CN105920025B - 托吡酯在治疗心肌梗死的药品中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用托吡酯在治疗心肌梗死中的应用。该药物作为一种新型的抗癫痫药，因其不良反应少，耐受性佳，广泛应用于临床。本发明在心肌梗死后早期应用托吡酯治疗，其通过激活单核/巨噬细胞表面的GABA_A受体，调节炎症反应和修复作用之间的平衡，进而通过减少梗死面积，增加胶原沉积，改善心功能，以减轻心室重构，最终降低心血管相关的临床不良事件(死亡、心室破裂)的发生率。由于目前临床上主要治疗心肌梗死的药物(ACEI、ARB、β受体阻滞剂)都受到其本身降低血压的药理学特性限制，本发明为心肌梗死后血压值无法稳定地达到90/60mmHg以上的患者，提供了新的治疗策略。

Description

托吡酯在治疗心肌梗死的药品中应用

技术领域

本发明涉及治疗心肌梗死领域，具体地指一种托吡酯在治疗心肌梗死的药品中应用。

背景技术

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠状动脉血流突然中断所导致，其引起的高死亡率和严重的临床并发症成为近年来威胁全球人类健康的严峻问题。MI后所致的心力衰竭和心室破裂是冠心病致残和致死的主要原因。大量研究发现，MI后的炎症反应是修复过程中坏死组织清除和瘢痕组织生成的基础，且适当调控炎症反应的时程和强度有利于上述两者的平衡，而MI后心肌组织的修复质量是影响远期预后的决定性因素。

自上市以来，以下三种药物由于显著的降压作用及广泛的应用范围而成为高血压治疗的基石：血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)和血管紧张素II受体阻滞剂(angiotensin receptor blockers,ARB)通过阻断肾素-血管紧张素-醛固酮(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)系统降压，β受体阻滞剂除此之外，还可以通过拮抗交感神经系统的过度激活发挥降压效应。随后，通过大量的循证医学证据进一步显示了它们在心肌梗死中的应用。

2015年急性ST段抬高型心肌梗死(ST-Segment Elevation MyocardialInfarction,STEMI)诊断和治疗指南将ACEI和β受体阻滞剂列为I类推荐(即已证实和/或一致公认某治疗措施或操作有益、有效，应该采用)，且示所有STEMI患者出院后均应在监测血压、心率的情况下，长期服用ACEI和β受体阻滞剂，不能耐受ACEI的患者可改用ARB类药物。同时，指南中强调，血压值在90/60mmHg以上的患者，应用上述两种药物较为安全。

业已证实，MI后，由于心肌坏死，引起左室射血分数下降，左室舒张末压增高，左室顺应性下降，冠脉灌注压下降，非梗死相关冠脉狭窄，远端心肌缺血和收缩功能减退，左心室总体泵血功能减低，因此，低血压状态是MI患者常见的症状，尤其MI后早期患者血压波动较大。MI患者的低血压症状，一方面使得冠状动脉的血液灌注不足加重,甚至进一步诱发或加重心肌缺血；另一方面，低血压症状引起的外周有效循环血量不足可引发低血压性休克，直接危害患者的生命安全。

综上所述，当MI患者的血压值无法稳定地达到90/60mmHg以上时，具有降压作用的ACEI、ARB和β受体阻滞剂的使用受到了限制，即该类患者丧失了使用上述三种药物相关的治疗方案。

发明内容

本发明的目的是提供托吡酯在治疗心肌梗死的药品中应用，解决了现有ACEI、ARB和β受体阻滞剂在血压值低于90/60mmHg条件下使用受限制缺陷。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种托吡酯在治疗心肌梗死的药品中应用。

托吡酯(topiramate)，商品名妥泰(Topamax)，化学名为2,3:4,5-双-O-(1-甲基亚乙基)-β-D-吡喃果糖氨基磺酸酯。它是由美国强生制药公司(Johnson&Johnson)开发，并于1995年在英国上市，FDA于1996年批准用于治疗成人原发性部分性癫痫，于2000年批准用于儿童癫痫治疗。2004年FDA又批准该药用于成人偏头痛的预防。2012年7月FDA批准了美国Vivus制药公司的含有托吡酯和苯丁胺的复方减肥药Qsymia上市，是美国13年来通过的第2个减肥新药。

临床上，托吡酯作为一种新型抗癫痫药，通过其阻断电压依赖性钠离子通道、在GABA受体非苯二氮类位点增加GABA活性、拮抗红藻氨酸/AMPA-谷氨酸受体、轻度抑制碳酸酐酶等药理学特性，已广泛用于成人和儿童的部分发作、原发性全面性强直阵挛发作及Lennox-Gastaut综合征的添加治疗，其不良反应较少，耐受性佳。同时，托吡酯也被作为特异性的GABA_A受体激动剂广泛应用于神经内科学，内分泌学和免疫学等领域的科学研究中，但在心血管领域中的相关研究，并无报道。

本发明中托吡酯应用于MI后的早期治疗，首先，由于其可通过激活单核/巨噬细胞表面的GABA_A受体以调节Ly6C^high/Ly6C^low型Mo、M1/M2型MΦ、Th1/Th2细胞之间的平衡，而减轻MI后早期M1型MΦ所介导的促炎反应的强度，增强M2型MΦ所介导的修复作用，最终改善炎症反应和修复作用失衡所引起的梗死面积增大、胶原密度减少和心功能恶化等心室不良重塑的表现，并降低死亡率和心室破裂率等临床不良事件的发生率。

综上所述，托吡酯通过激活单核/巨噬细胞表面的GABA_A受体减少梗死面积、增加胶原密度、改善MI后心功能并最终降低MI后死亡率和心室破裂率，与此同时，托吡酯已被证实，在治疗癫痫的同时不改变患者治疗中和治疗后的血压值，故应用托吡酯药理学特性使其能应用于MI后血压值无法稳定地达到90/60mmHg以上的患者，并使该类患者获益。

本发明的有益效果在于：

在MI后早期，本发明的托吡酯通过激活单核/巨噬细胞表面的GABA_A受体，调节炎症反应和修复作用之间的平衡，进而通过减少梗死面积，增加胶原沉积，改善心功能，以减轻心室重构，最终降低心血管相关的临床不良事件(死亡、心室破裂)的发生率。

