CN109674819A - 胎盘间充质干细胞制剂及其治疗硬化病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胎盘间充质干细胞制剂及其治疗硬化病的用途。具体地说，本发明一方面涉及一种细胞制剂，其是通过使间充质干细胞例如胎盘间充质干细胞混悬于0.9％氯化钠溶液中配制成的细胞混悬液，具体是通过包括方法制得的：将细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，离心，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液重悬，制得细胞制剂。本发明还涉及所述细胞制剂在制备用于治疗和/或预防系统性硬化病的药物中的用途。本发明还涉及制备所述细胞制剂及其所用胎盘间充质干细胞的方法以及其中所用到的混合酶消化液。本发明制得的细胞制剂在治疗硬化病方面呈现优异的生物学效应。

Description

胎盘间充质干细胞制剂及其治疗硬化病的用途

技术领域

本发明属于生物技术和生物医药领域，涉及使用干细胞治疗系统性硬化病的细胞制剂。具体地说，本发明涉及从胎盘中分离干细胞的方法，特别涉及从胎盘中分离间充质干细胞的方法，更特别的是涉及一种使用本发明所述独特配方的消化酶组合物从而从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法。使用本发明方法可以有效的提高从胎盘分离间充质干细胞的效率。进一步的，本发明涉及使用上述胎盘间充质干细胞制备成细胞制剂，进而使用该细胞制剂治疗系统性硬化病。

背景技术

系统性硬化病(systemic sclerosis，SSc)，又称硬皮病(scleroderma)，是一种原因不明，临床上以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征，也可影响心脏、肺和消化道的自身免疫性疾病。本病呈全球性分布，患病率为50-300/100万，每年发病率2.3-22.8/100万，发病高峰年龄30-50岁，女性多见，男女比例1：3～14。

根据雷诺现象，皮肤纤维化，特异性内脏受累，以及特异性抗核抗体(抗Scl-70抗体和ACA)，可以诊断为SSc。根据皮肤受累情况，分为弥漫性皮肤硬化症(dcSSc)和局限性皮肤硬化症(lcSSc)。弥漫性皮肤纤维化可以累及肢体远端和近端、面部和颈部，胸部和腹部，本型病情进展快，多伴有内脏病变，预后较差，10年生存率50％左右。局限性皮肤病变局限于肘(膝)的远端，可有颜面和颈部受累，进展缓慢。2/3以上的SSc患者有肺部受累，最常见的为肺间质纤维化，是本病主要的死亡原因。

目前系统性硬化病尚无特效药物。主要是对症治疗改善症状，糖皮质激素可减轻急性皮肤水肿，但不能阻止皮肤纤维化。合并脏器受累可用免疫抑制剂，常用的有环孢菌素A、环磷酰胺、甲氨蝶呤等。传统抗纤维化治疗有D-青霉胺。肌肉、关节疼痛可用非甾体抗炎药。弥漫型由于肺、肾、心脏受累容易导致死亡，预后较差。

以干细胞基础的治疗为SSc患者带来新的治疗选择。近年来，一些研究应用自体造血干细胞(HSC)移植治疗严重弥漫型SSc，与CYC治疗相比，延长生存时间，减少皮肤受累，取得了一定疗效。但自体HSCT存在费用昂贵，高复发率的弊病，异体HSC移植由于排异等原因造成死亡率较高。

研究发现，SSc患者骨髓间充质干细胞(MSCs)在生长、造血支持、细胞因子分泌等方面存在缺陷，推测MSCs的异常可能在SSc的发病中起了重要作用。MSC表现出良好的SSc患者手和面部治疗效果，可以改善皮肤硬化，手指和嘴巴的运动，以及减少手部和面部疼痛。新生儿胎盘组织中，蕴含有低免疫原性的具有多向分化潜能的间充质干细胞(MSCs)。胎盘MSCs中，具有免疫调节作用，对T细胞、NK细胞具有抑制作用，在抑制免疫应答、介导耐受和导致长期免疫逃逸方面起关键作用。特别是胎盘MSC细胞免疫原性低，同种异体间移植不会引起免疫排斥反应。不依赖抗原，以剂量依赖方式直接抑制激活的T细胞增殖。这些特征使得胎盘MSC应用于自身免疫性疾病成为可能。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每10⁵～10⁶个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。

现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。另外，中国专利申请号201210044648X公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。另外，本申请的发明人团队的发明公布CN107299082A(中国专利申请号201710653583.1，公开日2018年10月27日)中记载了一种获取胎盘间充质干细胞的方法已经显示呈现一些优良性能。

本领域仍然需要有新的从胎盘中分离干细胞的方法，特别是高效地从胎盘中分离间充质干细胞的方法。此外，本领域仍然需要的新的用于从胎盘中分离间充质干细胞方法中使用的消化酶组合物，以期提高从胎盘中分离间充质干细胞的方法效率。此外，本领域仍然需要有新的方法来治疗系统性硬化病，特别是期待有新的更有效的方法采用间充质干细胞来治疗系统性硬化病。

发明内容

本发明的目的包括如下一个或多个方面：一方面，解决现有获取胎盘间充质干细胞方法的不足，提供一种实用、简单、高效的从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法并任选地建立胎盘干细胞库的方法；另一方面，为上述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法提供一种消化酶组合物；再另一方面，为使用间充质干细胞治疗系统性硬化病而提供一种细胞制剂。本发明人发现采用特别的操作方法以及特别组方的消化酶组合物，所获得的细胞纯度高和/或细胞回收率高，以及通过配制一种特定的细胞制剂能够更有效地用于系统性硬化病的治疗。本发明基于此类发现而得以完成。

因此，本发明第一方面提供了一种例如可用于治疗系统性硬化病的细胞制剂，其是通过使间充质干细胞(例如胎盘间充质干细胞)混悬于0.9％氯化钠溶液中配制成的细胞混悬液。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中细胞浓度为1～10×10⁶个细胞/ml，例如1～5×10⁶个细胞/ml，例如1～3×10⁶个细胞/ml。

根据本发明第一方面的细胞制剂，所述0.9％氯化钠溶液中还添加葡萄糖酸镁和磷脂。在一个实施方案中，添加葡萄糖酸镁的量是使镁离子浓度为2.5mmol/L。在一个实施方案中，添加磷脂的浓度为0.2mg/ml。在一个实施方案中，所述磷脂是注射级大豆来源的。已经出人意料地发现，通过同时添加少量的镁盐和磷脂可以显著提高本发明细胞制剂治疗系统性硬化病的生物学效果。本发明人另外还发现，当在本发明实施例4的细胞制剂中，仅添加镁盐、或者仅添加磷脂、或者将上述镁盐替换为其它盐例如钙盐、锌盐、铜盐等时，其结果远不及同时添加镁盐和磷脂的PD-MSC组a的效果，并且这些情形的结果与本发明实施例4中的PD-MSC组b的结果相近。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其是通过包括方法制得的：将细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，离心，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液重悬，制得细胞制剂。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所述间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm³左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；

[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水]

(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；

[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)；所述Liberase MNP-S酶例如是罗氏公司的Liberase MNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001]

(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；

[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数]

(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；

[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO]

(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm²时可进行接下来的传代；

[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基]

(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm²，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。

