CN110229786A - 一种间充质干细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和胫骨收集等分的骨髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在无菌条件下进行的；(2)通过Ficoll‑Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；(3)在37℃下和5％CO2的75‑cm2烧瓶中，在补充有体积分数为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改良的EAG培养基(MEM‑α)中进行培养；(4)每4‑5天更换一次含有非贴壁细胞的培养基；(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白酶消化收获贴壁细胞；在这种条件下，Sca‑1阳性细胞超过96.67％。本发明大幅提高了细胞增殖速度，为细胞提供更充足的营养，促进蛋白质的合成，可以有效地提高和增强干细胞治疗系统性红斑狼疮的疗效。

Description

一种间充质干细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生命科学的技术领域，具体地，涉及用于治疗红斑狼 疮的一种间充质干细胞的制备方法及其应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(简称SLE)是一种常见的免疫性疾病。病因尚不 明确，其特点为整个免疫系统功能紊乱，细胞凋亡异常，淋巴细胞功 能异常，其血清具有以抗核抗体为代表的多种自身抗体，造成全身多 系统器官的慢性损害。传统激素免疫抑制剂的治疗方式副作用大，病 人需终身服药。系统性红斑狼疮是一种累及多系统多器官的自身免疫 病，患者体内免疫系统功能紊乱，T、B淋巴细胞异常活化，产生多 种自身抗体和免疫复合物，导致患者皮肤、关节、肾脏等全身多个器 官及系统受到损害。SLE好发于青年女性，男女比例为1：9，在我 国成年女性中发病率为0.1％，高于西方国家的0.05％，且随着社会 经济的发展及生活压力的增加，SLE的发病率日益上升，由于该病病 程长且反复发作，给患者的心理和生理带来了极大的影响。
SLE常用的治疗方法主要是通过服用糖皮质激素或免疫抑制剂 等药物，以此来缓解因免疫系统攻击正常组织所造成的炎症反应和抑 制免疫系统的作用。虽然糖皮质激素与免疫抑制剂被用于治疗系统性 红斑狼疮使患者的预后有了明显改善，但是，SLE的治疗现状仍不容 乐观：①目前仍然有约10％的患者在发病5年内死亡；②由于疾病 的进展及一些治疗带来的副作用，如出现感染、骨髓抑制、骨质疏松、 高血压、糖尿病等，尤其是细胞毒药物及糖皮质激素的应用，SLE患 者的平均寿命明显短于正常人群；③常规的治疗方法只能减缓病情的 发展速度，非根治疾病。因此，寻找一些高效、副作用少的新治方已 迫在眉睫。
自1996年开始用自体造血干细胞(HSC)移殖治疗SLE以来，在 重症难治性SLE中取得了较好的疗效，但存在易复发的问题，而异 基因HSC移殖治疗SLE虽能使部分患者病情长期缓解，但供体来源 不足，病死率高达30％～50％，且治疗费用高。骨髓中除了HSC外 还存在一种形态上类似成纤维细胞的间充质干细胞(MSC)，MSC具有 多向分化潜能、免疫原性低与增殖速度快等特点。MSC不仅具有支 持造血的功能，还具有免疫调节及诱导免疫耐受的功能，研究表明 MSC发挥免疫调节及诱导免疫耐受的机理主要是：抑制T细胞增殖， 使产生白细胞介素4(IL-4)的细胞数减少，产生干扰素γ(IFN-γ)的细 胞数增加，调节Th1/Th2的平衡。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重 要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有干细胞的共 性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境 下，能够诱导分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上 皮等多种组织细胞。