附图说明

图1为不同药物处理方式对小鼠MI术后生存率和心室破裂率的影响图；

图中，图1A为小鼠MI术后各组生存率(Survival)曲线图，纵坐标表示生存率，单位为％，横坐标表示天数，单位为Day；

图1B为小鼠MI术后各组心室破裂率(Rupture rate)曲线图，纵坐标表示心室破裂率，单位为％，横坐标表示天数，单位为Day；

图2为不同药物处理方式对小鼠MI术后心脏功能的影响图；

图中，图2A为小鼠MI术后14天各组B型超声图，

图2B为小鼠MI术后14天各组乳头肌(Mid)水平M型超声图，其中实线表示舒张期，虚线表示收缩期，箭头表示左室内径；

图2C为小鼠MI术后14天各组心尖(Apical)水平M型超声图，其中实线表示舒张期，虚线表示收缩期，箭头表示左室内径；

图3为不同药物处理方式对小鼠MI术后左室重构的影响图；

图中，图3A为小鼠MI术后14天各组心脏Masson染色图(低倍镜)，图中灰色区域为正常心肌组织，黑色区域为梗死区；

图3B为小鼠MI术后14天各组心脏Masson染色图(高倍镜)，图中灰色区域为正常心肌组织，黑色区域为梗死区胶原；

图3C为小鼠MI术后14天各组心脏梗死面积图(infarct size)，其中纵坐标表示心脏梗死面积百分比，单位为％，横坐标表示切片位置距离结扎线长度，

图3D为小鼠MI术后14天各组心脏梗死区胶原密度图(collagen density)，其中纵坐标表示心脏梗死区胶原密度百分比，单位为％，横坐标表示分组；

图4为心肌组织和免疫细胞上托吡酯作用受体即GABA_A受体α1和β3亚基表达的情况图；

图中，图4A为GABA_A受体α1亚基在小鼠心脏和脾脏巨噬细胞中的表达情况图，其中304bp为α1亚基片段长度，Br为脑组织，My为心肌组织，MΦ为巨噬细胞，NCM为乳鼠心肌细胞，NCF为乳鼠心肌成纤维细胞，ACM为成鼠心肌细胞，ACF为成鼠心肌成纤维细胞，AEC为成鼠内皮细胞；

图4B为GABA_A受体β3亚基在小鼠心脏和脾脏巨噬细胞中的表达情况，其中355bp为β3亚基片段长度，图4C为GABA_A受体α1亚基在小鼠免疫细胞中的表达情况，其中304bp为α1亚基片段长度，Br为脑组织，MΦ为巨噬细胞，Mo为单核细胞，CD4⁺T为CD4⁺T细胞；图4D为GABA_A受体β3亚基在小鼠免疫细胞中的表达情况，其中355bp为β3亚基片段长度，Br为脑组织，MΦ为巨噬细胞，Mo为单核细胞，CD4⁺T为CD4⁺T细胞；

图5为不同药物处理方式对小鼠MI术后单核细胞生成的影响图；

图中，图5A为小鼠MI术后1、3、7天各组脾脏(spleen)中Ly6C^high和Ly6C^low单核细胞(monocytes)的流式图和数目，其中左图为流式图，CD11b和Ly6C为单核细胞标记物，流式图中方框内的数字表示两型细胞的比例，右图为两型单核细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单位为1×10⁵个，横坐标表示天数，单位为Day；

图5B为小鼠MI术后1、3、7天各组外周血(peripheral blood)中Ly6C^high和Ly6C^low单核细胞(monocytes)的流式图和数目，其中左图为流式图，CD11b和Ly6C为单核细胞标记物，流式图中方框内的数字表示两型细胞的比例，右图为两型单核细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单位为1×10⁴个，横坐标表示天数，单位为Day；

图5C为小鼠MI术后1、3、7天各组骨髓(bone marrow)中Ly6C^high和Ly6C^low单核细胞(monocytes)的流式图和数目，其中左图为流式图，CD11b和Ly6C为单核细胞标记物，流式图中方框内的数字表示两型细胞的比例，右图为两型单核细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单位为1×10⁶个，横坐标表示天数，单位为Day；

图5D为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)、外周血(peripheral blood)、骨髓(bone marrow)和脾脏(spleen)中IL-1β的水平图，其中心脏、骨髓和脾脏中检测IL-1βmRNA水平，纵坐标表示ΔCt＝目的基因Ct值－管家基因Ct值，Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的目的DNA实时监测扩增时的荧光强度达到指数扩增时的循环数，单位为2×10³，横坐标表示天数，单位为Day；外周血中检测血清IL-1β蛋白水平，纵坐标表示IL-1β含量，单位为pg/mL，横坐标表示天数，单位为Day；

图5E为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)中MCP-1的mRNA水平，纵坐标表示ΔCt＝目的基因Ct值－管家基因Ct值，Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的目的DNA实时监测扩增时的荧光强度达到指数扩增时的循环数，单位为2×10³，横坐标表示天数，单位为Day；

图6为不同药物处理方式对小鼠MI术后巨噬细胞极化的影响图；

图中，图6A为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)中M1型和M2型巨噬细胞(macrophages,简写符号MΦ)的流式图和数目，其中左图为流式图，F4/80和CD11c为巨噬细胞标记物，流式图中方框内的数字表示两型细胞的比例，右图为两型巨噬细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单位为1×10³个，横坐标表示天数，单位为Day；

图6B为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)中巨噬细胞(F4/80⁺macrophages)的总数，纵坐标表示细胞数目，单位为1×10³个，横坐标表示天数，单位为Day；

图6C为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏中Mac-3的免疫组化图和巨噬细胞(macrophages)总数，上方为Mac-3的免疫组化图，其中黑色为Mac-3，下方为巨噬细胞总数，纵坐标表示细胞数目，单位为个/mm²，横坐标表示天数，单位为Day；

图6D为小鼠MI术后1、3、7天各组脾脏(spleen)中Th2细胞的流式图和数目，其中左图为流式图，CD4和IL-4为Th2细胞标记物，流式图中方框内的数字表示Th2细胞所占比例，右图为Th2细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单位为1×10³个，横坐标表示天数，单位为Day；

图6E为小鼠MI术后1、3、7天各组脾脏(spleen)中GATA3的mRNA水平图，纵坐标表示ΔCt＝目的基因Ct值－管家基因Ct值，Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的目的DNA实时监测扩增时的荧光强度达到指数扩增时的循环数，单位为2×10³，横坐标表示天数，单位为Day；

图6F为小鼠MI术后1、3、7天各组脾脏(spleen)中Th1细胞的流式图和数目，其中上方为流式图，CD4和IFN-γ为Th1细胞标记物，流式图中方框内的数字表示Th1细胞所占比例，下方为Th1细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单位为1×10³个，横坐标表示天数，单位为Day；

图7为不同药物处理方式对小鼠MI术后M1相关细胞因子表达情况的影响图；

图中，图7A为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)中TNF-α，IL-6，MMP-9的mRNA水平图，纵坐标表示△Ct＝目的基因Ct值－管家基因Ct值，Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的目的DNA实时监测扩增时的荧光强度达到指数扩增时的循环数，单位为2×10³，横坐标表示天数，单位为Day；

图7B为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)中MMP-9的蛋白印迹图和明胶酶谱图，上方为蛋白印迹图，中间为内参(GAPDH)，下方为明胶酶谱图；

图7C为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)中MMP-9的蛋白相对表达量图(protein relative expression)，纵坐标表示蛋白相对表达量，横坐标表示天数，单位为Day；

图7D为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)中MMP-9的蛋白相对活性图(proteinrelative activity)，纵坐标表示蛋白相对表达量，横坐标表示天数，单位为Day；

图8为不同药物处理方式对小鼠MI术后M2相关细胞因子表达情况的影响图；

图中，图8A为小鼠MI术后1、3、7、14天各组心脏(heart)中血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β1(TGF-β1)和白细胞介素10(IL-10)的mRNA水平图，纵坐标表示ΔCt＝目的基因Ct值－管家基因Ct值，Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的目的DNA实时监测扩增时的荧光强度达到指数扩增时的循环数，单位为2×10³，横坐标表示天数，单位为Day；

