CN106479969B - 使用hla-g阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用HLA‑G阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法。具体地说，本发明一方面涉及制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原‑G阳性的间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)分离培养HLA‑G+脐带间充质干细胞、(2)HLA‑G+间充质干细胞冻存、(3)HLA‑G+间充质干细胞复苏。本发明方法所制得的间充质干细胞中有90％以上的细胞人白细胞抗原‑G呈阳性。已经发现，本发明HLA‑G+脐带间充质干细胞在治疗系统性红斑狼疮方面具有优异的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于干细胞治疗领域，涉及间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法，特别是涉及使用人白细胞抗原-G(通常缩写为HLA-G)阳性间充质干细胞(这种HLA-G阳性的间充质干细胞在本发明中可缩写为HLA-G+间充质干细胞)治疗系统性红斑狼疮的方法。通过本发明，可以为系统性红斑狼疮提供更为有效的治疗方案。
背景技术
系统性红斑狼疮(简称SLE)是一种常见的免疫性疾病。病因尚不明确，其特点为整个免疫系统功能紊乱，细胞凋亡异常，淋巴细胞功能异常，其血清具有以抗核抗体为代表的多种自身抗体，造成全身多系统器官的慢性损害。传统激素免疫抑制剂的治疗方式副作用大，病人需终身服药。系统性红斑狼疮是一种累及多系统多器官的自身免疫病，患者体内免疫系统功能紊乱，T、B淋巴细胞异常活化，产生多种自身抗体和免疫复合物，导致患者皮肤、关节、肾脏等全身多个器官及系统受到损害。SLE好发于青年女性，男女比例为1：9，在我国成年女性中发病率为0.1％，高于西方国家的0.05％，且随着社会经济的发展及生活压力的增加，SLE的发病率日益上升，由于该病病程长且反复发作，给患者的心理和生理带来了极大的影响。
SLE常用的治疗方法主要是通过服用糖皮质激素或免疫抑制剂等药物，以此来缓解因免疫系统攻击正常组织所造成的炎症反应和抑制免疫系统的作用。虽然糖皮质激素与免疫抑制剂被用于治疗系统性红斑狼疮使患者的预后有了明显改善，但是，SLE的治疗现状仍不容乐观：①目前仍然有约10％的患者在发病5年内死亡；②由于疾病的进展及一些治疗带来的副作用，如出现感染、骨髓抑制、骨质疏松、高血压、糖尿病等，尤其是细胞毒药物及糖皮质激素的应用，SLE患者的平均寿命明显短于正常人群；③常规的治疗方法只能减缓病情的发展速度，非根治疾病。因此，寻找一些高效、副作用少的新治方已迫在眉睫。
自1996年开始用自体造血干细胞(HSC)移殖治疗SLE以来，在重症难治性SLE中取得了较好的疗效，但存在易复发的问题，而异基因HSC移殖治疗SLE虽能使部分患者病情长期缓解，但供体来源不足，病死率高达30％～50％，且治疗费用高。骨髓中除了HSC外还存在一种形态上类似成纤维细胞的间充质干细胞(MSC)，MSC具有多向分化潜能、免疫原性低与增殖速度快等特点。MSC不仅具有支持造血的功能，还具有免疫调节及诱导免疫耐受的功能，研究表明MSC发挥免疫调节及诱导免疫耐受的机理主要是：抑制T细胞增殖，使产生白细胞介素4(IL-4)的细胞数减少，产生干扰素γ(IFN-γ)的细胞数增加，调节Th1/Th2的平衡。MSC可通过多种途径调节炎症因子的释放、诱导免疫耐受、抑制自身免疫反应从而达到长期有效地治疗SLE。但是由于单纯的骨髓干细胞群体中MSC的含量极少，如果不通过体外的进一步扩增，很难达到治疗效果，且SLE是一种全身性疾病，单纯的使用MSC治疗，治疗效果有限，特别是对于一些重症SLE患者来说，短期内难以达到良好的治疗效果。
近年来，干细胞移植技术已经应用于SLE的治疗。国内外开展骨髓来源的造血干细胞移植治疗SLE，取得了一定疗效，但存在移植源寻找困难、费用昂贵等问题，临床难以开展。并且，自体造血干细胞移植(HSCT，hematopoietic stem cell transplant)存在高复发率的弊病，异体HSCT存在由于排异等原因造成死亡率较高。
因此，提供一种能够更有效地使用间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法，对于本领域技术人员而言是非常迫切的。
发明内容
本发明目的在于提供一种能够更有效地使用间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法。已经出人意料地发现，使用人白细胞抗原-G阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮是非常有临床价值的。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原-G阳性的间充质干细胞(可缩写为HLA-G+间充质干细胞或者HLA-G+MSC)的方法，该方法包括以下步骤：
步骤(1)、分离培养HLA-G+脐带间充质干细胞
(11)采集脐带后，放入运输液中(这种运输液是本领域技术人员公知的，一种示例性的运输液的组成为：100ml低糖DMEM、1ml双抗、1μg/ml两性霉素)低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D-HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；
(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；
(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D-HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞(例如有红细胞等)，重复3次；