MSC由于具有自我更新和多向分化的潜能，成为近年来研究的 热点。大量研究证实，MSC可以从骨髓中分离得到，也存在于其他 不同组织和脏器中，如脂肪组织、脐带血、脐带、胎盘等。骨髓间充 质干细胞(BMSCs)是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞(HSC)不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子(如IL-6，IL-11，LIF， M-CSF及SCF等)来支持造血。
MSC可通过多种途径调节炎症因子的释放、诱导免疫耐受、抑 制自身免疫反应从而达到长期有效地治疗SLE。但是由于单纯的骨髓 干细胞群体中MSC的含量极少，如果不通过体外的进一步扩增，很 难达到治疗效果，且SLE是一种全身性疾病，单纯的使用MSC治疗，治疗效果有限，特别是对于一些重症SLE患者来说，短期内难以达 到良好的治疗效果。
近年来，干细胞移植技术已经应用于SLE的治疗。国内外开展 骨髓来源的造血干细胞移植治疗SLE，取得了一定疗效，但存在移植 源寻找困难、费用昂贵等问题，临床难以开展。并且，自体造血干细 胞移植(HSCT，hematopoietic stem cell transplant)存在高复发率的弊病， 异体HSCT存在由于排异等原因造成死亡率较高。
因此，提供一种能够更有效地用于治疗红斑狼疮的间充质干细胞 的制备方法，对于本领域技术人员而言是非常迫切的。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种间充质干细胞的制备方法及 其应用。本发明大幅提高了细胞增殖速度，为细胞提供更充足的营养， 促进蛋白质的合成，在技术操作和分离效果上都有了较大的提高，可 以有效地提高和增强干细胞治疗系统性红斑狼疮的疗效，在生命科学 及医学领域将具有非常广阔的临床应用前景。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是一种间充质干 细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和胫骨收集等分的骨 髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在无菌条件下进行的；
(2)通过Ficoll-Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；
(3)在37℃下和5％CO2的75-cm2烧瓶中，在补充有体积分数 为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改 良的EAG培养基(MEM-α)中进行培养；
(4)每4-5天更换一次含有非贴壁细胞的培养基；
(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白酶消化收获贴壁细胞；在 这种条件下，Sca-1阳性细胞超过96.67％。
优选地，所述步骤(2)中，进行密度梯度离心法时首先将置于离 心管中的骨髓抽吸物用与所述骨髓抽吸物等体积的磷酸缓冲盐溶液 进行3遍洗涤。
在上述任一方案中优选的是，所述离心管是采用SepMateTM离 心管，安装有插件；离心是以2800-3200r/min的转速进行离心操作 30-40min。
在上述任一方案中优选的是，所述Ficoll-Paque为Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO的产品；所述链霉素为Sigma Chemical Co.的产品；进行胰蛋白酶消化时采用质量分数为0.25％胰蛋白酶 -EDTA，为Sigma Chemical Co.的产品。