图8B为小鼠MI术后7、14天各组心脏中CD31的免疫荧光图，其中白色为CD31；

图8C为小鼠MI术后7、14天各组心脏中α-SMA的免疫组化图，其中黑色为α-SMA；

图8D为小鼠MI术后7、14天各组心脏中I型胶原的免疫组化图，其中黑色为I型胶原；

图8E为小鼠MI术后7、14天各组心脏的苦味酸天狼星红染色图，其中白色为提高梗死区修复质量的相关胶原；

图8F为小鼠MI术后7、14天各组心脏中毛细血管数目(capillary numbers)，纵坐标表示毛细血管数目，单位为个/mm²，横坐标表示天数，单位为Day；

图8G为小鼠MI术后7、14天各组心脏中α-SMA所占比例(％)，纵坐标表示α-SMA所占比例，单位为％，横坐标表示天数，单位为Day；

图8H为小鼠MI术后7、14天各组心脏中I型胶原所占比例(％)，纵坐标表示I型胶原所占比例，单位为％，横坐标表示天数，单位为Day；

图8I为小鼠MI术后7、14天各组心脏中提高梗死区修复质量相关胶原所占比例(％)，纵坐标表示提高梗死区修复质量相关胶原所占比例，单位为％，横坐标表示天数，单位为Day。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

(一)心梗(MI)手术及分组

1、实验对象

300只8～10周龄C57BL/6雄性小鼠，体重22～25g，购于北京大学动物中心(由美国Jackson实验室引进繁殖)，依照2011年美国国家科学院所颁布的《实验动物饲养和使用指南》，动物饲养于华中科技大学动物实验中心SPF级实验动物房；

2、手术及分组

假手术组/Sham组：按照MI小鼠模型方法，只穿线不结扎，样本为6只；

心梗组/MI组：按照MI小鼠模型方法，结扎冠状动脉左前降支，随机分为以下3组，每组样本为12只，MI对照组即PBS组(control)；MI干预组即托吡酯干预组(topiramate)和荷包牡丹碱干预组(bicuculline)；

3、给药剂量、频率及途径

剂量：PBS 8mL/Kg、托吡酯35mg/Kg、荷包牡丹碱2mg/Kg；

频率：MI术后6小时开始给药，每24小时给药一次；

途径：腹腔注射。

(二)托吡酯对小鼠MI术后生存率及心室破裂率的影响

1、材料

1.1实验药物：托吡酯、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托吡酯溶于5％的羧甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS；

1.2实验仪器：小动物呼吸机(AL-V8S，上海奥尔科特生物技术有限公司，中国)、小动物手术器械(上海医疗器械厂，中国)、小动物心电图(BL-420F生物机能实验系统)；

2、动物及手术分组：

Sham组：6只，Control组：12只，

Topiramate组：12只，Bicuculline组：12只；

3、实验步骤

1)于MI术后每天记录各组小鼠的生存数量至14天，统计并通过Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验，绘制Kaplan–Meier生存曲线；

2)于MI术后每天观察各组小鼠的死亡情况并进行尸体解剖死因分析，记录心室破裂数量至14天，统计并通过Fisher检验，绘制心室破裂率曲线；

3)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用Kaplan-Meier生存分析、Log-rank检验和Fisher检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

四、实验结果

如图1A所示，与sham组比较，MI组各组MI术后生存率均下降，与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后生存率上升33.33％(80.0％比60.0％)，荷包牡丹碱干预组MI术后生存率下降(44.4％比60.0％)；

如图1B所示，与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后心室破裂率下降80.56％(11.1％比57.1％)，荷包牡丹碱干预组MI术后心室破裂率上升(88.0％比57.1％)；

由图1A和图1B结合分析可知：托吡酯降低小鼠MI术后心室破裂率，增加生存率。

(三)托吡酯对小鼠MI术后心功能的影响

1、材料

1.1实验药物：托吡酯、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托吡酯溶于5％的羧甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS；

1.2实验器材：小动物超声仪(Vevo2100型，Visualsonics，加拿大)

2、动物及手术分组：

Sham组：6只，Control组：12只，

Topiramate组：12只，Bicuculline组：12只；

3、实验步骤

3.1超声检测实验步骤

1)于MI术后14天，麻醉小鼠，置于加热垫上，维持温度36.5到37.5℃；

2)通过小动物超声仪检测B型超声和乳头肌及心尖水平的M型超声，记录各组小鼠心率(HR)，左室舒张末期内径(LVIDED)、左室收缩末期内径(LVIDES)、前壁厚度(AW)、后壁厚度(PW)和左室内径(LVD)等；

3)计算各组小鼠缩短分数FS(％)＝[(LVIDED-LVIDES)/LVIDED]×100％，射血分数LVEF(％)＝[(EDV-ESV)/EDV]×100％，比较各组小鼠心脏功能差异；

4)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

3.2血流动力学检测实验步骤

1)将上述小鼠行颈动脉插管；

2)通过Powerlab系统检测各组小鼠左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)，左室压力最大上升速率(+dp/dt_max)和左室压力最小下降速率(-dp/dt_max)等，比较各组小鼠心脏功能差异；

3)统计学分析：数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

如图2A所示：小鼠MI术后14天各组B型超声图，

如图2B所示：小鼠MI术后14天各组乳头肌(Mid)水平M型超声图，其中实线表示舒张期，虚线表示收缩期，箭头表示左室内径；

如图2C所示：小鼠MI术后14天各组心尖(Apical)水平M型超声图，其中实线表示舒张期，虚线表示收缩期，箭头表示左室内径；

如表1所示：与sham组比较，MI组各组MI术后第1天EF、FS减少，EDV、ESV增加，心率没有统计学差异；

如表2所示：与sham组比较，MI组各组MI术后第14天EF、FS减少，EDV、ESV增加，心率没有统计学差异，与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第14天EF增加22.49％、PapillaryFS增加32.75％，Apical FS增加24.92％，EDV、ESV减小，荷包牡丹碱干预组结果相反；MI组各组MI术后第14天心率没有统计学差异；

如表3所示：与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第14天LVDEP减少40.23％，LVSP增加11.02％、+dp/dt_max、-dp/dt_min增加，荷包牡丹碱干预组结果相反；

由图2A～C和表1～3结合分析可知：托吡酯提高了小鼠MI术后的心功能；

Table 1.Echocardiographic parameters on day 1 post MI

表1小鼠MI术后第1天超声参数表

注：EF为射血分数，EDV为左室舒张末期容积，ESV为左室收缩末期容积，PapillaryFS为乳头肌水平缩短分数，Apical FS为心尖水平缩短分数，HR为心率；MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05

Table 2.Echocardiographic parameters on day 14 after MI

表2小鼠MI术后第14天超声参数表

注：EF为射血分数，EDV为左室舒张末期容积，ESV为左室收缩末期容积，PapillaryFS为乳头肌水平缩短分数，Apical FS为心尖水平缩短分数，HR为心率；MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05

Table 3.Hemodynamics on day 14 post MI

表3小鼠MI术后第14天血流动力学参数表

注：LVSP为左室收缩压，LVDEP为左室舒张末压，+dp/dt_max表示左室压力最大上升速率，-dp/dt_min表示左室压力最大下降速率；MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05

(四)托吡酯对小鼠MI术后心脏形态的影响

1、材料

1.1实验药物：托吡酯、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托吡酯溶于5％的羧甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS；1.2其他试剂：水合氯醛、PBS、肝素、多聚甲醛、石蜡；