根据本发明第一方面的细胞制剂，在制备间充质干细胞的过程中，还包括：

(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。

根据本发明第一方面的细胞制剂，在制备间充质干细胞的过程中，还包括：

(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存。

根据本发明第一方面的细胞制剂，在制备间充质干细胞的过程中，还包括：

(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所得各代胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所述混合酶消化液中除了包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶外，还添加有0.2～0.3g/L氯化锌。已经出人意料的发现，在使用添加此浓度范围氯化锌的混合酶消化液的情况下，所得原代细胞的CD73表达大于60％、CD45不表达，并且所得原代细胞中的间充质干细胞含量达60％-70％，显示极高的干细胞浓度；而当混合酶消化液中未添加此氯化锌时，原代细胞中的间充质干细胞含量小于38％，通常在31～38％范围内。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。

根据本发明第一方面的细胞制剂，其中所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。

进一步的，本发明第二方面提供了从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm³左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；

[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水]

(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；

[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)；所述Liberase MNP-S酶例如是罗氏公司的Liberase MNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001]

(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；

[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数]

(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；

[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO]

(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm²时可进行接下来的传代；

[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基]

(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm²，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中还包括：

(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中还包括：

(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中还包括：

(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所得各代胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述混合酶消化液中除了包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶外，还添加有0.2～0.3g/L氯化锌。已经出人意料的发现，在使用添加此浓度范围氯化锌的混合酶消化液的情况下，所得原代细胞的CD73表达大于60％、CD45不表达，并且所得原代细胞中的间充质干细胞含量达60％-70％，显示极高的干细胞浓度；而当混合酶消化液中未添加此氯化锌时，原代细胞中的间充质干细胞含量小于38％，通常在31～38％范围内。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。

此外，在本发明第二方面方法中，提供了一种胎盘间充质干细胞。因此本发明第三方面提供了一种胎盘间充质干细胞。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，其各代的胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm³左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；

[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水]

(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；

[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的LiberaseMNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)；所述Liberase MNP-S酶例如是罗氏公司的Liberase MNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001]

(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；

[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数]

(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；

[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO]

(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm²时可进行接下来的传代；

[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基]

(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm²，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，还包括：

(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，还包括：

(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，还包括：

(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，所得各代胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，所述混合酶消化液中除了包含Hank's平衡盐溶液、LiberaseMNP-S酶、DNA I型酶外，还添加有0.2～0.3g/L氯化锌。已经出人意料的发现，在使用添加此浓度范围氯化锌的混合酶消化液的情况下，所得原代细胞的CD73表达大于60％、CD45不表达，并且所得原代细胞中的间充质干细胞含量达60％-70％，显示极高的干细胞浓度；而当混合酶消化液中未添加此氯化锌时，原代细胞中的间充质干细胞含量小于38％，通常在31～38％范围内。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。

根据本发明第三方面的胎盘间充质干细胞，所述制备步骤中，所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。

进一步，本发明第四方面提供了一种在从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中使用的混合酶消化液，该混合酶消化液中包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中包括：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNAI型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNAI型酶)。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中除了包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶外，还添加有如本文所述规定量的氯化锌。已经出人意料的发现，在使用添加此浓度范围氯化锌的混合酶消化液的情况下能够呈现如本发明所述优异技术效果。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm³左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；

[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水]

(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；

[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)；所述Liberase MNP-S酶例如是罗氏公司的Liberase MNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001]

(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；

[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数]

(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；

[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO]

(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm²时可进行接下来的传代；

[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基]

(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm²，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中还包括：

(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中还包括：

(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中还包括：

(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。

根据本发明第四方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间充质干细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。

进一步的，本发明第五方面提供了细胞制剂(例如本发明第一方面所述细胞制剂)在制备用于治疗和/或预防系统性硬化病的药物中的用途。

在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明中，术语“胎盘间充质干细胞”是指来源于胎盘的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“胎盘间充质干细胞”可以与“胎盘干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。

在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围，并且这些PBS缓冲液通常是可以通过商业途径获得的预配液(或预配粉)，例如用于本发明领域的PBS通常是pH7.4(±0.1)的商品化缓冲液，例如HyClone品牌的PBS缓冲液；本领域经典的应用时的PBS缓冲液组成中包括137mM氯化钠、2.7nM氯化钾和10mM磷酸根，在本发明中如未另外特别说明，所用PBS使用时的组成均为该组成。

在本发明中，术语“胎盘”是指新生儿胎盘，特别是指产后4小时之内的胎盘。

间充质干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，具有易分离、培养、扩增，免疫原性低，不表达II型主要组织相容性复合物(MHC)的优势，可以异体使用，具有强大的迁移、免疫调节能力，通过旁分泌方式促进组织损伤修复再生，是再生医学理想的种子细胞。

系统性硬化病是一种以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征的全身性自身免疫病。病变特点为皮肤纤维增生及血管洋葱皮样改变，最终导致皮肤硬化、血管缺血。本病临床上以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征，除皮肤受累外，它也可影响内脏(心、肺和消化道等器官)，作为一种自身免疫病，往往伴抗核抗体、抗着丝点抗体、抗Scl-70等自身抗体。本病女性多见，发病率约为男性的4倍，儿童相对少见。

系统性硬化病最多见的初期表现是雷诺现象和肢端、面部肿胀，并有手指皮肤逐渐增厚。部分病例首发症状为雷诺现象，雷诺现象可先于硬皮病的其他症状(手指肿胀、关节炎、内脏受累)1～2年或与其他症状同时发生。胃肠道功能紊乱(胃烧灼感和吞咽困难)或呼吸系统症状等偶尔也是本病的首发表现。患者起病前可有不规则发热、食欲减退和体重下降等。系统性硬化病通常在临床表现于皮肤、骨和关节、消化系统、肺部、心脏、肾脏。几乎所有病例皮肤硬化都从手开始。手指、手背发亮、紧绷，手指褶皱消失，汗毛稀疏，继而面部和颈部受累。患者上胸部和肩部有紧绷感。颈前可出现横向厚条纹，仰头时，患者会感到颈部皮肤紧绷，其他疾病很少有这种现象。面部皮肤受累可表现为典型的硬皮病面容，表现为：面具脸；口周出现放射性条纹，口唇变薄，鼻端变尖，张口受限。受累皮肤可有色素沉着或色素脱失。皮肤病变可局限在手指(趾)和面部，或向心性扩展，累及上臂、肩、前胸、背、腹和腿。有的可在几个月内累及全身皮肤，有的在数年内逐渐进展，有些呈间歇性进展。临床上皮肤病变可分为水肿期、硬化期和萎缩期，水肿期皮肤呈非可凹性肿胀，触之有坚韧感；硬化期皮肤呈蜡样光泽，紧贴于皮下组织，不易捏起；萎缩期浅表真皮变薄变脆，表皮松弛。由于皮肤增厚且与其下关节紧贴，致使关节挛缩和功能受限。由于腱鞘纤维化，当受累关节主动或被动运动时，特别在腕、踝和膝处，可觉察到皮革样摩擦感。部分患者可以出现关节炎症，其中一些病例可有侵袭性关节病变。由于长期慢性指(趾)缺血，可发生指(趾)端骨溶解。X线片表现关节间隙狭窄和关节面骨硬化。消化道受累为硬皮病最常见的内脏损害。消化道的任何部位均可受累，其中食管受累最常见，肛门和直肠次之，小肠和结肠较少。在硬皮病中肺脏受累普遍存在，最常见的症状为运动时气短、活动耐受量减低和干咳，肺间质纤维化和肺动脉血管病变可同时存在，但往往是其中一种占主导地位。心脏方面，临床表现为气短、胸闷、心悸、水肿。临床检查可有室性奔马律、窦性心动过速和充血性心力衰竭，偶可闻及心包摩擦音。超声心动图显示约半数病例有心包肥厚或积液，但临床心肌炎和心包填塞不多见。硬皮病的肾脏病变以叶间动脉、弓形动脉及小动脉最为显著，其中最主要的是小叶间动脉。血管内膜有成纤维细胞增生、黏液样变、酸性黏多糖沉积及水肿；血管平滑肌细胞发生透明变性；血管外膜及周围间质均有纤维化；肾小球基底膜不规则增厚。硬皮病肾脏病变临床表现不一，部分患者有多年皮肤及其他内脏受累而无肾损害的临床现象；有些在病程中出现肾危象，即突然发生严重高血压和急进性肾功能衰竭。如不及时处理，常于数周内死于心力衰竭及尿毒症。虽然肾危象初期可无症状，但大部分患者感疲乏加重，出现气促、严重头痛、视物模糊、抽搐、神志不清等症状。实验室检查发现肌酐增高、蛋白尿和(或)镜下血尿，可有微血管溶血性贫血和血小板减少。