在上述任一方案中优选的是，在所述步骤(2)和(3)之间好 包括分选纯化的步骤，采用CD14-和CD105+双标分选纯化。
在上述任一方案中优选的是，在所述步骤(3)中，EAG培养 基的pH值为7.2-7.4。
在上述任一方案中优选的是，在所述步骤(5)中，进行胰蛋白 酶消化的时间为3.5-4.5分钟min。
此外，本发明为解决上述技术问题所采用的另一技术方案是一 种间充质干细胞的应用，其在疾病的早期输注到染病个体中，用药 量为2剂量，每1剂量为1×106/染病个体/输注。
优选地，疾病的早期是指染病开始的8周时间。
本发明是根据多年的实际应用实践和经验所得，采用最佳的技 术手段和措施来进行组合优化，获得了最优的技术效果，并非是技 术特征的简单叠加和拼凑，因此本发明具有显著的意义。
本发明的有益效果：
1.本发明的间充质干细胞的制备方法没有诱导细胞的过早分化， 还大幅提高了细胞增殖速度，为细胞提供了更充足的营养，促进了 蛋白质的合成，促进了细胞的增殖，抑制细胞的分化；提高了分离 的速度跟效果，也降低了操作上的难度。利用本发明方法，可建立 起快速稳定的分离方法及和高效的扩增体系，在生命科学及医学领 域将具有非常广阔的临床应用前景。
2.本发明能更好的促进细胞增殖的作用，利用本发明的方法培养 的细胞，不同批次之间的差异小，成本低，利于分离细胞下游产品， 安全性好。本发明提供的间充质干细胞的制备方法无需特殊设备， 操作简单可行；大大降低了反复加液引起的污染概率，缩短了细胞 操作时间，显著提高细胞培养的成功率，从而极大地降低了同种异 体移植时免疫排斥反应的风险。
3.本发明的间充质干细胞(BMSCs)具有调节紊乱的免疫功能，减 缓或改变疾病进程，对病患效果十分明显，病人病情改善情况令人 满意，并且安全有效、无任何不良副作用。此外，本发明的间充质 干细胞(BMSCs)来源广，治疗费用较为合理。
4.本发明可以获取具有旺盛生理功能的细胞，利于组织构建。可 以提高其成活率和临床疗效。
5.本发明把密度梯度离心、贴壁培养和消化时间控制相结合，具 有操作简单，快速，实用等优点。
附图说明
图1是MRL/LPR小鼠淋巴结肿大的H&E染色图；
图2是MRL/lpr小鼠(400x)肾脏中的IgM影响染色以及MRL/lpr 小鼠肾脏中的IgM沉积图；
图3是C3、IgG、IgG1和IgG2A在Mrl/lpr小鼠肾小球中的沉 积图；
图4-5分别是MRL/LPR小鼠蛋白尿的变化图；
图6是骨髓间充质干细胞抗DS-DNA水平的变化图；
图7是间充质干细胞对脾脏T、B淋巴细胞亚群的影响图。
具体实施方式
以下结合附图以及具体实施例对本发明作进一步描述，但要求 保护的范围并不局限于此。
实施例1
一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和胫骨收集等分的骨 髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在无菌条件下进行的；
(2)通过Ficoll-Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；
(3)在37℃下和5％CO2的75-cm2烧瓶中，在补充有体积分数 为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改 良的EAG培养基(MEM-α)中进行培养；
(4)每4-5天更换一次含有非贴壁细胞的培养基；
(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白酶消化收获贴壁细胞；在 这种条件下，Sca-1阳性细胞超过96.67％。
所述步骤(2)中，进行密度梯度离心法时首先将置于离心管中的 骨髓抽吸物用与所述骨髓抽吸物等体积的磷酸缓冲盐溶液进行3遍 洗涤。
所述离心管是采用SepMateTM离心管，安装有插件；离心是以2800-3200r/min的转速进行离心操作30-40min。
