUTRN，从而发挥改善和/或治疗心力衰竭的作用。
本发明还提供了一种治疗心力衰竭的药物，所述药物包括：上述重组载体。在本发明中，当所述重组载体的成环载体为AAV过表达载体时，所述药物的制备方法优选包括腺相关病毒包装；所述腺相关病毒优选包括AAV9病毒。本发明对所述药物的包装没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的操作方式即可。本发明所述腺相关病毒不参与任何疾病的发生，免疫原性低，基因可持续表达半年以上，其中AAV9病毒对心脏组织存在强的亲和性，可以作为载体将目的基因序列在心脏组织中稳定高效的表达。
在本发明中，当所述重组载体的成环载体为慢病毒过表达载体时，所述药物的制备方法优选包括慢病毒包装。本发明对所述药物的包装没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的操作方式即可。
在本发明中，所述药物优选还包括药学上可接受的辅料。
在本发明中，所述心力衰竭优选包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭，更优选包括缺血再灌注损伤引起的心力衰竭。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种表达circUTRN的重组载体，由以下步骤构建得到：
1)将小鼠心脏组织总RNA逆转录后依次进行PCR扩增，双酶切，回收获得circUTRN的cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)；所述PCR扩增的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：5’-CGGAATTCTGAAATATGCTATCTTACAGTGGATCTCTTAGAGCTGAATACGACG-3’，所述PCR扩增的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
5’-GGAATTCCATATGTCAAGAAAAAATATATTCACCGGTATGCAGTATTCTACCATCGG-3’；
每50μLPCR扩增反应体系中，由以下组分组成：上游引物(10μM)1μL(终浓度为0.2μM)、下游引物(10μM)1μL(终浓度为0.2μM)、2×TransStart FastPfuPCR SuperMix(全式金生物，货号AS221)25μL、cDNA模板(500ng/μL)1μL和无酶水22μL。
PCR反应进程为：95℃预变性2min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s，36个循环；4℃，保温。
所述双酶切的体系为：EcoRI-HF(星选酶)1μL、NdeI(星选酶)1μL、10x CutSmart缓冲液5μL、PCR产物/或者载体1μg和无酶水(体积定容到50μL)。
双酶切反应：37℃，4h；
双酶切后的PCR产物采用天根生物超薄DNA产物纯化试剂盒(货号DP203)清洁回收。
2)将成环载体(慢病毒过表达载体pLO-ciR，购自广州吉赛生物科技股份有限公司，货号为GS0103)进行双酶切(方法同步骤1)后，采用天根生物超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号DP208)回收大片段载体。
3)将步骤1)回收的片段插入步骤2)回收的成环载体上，得到连接产物。具体反应体系如下：T4 DNA连接酶1μL、10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL、双酶切的载体(100ng)2μL、双酶切的基因(100ng)1μL和无酶水5μL，总体积为10μL。
反应条件为：16℃，8h；
4)50μL感受态细胞(感受态细胞TransStbl3 Chemically Competent Cell全式金生物，货号CD521)冰上化开，加入5μL步骤3)制备的连接产物，轻弹混匀，在冰上放置25min；42℃热激45s，然后放置回冰上2min；后加入500μL培养基(无抗LB培养基，品牌为全式金，货号为Cat#CD521)，混匀后37℃，180转/min培养1h，复苏细菌。涂布在氨苄抗性的培养平板上过夜培养。过夜培养后挑取单克隆摇菌，送Sanger测序。
实施例2
一种与实施例1相似的表达circUTRN的重组载体，区别在于：
1、将步骤1)中的下游引物替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物，具体如下：
5’-CGGGATCCAGTTGTTCTTACCGGTATGCAGTATTCTACCATCGG-3’；2、将步骤1)中的NdeI(星选酶)替换为BamHI-HF(星选酶)；
3、将步骤2)中的成环载体替换为AAV过表达载体pK5ssAAV-ciR(购自广州吉赛生物科技股份有限公司，货号为GS0109)。
实施例3
一种治疗心力衰竭的药物，所述药物的制备方法如下：