吴树才文献(吴树才，等，人胎盘间充质干细胞对小鼠肺纤维化的影响及机制，山东医药，2016年12期)观察了人胎盘间充质干细胞对小鼠肺纤维化的影响，并探讨其作用机制。其方法是，采用组织块贴壁法分离并体外培养人胎盘间充质干细胞。将30只C57BL/6小鼠随机均分为观察组、对照组，均给予气管内注入博来霉素8.5mg/kg建立肺纤维化模型。造模成功后，观察组尾静脉输注体外培养的人胎盘间充质干细胞0.3mL(细胞数为1.0×10^6个)，对照组注射等量生理盐水，1次/d，连续注射3天；处死小鼠，取肺组织，检测肺组织羟脯氨酸含量，采用Western blotting法检测肺组织血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素1(ET-1)和血管生成素2(Ang-2)蛋白。其结果是，观察组肺组织羟脯氨酸含量为(5.76±0.13)μg/mL，对照组为(8.13±0.87)μg/mL，两组比较P<0.01。观察组肺组织VEGF的相对表达量为52.7±4.7、ET-1为68.1±5.4、Ang-2为59.6±2.8，均较对照组(100)降低(P均<0.05)。其结论是，人胎盘间充质干细胞可抑制小鼠肺组织纤维化形成；降低肺组织VEGF、ET-1和Ang-2表达可能是其作用机制。

余慧文献(余慧，等，胚胎干细胞治疗博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，复旦学报(医学版)，2008年03期)研究静脉注射胚胎干细胞(ESC)对肺纤维化小鼠的治疗作用。其方法是，气管内滴注博来霉素8.5mg/kg制作C57/BL6雌性小鼠的肺纤维化模型。治疗组(n＝20)静脉注射S8小鼠ESC，对照组(n＝10)注射生理盐水。治疗组又分为单次治疗(n＝10)和重复治疗(n＝10)，两者均在造模后1h静脉注射ESC，重复治疗组在造模后3d再次静脉注射ESC。记录小鼠的生存时间，测定小鼠肺组织的羟脯氨酸含量，肺脏病理学观察炎症状态。利用秩和检验统计3组小鼠生存时间，方差分析3组小鼠肺羟脯氨酸含量的差异。其结果是，接受干细胞治疗后，肺纤维化模型小鼠的生存时间(d)延长，重复治疗组更加明显(对照组、单次治疗组、重复治疗组分别为7.8±2.8、8.4±3.8、13.5±5.6，P<0.01)；肺羟脯氨酸含量(μg/mL)降低(对照组、单次治疗组、重复治疗组分别为8.59±1.14、8.23±1.09、5.51±0.39，P<0.01)；肺脏病理检查显示肺组织炎症程度降低，结构破坏减轻。其结论是，静脉注射胚胎干细胞可以减轻博来霉素诱导的小鼠肺部炎症和肺纤维化，延长肺纤维化小鼠的生存时间。

邓冏睿文献(邓冏睿，等，两种间充质干细胞对肺纤维化治疗作用的比较，广东医学，2018年S1期)比较骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)与脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)对肺纤维化大鼠的疗效。其方法是，48只雄性SD大鼠随机分为4组：A组于气管内注入0.1mL生理盐水；B、C、D组于气管内注入0.1mL 5mg/kg的博来霉素制作肺纤维化模型。建模后1d，A、B组经尾静脉注射生理盐水1.0mL，C组经尾静脉注射BM-MSCs 1×10^6个，D组经尾静脉注射UCB-MSCs 1×10^6个。建模后28d及42d处死各组大鼠的一半，分别留取肺组织进行病理学检查、并测定肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、羟脯氨酸(HYP)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)表达水平。其结果是，B组可见肺泡结构严重紊乱，大量胶原纤维沉积，B、C、D、A组肺纤维化评分依次降低[28d时为(3.00±0.00)分、(2.17±0.75)分、(1.60±0.89)分、(0.00±0.00)分，42d时为(3.00±0.00)分、(2.40±0.55)分、(1.75±0.96)分、(0.00±0.00)分]，肺组织TGF-β1、HYP、MMP-2/TIMP-1水平依次下降。肺组织TGF-β1、HYP、MMP-2/TIMP-1分别与肺泡炎程度评分、肺纤维化程度评分存在正相关。其结论是，BM-MSCs与UCBMSCs均可延缓大鼠肺纤维化进展，其中UCB-MSCs疗效更好，其治疗机制可能与下调TGF-β1水平、改善MMP/TIMP失衡有关。

潘雍文献(潘雍，等，骨髓间充质干细胞移植治疗矽肺小鼠肺炎及肺纤维化，中国组织工程研究，2013年06期)观察了骨髓间充质干细胞移植对矽肺的治疗作用。其方法是，36只C57BL/6小鼠随机摸球法均分为3组。对照组小鼠气管内注入生理盐水；矽肺模型组和骨髓间充质干细胞移植组小鼠气管内注入二氧化硅混悬液建立矽肺模型；骨髓间充质干细胞移植组于造模后6h尾静脉输注骨髓间充质干细胞。其结果和结论是，肺组织羟脯氨酸的含量矽肺模型组和骨髓间充质干细胞移植组高于对照组，差异均有显著性意义(P<0.01)；骨髓间充质干细胞移植组含量明显低于矽肺模型组，差异有显著性意义(P<0.01)。矽肺模型组和骨髓间充质干细胞移植组小鼠的肺系数均高于对照组(P<0.01)，其中骨髓间充质干细胞移植组低于矽肺模型组，差异有显著性意义(P<0.01)。白细胞介素1β的表达矽肺模型组和骨髓间充质干细胞移植组高于对照组(P<0.01)；骨髓间充质干细胞移植组低于矽肺模型组，差异均有显著性意义(P<0.01)。转化生长因子β1在肺组织中的表达同样为矽肺模型组(P<0.01)和骨髓间充质干细胞移植组(P<0.05)高于对照组；骨髓间充质干细胞移植组低于矽肺模型组，差异有显著性意义(P<0.01)。这些结果说明骨髓间充质干细胞移植可以减轻肺部炎症反应和纤维化程度。