(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置约30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液(但要避免组织块漂起)，当达到70％～80％融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；
(15)传代培养：
(15a)贴壁细胞传代：
清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D-HANKS液加入每个培养瓶中，约为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D-HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D-HANKS液并弃去；
消化：每瓶加入一定量的25％胰酶(通常的量为约2ml/T25瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
中止：每瓶加入2～5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D-HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×107个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA-G+CD11b-CD34-CD45-细胞(即表达CD73、CD90、CD105、HLA-G，但不表达CD11b、CD34、CD45的细胞)；
传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液；细胞融合达到70-80％后，对细胞进行消化传代，在消化前一天全量换液；细胞消化计数(通常，10个培养瓶的细胞总数可达1.3×105个以上)，按1：3传代，2-3天细胞铺满底部，漩涡状密集分布，生长较一致；
(15b)组织块传代：
将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的培养皿，间隔5mm种植；加少量完全培养基湿润底部即可，待其贴壁后再补加一定量(通常的量为浸没组织块)的完全培养基；
待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，游出组织块细胞2～3d迅速生长达到80％～90％的融合度，再次将细胞和组织块分别传代，方法同上面针对贴壁细胞传代的操作；
共传代3次；细胞消化计数(在第1次传代后细胞总数可达12.5×105个以上，第2次传代后可达15.5×105个以上，第3次传代后可达8.5×105个以上)；
步骤(2)、HLA-G+间充质干细胞冻存
(本步骤(2)的目的是，对HLA-G+细胞(例如P2代)作为种子细胞进行冻存，在必要时复苏传代培养至P4～P6用于临床治疗SLE。通过细胞的表型、增殖能力、多向分化能力、细胞活性检测等，鉴定细胞生物学效力。步骤(1)由贴壁细胞传代和组织块传代所得两种细胞可以分别或者混合进行后续操作，优选的是使用贴壁细胞传代所得细胞。)
(21)配制冻存液：按1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基比例配制，根据计数结果和冻存密度计算冻存液体积，冻存液需多配制10ml左右用于无菌检测，将配好的冻存液放入4度冰箱预冷；
(22)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(23)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入一定体积的冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(24)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；
(25)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，填写完成储存位置表；
步骤(3)、HLA-G+间充质干细胞复苏
(31)准备工作：打开水浴锅，配制完全培养基；
(32)取细胞：根据所需细胞数量计算取出细胞管数，在细胞库存管理台账中记录取出时间和取出管数，并在储存位置表中相应位置进行标记；打开液氮储存罐，找到相应冻存架和冻存盒位置，取出细胞；
(33)解冻：将细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻；
(34)去冻存液：由于冻存液中的DMSO在常温下对细胞有伤害作用，因此需迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(35)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(36)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入二氧化碳培养箱中培养；传至P4～P6代，得到可用于临床治疗的HLA-G+间充质干细胞。
根据本发明第一方面的方法，其所制得的间充质干细胞中有90％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
根据本发明第一方面的方法，其所制得的间充质干细胞中有95％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
根据本发明第一方面的方法，其所制得的间充质干细胞中有98％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
进一步的，本发明第二方面提供了一种用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原-G阳性间充质干细胞，其是通过包括以下步骤的方法制备得到的：