使用293T细胞在合适的细胞密度(80％)时加入包装体系；每皿10cm培养皿加入1mL包装体系：10μgAAV2/9(购自Addgene Plasmid，货号#112865)、10μg pAdDeltaF6质粒(购自Addgene Plasmid，货号#112867)、10μg实施例2构建的重组载体，加DMEM培养基(无FBS无双抗)至910μl，加90μl PEI转染试剂(总体积：1mL)；细胞转染60h之后收集上清及其细胞；采用碘克沙醇浓缩超速离心纯化病毒(收集上清后用浓缩柱(Merck UFC905096)4000rpm 4℃，将所有上清离心浓缩至10～15mL即可)，得到的病毒悬液为所述药物；所述病毒悬液滴度为1×1013vg/mL。
应用例1
心肌缺血再灌注损伤(IRI)模型建立：IRI模型采用最严重的损伤效果，通过结扎冠状动脉左前降支造成心肌缺血30min后再进行血液复灌。取8～10周龄的野生型雄性小鼠，给小鼠以10μL/g的剂量腹腔注射4％水合氯醛对小鼠进行麻醉，麻醉后使用医用胶带将小鼠腹部朝上固定在恒温毯上，使用脱毛膏去除小鼠后颈部毛发。75％乙醇对脱毛部分进行消毒，在显微镜下，使用小剪刀将小鼠胸骨左缘第四第五肋间位置做一横形切口，切口长约1.2cm，并逐层分离胸壁肌肉直至肋间肌暴露，使用显微镊钝性分离肋间肌肉，暴露心脏，结扎左前降支动脉(左心耳至肺动脉圆锥间，因肉眼不可见，故结扎成功视下方心尖部缺血(变白)情况而定)。缝合肋间肌和胸壁肌肉。30min后再次打开胸腔，将结扎线剪断取出。将小鼠至于恒温毯上保温等待复苏后转移至鼠笼中饲养24小时(IRI急性模型)或21天(IRI 3周，长期重构模型)后处死小鼠，称量小鼠体重、胫骨长度、心脏重量等称重后留样进行后续检测。本实施例中所述假手术与上述IRI手术相似，唯一区别在于，未进行结扎处理。
实验分组分为4个组，具体分组信息：
第1组对照病毒组(实施例3中的AVV2/9)+假手术组，对小鼠心脏进行注射对照病毒，均按照10^11vg/只小鼠，一周后进行假手术，样本数为10只；
第2组AAV9-circUTRN病毒(实施例3制备的药物)+假手术组，对小鼠心脏进行注射AAV9-circUTRN病毒，均按照10^11vg/只小鼠，一周后进行假手术，样本数为10只；
第3组对照病毒(实施例3中的AVV2/9)+IRI手术组，对小鼠心脏进行注射对照病毒，均按照10^11vg/只小鼠，一周后进行上述IRI手术，样本数为14只；
第4组AAV9-circUTRN病毒(实施例3制备的药物)+IRI手术组，对小鼠心脏进行注射AAV9-circUTRN病毒，均按照10^11vg/只小鼠，一周后进行上述IRI手术，样本数为13只。
利用RNAiso Plus提取上述4组小鼠心脏组织中的总RNA，采用荧光定量PCR法检测假手术及IRI手术后三周的circUTRN相对表达量；
具体如下：以18s作为内参引物(具体序列为F1：5’-TCAAGAACGAAAGTCGGAGG-3’，SEQ ID NO.5和R1：5’-GGACATCTAAGGGCATCAC-3’，SEQ ID NO.6)；circUTRN的qPCR引物序列为：F2：5’-GGCCACAAGTTACATTACCCG-3’，SEQ ID NO.7和R2：5’-acgttgagcagccagttgag-3’，SEQ ID NO.8，qPCR的结果采用相对定量法进行分析，运用2-ΔΔCt进行计算，如下：ΔCt＝靶基因Ct值-内参Ct值，ΔΔCt＝各实验组ΔCt值-对照组ΔCt平均值；
具体实时荧光PCR(10μL体系)方法如下：
配制引物工作液：储液(100μM)稀释20倍变成母液(5μM)，母液稀释10倍变成工作液(0.5μM)；
配制cDNA和SYBR混合液：常用体积比是cDNA:SYBR＝1:20(5μL/孔)。
加板：加板顺序为：先加5μL引物工作液，后加5μL cDNA和SYBR的混合液，共10μL体系。
PCR反应程序：BIO-RAD 2STEP
95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃退火60s，循环40次；
熔融曲线分析：95℃1s，60℃1s，95℃continuous
(65～95℃0.5℃increments at 2-5sec/step)
Cooling 40℃30s。
具体的，第1组10只小鼠相对RNA含量为0.838568、1.141555、1.018185、1.334223、0.75576、0.835667、0.777007、1.236275、1.249196、1.014663；
第2组10只小鼠相对RNA含量为1.848045、1.522033、1.718322、1.470187、2.940375、2.631709、3.108029、1.712377、1.913216、1.181812；
第3组14只小鼠相对RNA含量为0.454074、0.753145、0.557097、0.503827、0.541863、0.491751、0.560972、0.592957、0.484981、0.473357、0.368823、0.410655、0.373971、0.483303；
第4组13只小鼠相对RNA含量为1.83528、1.575708、2.167452、1.223488、1.516768、2.613531、2.455471、1.53262、0.796088、1.454981、1.642621、2.057653、0.911301。统计结果如图1所示，*，P＜0.05，***，P＜0.001。