郑凯文献(郑凯，等，骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性放射性肺损伤，中国组织工程研究，2014年50期)观察了骨髓间充质干细胞对大鼠放射性肺损伤的治疗作用，并初步探讨其作用机制。其方法是，体外分离、培养并鉴定雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞。应用直线加速器照射60只雌性SD大鼠胸部，建立大鼠放射性肺损伤模型，随机分为骨髓间充质干细胞治疗组和生理盐水对照组。骨髓间充质干细胞治疗组经大鼠尾静脉输注骨髓间充质干细胞2×10^9/L，生理盐水对照组注射等量生理盐水，分别于照射后1，2，4，6周时进行相关指标检测。其结果和结论是，照射后第1，2，4周时，骨髓间充质干细胞治疗组大鼠肺系数明显低于生理盐水对照组(P<0.05)。镜下见骨髓间充质干细胞治疗组大鼠肺组织炎症渗出较少，肺泡、肺泡壁结构基本完整，纤维化程度等均明显轻于生理盐水对照组。照射2周时骨髓间充质干细胞治疗组血清转化生长因子β1、羟脯氨酸水平显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。照射2，4，6周时骨髓间充质干细胞治疗组肺组织超氧化物歧化酶活力显著高于生理盐水对照组(P<0.05)，照射4，6周时骨髓间充质干细胞治疗组丙二醛含量显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。照射6周时骨髓间充质干细胞治疗组的肺表面活性物质B表达显著高于生理盐水对照组。PCR方法检测肺、肝脏、胰腺、肾脏等器官组织均有不同程度的Sry基因表达，尤以肺显著。结果表明骨髓间充质干细胞可以迁移到放射性损伤的肺组织，促进放射性肺损伤组织的修复，其治疗机制可能与抑制炎症反应、抗氧化、减轻肺组织纤维化等有关。

何立锋文献(何立锋，等，小鼠肺纤维化模型中衰老对肺干细胞的影响，中国比较医学杂志，2013年07期)研究衰老对肺干细胞在博来霉素致肺纤维化小鼠模型中修复能力的影响。其方法是，利用博来霉素处理年轻，年老小鼠建立肺纤维化模型，通过流式细胞术等方法比较肺组织干细胞在年轻、年老小鼠肺纤维化模型中的比例及增殖情况，研究衰老对肺组织干细胞的损伤修复能力的影响。其结果是，在博来霉素致肺纤维化的模型中，年老小鼠相对年轻小鼠肺组织干细胞增殖明显降低，肺上皮干细胞和肺间质干细胞比例显著下降。其结论是，在衰老过程中肺组织干细胞在肺纤维化损伤后修复能力明显减弱。

赵峰文献(赵峰，等，骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的影响，中国组织工程研究与临床康复，2008年29期)观察了骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的影响。设计、时间及地点：随机对照，细胞学体外实验，于2005-05/2006-02在解放军第四军医大学完成。材料：清洁级雌性SD大鼠20只，随机分为正常对照组、细胞对照组、肺损伤组、细胞移植组，5只/组。雄性SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的采集。其方法是，肺损伤组、细胞移植组大鼠经气管注入5mg/kg博来霉素0.2～0.3mL诱发建立肺损伤模型。造模后12h，细胞移植组、细胞对照组大鼠经尾静脉注入骨髓间充质干细胞悬液0.5mL，约5×10^6个细胞；肺损伤组、正常对照组大鼠同法注入无血清DMEM-F120.5mL。主要观察指标：苏木精-伊红染色观察肺组织形态学变化。酸解法测定肺组织羟脯氨酸含量。ELISA法检测血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达。其结果是，细胞移植2周后，正常对照组及细胞对照组的肺泡腔均匀完整；肺损伤组的肺泡结构破坏，肺泡间隔增厚，间质增生；细胞移植组肺损伤程度明显减轻。与正常对照组比较，肺损伤组、细胞移植组的肺组织羟脯氨酸含量均显著升高(P<0.01或0.05)，细胞移植组升高幅度明显低于肺损伤组(P<0.01)。各组大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达水平与肺组织羟脯氨酸含量基本相似。其结论是，骨髓间充质干细胞可减少肺损伤大鼠肺组织羟脯氨酸含量，减轻大鼠肺损伤及纤维化程度，可能与降低转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达有关。

左懿文献(左懿，人脐带血干细胞对肺纤维化大鼠TNF-α、NO作用分析，中国医疗前沿，2013年07期)探究人脐带血干细胞对肺纤维化大鼠TNF-α、NO的作用和影响。其方法是，选取清洁并健康大鼠60只，随机分为治疗组与对照组各30只，两组大鼠先用博来霉素经气管注入的方法制造肺纤维化模型，治疗组大鼠在模型成功建立后注入干细胞，对照组大鼠不注入干细胞，此后在不同时间将大鼠处死，观察两组大鼠肺泡损伤程度及TNF-α、NO水平改变情况。其结果是，对照组大鼠肺泡损伤程度比治疗组大鼠肺泡损伤严重，在肺纤维化程度方面0-1分之间例数两组大鼠相同，1.1-2分之间、2.1-3分之间治疗组大鼠例数较对照在大鼠少，此外在不同时间治疗组大鼠TNF-α、NO水平较对照组大鼠低，P<0.05，差异有统计学意义。其结论是，将人脐带血内的干细胞注入肺纤维化大鼠体内后，随着时间的发展TNF-α、NO的水平有所降低，在一定程度上有保护性作用，TNF-α、NO的表达受到抑制，对大鼠肺纤维化有抑制作用。

陈娟文献(陈娟，等，骨髓间充质样干细胞和骨髓单个核细胞影响博莱霉素诱导肺纤维化的比较，中国组织工程研究与临床康复，2010年36期)比较骨髓间充质样干细胞和骨髓单个核细胞对博莱霉素A5所致大鼠肺泡炎和早期纤维化的治疗作用。其方法是，收集Wistar雄性幼鼠的骨髓间充质样干细胞、骨髓单个核细胞并分别进行DAPI标记。21只Wistar雌性大鼠气管内注入博莱霉素A5制作肺损伤模型，随机均分为骨髓间充质样干细胞治疗组、骨髓单个核细胞治疗组和模型组。造模后第7天处死大鼠，取肺组织病理切片观察炎症和纤维化情况；荧光显微镜下检测DAPI标记细胞；ELISA法检测肺组织匀浆羟脯氨酸和肿瘤坏死因子的含量。其结果和结论是，①在骨髓间充质样干细胞治疗组、骨髓单个核细胞治疗组肺组织冰冻切片中均见到DAPI标记的外源细胞。②模型组肺泡炎最严重，骨髓间充质样干细胞治疗组肺泡炎最轻，各组比较，差异有显著性意义(P<0.05)。③模型组肺组织匀浆中羟脯氨酸和肿瘤坏死因子α含量最多，骨髓间充质样干细胞治疗最少，各组比较差异有显著性意义(P<0.05)。提示骨髓间充质样干细胞和骨髓单个核细胞均可定植于损伤肺组织，并能有效阻止博莱霉素A5诱导的大鼠肺泡炎和早期纤维化，前者作用更为显著。