2、动物及手术分组：

Sham组：6只，Control组：12只，

Topiramate组：12只，Bicuculline组：12只；

3、实验步骤

1)于MI术后14天，麻醉小鼠，心尖注射1mL10％氯化钾，使心脏停在舒张期；

2)迅速取出心脏，用预冷的PBS和肝素冲洗干净；

3)沿结扎线结下方横切，取心室组织，置于4％多聚甲醛中，固定24小时，石蜡包埋；

4)左心室石蜡包埋切片，从线结下方每间隔500μm留取一张贴片，约5μm/片，共计4张，记为0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm，进行Masson染色；

5)计算各组小鼠心脏梗死面积(％)＝总梗死面积/左心室周长×100％；胶原密度(％)＝胶原面积/左心室容积×100％，比较各组小鼠心脏形态差异；

4、统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

如图3A所示：小鼠MI术后14天各组心脏Masson染色图(低倍镜)，图中灰色区域为正常心肌组织，黑色区域为梗死区；

如图3B所示：小鼠MI术后14天各组心脏Masson染色图(高倍镜)，图中灰色区域为正常心肌组织，黑色区域为梗死区胶原；

如图3C所示：与sham组比较，MI组MI术后14天心脏梗死面积增加，与MI对照组相比，1.5mm，2.0mm层面托吡酯干预组MI术后14天心梗面积分别减少21.85％和22.4％，荷包牡丹碱干预组心梗面积增加；

如图3D所示：与sham组比较，MI组心脏梗死区胶原密度增加，与MI对照组相比，托吡酯干预组心脏梗死区胶原密度增加22.90％，荷包牡丹碱干预组心脏梗死区胶原密度减少；

由图3A～图3D结合分析可知：托吡酯通过减少MI后梗死面积，增加梗死区胶原密度，减轻MI后左室重塑。

(五)免疫细胞上托吡酯作用受体的表达检测

1、材料

1.1实验药物：托吡酯、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托吡酯溶于5％的羧甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS；

1.2其他试剂：青霉素、链霉素、肝素、PBS、台氏液(mmol/L：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl₂ 1.0，CaCl₂ 1.8，NaH₂PO₄ 0.33，HEPES 5.0，葡萄糖10.0，充分混匀，用PH仪调节PH值至7.4)、无钙液(mmol/L：NaCl 120，KCl 14.7，KH₂PO₄ 0.6，Na₂HPO₄ 0.6，MgSO₄-7H₂O 1.2，NaHEPES 10，NaHCO₃ 4.6、taurine 30，butanedione monoxime 10，glucose 5.5，充分混匀，用pH仪调节pH值至7.4)、DMEM培养基、DMEM/12培养基、MEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清、胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶、DispaseⅡ、牛血清白蛋白、谷氨酰胺、Trizol、氯仿、异丙醇、琼脂糖、TAE、goldview等；

1.3实验器材：Heal Force超净工作台(力康公司，中国)、Heal Force超纯水系统(力康公司，中国)、Thermo二氧化碳培养箱(Thermo公司，美国)、HIRAYAMA HVE-50灭菌器(平山公司，日本)、低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)、Thermo IEC CL3R低温离心机(Thermo公司，美国)、台式高速离心机TGL-16G(上海精密仪器仪表有限公司，中国)、L8-M型低温超高速离心机(Beckman公司，美国)、细胞计数板XB-K-25(玉环求精医用仪器厂，中国)、紫外仪WD-9403F(北京市六一仪器厂，中国)、紫外分光光度计72-1(上海浦东荣丰科学仪器有限公司，中国)等

2、细胞分离及培养

腹腔巨噬细胞、乳鼠心肌细胞、乳鼠心肌成纤维细胞、成鼠心肌细胞、成鼠心肌内皮细胞、单核细胞、CD4⁺T细胞

3、实验步骤

3.1细胞分离与培养

3.1.1腹腔巨噬细胞分离培养

1)C57BL/6小鼠腹腔注射3％硫胶质4天；

2)麻醉小鼠，无菌条件下腹腔注射含有青霉素、链霉素和肝素的PBS，用21号针头注射器吸出液体；

3)室温下离心，200g，10min；

4)弃上清，重悬细胞，计数，调整细胞密度为1×10⁶/孔，接种入含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于5％CO₂，37℃培养箱静置培养；

5)2h后弃非贴壁细胞，贴壁细胞继续培养至铺满培养板；

3.1.2乳鼠心肌细胞和乳鼠心肌成纤维细胞分离培养

1)取1或2日龄的C57BL/6乳鼠麻醉；

2)无菌条件下迅速开胸摘取心脏，PBS冲洗干净，眼科剪剪碎心肌组织；

3)37℃下，置于含有0.06％(W/V)胰蛋白酶和0.025％(w/v)胶原酶Ⅱ的无钙Hanks缓冲液中震荡消化；

4)收集消化液，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；

5)上述3.4步骤不断重复直至组织完全被消化；

6)消化液通过40μm滤网过滤，收集滤液，室温下离心，100g，10min；

7)弃上清，重悬细胞，接种于含有10％胎牛血清和1％青霉素、链霉素的培养板中，于5％CO₂，37℃培养箱静置培养；

8)90分钟后取非贴壁细胞即心肌细胞，计数，调整细胞密度为3×10⁵/孔，接种入含有10％胎牛血清和1％青霉素、链霉素的DMEM培养基中，加入溴脱氧尿苷，培养3天直到使用；

9)贴壁细胞即心肌成纤维细胞继续培养4至6天；

3.1.3成鼠心肌细胞分离培养

1)取8～10周龄的雄性C57BL/6小鼠麻醉；

2)无菌条件下迅速开胸摘取心脏，置于含有120mmol/L NaCl，14.7mmol/L KCl，0.6mmol/L KH₂PO₄，0.6mmol/L Na₂HPO₄，1.2mmol/L MgSO₄-7H₂O，10mmol/L NaHEPES、4.6mmol/L NaHCO₃、30mmol/L taurine，10mmol/L butanedione monoxime，5.5mmol/Lglucose的无钙灌流缓冲液中冲洗干净，清理残余肺叶及多余组织；

3)用22号灌流针迅速行主动脉插管，将心脏悬于Langendorff灌流装置上，以37℃，110cm H₂O恒温恒压下行恒流逆行灌流；

4)无钙缓冲液灌流4min，3mL/min；

5)无钙缓冲液中加入胶原酶Ⅱ，灌流10min；

6)消化缓冲液中加入CaCl₂至浓度为100μmol/L，灌注8～10min；

7)取下心脏，置于2.5mL的消化液中，眼科剪剪碎心肌组织，轻轻搅拌至完全消化，加入含有10％胎牛血清和12.5μM CaCl₂的无钙灌流液7.5mL终止消化；

8)消化液通过40μm滤网过滤，收集滤液，室温下离心，40g，3min；

9)弃上清，重悬细胞，分四次逐步增加CaCl₂浓度直到1.2mmol/L；

10)计数，调整细胞密度为1×10⁴/cm²，接种入含有5％胎牛血清，1％青霉素-链霉素的MEM培养基的粘连蛋白包被的培养皿中，于5％CO₂，37℃培养箱静置培养；