步骤(1)、分离培养HLA-G+脐带间充质干细胞
(11)采集脐带后，放入运输液中(这种运输液是本领域技术人员公知的，一种示例性的运输液的组成为：100ml低糖DMEM、1ml双抗、1μg/ml两性霉素)低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D-HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；
(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；
(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D-HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞(例如有红细胞等)，重复3次；
(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置约30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液(但要避免组织块漂起)，当达到70％～80％融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；
(15)传代培养：
(15a)贴壁细胞传代：
清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D-HANKS液加入每个培养瓶中，约为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D-HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D-HANKS液并弃去；
消化：每瓶加入一定量的25％胰酶(通常的量为约2ml/T25瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
中止：每瓶加入2～5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D-HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×107个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA-G+CD11b-CD34-CD45-细胞(即表达CD73、CD90、CD105、HLA-G，但不表达CD11b、CD34、CD45的细胞)；
传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液；细胞融合达到70-80％后，对细胞进行消化传代，在消化前一天全量换液；细胞消化计数(通常，10个培养瓶的细胞总数可达1.3×105个以上)，按1：3传代，2-3天细胞铺满底部，漩涡状密集分布，生长较一致；
(15b)组织块传代：
将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的培养皿，间隔5mm种植；加少量完全培养基湿润底部即可，待其贴壁后再补加一定量(通常的量为浸没组织块)的完全培养基；
待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，游出组织块细胞2～3d迅速生长达到80％～90％的融合度，再次将细胞和组织块分别传代，方法同上面针对贴壁细胞传代的操作；
共传代3次；细胞消化计数(在第1次传代后细胞总数可达12.5×105个以上，第2次传代后可达15.5×105个以上，第3次传代后可达8.5×105个以上)；
步骤(2)、HLA-G+间充质干细胞冻存
(本步骤(2)的目的是，对P2的HLA-G+细胞作为种子细胞进行冻存，在必要时复苏传代培养至P4～P6用于临床治疗SLE。通过细胞的表型、增殖能力、多向分化能力、细胞活性检测等，鉴定细胞生物学效力。步骤(1)由贴壁细胞传代和组织块传代所得两种细胞可以分别或者混合进行后续操作，优选的是使用贴壁细胞传代所得细胞。)
(21)配制冻存液：按1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基比例配制，根据计数结果和冻存密度计算冻存液体积，冻存液需多配制10ml左右用于无菌检测，将配好的冻存液放入4度冰箱预冷；
(22)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(23)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入一定体积的冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(24)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；
(25)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，填写完成储存位置表；
步骤(3)、HLA-G+间充质干细胞复苏
(31)准备工作：打开水浴锅，配制完全培养基；
(32)取细胞：根据所需细胞数量计算取出细胞管数，在细胞库存管理台账中记录取出时间和取出管数，并在储存位置表中相应位置进行标记；打开液氮储存罐，找到相应冻存架和冻存盒位置，取出细胞；
(33)解冻：将细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻；
(34)去冻存液：由于冻存液中的DMSO在常温下对细胞有伤害作用，因此需迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(35)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(36)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入二氧化碳培养箱中培养；传至P4～P6代，得到可用于临床治疗的HLA-G+间充质干细胞。