王红阳文献(王红阳，等，人脐带血干细胞抑制大鼠肺纤维化及肺巨噬细胞TGF-β1的表达，细胞与分子免疫学杂志，2013年01期)研究人脐血间充质干细胞对博来霉素所致的大鼠肺纤维化及TGF-β1的影响。其方法是，取清洁级健康雄性SD大鼠60只随机分为博来霉素组(P组)、干细胞治疗组(M组)、地塞米松治疗组(D组)和阴性对照组(N组)，取第2代人脐血间充质干细胞培养至第4代；P组、M组和D组分别经气管注入博来霉素制造肺纤维化模型，M组造模后立即经鼠尾静脉注入5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的干细胞，D组造模后第2天开始连续7d腹腔注射地塞米松，N组经气管注入等量生理盐水，在第7、14、28天处死各组大鼠，行HE、Masson染色，免疫组织化学法观察TGF-β1表达及标记细胞情况。其结果是，M组第7、14、28天肺组织均可见标记的干细胞；HE及Masson染色后观察，与N组相比，P组7d时肺泡炎最明显，28d肺纤维化程度最重，M、D组较P组轻且病理切片可见M组较D组肺泡炎及纤维化程度稍轻；肺组织中TGF-β1在P组7d时最高，M、D组明显少于P组，M组减少更明显，组间差异有统计学意义。其结论是，人脐血间充质干细胞可以定植于肺组织中，在肺纤维化早期通过抑制TGF-β1的表达，可能减轻肺泡炎及肺纤维化。

陈侃文献(陈侃，骨髓间充质干细胞移植联合吡菲尼酮治疗肺间质纤维化的研究，中国实用医药，2016年01期)探讨吡菲尼酮(PFD)联合骨髓间充质干细胞(MSCs)移植入博来霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠的疗效。其方法是，36只健康清洁级体重200g雄性SD大鼠，随机分为6组，A组为阴性对照组、B组阳性对照组、C组单纯激素治疗组、D组单纯MSCs移植组、E组单纯PFD治疗组、F组PFD联合MSCs移植组，各6只。SD大鼠体外培养MSCs，注入BLM制备肺纤维化模型，观察肺组织形态学变化，测定转化生长因子(TGF-β1)的蛋白表达。其结果是，造模7d后，C、D、E、F组大鼠出现炎症细胞浸润比B组减少，肺纤维化程度明显减轻，F组较C、D、E组的病理改变更轻，肺纤维化不明显。肺系数中B组下降明显，与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)。B、C、D、E、F组肺纤维化评分高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。肺组织中转化生长因子胶原表达的阳性细胞数明显减少，F组较B、C、D、E组数量减少和强度减弱更加明显，A组与B、C、D、E、F组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。其结论是，骨髓间充质干细胞移植联合吡菲尼酮对肺纤维化有一定的抑制作用，能够降低肺组织转化生长因子的表达，有修复和再生作用，治疗肺纤维化效果明显。

曾省都文献(曾省都，等，骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肺纤维化的实验研究，赣南医学院学报，2016年01期)探讨骨髓间充质干细胞移植对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型肺泡炎和肺纤维化的影响及其可能机制。其方法是，体外分离、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，传至第四代用于实验；60只SD大鼠随机分为阴性对照组(N组)、阳性对照组(P组)、地塞米松治疗组(D组)和间充质干细胞移植治疗组(M组)，每组各15只大鼠。P组、D组和M组分别经气管注入博莱霉素制备肺纤维化模型。造模后7、14、21天留取肺组织，HE染色观察肺泡炎和肺纤维化的程度，免疫组化的方法测定肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)的表达。其结果是，博莱霉素造模后，取肺组织行HE染色，病理符合肺纤维；在处理后的7、14和21天，与P组相比，D、M组大鼠出现肺炎和肺纤维化程度明显减轻，同时大鼠肺组织中表达转化生长因子β1(TGF-β1)的阳性细胞数明显减少(P<0.05)；而D、M组在第7、14、21天病理结果及转化生长因子表达的比较中，组间差异无显著性。其结论是，骨髓间充质干细胞移植对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化模型的肺泡炎和肺纤维化程度具有一定的抑制作用，作用机制可能与其降低肺组织转化生长因子(TGF-β1)的表达有关。

刘晨文献(刘晨，等，人脐血间充质干细胞预防博来霉素致大鼠肺纤维化效果，中国职业医学，2013年03期)探讨人脐血间充质干细胞(HUCBMSC)对博来霉素所致大鼠肺纤维化的预防性干预效果及可能机制。其方法是，取第2代HUCBMSC培养至第4代；取无特定病原体级5周龄雄性SD大鼠120只随机分为博来霉素组、干细胞干预组、地塞米松干预组和阴性对照组，每组30只。前3组分别经气管注入博来霉素建立肺纤维化模型，干细胞干预组造模后经鼠尾静脉注入5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记的HUCBMSC，地塞米松干预组造模后第1天开始连续腹腔注射地塞米松7d，阴性对照组经气管注入等体积生理氯化钠溶液，在第7、14、28天分别处死各组中的10只动物，肺组织行苏木精-伊红、马松三色染色，碱水解法测定肺羟脯氨酸的水平。其结果是，干细胞干预组第7、14、28天肺组织均可见Brdu标记的干细胞。3个时间点的博来霉素组肺羟脯氨酸水平呈逐渐升高的趋势，第28天达最高水平(P<0.01)。3个时间点干细胞干预组和地塞米松干预组的肺泡炎症及肺纤维化程度均分别较博来霉素组轻，差异均有统计学意义(P<0.05)。其结论是，HUCBMSC可以定植于受损的肺组织中，并可能在肺纤维化早期有效减轻肺泡炎及肺纤维化。

王贤文献(王贤，等，骨髓间充质干细胞抑制大鼠肺纤维化的作用机制，华中科技大学学报(医学版)，2014年03期)观察了骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠肺纤维化抑制作用的机制。其方法是，体外分离、培养、纯化4周龄SD大鼠的骨髓MSCs。SD实验大鼠随机分为4组(每组12只)：正常对照组(气管内注入生理盐水)、模型组(气管内注入博莱霉素)、MSCs治疗早期组(造模后立即给予尾静脉注射MSCs)、MSCs治疗晚期组(造模后14d给予尾静脉注射MSCs)，气管内注入博莱霉素用量为5mg/kg，正常对照组注入等体积生理盐水，尾静脉注射MSCs用量为1.0×10^6/mL DMEM培养液1mL。于第28天统一处死大鼠后取肺组织，肺组织病理切片行苏木精-伊红(HE)染色及Masson染色观察肺部炎症和纤维化情况，Western blot法检测肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)蛋白表达量。其结果是，①成功分离培养MSCs并鉴定。②模型组肺泡炎和肺纤维化程度较正常对照组明显加重，MSCs治疗早期组肺泡炎和肺纤维化程度较模型组显著减轻，MSCs治疗晚期组肺泡炎和肺纤维化程度与模型组比较差异无统计学意义。③模型组TGF-β1、TIMP-1蛋白表达较正常对照组显著增加，MSCs治疗组TGF-β1、TIMP-1蛋白表达较模型组显著减少，MMP-2蛋白表达在各组大鼠间差异无统计学意义。其结论是，骨髓MSCs可抑制博莱霉素诱导的肺纤维化，并且在肺损伤早期给予MSCs干预的疗效更好，其机制可能为降低TGF-β1蛋白的表达，调节MMP-2与TIMP-1之间的平衡。