所述Ficoll-Paque为Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO的产品； 所述链霉素为Sigma Chemical Co.的产品；进行胰蛋白酶消化时采用 质量分数为0.25％胰蛋白酶-EDTA，为Sigma Chemical Co.的产品。
在所述步骤(2)和(3)之间好包括分选纯化的步骤，采用CD14-和CD105+双标分选纯化。
在所述步骤(3)中，EAG培养基的pH值为7.2-7.4。
在所述步骤(5)中，进行胰蛋白酶消化的时间为3.5-4.5分钟 min。
一种间充质干细胞的应用，其在疾病的早期输注到染病个体中， 用药量为2剂量，每1剂量为1×106/染病个体/输注。
疾病的早期是指染病开始的8周时间。
实施例2
一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和胫骨收集等分的骨 髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在无菌条件下进行的；将骨 髓(BM)抽吸物在900g-1200离心10-15分钟以沉淀细胞物质；
(2)通过Ficoll-Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；收集 残留在顶部的骨髓上清液，冷冻并在(-25℃)～(-30℃)下储存以 供进一步使用。
(3)在37℃下和5％CO2的75-cm2烧瓶中，在补充有体积分数 为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改 良的EAG培养基(MEM-α)中进行培养；
(4)每4-5天更换一次含有非贴壁细胞的培养基；
(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白酶消化收获贴壁细胞；在 这种条件下，Sca-1阳性细胞超过96.67％。
所述步骤(2)中，进行密度梯度离心法时首先将置于离心管中的 骨髓抽吸物用与所述骨髓抽吸物等体积的磷酸缓冲盐溶液进行3遍 洗涤。
所述密度梯度离心法中的离心管是采用SepMateTM离心管，安 装有插件；离心是以2800-3200r/min的转速进行离心操作30-40min。
所述Ficoll-Paque为Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO的产品； 所述链霉素为Sigma Chemical Co.的产品；进行胰蛋白酶消化时采用 质量分数为0.25％胰蛋白酶-EDTA，为Sigma Chemical Co.的产品。
在所述步骤(2)和(3)之间好包括分选纯化的步骤，采用CD14-和CD105+双标分选纯化。
在所述步骤(3)中，EAG培养基的pH值为7.2-7.4。
在所述步骤(5)中，进行胰蛋白酶消化的时间为3.5-4.5分钟 min。
一种间充质干细胞的应用，其在疾病的早期输注到染病个体中， 用药量为2剂量，每1剂量为1×106/染病个体/输注。
疾病的早期是指染病开始的8周时间。
试验例
1.试验对象：雌性MRL/MpJ-lpr/lpr(MRL/lpr)和MRL/MPJ-+/+ (MRL/MPJ)小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。绿 色荧光蛋白(GFP+)ICR小鼠由Z/EG报告小鼠24与β-actin/Cre小 鼠25之间的杂交产生。
2.通过尾静脉输注MSCs
每剂GFP+MSC含有1×106个细胞。将MSC悬浮于0.2ml的 磷酸缓冲盐溶液中，并使用29号针头通过MRL/lpr，MRL/MPJ小 鼠的尾静脉输注。将MRL/lpr小鼠分成两组，早期治疗8周龄组(8wk) 和晚期治疗11周龄组(11wk)。在这两组中的每一组中，将小鼠进 一步分成四个亚组，它们以每两周一次的间隔接受一剂(8wk1x； 11wk1x)，两剂(8wk2x；11wk2x)或三剂(8wk3x；11wk3x)注射 MSC。磷酸缓冲盐溶液注射以2周的间隔给予3次，并且这些用作 阴性对照(8wk3磷酸缓冲盐溶液；11wk3磷酸缓冲盐溶液)。除了这 些亚组，在最初的实验中发现了更高剂量组的更高死亡率之后，招 募了另外6个8周龄小鼠的亚组。另外的组接受1,2,3,4或5个剂量 的MSC(8wk1x，8wk2x，8wk3x，8wk4x，8wk5x)或5个剂量的 磷酸缓冲盐溶液作为阴性对照(8wk5磷酸缓冲盐溶液)。每个小鼠 亚组由最少6只小鼠组成。招募总共125只小鼠用于该研究。