根据本发明第二方面的间充质干细胞，其中该间充质干细胞中有90％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
根据本发明第二方面的间充质干细胞，其中该间充质干细胞中有95％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
根据本发明第二方面的间充质干细胞，其中该间充质干细胞中有98％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
进一步的，本发明第三方面提供了间充质干细胞在制备治疗系统性红斑狼疮的药物中的用途。
根据本发明第三方面的用途，其中所述间充质干细胞中有90％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
根据本发明第三方面的用途，其中所述间充质干细胞中有95％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
根据本发明第三方面的用途，其中所述间充质干细胞中有98％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
根据本发明第三方面的用途，其中所述间充质干细胞是通过包括以下步骤的方法制备得到的：
步骤(1)、分离培养HLA-G+脐带间充质干细胞
(11)采集脐带后，放入运输液中(这种运输液是本领域技术人员公知的，一种示例性的运输液的组成为：100ml低糖DMEM、1ml双抗、1μg/ml两性霉素)低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D-HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；
(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；
(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D-HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞(例如有红细胞等)，重复3次；
(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置约30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液(但要避免组织块漂起)，当达到70％～80％融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；
(15)传代培养：
(15a)贴壁细胞传代：
清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D-HANKS液加入每个培养瓶中，约为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D-HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D-HANKS液并弃去；
消化：每瓶加入一定量的25％胰酶(通常的量为约2ml/T25瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
中止：每瓶加入2～5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D-HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×107个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA-G+CD11b-CD34-CD45-细胞(即表达CD73、CD90、CD105、HLA-G，但不表达CD11b、CD34、CD45的细胞)；
传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液；细胞融合达到70-80％后，对细胞进行消化传代，在消化前一天全量换液；细胞消化计数(通常，10个培养瓶的细胞总数可达1.3×105个以上)，按1：3传代，2-3天细胞铺满底部，漩涡状密集分布，生长较一致；
(15b)组织块传代：
将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的培养皿，间隔5mm种植；加少量完全培养基湿润底部即可，待其贴壁后再补加一定量(通常的量为浸没组织块)的完全培养基；
待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，游出组织块细胞2～3d迅速生长达到80％～90％的融合度，再次将细胞和组织块分别传代，方法同上面针对贴壁细胞传代的操作；
共传代3次；细胞消化计数(在第1次传代后细胞总数可达12.5×105个以上，第2次传代后可达15.5×105个以上，第3次传代后可达8.5×105个以上)；
步骤(2)、HLA-G+间充质干细胞冻存
(本步骤(2)的目的是，对P2的HLA-G+细胞作为种子细胞进行冻存，在必要时复苏传代培养至P4～P6用于临床治疗SLE。通过细胞的表型、增殖能力、多向分化能力、细胞活性检测等，鉴定细胞生物学效力。步骤(1)由贴壁细胞传代和组织块传代所得两种细胞可以分别或者混合进行后续操作，优选的是使用贴壁细胞传代所得细胞。)
(21)配制冻存液：按1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基比例配制，根据计数结果和冻存密度计算冻存液体积，冻存液需多配制10ml左右用于无菌检测，将配好的冻存液放入4度冰箱预冷；