崔瑷文献(崔瑷，等，骨髓间充质干细胞对博来霉素致大鼠肺纤维化形成的影响，中华结核和呼吸杂志，2007年09期)通过观察骨髓间充质干细胞(MSC)对博来霉素致大鼠肺纤维化动物模型的影响，探讨治疗肺纤维化的新方法。其方法是，体外分离、培养雄性6周龄SD大鼠的骨髓MSC。将48只雌性SD大鼠随机分为6组，第1～5组经气管注入5.0mg/kg博来霉素0.3ml，第1和第3组分别于博来霉素注射第1天和第7天经尾静脉注入雄性大鼠MSC液0.2ml(细胞数为2.5×10^6个)；第2和第4组分别于博来霉素注射第1天和第7天经尾静脉注入等量的磷酸缓冲液0.2ml；第5组作为模型阳性对照，注射博来霉素后未给予其他处理；第6组作为模型阴性对照，经气管注入等量生理盐水0.3ml代替博来霉素，未给予其他处理。于实验第28天统一处死大鼠，留取肺组织行病理学检查、羟脯氨酸含量测定；提取肺组织的DNA，通过聚合酶链反应(PCR)-琼脂糖电泳法检测雄鼠的性别决定基因(sry基因)，以判断外源给予的MSC是否在雌性大鼠肺组织中存在。其结果是，在博来霉素致肺损伤第1天和第7天给予MSC干预治疗后的大鼠肺脏病理改变均较对照组减轻，肺纤维化程度评分分别为1.0±0.2分、2.5±0.5分和1.6±0.5分、2.3±0.8分；肺组织羟脯氨酸含量分别为(83±17)μg/mg、(96±20)μg/mg和(123±32)μg/mg、(127±34)μg/mg，在博来霉素致肺损伤第1天较第7天给予MSC其作用更明显。PCR检测结果显示，在博来霉素致肺损伤第1天给予MSC组的大鼠肺组织可以检测到sry基因。其结论是外源给予的MSC可以减轻肺纤维化的形成在肺损伤早期给予MSC干预的疗效更好。

刘晨文献(刘晨，等，人脐带血干细胞对肺纤维化大鼠TNF-α、NO的影响，中国工业医学杂志，2012年06期)探究人脐血间充质干细胞对大鼠肺纤维化及TNF-α、NO的影响。其方法是，取清洁级健康雄性SD大鼠35只随机分为博来霉素组15只(P组)、干细胞治疗组15只(M组)和阴性对照组5只(N组)，取第二代人脐血间充质干细胞培养至第四代；P组、M组分别经气管注入博来霉素制造肺纤维化模型，N组注入等量的生理盐水，M组造模后立即经鼠尾静脉注入5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记的干细胞。N组大鼠在造模后第7天全部处死，P组和M组大鼠在造模后第7、14、28天分别处死。取肺组织行HE、Masson染色，ELISA法检测肺泡灌洗液中TNF-α、NO的表达情况。其结果是，M组第7、14、28天肺组织均可见标记的干细胞；HE及Masson染色后观察，与N组相比，P组7d时肺泡炎最明显，28d肺纤维化程度最重，M组较P组肺泡炎及纤维化程度减轻；与N组相比，P组大鼠的TNF-α、NO水平明显升高，在7d时达高峰，M组TNF-α、NO水平在各个时间段明显少于P组，组间差异有统计学意义。其结论是，人脐血间充质干细胞可以定植于肺组织中，在肺纤维化早期可有效减轻肺泡炎及肺纤维化；抑制TNF-α、NO的表达，可能为其作用机制。

本发明的发明人曾利用灌流法从胎盘中分离培养间充质干细胞，获得了纯度很高的间充质干细胞。但是经过灌流后仍然会有大量干细胞滞留在胎盘组织中，不能有效地被分离出来。因此可以认为，采用灌流法不能最大限度的得到间充质干细胞。

本发明公开了一种从胎盘中大量分离间充质干细胞的方法，并利用这种方法保存胎盘间充质干细胞并建立胎盘干细胞库。本发明的发明人在总结以往分离培养间充质干细胞的基础上，利用多种组织消化酶混合消化胎盘小叶组织块，结合贴壁培养法，成功自胎盘中分离得到大量间充质干细胞。本发明方法得到的间充质干细胞纯度高、数量多，具有与骨髓间充质干细胞相同的生物学特性，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞等分化。由于胎盘中干细胞较成体干细胞幼稚，含量丰富，在临床上具有广泛的应用前景，我们运用常规的细胞冻存方法将间充质干细胞像脐血一样冻存起来，建立胎盘干细胞库，为以后干细胞的深入研究和临床治疗奠定基础。

由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们建立脐血库把脐血造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样胎盘间充质干细胞作为一种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立胎盘干细胞库，为日后的干细胞治疗保存种子。

特别需要说明的是，通过本发明方法，可以在P0代获得间充质干细胞纯度极高的原代细胞，这些原代细胞的CD73表达大于60％、CD45不表达，并且这些原代细胞中间充质干细胞含量达60％-70％。

本发明的方法的技术效果是显而易见的。例如，本发明选取足月的胎盘样本，剪取胎盘小叶特定位置组织15g，用一种混合酶体系将之消化，得到细胞后进行提纯，即可得到一群较纯的间充质干细胞(CD73表达大于60％，CD45不表达)，每克组织获取细胞数可达2.5×10⁷，且得率稳定，大大降低了样本特异性。将该批原代间充质干细胞冻存后复苏培养，使用经典的完全培养基配方进行培养，4天左右即可镜检到较多纺锤型贴壁细胞，10天细胞融合率达到70-80％，即可传到P1代。连续传代至P5代后，进行流式表型鉴定，细胞周期检测和诱导分化等实验，结果表明P1-P5代细胞均为间充质干细胞，阳性表达(CD73，CD90，CD105)大于98％，阴性表达(CD34，CD45，CD19，CD11b，HLA-DR)小于2％；P5代细胞G2期细胞小于1％，增殖能力强，未进入分裂期；在特异性诱导培养基刺激下，有向成骨细胞，成脂细胞，成软骨细胞分化的能力。

本发明操作简单，方便实用，能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。与现有方法的比较：目前MSC主要采用手术法抽取供者骨髓或灌流法分离胎盘，贴壁培养获得。该法分得细胞数量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本发明成功自胎盘中分离获得大量纯度较高的间充质干细胞，并运用此法建立胎盘干细胞库来储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于胎盘与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。

附图说明

图1：本发明所得原代细胞的流式表型鉴定结果图。

图2：样本在P0传代过程中的显微图。

图3：样本在P5传代过程中的显微图。

图4：样本在P5代流式表型鉴定结果。

图5：样本P5代细胞的DNA含量-细胞数关系图。

图6：P5代细胞的诱导分化测试，显示其具有向成骨、成脂、成软骨细胞分化的能力。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。

实施例1、胎盘全细胞处理：

1、混合合酶消化液的预配制：分别移取22ml含钙镁离子的HBSS(Hank's平衡盐溶液)、0.4ml罗氏Liberase MNP-S酶(例如购自西宝生物，货号：5578582001)、0.7ml的DNA I型酶于50ml离心管中，再添加氯化锌(添加浓度为0.2g/L、0.25g/L、或0.3g/L)，混均，37℃预热20min以上。所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。

2、胎盘小叶的准备：从采集袋中取出胎盘于白瓷盘中，组织清洗液冲洗后，去除胎盘瘀血，剪取少量胎盘小叶组织(20g左右)于钢杯中。使用组织清洗液(0.9％生理盐水+双抗(双抗为青链霉素，含量1％))清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g±1g较好的组织于100mm玻璃皿中。

3、血细胞的去除：加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm³左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再用组织清洗液清洗两次(每次将小叶组织移到钢杯中加100ml组织清洗液搅匀后，300目过滤)。

4、混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入已预热的23ml混合酶消化液中充分混匀后，摇床37度100rpm振荡消化30min。消化结束后，组织液+2ml FBS终止。

5、原代细胞的收集：

加50ml组织清洗液稀释混匀组织液，300目过滤，收集细胞液，两次洗涤消化后的组织(每次使用50ml组织清洗液)，滤液合并至1只250ml离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；