结果表明，circUTRN在急性IRI手术三周后表达下调；尾静脉注射AAV9包装的circUTRN后心脏组织中circUTRN的表达明显上调。
应用例2
采用应用例1相同的分组及处理方式，选取C57BL/6J成年公鼠施行冠状动脉左前降支结扎，结扎30min后松开，在IRI手术3周后，进行心脏超声测量上述四个组心功能相关指标(射血分数(EF)和短轴缩短率(FS))。小动物心脏超声测定小鼠心功能：将小鼠胸部脱毛后，用异氟烷吸入麻醉法将小鼠麻醉，在超声平板上固定好小鼠四肢，并将适量螯合剂涂抹于小鼠腹部心脏处，用探头找到小鼠心脏，待心率稳定在400bpm左右，取胸骨旁左心室长轴及左心室短轴进行检查，测量并计算心功能，获得心功能相关指标：左室射血分数EF和左心室短轴缩短率FS。结果见图2。
具体数据为：第1组10只小鼠FS(％)值为26.57607、28.73468、30.00613、34.14948、32.35228、29.93588、22.36367、26.9502、27.2448、26.21533；
第2组10只小鼠FS(％)值为28.37145、34.25649、31.288、26.87928、31.41054、37.83692、27.23812、22.8164、34.70449、32.0555；
第3组14只小鼠FS(％)值为25.7799、25.72851、17.9281、16.89639、16.79336、18.24466、17.54019、20.96864、16.8033、23.96844、14.63545、24.6609、16.61429、23.86121；
第4组13只小鼠FS(％)值为31.41518、30.00557、30.17961、28.22829、27.84015、34.28185、34.86179、29.70271、28.46201、22.60534、34.172137、27.64563、24.13351。
第1组10只小鼠EF(％)值为52.58755、55.87751、58.14579、64.05795、61.45018、57.95299、45.50572、53.6604、53.85443、52.0395；
第2组10只小鼠EF(％)值为55.51394、64.23814、59.70567、53.01966、60.23159、68.61732、53.49452、46.05206、65.00643、60.71237；
第3组14只小鼠EF(％)值为51.63186、51.77215、37.77709、35.63613、35.49855、38.65654、37.26884、43.38542、35.61092、48.38518、32.21303、49.7293、35.34495、49.15511；
第4组13只小鼠EF(％)值为60.09334、57.32902、58.13966、55.29248、54.55704、64.67837、65.48337、57.59445、56.06144、46.36027、63.965966、54.38887、49.07793。统计结果如图2所示，**，P＜0.01。
由图2可知，尾静脉注射circUTRN过表达AAV9能够改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全。
应用例3
TTC染色实验分组分为2个组，每组各10只小鼠，具体为：
第1组：在IRI模型造模1周前开始，采用一次性1mL无菌注射器通过尾静脉注射对照AAV9(实施例3中的AVV2/9)，按照10^11vg/只小鼠的浓度进行处理；
第2组：在IRI模型造模1周前开始，采用一次性1mL无菌注射器通过尾静脉注射AAV9-circUTRN(实施例3制备的药物))，按照10^11vg/只小鼠的浓度进行处理。一周后两组采用应用1所述的方法进行IRI手术，24小时之后取样。
TTC(Triphenyltetrazolium Chloride，2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色：将接受IRI手术后的小鼠用4％的水合氯醛腹腔注射麻醉，按照每20g体重200μL麻醉。待小鼠麻倒后，将小鼠腹部向上平躺固定在泡沫板上，剪刀剪开胸部皮肤、肌肉和肋骨，露出心脏。首先，用7-0带线针再次结扎缺血手术时的心脏结扎位点，结扎完成后，用1mL胰岛素注射器吸取1～2mL 1％的Evans Blue，注射入小鼠心脏左心室，观察小鼠鼻尖和四肢，直到鼻尖和四肢变蓝色，注射完成。取出心脏后将心脏置于1.5mL离心管，-20℃冰箱暂存。待心脏冷冻变硬后便可进行切片。将心脏放与切片模具的凹槽里，按凹槽空格依次将刀片经心脏表面由上向下插进空格。待刀片插满后，平行按压刀片，将心脏切成每片1mm的厚度，取下刀片，将心脏切片放进1.5mL离心管。将事先配好的1％的TTC溶液加到离心管中，每管1mL，加好后将离心管置于37℃避光水浴10min。将4％的PFA溶液加到96孔板中，用于固定心脏切片。水浴结束后，将心脏切片从离心管中取出，放入96孔板中固定，每孔一片。固定时间1.5小时。切片固定后1.5小时拍照，防止时间过久颜色流失。96孔板中取出每片心脏称重，记录。使用Image J软件手动圈绘统计心脏切片正面整片面积，正面白色梗死面积，正面红色面积和反面整片面积，反面白色梗死面积，反面红色面积。将统计得到面积数据对应每片切片重量填入表格。