11)1h后更换为含有1mg/mL牛血清白蛋白和2mM谷氨酰胺的MEM培养基，每48h换液一次；

3.1.4成鼠心肌成纤维细胞分离培养

1)取8～10周龄的雄性C57BL/6小鼠麻醉；

2)无菌条件下迅速开胸摘取心脏，用PBS冲洗干净；

3)置于pH 7.2的预冷KHB缓冲液中，眼科剪剪碎心肌组织；

4)加入0.1％胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ50U/mL，37℃下不断搅拌；

5)消化液通过40μm滤网过滤，收集滤液，室温下离心，200g，5min；

6)弃上清，重悬细胞，计数，调整细胞密度为5×10⁴/孔，接种入含有10％小牛血清和1％PS的DMEM培养基中，于5％CO₂，37℃培养箱静置培养；

7)1h后弃非贴壁细胞，培养于含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素和10ng/mL成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中，直到7～10天铺满细胞板；

3.1.5成鼠心肌内皮细胞分离培养

1)取8～10周龄的雄性C57BL/6小鼠麻醉；

2)无菌条件下迅速开胸摘取心脏，用PBS冲洗干净；

3)置于含有500U/mL胶原酶II，0.6u/mL DispaseⅡ和1％BSA的Hank's平衡盐溶液中，在37℃轻轻震荡45～60min；

4)消化液通过40μm目滤网过滤，收集滤液，室温下离心，400g，5min；

5)弃上清，重悬细胞，用抗CD31抗体孵育，经过磁珠分选；

6)将细胞置于含有10％胎牛血清，1％P-S，50μg/mL的内皮细胞生长因子和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中，每3天换液一次；

3.1.5单核细胞分离培养

1)取8～10周龄的雄性C57BL/6小鼠麻醉，

2)无菌条件下迅速开腹摘取脾脏，用PBS冲洗干净；

3)置于含有1％FBS HBSS的培养皿中，使用注射器芯研磨脾脏到无肉眼可见的组织团块；

4)细胞悬液通过40μm目滤网过滤，收集滤液，室温下离心，400g，10min；

5)弃上清，加入红细胞裂解液，用含1％胎牛血清的HBSS洗涤两次；

6)用抗CD11b抗体孵育，通过磁珠分选，将得到的溶液离心300g，5min，

7)弃上清，重悬细胞，调整细胞密度为5×10⁶/孔，接种入含有10％FBS和1％PS的RPMI-1640培养基中；24h后换液一次；

3.1.6 CD4⁺T细胞分离培养

1)小鼠脾脏单个核细胞悬液和红细胞去除如上所述；

2)用抗CD4抗体孵育，通过磁珠分选细胞；

3)调整细胞密度为1×10⁶/孔，接种入含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，24h后换液一次；

3.2逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

1)分别取脑组织，心肌组织及上述培养细胞于高压灭菌的研磨器中，加入1mLTrizol，冰上匀浆；

2)收集裂解液到1.5mL高压灭菌去RNAase的EP管中，加入0.2mL氯仿，上下倒置EP管，使两种液体充分混合即呈粉色乳液状，常温静置至分层；

3)12000r/min，15min，4℃离心；

4)离心后混合物分为三层：上层无色水相为RNA层，中层白色膜状为DNA层，下层粉红色酚-氯仿相为蛋白质层，分次小心吸取无色水相层(400～600μL)至新的EP管中，加入等体积的冰浴异丙醇上下倒置混匀，常温静置10～15min；

5)12000r/min，10min，4℃离心；

6)离心后应可见EP管侧壁附有白色膜状物即为RNA，小心吸弃上清液。加入冰浴无水乙醇1mL，轻柔震荡洗涤；

7)500r/min，5min，4℃离心；

8)吸弃上清液，避免误吸管侧壁附着的白色膜状RNA；

9)每管加入18μL去RNAase水，溶解RNA；

10)取1μL RNA加入99μL去RNAase的蒸馏水，采用紫外分光光度仪测OD260、OD280数值，通过OD260/OD280比值评价RNA纯度；

11)计算RNA浓度，按照PrimeScript反转录试剂盒使用说明书，在冰上配制反转录体系并进行反转录反应；

12)按照Takara Taq TM试剂盒说明，冰上配制PCR反应体系并进行PCR扩增程序；

13)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，配制1.5％的琼脂糖凝胶：0.9g琼脂糖溶于60mL TAE中，加入goldview 3.5μL，摇匀沸腾后倒入制模板自然冷却；

14)扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，加样量为5μL，电泳120V，电泳完毕后在紫外灯下观察结果并照相。

如图4A所示：小鼠心脏组织和脾脏巨噬细胞表达GABA_A受体α₁亚基，心肌细胞、心肌成纤维细胞、心肌内皮细胞不表达GABA_A受体α₁亚基；

如图4B所示：小鼠心脏组织和脾脏巨噬细胞表达GABA_A受体β₃亚基，心肌细胞、心肌成纤维细胞、心肌内皮细胞不表达GABA_A受体β₃亚基；

如图4C所示：单核细胞和CD4⁺T细胞表达GABA_A受体α₁亚基，巨噬细胞表达GABA_A受体α₁和β₃亚基；如图4D所示：单核细胞和CD4⁺T细胞表达GABA_A受体α₁亚基，巨噬细胞表达GABA_A受体α₁和β₃亚基。

由图4A～图4D结合分析可知：托吡酯在C57小鼠的心脏组织中，特异性地作用于巨噬细胞上GABA_A受体的β₃亚基。

(六)托吡酯对小鼠MI术后单核细胞生成的影响

1、材料

1.1实验药物：托吡酯、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托吡酯溶于5％的羧甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS；

1.2其他试剂：PBS、淋巴细胞分离液、台酚蓝、抗Ly6C、CD11b抗体等；1.3实验器材：容声冰箱BCD-575WYM(容声公司，中国)、Thermo Forma-86℃冰箱(Thermo公司，美国)、低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)、Thermo IEC CL3R低温离心机(Thermo公司，美国)、台式高速离心机TGL-16G(上海精密仪器仪表有限公司，中国)、L8-M型低温超高速离心机(Beckman公司，美国)、细胞计数板XB-K-25(玉环求精医用仪器厂，中国)等；

2、动物及手术分组：

Sham组：6只，Control组：12只，

Topiramate组：12只，Bicuculline组：12只；

3、实验步骤

3.1小鼠外周血单核细胞流式检测

1)分别于MI术后1、3和7天，麻醉小鼠；

2)通过心脏穿刺收集外周血1.5mL，加入到含有50mM EDTA抗凝管中；

3)分别于室温下静置2h，4℃下静置10min，室温下离心，400g，25min；

4)离心后，血液分为三层，弃上层淡黄色澄亮血清，加入PBS到1.5mL重悬；

5)将细胞悬浮液轻轻加入到事先盛有1.5mL淋巴细胞分离液的10ml无菌离心管中，使细胞悬液位于淋巴分离液上层，室温下Ficoll密度梯度离心400g，25min；

6)离心后，液体分为三层，取中间淡黄色云雾状层为淋巴细胞层，转移入10mL无菌离心管中，室温下离心，300g，8min，弃上清液，PBS洗涤一次，得到细胞悬浮液；