移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；

移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；取1ml悬液，用于sysmex血液分析仪进行细胞计数，经测定，该原代细胞纯度较高，间充质干细胞含量约为60％-70％。

6、原代细胞冻存：

现配冻存液，冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO，现用现配；

使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml(另上清10ml留样)，重悬后缓缓加入已配制的冻存液，边加边摇匀；

将细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml(程序降温盒预冷)。剩余细胞悬液+留样上清用于无菌检测；

使用程序降温仪器程序降温，细胞转入液氮存储罐中，对所得原代细胞进行冻存。

通过上述实施例1的胎盘全细胞处理过程，选取足月的胎盘样本，剪取胎盘小叶特定位置组织15g，用所述的混合酶消化液体系将之消化，得到细胞后进行提纯，即可得到一群较纯的原代间充质干细胞(CD73表达大于60％，CD45不表达)，这些原代细胞中的间充质干细胞含量达60％-70％，每克胎盘小叶组织获取的原代细胞数可达(2.4～2.8)×10⁷个，且得率稳定，大大降低了样本特异性。然而，当所述混合酶消化液中未添加此氯化锌时，原代细胞中的间充质干细胞含量小于38％，通常在31～38％范围内，并且每克胎盘小叶组织获取的原代细胞数小于5×10⁵个；另外，本发明人在参照其它现有技术进行原代细胞制备时发现每克胎盘小叶组织获取的原代细胞数小于2×10⁶个，是本发明方法的1/10以下。本发明上述对胎盘进行全细胞处理能够高效的获得原代的间充质干细胞，为其后续传代培养成具有极高医学价值的间充质干细胞奠定良好的基础。

例如，在本实施例中，胎盘组织处理后细胞得率非常稳定，一些试验的典型数据见表1。

表1：从胎盘组织获取原代细胞的细胞收率

处理日期	样本注册号	组织量(g)	细胞数(×10<sup>8</sup>)	细胞得率(10<sup>8</sup>/g)
					2016.7.22	9004116082279	15	3.8	0.25
2016.7.25	9004116082301	15.9	3.9	0.25
					2016.7.26	9004116082311	14.9	3.8	0.26
2016.7.27	9004116082319	14.9	3.8	0.26
					2016.8.25	9004116082539	15	3.75	0.25

另外，上述胎盘处理后所得原代细胞流式表型鉴定结果显示CD73表达高达60％以上，CD45不表达，表明原代细胞是一群比较纯的间充质干细胞，不含血细胞。流式表型鉴定结果如图1所示。

实施例2、原代细胞复苏和传代培养

1、细胞复苏：

取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；如未另外说明，本文所用的完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基；

接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm²时可进行接下来的传代；

2、细胞传代：取复苏后的P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm²，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；

依次重复上述P0代至P1代的传代操作，以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。

在本实施例中原代接种密度约为5×10⁵cells/cm²，接种4天镜检视野内有很多贴壁细胞，呈纺锤型。接种后10天即可传至P1代。细胞生长速度快，量多，形态呈梭形，饱满。从P0代至P1代的传代过程中，一些试验的细胞计数示意性结果如下表2所示。其中PS162279样本在传代过程中的显微图如图2所示。

表2：P0代至P1代的传代过程中的细胞计数结果

样本注册号	P0-P1	P0计数
			PS162311	D10	8*10<sup>5</sup>(ADAM)
PS162319	D10	1.4*10<sup>6</sup>(ADAM)
			PS162279	D9	1.5*10<sup>6</sup>(ADAM)

另外，在P1-P5接种传代过程中，通常培养4～5天即收获并传代至下一代。示例性的，PS162279样本在P5传代过程中的显微图如图3所示。

在本试验中，进行了P1-P5代的流式表型鉴定，结果显示，CD73、CD90、CD105阳性表达均>98％，同时鉴定了CD34、CD45、CD19、HLA-DR，结果如表3所示，这些结果证明胎盘中分离培养出的细胞为间充质干细胞，且纯度高。

表3：P1-P5代细胞的流式表型鉴定结果

示例性的，PS162279样本P5代流式表型鉴定结果如图4所示。

另外，针对一些样本的P5代细胞测定它们的生长周期，结果显示G2期细胞<1％，S期细胞>10％，证明这些细胞增殖能力强，未进入分裂期，具体结果见表4。

表4：P5代细胞生长周期测定结果

样本注册号	GO/G1期	S期	G2/M期
				PS162311-P5	84.60％	14.80％	0.64％
PS162319-P5	82.30％	16.80％	0.93％
				PS162279-P5	87.00％	11.90％	0.80％

另外，针对PS162311-P5细胞，绘制其DNA含量-细胞数关系图，典型的结果显示于图5。

实施例3、胎盘MSC的生物学特性鉴定

参照已经授权的专利CN102676451A之[0062]至[0089]的方法进行胎盘间充质干细胞的生物学特性鉴定，结果显示，应用本发明方法分离得到的MSC，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力，证实本发明方法获得的MSC具有干细胞特性。

例如，示例性的，对P5代细胞进行诱导分化测试，结果显示这些细胞具有向成骨、成脂、成软骨细胞分化的能力。典型的成脂分化、成骨分化、和成软骨分化的显微图见图6。

实施例4、胎盘间充质干细胞治疗SSc的有效性

2/3以上的SSc患者有肺部受累，最常见的为肺间质纤维化，是本病主要的死亡原因。因此，以经典博来霉素诱导的肺间质纤维化小鼠模型作为临床前研究的动物模型以考察胎盘间充质干细胞治疗SSc的有效性。

参考苏敏红文献(苏敏红，等。腹腔注射博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型的长期稳定性。中国组织工程研究，2017年，第21卷第4期，512-519进行试验)。6-8周雌性C57BL/6小鼠，以博来霉素35mg/kg溶于200μL生理盐水，腹腔注射，2次/周，连续注射8次。第8次腹腔注射后，肺泡炎、肺纤维化评分于2周开始逐渐升高，于6-8周达高峰，持续至10周仍无明显降低，由此完成博来霉素肺纤维化建模。

在试验中，将6-8周雌性C57BL/6小鼠，随机均分为4组，分别为：第1组-对照组(n＝20)：未给予博来霉素的正常动物，模拟建模，经腹腔注射生理盐水，每周2次，共8次；第2组-肺纤维化模型组(n＝20)：博来霉素肺纤维化建模动物；第3组-胎盘MSC治疗组a(n＝20)：博来霉素肺纤维化建模成功后即自首次注射博来霉素开始10周后，尾静脉注射人胎盘MSC制剂a，每次2.5×10^5个MSC细胞，每周1次，共2次；第4组-胎盘MSC治疗组b(n＝20)：博来霉素肺纤维化建模成功后即自首次注射博来霉素开始10周后，尾静脉注射人胎盘MSC制剂b，每次2.5×10^5个MSC细胞，每周1次，共2次。第1组和第2组在另外两组给予MSC的同时静脉注射等体积生理盐水。

在本实验中，使用的是胎盘间充质干细胞注射制剂是这样配制的：将实施例2之步骤2细胞传代所得间充质干细胞(本例使用PS162279样本P4代)转移至离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液重悬，制得细胞浓度为1～3×10^6个胎盘间充质干细胞/ml的细胞制剂；其中，所述0.9％氯化钠溶液中额外添加葡萄糖酸镁和磷脂(使镁离子浓度达到2.5mmol/L，磷脂浓度为0.2mg/ml，磷脂是注射级大豆来源的，加葡萄糖酸镁和磷脂组标记为PD-MSC组a，即上述第3组)或不添加葡萄糖酸镁和磷脂(不加葡萄糖酸镁和磷脂组标记为PD-MSC组b，即上述第4组)。