具体实验结果见附图3，具体的，第1组AAR/LV比值为0.546797124、0.498411923、0.573749793、0.478128607、0.502519571、0.474636482、0.466649783、0.501469873、0.504364335、0.445463737；
第2组AAR/LV比值为0.420656141、0.501991857、0.504419175、0.412981739、0.596882045、0.560244519、0.55786186、0.475217199、0.523069062、0.459159742；
第1组INF/AAR比值为0.412583、0.558483、0.544388、0.485926、0.573036、0.541956、0.484268、0.498673、0.548814、0.542946；
第2组INF/AAR比值为0.278354675、0.261470747、0.473479359、0.387369342、0.245335、0.367833474、0.349436683、0.497779168、0.404129982、0.296345906。统计结果如图3所示，**，P＜0.01。
结果表明，尾静脉注射circUTRN过表达AAV9能够改善心肌缺血再灌注损伤引起的心肌梗死面积。
应用例4
心肌细胞氧葡萄糖剥夺恢复(OGD/R)模型建立及质粒转染：NMCM用正常心肌细胞培养基培养，待细胞铺展至80％孔面积时换无血清培养基饥饿处理7小时；将6μL
Figure BDA0003519949020000111
2000加入100μL无血清培养基(DMEM)中，预混5分钟(轻轻吹打混匀后静置5分钟)，记为A液；将2μg质粒加入100μl无血清培养基(DMEM)中，预混5分钟(轻轻吹打混匀后静置5分钟)，记为B液；预混结束将A液与B液混匀，室温静置20分钟后，以100μl/孔的量加入到96孔板中，转染7小时后，弃转染培养基，换成无血清培养基，于37℃，5％CO2的恒温培养箱中继续培养；换液20h之后，将细胞的培养基换成无糖培养基，并将细胞培养板放置在缺氧盒(一个缺氧盒中放置一个缺氧袋，并用无菌填充物尽量排尽缺氧盒中的空气)中孵育8h；从缺氧盒中取出细胞培养板行复氧操作，并将无糖培养基换回正常心肌细胞培养基孵育12h至实验终点。
在新生小鼠心肌细胞中，转染实施例1制备的表达circUTRN的重组载体(0.02mg/L)，处理72h后收集细胞，在实验终点前20小时构建OGD/R模型(缺氧缺糖8h，复氧复糖12h)完成功能获得性实验。具体分组为：1)circUTRN对照组(实施例1中的慢病毒过表达载体pLO-ciR)，2)circUTRN对照+OGD/R处理组，3)circUTRN过表达组(实施例1制备的表达circUTRN的重组载体)，4)circUTRN过表达+OGD/R处理组。实验终点以Tunel与α-actinin/Hoechst免疫荧光共染检测circUTRN对心肌细胞凋亡的保护作用。
由图4可知，OGDR模型中，NMCM凋亡水平与对照组相比显著上升；并且在基础水平过表达circUTRN对凋亡没有影响；而在OGDR刺激下，过表达circUTRN能够保护NMCM缺血再灌注损伤引起的凋亡。具体的，第1)组凋亡率(％)为4.164398、3.660825、3.954054、5.02763、5.036923、6.062882；
第2)组凋亡率(％)为4.35287、5.562385、4.304403、5.45163、3.801478、4.991256；
第3)组凋亡率(％)为12.97532、15.21066、15.17345、17.85742、14.54959、15.53715；
第4)组凋亡率(％)为9.172941、9.148951、8.449327、11.39639、7.821497、10.04349。统计结果如图4所示，**，P＜0.01。
综上所述，circUTRN具有改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全的作用；另外，circUTRN还可以减小急性心肌缺血再灌注损伤的梗死面积；过表达circUTRN能够抑制氧糖剥夺/恢复所诱导的心肌细胞凋亡。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 上海大学
<120> circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 725
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggatctctt agagctgaat acgacgaatg aagttttcaa gcagcacaaa ctgaaccaaa 60
atgatcagct cctgagtgtc ccagacgtca tcaactgtct gaccaccact tacgatgggc 120