7)台盼蓝检测分离细胞的活性大于97％。细胞计数，调整细胞密度为10⁷/mL；

8)4℃下抗Ly6C、CD11b抗体避光孵育30分钟，PBS洗涤两次；

9)通过流式细胞术检测，分析各组小鼠Ly6C^high型(CD11b⁺Ly6C⁺)和Ly6C^low型(CD11b⁺Ly6C^-)单核细胞所占比例；

10)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

3.2小鼠脾脏单核细胞流式检测

1)无菌条件下将上述小鼠迅速开腹摘取脾脏，置于平皿中，加入3mLPBS；

2)脾脏置于40μm滤网上，用注射器末端研磨脾脏直至无肉眼可见的组织，收集网下细胞于培养皿中，再次40μm滤网过滤，PBS冲洗滤网；

3)收集淡红色脾细胞悬液于10mL无菌离心管中，4℃下离心，300g，8min；

4)弃上清液，加入3mlPBS，重悬，将细胞悬浮液轻轻加入到事先盛有3ml淋巴细胞分离液的10ml无菌离心管中，使细胞悬液位于淋巴分离液上层，室温下Ficoll密度梯度离心400g，25min；

5)步骤同外周血单核细胞表型检测的6.7.8.9

6)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

3.3小鼠骨髓单核细胞流式检测

1)无菌条件下将上述小鼠的股骨迅速剥离，剔除多余组织，PBS冲洗干净，剪去干骺端；

2)将股骨置于3mLPBS中，用1mL注射器吹出骨髓并将其吹散；

3)收集淡红色骨髓细胞悬液于10mL无菌离心管中，4℃下离心，300g，8min；

4)步骤同前；5)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

3.4酶联免疫吸附实验(ELISA)

1)分别于MI术后1、3和7天，麻醉小鼠；

2)通过心脏穿刺收集外周血，加入50mM EDTA抗凝；

3)分别于室温下静置2h，4度下静置10min，析出上层的淡黄色澄亮血清；

4)收集上清液，根据说明书检测血清中IL-1β水平；

5)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

3.5实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

1)根据上述方法分别提取心脏，脾脏，骨髓和血清RNA；

2)照PrimeScript反转录试剂盒使用说明书，在冰上配制反转录体系并进行反转录反应；

3)按照SYBR Green Master试剂盒使用说明书，配制PCR反应体系，使用CFX96实时定量系统进行测定；

4)利用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件获取并分析样本IL-1β、MCP-1及内参的Ct值；

5)计算方法：待测样品mRNA相对值＝2^-ΔCt

ΔCt＝目的基因Ct值－管家基因Ct值

Ct值：C代表Cycle，t代表threshold。Ct值的含义是每个反应管内的目的DNA实时监测扩增时的荧光强度达到指数扩增时的循环数；

6)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

如图5A所示：与MI对照组相比，托吡酯和荷包牡丹碱干预组MI术后对脾脏中两型单核细胞的变化趋势没有影响，即Ly6C^high单核细胞均在心梗后第3天达峰，Ly6C^low单核细胞均在心梗后第7天达峰；与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后降低脾脏Ly6C^high单核细胞数目，MI术后第3、7天分别降低8.64％(11.42±0.35×10⁵比12.50±0.20×10⁵)和12.05％(8.83±0.29×10⁵比10.04±0.34×10⁵)，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图5B所示：与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后降低外周血中Ly6C^high单核细胞数目，MI术后第3、7天分别降低18.84％(3.49±0.23×10⁴比4.30±0.21×10⁴)和21.77％(3.09±0.21×10⁴比3.95±0.21×10⁴)；荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图5C所示：与MI对照组相比，托吡酯和荷包牡丹碱干预组MI术后不改变骨髓中单核细胞总数和Ly6C^high单核细胞数目；

如图5D所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天IL-1β水平增加；与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第3、7天心脏、外周血、骨髓、脾脏中IL-1β水平降低，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图5E所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天MCP-1水平增加，但MI组各组之间MCP-1水平没有统计学差异；

由图5A～图5E结合分析可知：托吡酯调节小鼠MI后的脾脏单核细胞生成。

(七)托吡酯对小鼠MI术后巨噬细胞极化的影响

1、材料

1.1实验药物：托吡酯、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托吡酯溶于5％的羧甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS；

1.2其他试剂：PBS、淋巴细胞分离液、台酚蓝、抗F4/80、CD11c、CD4、IFN-γ、IL-4抗体等；

1.3实验器材：容声冰箱BCD-575WYM(容声公司，中国)、Thermo Forma-86℃冰箱(Thermo公司，美国)、低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)、Thermo IEC CL3R低温离心机(Thermo公司，美国)、台式高速离心机TGL-16G(上海精密仪器仪表有限公司，中国)、L8-M型低温超高速离心机(Beckman公司，美国)、细胞计数板XB-K-25(玉环求精医用仪器厂，中国)等；

2、动物及手术分组：

Sham组：6只，Control组：12只，

Topiramate组：12只，Bicuculline组：12只；

3、实验步骤

3.1小鼠心梗局部两种巨噬细胞流式检测

1)分别于MI术后1、3和7天，麻醉小鼠；

2)无菌条件下迅速开胸摘取心脏，PBS冲洗干净，剪取包括梗死边缘区在内的梗死心脏组织并剪碎；

3)置于含有450U/mL胶原酶I，125U/mL胶原酶XI，60U/mlDNase I和60U/mL的透明质酸酶中37℃震荡1h；

4)通过40μm滤网过滤，收集滤液，4℃下离心，400g，10min；

5)弃上清，加入PBS重悬，将细胞悬浮液轻轻加入到事先盛有1.5mL淋巴细胞分离液的10ml无菌离心管中，使细胞悬液位于淋巴分离液上层，室温下Ficoll密度梯度离心400g，25min；

6)离心后，液体分为三层，取中间淡黄色云雾状层为淋巴细胞层，转移入10ml无菌离心管中，室温下离心，300g，8min，弃上清液，PBS洗涤一次，得到细胞悬浮液；