在第二次尾静脉注射胎盘MSC注射后7天、14天和28天处死各组小鼠，每组6只，进行检测。

(1)肺病理改变

移植完毕后7天、14天、28天，处死各组小鼠(每组6只)，将小鼠肺组织在10％中性甲醛液中固定24h，乙醛脱水，石蜡包埋，组织切片厚度为5um，苏木精-伊红染色，显微镜下观察肺泡结构。结果显示：第1组动物的肺组织呈正常状态；第2组在第7天、14天和28天，小鼠肺组织有明显的炎细胞浸润，成纤维细胞病灶，正常肺泡结构变形；第3组尾静脉注射MSC后7天、14天和28天，炎症细胞浸润较第2组明显少，肺泡结构基本维持正常状态；第4组尾静脉注射MSC后7天、14天和28天，炎症细胞浸润比第2组少但无明显差异，且明显比第3组多，肺泡结构已见变形。

(2)ELISA检测肺组织中IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β蛋白水平

冷冻小鼠肺组织，经含有蛋白酶抑制剂裂解缓冲液裂解，离心，收集上清液。ELISA检测小鼠肺组织裂解液中，IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β蛋白的含量(单位重量肺组织中细胞因子的重量)。ELISA板在450nm处进行检测，并根据标准曲线计算上述蛋白的浓度读数。结果显示：与健康小鼠比较，MSC注射后14天，博来霉素引起肺组织中细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β)表达显著增加，这些细胞因子能够介导炎症和纤维化(p<0.01)，而给予MSC的第3组相对于第2组这些因子表达量明显更低(p<0.01或p<0.05)。具体结果见下表：

组别	第1组	第2组	第3组	第4组
					IL-1(pg/ug)	93.2±9.3	217.2±17.2**	131.6±12.5##	185.2±16.3#
IL-6(pg/ug)	827.8±58.4	2186±141.3**	1276.2±94.7##	1764.7±137.2#
					TNF-α(pg/ug)	687.3±46.1	1732.7±143.2**	974.4±68.9##	1647.6±127.4
TGF-β(pg/mg)	7.13±1.02	23.57±2.14**	13.86±1.28##	17.83±2.02#

表中，与第1组比较，第2组*p<0.05，**p<0.01；与第2组比较，第3组和第4组#p<0.05，##p<0.01。

(3)测定小鼠肺组织胶原含量

羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是一种非必需氨基酸，是胶原组织的主要成分之一，且为胶原中特有的氨基酸。通过对肺组织羟脯氨酸(Hydroxyproline)含量的测定，评估小鼠肺组织胶原含量的变化。取冷冻小鼠肺组织，在HCl中水解，在558nm处，检测各组样品的吸光度并计算羟脯氨酸含量。结果显示：博莱霉素诱导的肺纤维化，在7天、14天、28天，有显著的胶原沉积，羟脯氨酸(HYP)含量明显增加。给予胎盘MSC的第3组有显著的减弱胶原沉积的作用(p<0.01)。具体结果见下表：

测定日	第1组	第2组	第3组	第4组
					7天	1.89±0.43	2.42±0.63*	1.96±0.58##	2.29±0.81
14天	1.96±0.38	2.68±0.84*	2.02±0.72##	2.46±0.76#
					28天	1.84±0.42	3.37±0.71*	2.14±0.61##	2.84±0.69#

表中，与第1组比较，第2组*p<0.05，**p<0.01；与第2组比较，第3组和第4组#p<0.05，##p<0.01。

(4)评估基质金属蛋白酶活性

通过密度测定和明胶酶活性定量评估冷冻肺组织中基质金属蛋白酶的活性。蛋白质含量(15mg/样品)加载到含有7.5％的丙烯酰胺和1mg/ml明胶的凝胶上。并评估MMP-2、MMP-9和MMP-13的变化。结果显示：用密度测定法定量校准，对照组小鼠的各种酶活性设为1，计算各组的各种酶海性值。具体结果见下表：

酶活性	第1组	第2组	第3组	第4组
					MMP-2	1	1.07±0.13	1.53±0.15#	1.24±0.15
MMP-9	1	1.11±0.19	2.27±0.17##	1.63±0.18#
					MMP-13	1	1.28±0.08	1.74±0.09##	1.51±0.11#

表中，与第2组比较，第3组和第4组#p<0.05，##p<0.01。

上述结果证实了本发明细胞制剂用于SSc的有效性，并且结果还显示PD-MSC组a的效果明显优于PD-MSC组b结果。

实施例5、胎盘干细胞库的建立

1、细胞活性的检测：利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

2、细胞污染的检测：利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。利用病原学方法，检测细胞是否受到乙肝两对半、丙肝、艾滋、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST感染。

3、遗传病的检测：利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。

4、HLA-ABC/DR配型：检测细胞HLA-ABC/DR表型，并记录在案。

5、细胞来源的调查：记录胎儿及其父母的详细资料，并记录在案。

6、胎盘干细胞数据库的建立：在保存正常的胎盘干细胞后，建立胎盘干细胞的数据库，其中包括前六项资料，并建立与冻存细胞的关联。

Claims (10)

1.一种细胞制剂，其是通过使间充质干细胞(例如胎盘间充质干细胞)混悬于0.9％氯化钠溶液中配制成的细胞混悬液。

2.根据权利要求1的细胞制剂，其中细胞浓度为1～10×10⁶个细胞/ml，例如1～5×10⁶个细胞/ml，例如1～3×10⁶个细胞/ml。

3.根据权利要求1的细胞制剂，所述0.9％氯化钠溶液中还添加葡萄糖酸镁和磷脂；例如，添加葡萄糖酸镁的量是使镁离子浓度为2.5mmol/L；例如，添加磷脂的浓度为0.2mg/ml；例如，所述磷脂是注射级大豆来源的。

4.根据权利要求1的细胞制剂，其是通过包括方法制得的：将细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，离心，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液重悬，制得细胞制剂。

5.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm³左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；

[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水]

(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；

[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2～2体积的DNA I型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的Liberase MNP-S酶、0.5～1体积的DNA I型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的Liberase MNP-S酶、0.7体积的DNA I型酶)；所述Liberase MNP-S酶例如是罗氏公司的Liberase MNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001]

(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；

[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数]

(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；

[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO]

(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm²时可进行接下来的传代；

[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基]

(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm²，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。

6.根据权利要求1的细胞制剂，在制备间充质干细胞的过程中，还包括：

(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；

(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；和/或

(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。

7.根据权利要求1的细胞制剂，其中所得各代胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％；例如，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。

8.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述Hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/L的NaCl、0.4g/L的KCl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的MgCl2·6H2O、0.06g/L的Na2HPO4·2H2O、0.06g/L的KH2PO4、1.0g/L的葡萄糖、0.14g/L的CaCl2、0.35g/L的NaHCO3、0.2g/L的酚红、盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4；例如，其中所述混合酶消化液中除了包含Hank's平衡盐溶液、Liberase MNP-S酶、DNA I型酶外，还添加有0.2～0.3g/L氯化锌。

9.根据权利要求1的细胞制剂，其特征在于：

所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目；

所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染；

所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST；

所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病；

所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型；

所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中；

所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。

10.权利要求1～9任一项的细胞制剂在制备用于治疗和/或预防系统性硬化病的药物中的用途。