ttgagcagct gcacaaggac ttggtcaatg ttccactctg cgtcgatatg tgtctcaact 180
ggctgctcaa cgtatacgac acgggccgga ctggaaaaat tcgggtacag agtctgaaga 240
ttggattgat gtctctctcc aaaggcctct tagaagagaa atacagatgt ctctttaagg 300
aggtggcagg gccaacagag atgtgtgacc agcggcagct tggcctgcta cttcacgatg 360
ccatccagat ccctaggcag ctgggggaag tagcagcctt tgggggcagt aacattgagc 420
ccagtgtccg cagctgcttc cagcagaata acaacaagcc agaaatcagt gtgaaggagt 480
ttatagactg gatgcatttg gaaccccagt ccatggtgtg gttgccggtt ctgcatcggg 540
tcgcagctgc tgagactgca aaacatcagg ccaaatgcaa catctgcaaa gaatgcccga 600
ttgttgggtt cagatacagg agcctaaagc attttaatta tgatgtctgc cagagttgct 660
tcttttctgg aagaacagca aagggccaca agttacatta cccgatggta gaatactgca 720
taccg 725
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggaattctg aaatatgcta tcttacagtg gatctcttag agctgaatac gacg 54
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaattccat atgtcaagaa aaaatatatt caccggtatg cagtattcta ccatcgg 57
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgggatccag ttgttcttac cggtatgcag tattctacca tcgg 44
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaagaacga aagtcggagg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggacatctaa gggcatcac 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggccacaagt tacattaccc g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttgagca gccagttgag 20

Claims (10)

1.circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用，其特征在于，所述circUTRN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心力衰竭包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭。
3.一种表达circUTRN的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括核苷酸序列如SEQID NO.1所示的circUTRN和成环载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述成环载体包括含有启动子CMV的成环载体。
5.根据权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，所述成环载体包括慢病毒过表达载体或腺病毒过表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述circUTRN序列位于慢病毒过表达载体的EcoRI和NdeI酶切位点之间。
7.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述circUTRN序列位于AAV过表达载体的EcoRI和BamHI酶切位点之间。
8.一种治疗心力衰竭的药物，其特征在于，所述药物包括：权利要求3～7任一项所述的重组载体。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物的制备方法包括病毒包装。
10.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于，所述心力衰竭包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭。
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