7)台盼蓝检测分离细胞的活性大于97％。细胞计数，调整细胞密度为10⁷/mL；

8)4℃下抗F4/80、CD11c抗体避光孵育30分钟，PBS洗涤两次；

9)通过流式细胞术检测，分析各组小鼠M1型MΦ(F4/80⁺CD11c⁺)和M2型MΦ(F4/80⁺CD11c^-)所占比例；

10)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

3.2小鼠外周两型T细胞流式检测：

1)收集上述脾脏单个核细胞悬浮液，计数，调整细胞密度为10⁷/mL；

2)4℃下抗CD4抗体避光孵育30分钟，PBS洗涤两次，室温下离心，300g，8min；

3)弃上清液，重悬细胞，接种于6孔板，加入cocktail刺激，37℃下孵育4h，收集细胞；

4)常温下离心，300g，8min，PBS洗涤两次；

5)每管加入500μl细胞固定液，静置30min；室温下，离心300g，8min；

6)弃上清液，加入500μL细胞破膜液，静置5min；室温下，离心300g，8min，重复操作，共破膜两次；

7)弃上清液，PBS洗涤两次，重悬细胞，4℃下抗IFN-γ、IL-4抗体避光孵育30分钟，PBS洗涤两次；

8)通过流式细胞术检测，分析各组小鼠Th1(CD4⁺IFN-γ⁺)和Th2(CD4⁺IL-4⁺)所占比例。

9)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

如图6A所示：与MI对照组相比，托吡酯和荷包牡丹碱干预组MI术后对脾脏中两型单核细胞的变化趋势没有影响，即M1型巨噬细胞均在心梗后第3天达峰，M2型巨噬细胞均在心梗后第7天达峰，与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第3、7天M1型巨噬细胞数目或百分比降低，分别为0.61±0.07×10³比0.88±0.07×10³/47.02±3.43％比66.25±1.31％，0.53±0.05×10³比0.75±0.06×10³/34.38±1.92％比48.61±2.79％，托吡酯干预组MI术后第3、7天M2型巨噬细胞数目或百分比增加，分别为0.67±0.06×10³比0.47±0.06×10³/52.98±3.43％比33.75±1.31％，0.98±0.06×10³比0.78±0.05×10³/65.62±1.92％比51.39±2.79％，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图6B所示：为小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)中巨噬细胞(F4/80⁺macrophages)的总数，纵坐标为细胞数目，单位为1×10³个，横坐标为天数，单位为Day，与MI对照组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天不改变心脏中巨噬细胞总数；

如图6C所示：与sham组相比，MI组各组术后第1、3、7天巨噬细胞的总数增加；但MI组各组之间巨噬细胞总数没有统计学差异；

如图6D所示：与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第3、7天Th2细胞数目增加，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图6E所示：与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第3、7天组GATA3的mRNA水平增加，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图6F所示：与MI对照组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天托吡酯或者荷包牡丹碱干预组不改变脾脏中Th1细胞数目；

由图6A～图6F结合分析可知：托吡酯促进小鼠MI后巨噬细胞向M2型分化。

(八)托吡酯对小鼠MI术后M1型相关细胞因子表达的影响

1、材料

1.1实验药物：托吡酯、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托吡酯溶于5％的羧甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS；

1.2 RT-PCR相关试剂：Trizol、氯仿、异丙醇、琼脂糖、TAE、goldview；

western blot相关溶液：A液(30％丙烯酰胺储存液，100mL)：丙烯酰胺29.2g，双丙烯酰胺0.8g，纯水充分溶解并定容至100mL，4℃避光保存；B液(4×分离胶缓冲液，100mL)：Tris-Base 18.165g，SDS 0.4g，纯水充分溶解并定容至100mL，HCl调节pH值至8.8，4℃保存；C液(4×浓缩胶缓冲液，100mL)：Tris-Base 6.005g，SDS 0.4g，纯水充分溶解并定容至100mL，HCl调节pH值至6.8，4℃保存；10％AP的配制：AP 1g，纯水10mL，充分混匀，4℃可以保存一周；电泳缓冲液(10×)的配制：Tris-Base 15g，甘氨酸72g，SDS 5g，纯水充分溶解并定容至500mL，调节pH值至8.3，4℃保存；转膜缓冲液(10×)的配制：Tris-Base 9.65g，甘氨酸45g，纯水充分溶解并定容至500mL，调节pH值至8.1～8.4，4℃保存，使用时稀释为1×转膜缓冲液，加入20％的甲醇；5×SDS上样缓冲液的配制：Tris-Base(pH 6.8)0.6mL，β-巯基乙醇0.5mL，SDS 0.2g，溴酚蓝0.01g，甘油2.5mL，纯水充分溶解并定容至10mL，调节pH值至6.8，-20℃保存；Tris缓冲盐溶液(TBS，10×)的配制：NaCl 43.875g，Tris-Base 6.055g，纯水充分溶解并定容至500mL，调节pH值至7.5，4℃保存；0.3％TBS-T缓冲液的配制：1×TBS缓冲液1000mL，Tween-20 3mL，充分混匀后，置于4℃保存；封闭液的配制：0.3％TBS-T缓冲液100mL，脱脂奶粉5g，充分混匀后，4℃保存；

明胶酶谱相关溶液：匀浆缓冲液(RIPA)：Tris-HCl 1mol/L，NaCl 0.5mol/L，调节pH值至7.0；样本缓冲液(5*LB,100ml)：Tris 4.86g(0.4M)，SDS 5.0g(5％)，甘油20ml(20％)，Bromophenol blue 30mg(0.03％)，调节pH值至8.0；洗脱液1L Triton X-100 25ml(2.5％)，Tris-HCl 6.06g(50mmol/L)，CaCl₂ 0.56g(5mmol/L)，ZnCl₂ 0.136g(1μmol/L)，调节pH值至7.6；漂洗液：Tris-HCl 6.06g(50mmol/L)，CaCl₂ 0.56g(5mmol/L)，ZnCl₂ 0.136mg(1μmol/L)，调节pH值至7.6；孵育液：Tris-HCl 6.06g(50mmol/L)，CaCl₂ 0.56g(5mmol/L)，ZnCl₂ 0.136mg(1μmol/L)，Brij-35 0.2g(0.02％)调节pH值至7.6；考马斯亮蓝染色液(200mL)：考马斯亮蓝R-2500.1g，甲醇60mL，乙酸20mL，加去离子水至200mL；脱色液A：甲醇60mL(30％)，乙酸20mL(10％)，去离子水120mL，脱色液B：甲醇40mL(20％)，乙酸20mL(10％)，去离子水140mL；脱色液C：甲醇20ml(10％)，乙酸10mL(5％)，去离子水170mL；

1.3实验器材：容声冰箱BCD-575WYM(容声公司，中国)、Thermo Forma-86℃冰箱(Thermo公司，美国)、低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)、Thermo IEC CL3R低温离心机(Thermo公司，美国)、台式高速离心机TGL-16G(上海精密仪器仪表有限公司，中国)、L8-M型低温超高速离心机(Beckman公司，美国)、Type 70Ti转头(Beckman公司，美国)、紫外仪WD-9403F(北京市六一仪器厂，中国)、紫外分光光度计72-1(上海浦东荣丰科学仪器有限公司，中国)、ELX800型酶标仪(Bio-Tek公司，美国)、SYC-2101水平摇床(南京畅翔设备有限公司)、涡漩振荡器(深圳天南海北有限公司，中国)、电子pH计(Mettler-Toledo公司，瑞士)等；

2、动物及手术分组：

Sham组：6只，Control组：12只，

Topiramate组：12只，Bicuculline组：12只；

3、实验步骤

3.1 RT-PCR

1)根据上述步骤检测心脏中TNF-α，IL-6，MMP-9mRNA水平；

2)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

3.2蛋白质印迹(western blotting)

1)将上述得到的心脏C、D层面提取心肌组织的蛋白；

2)提取的蛋白用BCA法测蛋白浓度；

3)每孔取80μg蛋白上样于10％SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳后转移样品蛋白至硝酸纤维素膜上；

4)将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST中室温摇动封闭2.5小时，加以1∶1000一抗4℃孵育过夜；

5)用TBST洗膜3次，每次15min，加入1∶10000HRP标记羊抗兔二抗室温孵育2h，TBST洗膜3次，每次15min，浸入增强化学发光试剂，条带显色后暗室X线压片曝光30秒，洗片，烘干；