(22)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(23)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入一定体积的冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(24)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；
(25)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，填写完成储存位置表；
步骤(3)、HLA-G+间充质干细胞复苏
(31)准备工作：打开水浴锅，配制完全培养基；
(32)取细胞：根据所需细胞数量计算取出细胞管数，在细胞库存管理台账中记录取出时间和取出管数，并在储存位置表中相应位置进行标记；打开液氮储存罐，找到相应冻存架和冻存盒位置，取出细胞；
(33)解冻：将细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻；
(34)去冻存液：由于冻存液中的DMSO在常温下对细胞有伤害作用，因此需迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(35)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(36)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入二氧化碳培养箱中培养；传至P4～P6代，得到可用于临床治疗的HLA-G+间充质干细胞。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明的步骤(15a)贴壁细胞传代过程中，对细胞进行了分选的操作，具体工作是采用流式细胞仪分选表达CD73、CD90、CD105、HLA-G，但不表达CD11b、CD34、CD45的细胞。经此分选操作所得细胞，已经发现，在进行P1～P6的六代传代后，这些细胞仍然具备上述表达CD73、CD90、CD105、HLA-G，但不表达CD11b、CD34、CD45的特征，特别是在传代至P1至P6代后各代细胞中仍然有98％以上的细胞HLA-G呈阳性。然而，当这些P1～P6代的细胞在经历步骤(2)的HLA-G+间充质干细胞冻存以及步骤(3)的HLA-G+间充质干细胞复苏之后，经流式细胞仪检测，仅有56％～63％的细胞HLA-G呈阳性，这是非常令人遗憾的。已经出人意料地发现，当步骤(2)的DMSO/人血清白蛋白/完全培养基这一冻存液中添加0.01％～0.03％的焦磷酸钠时，对步骤(15a)所得P1～P6代的细胞进行步骤(2)的HLA-G+间充质干细胞冻存以及步骤(3)的HLA-G+间充质干细胞复苏之后，经流式细胞仪检测，有96％～99％的细胞HLA-G仍然呈阳性，这表明仅仅是向冻存液中添加微量的试剂可以有效地保持细胞传代的遗传稳定性，这是完全出人意料的。因此，在本发明的一个实施方案中，在步骤(2)的HLA-G+间充质干细胞冻存过程中，所用的冻存液中还添加0.01％～0.03％(w/v)的焦磷酸钠。
本发明特别地选取表达人白细胞抗原-G的间充质干细胞作为相应疾病的治疗剂。白细胞抗原-G，即HLA-G，其是由Geraghty于1987年首次克隆出来的位于6号染色体短臂的一类免疫耐受分子，具有选择性组织分布的特点，表达于母胎界面绒毛外滋养细胞、一些肿瘤细胞系、肿瘤活检组织和一些感染及正常组织细胞，以及心脏移植后的移植物细胞等。
HLA-G是位于人第6号染色体短臂上的一群紧密连锁基因群，属于人类一种非经典的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的I类分子，选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞。妊娠被认为是成功的同种异体移植，很多妊娠相关疾病与滋养细胞异常增殖、浸润、胎盘形成不良有关。
HLA-G在母胎界面的表达对母胎免疫耐受和维持正常妊娠有重要作用，但HLA-G的具体生物学作用，尤其是非免疫学功能仍不明确。
HLA-G属非经典的HLAⅠ类分子，与经典的HLAⅠ类分子相比它有3个特点：(1)多态性水平低；(2)体内分布局限于特定组织；(3)由于内含子和外显子间的剪接位点改变可形成4种膜结合型和两种可溶型HLA-G异构体。过去几年大量研究结果表明，HLA-G是一种免疫耐受分子。
人白细胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)G、E和F同属非经典的HLAⅠ类基因(HLAⅠb)，是继HLA-A，HLA-B，HLA-C和HLA-E之后发现的第5个HLAⅠ类基因。HLA-G最早由Geraghty等克隆并测序，由于它存在于6.0kb的HindⅢ酶切片段中，被命名为HLA-6.0。1988年McAlpine建议为避免在命名中使用标点符号，将该基因命名为HLA-60。1990年在Bodmer等发布的HLA命名通报中将该基因正式命名为HLA-G。
HLA-G位于6号染色体HLA-A端粒侧，其基因结构与HLA-A，HLA-B和HLA-C相似，但提前出现的终止密码使其编码的蛋白产物胞内段仅6个氨基酸，比经典HLAⅠ类抗原的30个氨基酸明显缩短.HLA-G的这一结构特点，加上启动子区结构与鼠的HLAⅠ类基因Qa相似，提示该基因与Qa基因同源。
HLA-G多态性：1992年Geraghty等发现，在HLA-A和HLA-G之间有一个高度多态的区域，这一区域在某种HLA单倍型时缺失，使两基因之间的距离缩短50kb以上。1993年Morales等报道了3个新的HLA-G等位基因，从而证明HLA-G基因有多态性。