3.归巢MSCs
每天通过体内成像系统Xenogen't IVIS 100系列(Caliper Life Sciences，Inc，Xenogen，Hopkinton，MA，USA)扫描注射1×106个MSC的小鼠。在MSCs输注后两周，处死小鼠并收获其肝，肺， 脾，肾和皮肤，并在具有干冰的容器内在2-甲基丁烷中快速冷冻。 用荧光显微镜处理5微米低温恒温切片用于检测GFP+MSC。收获 骨髓并使用氯化铵-钾(ACK)缓冲液除去红细胞。用Cytopro 7620 (Wescor，Inc，Utah，USA)将1×105个细胞离心至载玻片，然后 用荧光显微镜检测GFP+细胞。
4.临床评估
脱发和皮肤溃疡在MRL/lpr小鼠中是肉眼可检测的SLE样表现， 通过评分方案评估该研究中的脱发程度。得分以0至6的等级给出 如下：
0，没有明显的毛发或皮肤变化；
1，面部脱发但不能延伸到眼睛以外；
2，脸部脱发延伸到眉毛；
3，整个面部脱发延伸至前背部分但无皮肤溃疡或出血；
4，整个面部和部分背部脱落，皮肤溃烂或出血；
5，整个面部，背部的一部分和一只耳朵的耳廓脱发；
6，整个面部，背部的一部分和双耳的耳廓脱发。
使用市售试剂盒(Multistix，Bayer Diagnostic，South Wales，UK)评估蛋白尿。评分按照如下所示的预设比例(单位为mg/dL)：
0(负)，
10(跟踪)，
30(+)，
100(++)，
300(+++)和
>2000(++++)。
还用Chemstrip同时评估了血尿。分级根据量表(单位为细胞/ μl)：
0(阴性)，
10(痕量)，
25(小，非血细胞)，
80(中等，非血细胞)，
25(小，血细胞)，
80(中等血细胞)，
200(大，血细胞)。
收集小鼠的尿液，并在最后一次输注MSC后每两周评估一次。
5.病理评估
在实验结束时，定义为死亡或当它们达到第24天(如果在8周 时给予MSCs)或第25周(如果在11周时给予MSC)时，将小鼠 处死并且其器官包括皮肤，肾脏收获脾脏，淋巴结，肝脏，心脏和 肺部。对于组织学检查，将组织固定在4％缓冲福尔马林中，然后包 埋在石蜡中，其中5微米切片用苏木精和曙红(H&E)或高碘酸- 希夫(PAS)染色。肾脏病理学的程度如肾小球肾炎，如前所述，根 据0至4的等级对肾小球硬化和间质性肾炎进行分级。根据先前报 道27：0的模式，将动脉炎的程度按以下等级分级：
无；
1(+)，局灶性内膜受累，仅为非坏死性动脉炎；
2(++)，弥漫性内膜动脉炎或局灶性透壁动脉炎和/或坏死性动 脉炎，累及<20％的动脉；
3(+++)，透壁和/或坏死性动脉炎，涉及20％至50％的动脉；
4(++++)，透壁和/或坏死性动脉炎，涉及>50％的动脉。
对于免疫荧光(IF)显微术，将组织在含有干冰的容器中在2- 甲基丁烷中冷冻。处理5微米低温恒温器部分用于直接IF。将切片 固定在丙酮中并用针对小鼠C3，IgG，IgG1，IgG2a，IgM(Dako， Carpinteria，CA)的FITC缀合的抗体染色，在本研究中将其稀释至 1:50。从先前的报告28中以不知情的方式评估染色强度和从0到8 的分布的半定量评分。总评分是强度的分数乘以分布的分数。将正 常MRL/MPJ小鼠的肾切片用作阴性对照，并将来自6个月大的未治 疗的MRL/lpr小鼠的肾切片用作阳性对照。荧光强度评估如下：当FITC-缀合的抗体处于1:50稀释时，得分为1(+)；稀释1：200，得 分为2(++)；1：400稀释，得分为3(+++)；稀释度为1：500，得 分为4(++++)。关于分布评分，如果仅包括肾小球或肾小管，则评 分为1，如果两者都包括在内，则评分为2。
6.检测抗dsDNA反应