6)统计数据并进行分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

3.2明胶酶谱

1)分别于MI术后1、3和7天，麻醉小鼠；

2)无菌条件下迅速开胸摘取心脏，PBS冲洗干净，剪取左心室梗死组织，于液氮中迅速冷冻；

3)取100mg的冷冻组织裂解得到蛋白匀浆液，4度下离心12000g，10min；

4)每孔取80μg蛋白上样于含有1mg/mL明胶的10％SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳后用2.5％的Triton X-100在37度下冲洗凝胶2次，每次15min；

5)凝胶在37℃缓冲液(mmol/L：Tris Base 10、Tris–HCl 40、NaCl 200、CaCl₂ 10、0.02％Brij 35)中孵育24h；

6)0.25％(w/v)考马斯蓝R-250进行凝胶染色2h；

7)含有30％甲醇溶液、10％冰醋酸、60％水的脱色液脱色，扫描凝胶并拍照；

8)统计数据并进行分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

如图7A所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天TNF-α、IL-6、MMP-9mRNA水平增加，与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第3、7天TNF-α、IL-6、MMP-9mRNA水平下降，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图7B所示：小鼠MI术后1、3、7天各组心脏(heart)中MMP-9的western blot图和明胶酶谱图，上方为样本western blot图，中间为内参(GAPDH)，下方为明胶酶谱图；

如图7C所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天MMP-9蛋白表达水平增加，与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第3、7天MMP-9蛋白表达水平减少，荷包牡丹干预组结果相反；

如图7D所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天MMP-9蛋白相对活性增加，与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第3、7天MMP-9蛋白相对活性减少，荷包牡丹干预组结果相反；

由图7A～图7D结合分析可知：托吡酯降低小鼠MI后M1相关细胞因子的表达并适当减轻MI后多度的炎症反应强度。

(九)托吡酯对小鼠MI术后M2型相关细胞因子表达的影响

1、材料

1.1实验药物：托吡酯、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托吡酯溶于5％的羧甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS；

1.2其他试剂：抗CD31免疫荧光抗体、抗α-SMA、I型胶原α抗体、苦味酸天狼星红染液等2、动物及手术分组：

Sham组：6只，Control组：12只，

Topiramate组：12只，Bicuculline组：12只；

3、实验步骤：

3.1 RT-PCR

1)根据上述步骤检测心脏中VEGF、TGF-β1and IL-10水平，

2)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

3.2免疫组化和免疫荧光

1)于MI术后1、3、7和14天，麻醉小鼠；

2)迅速取出心脏，用预冷的PBS和肝素冲洗干净；

3)沿结扎线结下方横切，取心室组织，置于4％多聚甲醛中，固定24小时，石蜡包埋；

4)左心室石蜡包埋切片，约5μm/片；

5)通过抗CD31免疫荧光抗体，检测各组小鼠心脏组织切片梗死边缘区的高倍镜视野中毛细血管数目，分析比较各组小鼠差异。

6)通过抗α-SMA抗体，检测各组小鼠心脏组织切片梗死边缘区的高倍镜视野中肌成纤维细胞数量，分析比较各组小鼠差异；

7)通过抗I型胶原α抗体，检测各组小鼠心脏组织切片梗死局部的高倍镜视野中胶原沉积情况，分析比较各组小鼠差异；

8)通过苦味酸天狼星红染色和偏光显微镜观察，检测各组小鼠心脏组织切片梗死局部提高梗死区修复质量相关胶原数量，分析比较各组小鼠差异；

9)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI组与sham组相比有统计学意义，^#P≤0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；

如图8A所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7、14天VEGF、TGF-β1 and IL-10mRNA水平增加，与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第3、7、14天VEGF、TGF-β1and IL-10mRNA水平增加，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图8B所示：小鼠MI术后7、14天各组心脏中CD31的免疫荧光图，其中白色为CD31；

如图8C所示：小鼠MI术后7、14天各组心脏中α-SMA的免疫组化图，其中黑色为α-SMA；

如图8D所示：小鼠MI术后7、14天各组心脏中I型胶原的免疫组化图，其中黑色为I型胶原；

如图8E所示：小鼠MI术后7、14天各组心脏的苦味酸天狼星红染色图，其中白色为提高梗死区修复质量的相关胶原；

如图8F所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第7、14天梗死边缘区毛细血管数量减少；与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第7、14天梗死边缘区毛细血管分别增加17.14％和18.10％，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图8G所示：与sham组相比，MI组各组术后第7、14天梗死边缘区α-SMA阳性心肌成纤维细胞增加；与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第7、14天梗死边缘区α-SMA阳性心肌成纤维细胞分别增加32.38％和70.53％，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图8H所示：与MI对照组相比，托吡酯干预组术后第7、14天梗死区I型胶原分别增加27.52％和26.51％，荷包牡丹碱干预组结果相反；

如图8I所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第7、14天提高梗死区修复质量相关胶原所占比例增加；与MI对照组相比，托吡酯干预组MI术后第7、14天提高梗死区修复质量相关胶原所占比例分别增加51.68％和33.55％，荷包牡丹碱干预组结果相反；

由图8A～8I结合分析可知：托吡酯增加小鼠MI后M2相关细胞因子的表达并增强MI后的修复作用。

(十)托吡酯治疗窗的确定

1、材料

实验药物：托吡酯、羧甲基纤维素购自美国Sigma-Aldrich公司。

2、动物及手术分组：

Control组：12只，

20mg/kg Topiramate组：12只，25mg/kg Topiramate组：12只，

30mg/kg Topiramate组：12只，35mg/kg Topiramate组：12只，

40mg/kg Topiramate组：12只；

3、实验步骤：

1)配制溶剂：0.15mg的羧甲基纤维素溶于30mL双蒸水，于涡旋混合器上充分混匀，配制成0.5％的羧甲基纤维素作为溶剂；

2)配制托吡酯溶液：托吡酯粉末溶于0.5％的羧甲基纤维素，配制五种给药浓度，充分混匀；

3)MI术后6小时开始给药，每间隔24h给药一次直至MI术后第14天，每次给药前，称量小鼠体重，并按20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg腹腔注射托吡酯，对照组腹腔注射PBS；

4)MI术后14天超声检测心功能，步骤同前；

5)统计学分析：

数据以均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检验，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；MI干预组中各组与35mg/kgTopiramate组相比有统计学意义，^§P≤0.05；

如表4所示：与MI对照组相比，托吡酯干预组25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kgMI术后第14天EF、Papillary FS增加，EDV、ESV减小，心率没有统计学差异，20mg/kg组各项参数没有统计学差异；与托吡酯干预组35mg/kg相比，25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg组MI术后第14天各项参数没有统计学差异；

Table 4.Echocardiographic parameters on day 14 post MI

表4小鼠MI术后14天超声参数表

注：EF为射血分数，EDV为左室舒张末期容积，ESV为左室收缩末期容积，PapillaryFS为乳头肌水平缩短分数，HR为心率；MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，^*P≤0.05；MI干预组中各组与35mg/kg Topiramate组相比有统计学意义，^§P≤0.05。

由表4分析可知：25mg/kg～40mg/kg为小鼠MI后托吡酯有效治疗剂量。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种托吡酯在制备治疗心肌梗死的药品中应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述托吡酯的用量为25～40mg/Kg。

3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于：所述托吡酯的用量为35mg/Kg。