HLA-G分子主要在人胎盘组织中转录，表达于孕卵着床期植入母体子宫内膜的胎盘组织中，而此处恰恰不表达经典的HLA-A，B分子及DR，DQ和DP分子。在绒毛膜外细胞滋养层细胞，包括那些侵入子宫蜕膜的细胞滋养层细胞中HLA-G高表达；而在胎盘绒毛的合体滋养层中，HLA-G表达水平较低.绒毛膜细胞滋养层与绒毛膜外细胞滋养层的分化伴随着细胞表面HLA-G分子表达水平的提高，而在植入前的胚胎或生殖细胞中未见HLA-G表达。用灵长类恒河猴进行的实验表明，在妊娠14～19天HLA-G主要表达于侵入母体血管和子宫内膜的细胞滋养层中，而在滋养层腔隙表面的合体滋养层和新形成的绒毛膜中基本上是HLA-G阴性.到妊娠第36天，在绒毛膜合体滋养层中也表达HLA-G分子，母体子宫和胎儿滋养层间也积聚大量HLA-G分子。在整个妊娠期间，母胎界面处的滋养层细胞还分泌sHLA-G1。HLA-G分子在胎盘组织中的分布可能反应了它的功能，使母体对同种异体胎儿组织抗原产生免疫耐受。此外，在胎儿的肝，眼，心，肺和肾，及成人的甲状腺，角质化细胞，外周血T细胞和B细胞，脾，肝和肾也可检出HLA-GmRNA，但其水平远低于这些组织中经典HLAⅠ类基因mRNA水平。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
实施例1：制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原-G阳性间充质干细胞
(HLA-G+间充质干细胞或者HLA-G+MSC)
步骤(1)、分离培养HLA-G+脐带间充质干细胞
(11)采集脐带后，放入运输液中(这种运输液的组成为：100ml低糖DMEM、1ml双抗、1μg/ml两性霉素)低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D-HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；
(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；
(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D-HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞(例如有红细胞等)，重复3次；
(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置约30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液(但要避免组织块漂起)，当达到70％～80％融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；
(15)传代培养：
(15a)贴壁细胞传代：
清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D-HANKS液加入每个培养瓶中，约为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D-HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D-HANKS液并弃去；
消化：每瓶加入一定量的25％胰酶(通常的量为约2ml/T25瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
中止：每瓶加入2～5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D-HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×107个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA-G+CD11b-CD34-CD45-细胞(即表达CD73、CD90、CD105、HLA-G，但不表达CD11b、CD34、CD45的细胞)；
传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液；细胞融合达到70-80％后，对细胞进行消化传代，在消化前一天全量换液；细胞消化计数(通常，10个培养瓶的细胞总数可达1.3×105个以上)，按1：3传代，2-3天细胞铺满底部，漩涡状密集分布，生长较一致；
(15b)组织块传代：
将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的培养皿，间隔5mm种植；加少量完全培养基湿润底部即可，待其贴壁后再补加一定量(通常的量为浸没组织块)的完全培养基；
待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，游出组织块细胞2～3d迅速生长达到80％～90％的融合度，再次将细胞和组织块分别传代，方法同上面针对贴壁细胞传代的操作；
共传代3次；细胞消化计数(在第1次传代后细胞总数可达12.5×105个以上，第2次传代后可达15.5×105个以上，第3次传代后可达8.5×105个以上)；
步骤(2)、HLA-G+间充质干细胞冻存
(本步骤(2)的目的是，对P2的HLA-G+细胞作为种子细胞进行冻存，在必要时复苏传代培养至P4～P6用于临床治疗SLE。通过细胞的表型、增殖能力、多向分化能力、细胞活性检测等，鉴定细胞生物学效力。步骤(1)由贴壁细胞传代和组织块传代所得两种细胞可以分别或者混合进行后续操作，优选的是使用贴壁细胞传代所得细胞，在本实例中是使用贴壁细胞传代P2代所得细胞进行冻存操作。)
(21)配制冻存液：按1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基比例配制，根据计数结果和冻存密度计算冻存液体积，冻存液需多配制10ml左右用于无菌检测，将配好的冻存液放入4度冰箱预冷；
(22)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(23)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入一定体积的冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(24)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；