每2周对小鼠放血，每次收获200μl血液。使用商业ELISA试 剂盒(AlphaDiagnostic International Co.，Texas，USA)测试血清的 系列稀释液的抗dsDNA(IgG)。
7.脾脏淋巴细胞亚群的分析
对所有小鼠的体重，淋巴结，肝脏和脾脏进行加权。对于淋巴 细胞表型分析，从受体小鼠制备脾细胞，计数总细胞，然后用 FITC-CD4，PE-CD3，PE-cy5-CD8或PE-cy5-CD19(BDPharMingen) 染色500万个脾细胞。)。用流式细胞仪(Becton Dicknson，San Jose， CA，USA)分析用特异性抗体染色的细胞。
8.统计
统计分析由SPSS使用学生t检验进行，p值<0.05被认为是显 着阈值。通过Kaplan-Meier方法分析小鼠的存活率。
9.结果
(1)归巢MSCs
为了研究通过尾静脉全身给药后MSC的分布以及它们是否可 以到达靶组织并存活，使用Xenogen't IVIS 100系列扫描受体裸鼠(n ＝8)。可以发现GFP+细胞全身性迁移，但在注射后两周肺部更丰富。 使用荧光显微镜，在输注后2,4和6周，还可以在MRL/lpr小鼠的 脾，肾，肺，皮肤，肝和骨髓中发现GFP+MSC。有趣的是，在输 注后4周，在野生型正常MRL/MPJ+/+小鼠的这些器官中未发现GFP +MSC(数据未显示)。这些发现表明虽然MSCs可以通过尾静脉成 功地全身给药，但炎症趋化因子对靶向器官归巢至关重要。
(2)接受高剂量MSC的小鼠的存活期较短
在疾病早期(8周)或大多数小鼠已经发展出更明确的疾病表型 (11周)时用不同剂量的MSCs处理MRL/lpr小鼠。令人惊讶的是， 小鼠接受更高剂量的MSC(8wk3x；8wk4x，8wk5x和11wk3x)具有 明显比磷酸缓冲盐溶液对照更短的存活率。在24-24周的实验结束时，8wk3x亚组的存活率为91.67％，8wk4x为62.5％，8wk5x为50％， 11wk3x亚组为66.67％。相反，在用较低剂量的MSC和磷酸缓冲盐 溶液对照治疗的所有其他实验亚组中没有过早死亡，它们具有100％ 存活率。淋巴组织增生组织的组织学检查未显示提示移植后淋巴组 织增生性疾病或淋巴恶性肿瘤的任何特征(图2)。
(3)如果在疾病的早期阶段给予中等剂量的MSC，MRL/lpr 小鼠的脱发可以受益
MRL/lpr小鼠中狼疮最明显的表现是脱发。我们发现，当用两 剂MSCs治疗小鼠并且在疾病的早期阶段(8wk2x)给予时，有效地 抑制了脱发现象。然而，由于未知原因，MRL/lpr小鼠接受3个早 期剂量的MSC(8wk3x)具有严重的脱发并且没有从治疗中受益(图 2)。对于从11周开始接受MSC的小鼠组，任何剂量的MSC都不能 抑制脱发现象。当将MSC注入正常MRL/MPJ+/+小鼠时未观察到表 型变化(数据未显示)。
(4)如果在疾病的早期阶段给予中等剂量的MSC，MRL/lpr 小鼠的肾损伤也可以受益
所有存活的小鼠在出生后第24-25周处死。数据显示在表1中。 虽然在肾小球肾炎中8w2x亚组与磷酸缓冲盐溶液对照之间没有统 计学差异，但肾小球硬化，动脉炎和间质性肾炎严重程度的客观评 分均显示出下降趋势，并且与磷酸缓冲盐溶液控制相比，差异具有统计学意义。对于8wk1x和8wk3x的亚组，没有发现统计学上的显 着差异。在从11周开始接受MSC的小鼠中，无论任何剂量如何， MSC在疾病控制中都没有显示出任何益处。
表1
表1中，在早期(8周龄)或晚期(11周龄)用不同剂量的MSC 或PBS治疗的小鼠，通过组织学指数分类的肾病程度和严重程度的 半定量评分(0至4)。数据表示为平均值±SD.*与PBS对照相比， p<0.05。缩写：PBS8wk，8wk1x，8wk2x，8wk3x，代表分别用PBS， 1,2或3个剂量的MSC处理的8周龄MRL/lpr小鼠；PBS11wk，11wk1x， 11wk2x，11wk3x，PBS11wk代表分别用1,2或3次注射PBS或MSC 处理的11周龄MRL/lpr小鼠。