(25)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，填写完成储存位置表；(本试验中至少冻存15天)
步骤(3)、HLA-G+间充质干细胞复苏
(31)准备工作：打开水浴锅，配制完全培养基；
(32)取细胞：根据所需细胞数量计算取出细胞管数，在细胞库存管理台账中记录取出时间和取出管数，并在储存位置表中相应位置进行标记；打开液氮储存罐，找到相应冻存架和冻存盒位置，取出细胞；
(33)解冻：将细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻；
(34)去冻存液：由于冻存液中的DMSO在常温下对细胞有伤害作用，因此需迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(35)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(36)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入二氧化碳培养箱中培养；传至P4～P6代，得到可用于临床治疗的HLA-G+间充质干细胞。
本实施例步骤(15a)分选的HLA-G+细胞，以及步骤(15b)组织块传代操作中经分选的HLA-G+细胞，在经接下来的传代后，试验发现，它们传代至P1～P6代，各代细胞中仍然均有98％以上的细胞HLA-G呈阳性。然而，当这些P1～P6代的细胞在经历步骤(2)的HLA-G+间充质干细胞冻存以及步骤(3)的HLA-G+间充质干细胞复苏之后，经流式细胞仪检测，仅有56％～63％的细胞HLA-G呈阳性(在下文实施例2的补充试验中，使用此种经冻存后HLA-G+细胞量大大降低的细胞作为治疗剂，结果显示其生物学效果明显地不好呈阳性HLA-G+间充质干细胞组，稍强于间充质干细胞组)，这是非常令人遗憾的。补充试验1：参照上述实施例1，不同的仅是在冻存液中添加0.01％、0.02％、或0.03％(w/v)的焦磷酸钠，试验发现，当步骤(15a)分选的HLA-G+细胞以及步骤(15b)组织块传代操作中经分选的HLA-G+细胞并经传代至P1～P6代，这些P1～P6代的细胞在经历步骤(2)的HLA-G+间充质干细胞冻存以及步骤(3)的HLA-G+间充质干细胞复苏之后，经流式细胞仪检测，有96％～99％的细胞HLA-G仍然呈阳性。以下实施例2所用的HLA-G+MSC细胞是使用本补充试验1中以步骤(15a)分选并传代至P2的HLA-G+细胞用0.02％焦磷酸钠冻存液方案冻存再经步骤(3)复苏、传代至P4代所得细胞，该细胞群中有95％以上的细胞HLA-G呈阳性。所用的MSC细胞是步骤(15a)分选HLA-G阴性并同HLA-G+MSC细胞类似方法冻存、复苏、传代所得细胞。
实施例2：使用人白细胞抗原-G阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮
以MRL/lpr鼠作为SLE动物模型，试验分组：
治疗组：HLA-G+MSC细胞治疗组，门静脉注射组、尾静脉注射组、胫骨内注射组；
对照组：MSC细胞治疗组，门静脉注射组、尾静脉注射组、胫骨内注射组；及
空白对照组：同法给予生理盐水。
各组动物n＝30。分别于造模后第1、2、3周末分别注射2×105个相应细胞。
(1)考察小鼠的生存状况：
观察各组小鼠生存率，结果显示：MSC静脉(门静脉和尾静脉)治疗组可以稍微延长狼疮鼠生存期限但短于胫骨内注射组，胫骨内注射组12个月生存率达100％但在12～15个月期间生存率急剧降低至40％以下；HLA-G+MSC静脉(门静脉和尾静脉)注射组18个月生存率仍达100％但后续的生存率明显代于胫骨内注射组，胫骨内注射组2.5年以上生存率仍达100％。结论：在生存率方面，HLA-G+治疗组生存率明显高于MSC治疗组；在输注途径方面，以延长生存率表征，胫骨内注射>门静脉注射组>尾静脉注射组。
(2)动物尿液蛋白定量检测：分别于移植前、移植过程中、移植之后，收集蛋白尿，做尿液蛋白定量检测。结果：对照组小鼠从16周始，尿蛋白逐渐升高，至32周后直到试验结束时仍然维持异常的高位；各治疗组小鼠在治疗的初期，尿蛋白也逐渐上升，但上升趋势较对照组明显减慢，并且接着呈下降趋势，至32周后各治疗组尿蛋白水平基本与空白对照组持平。
(3)检测血清ANA、抗dsDNA抗体水平：移植完毕后16周时，处死各组小鼠(每组n＝5)，检测血清ANA、抗dsDNA抗体水平等。结果：治疗组对MRL/lpr狼疮鼠抗ds-DNA抗体较对照组抗体水平明显降低，有显著性意义(p<0.05)，而抗ANA抗体的水平在各组间的差异无显著性意义。
(4)肾脏病理改变：
移植完毕后16周时，处死各组小鼠(每组n＝5)，每组取小鼠的肾脏组织于体积分数10％中性甲醛液固定24h，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，厚4μm，苏木精-伊红染色，显微镜下观察小鼠肾脏细胞数、肾小球硬化、新月体的性质和数目、肾小球毛细血管袢坏死及肾小球毛细血管袢内血栓形成。
结果：对照组(MSC细胞治疗组)小鼠肾脏病理显示显著的病理改变，表现为肾小球硬化、肾小球系膜细胞增殖、基质增宽，并可见新月体形成，肾间质内大量淋巴细胞浸润。治疗组(HLA-G+MSC细胞治疗组)表现为系膜细胞，系膜基质轻至中度增生，局灶性硬化，偶尔可见的肾间质的炎症细胞的浸润。肾小球硬化、间质纤维化程度及间质炎症细胞浸润程度较对照组减轻，这些结果均表明HLA-G+MSC细胞对MRL/lpr狼疮鼠肾脏病变具有修复作用。
结论：HLA-G+MSC细胞移植后临床指标以及肾脏病理均明显好转，表明HLA-G+MSC细胞移植对狼疮肾炎有优良的治疗作用。
Claims (4)
1.制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原-G阳性的间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
步骤(1)、分离培养HLA-G+脐带间充质干细胞
(11)采集脐带后，放入运输液中低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D-HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；
(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；
(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D-HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞，重复3次；
(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5%CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液，当达到70%~80%融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；
(15)传代培养：
(15a)贴壁细胞传代：
清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D-HANKS液加入每个培养瓶中，为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D-HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D-HANKS液并弃去；
消化：每瓶加入一定量的25%胰酶，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
中止：每瓶加入2~5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D-HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×107个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA-G+CD11b-CD34-CD45-细胞；
传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液；细胞融合达到70-80%后，对细胞进行消化传代，在消化前一天全量换液；细胞消化计数，按1：3传代，2-3天细胞铺满底部，漩涡状密集分布，生长较一致；
(15b)组织块传代：
将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的培养皿，间隔5mm种植；加少量完全培养基湿润底部即可，待其贴壁后再补加一定量的完全培养基；
待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，游出组织块细胞2~3d迅速生长达到80%~90%的融合度，再次将细胞和组织块分别传代，方法同上面针对贴壁细胞传代的操作；
共传代3次；细胞消化计数；
步骤(2)、HLA-G+间充质干细胞冻存
(21)配制冻存液：按1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基比例配制并添加重量/体积百分数为0.01%~0.03%的焦磷酸钠，根据计数结果和冻存密度计算冻存液体积，冻存液需多配制10ml用于无菌检测，将配好的冻存液放入4度冰箱预冷；
(22)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(23)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入一定体积的冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(24)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程为90分钟；
(25)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，填写完成储存位置表；
步骤(3)、HLA-G+间充质干细胞复苏
(31)准备工作：打开水浴锅，配制完全培养基；
(32)取细胞：根据所需细胞数量计算取出细胞管数，在细胞库存管理台账中记录取出时间和取出管数，并在储存位置表中相应位置进行标记；打开液氮储存罐，找到相应冻存架和冻存盒位置，取出细胞；
(33)解冻：将细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻；
(34)去冻存液：由于冻存液中的DMSO在常温下对细胞有伤害作用，因此需迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(35)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(36)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入二氧化碳培养箱中培养；传至P4~P6代，得到可用于临床治疗的HLA-G+间充质干细胞。
2.根据权利要求1的方法，其所制得的间充质干细胞中有90%以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
3.根据权利要求1的方法，其所制得的间充质干细胞中有95%以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
4.根据权利要求1的方法，其所制得的间充质干细胞中有98%以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。
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