免疫荧光染色的结果表明，在中间剂量早期治疗(8wk2x)的亚 组中，IgM抗体的沉积只局灶局限于肾小球，而其它两个早期治疗 亚组，8wk1x和8wk3x，与磷酸缓冲盐溶液对照，IgM抗体一起在 肾小球和肾小管中均可发现弥漫性沉积(图3)。两剂MSCs显着改 善了疾病的严重程度(图2)。但早期治疗亚组中IgG，IgG1，IgG2a 和C3的沉积没有显着差异(图3)。对于晚期治疗组，与磷酸缓冲 盐溶液对照相比，MSC在任何细胞剂量中均未诱导有益效果。
(5)中等剂量的MSC可以降低蛋白尿水平
蛋白尿是肾小球肾炎的一种表现，它是SLE死亡的主要原因。 没有干预，MRL/lpr小鼠随着年龄的增长而发展为自发性和进行性 蛋白尿。在我们的研究中，我们发现中间剂量(2x)的MSCs可以 显着降低蛋白尿水平(图4-5)，尽管早期治疗(8wk2x)和晚期治 疗(11wk2x)亚组之间的改善程度存在显着差异。早期治疗显示更 好的结果。另一方面，无论是早期(8周)还是晚期(11周)，1或 3剂量的MSCs都不能减少蛋白尿的进展，此外，用4或5剂MSCs 治疗的小鼠与磷酸缓冲盐溶液对照相比，出现明显的血尿(图4-5)。
(6)如果在疾病的早期阶段给予MSC，则降低了抗dsDNA的 水平
比较用MSC或磷酸缓冲盐溶液对照处理的小鼠的血清抗 dsDNA水平，发现当在疾病的早期阶段(8wk)施用时，MSC可以 有效地降低抗dsDNA的水平(图6的A)。然而，如果在疾病的晚 期(11周)给予MSC，则未观察到抗dsDNA水平的显着降低。此 外，在晚期(11wk3x)给予高剂量的MSC反常诱导更多的抗dsDNA 而不是抑制它(图6的B)。
(7)通过两剂MSCs抑制MRL/lpr小鼠的淋巴结、肝和脾的 扩大
所有小鼠的体重均无明显差异。然而，2剂MSCs显着抑制了淋 巴结，肝脏和脾脏的重量(图7的A)。8wk2x亚组中MRL/lpr小 鼠的脾脏明显小于其他亚组的脾脏(图7的C)。8wk2x亚组的总脾 细胞数远低于磷酸缓冲盐溶液对照组和其他亚组(图7的B)。
(8)最佳剂量的MSCs抑制脾脏CD3+CD4-CD8-T-和CD19+B- 淋巴细胞
在SLE中，T淋巴细胞和B淋巴细胞都具有异常功能，因此是 免疫抑制治疗的靶标。由于MSCs可以抑制T淋巴细胞和B淋巴细 胞，检查了模型中观察到的体内效应是否与这种现象有关。通过研 究脾淋巴细胞亚群，发现在早期治疗组(8wk)中，2个剂量的MSCs 抑制CD3+CD4-CD8-T细胞，而CD3+CD4+T细胞增加。当用3 个剂量的MSC处理时，CD4+CD8+T细胞增加而CD3+CD4-CD8-T， CD3+CD4+T细胞减少。更高剂量(4或5剂量)的MSC抑制CD3 +CD4-CD8-T，CD3+CD4+T细胞，但CD3+CD8+和CD3+CD4+ CD8+T高于磷酸缓冲盐溶液对照。CD19+B细胞被1,2或3个剂 量的MSC显着抑制，但当用4或5个剂量的MSC处理时，CD19+B 不再下调(图7的D)。对于晚期治疗组11wk，CD4+-，CD8+-和 CD4+CD8+-T和CD19+B细胞均被MSCs显着抑制，给予一次或 两次MSC(11wk1x和11wk2x)。然而，三次注射MSC未能对这些 淋巴细胞显示出任何显着的抑制作用，甚至还注意到一些明显的增 殖作用。
10.结论
MSCs具有多种分化能力和广谱免疫抑制能力。通过从供体骨髓 中获取而无需事先动员或操作以及相对简单和稳定的离体扩增过程， 易于获得，使其成为临床应用的合适候选者。以前的研究表明，MSCs 具有抑制正在进行的体外或体内免疫反应的能力。发现非MHC匹配 的同种异体MSCs可以对MRL/lpr小鼠发挥体内免疫抑制作用，这 是一种众所周知的系统性红斑狼疮动物模型。
在本试验例中，仅研究了MSCs的作用，并研究了低，中，高 剂量MSCs的作用。发现只有最佳剂量的MSCs(两次输注1x106个 MSCs，总共约2x106或6x107/Kg)可以有效降低MRL/lpr小鼠SLE 表现的严重程度，同时降低MSCs的剂量(一次输注尽管注意到替 代标志物的一些改善，但MSC，1×106个MSC，总共约3×107/Kg) 没有发挥明显的表型保护作用。矛盾的是，发现更高剂量的MSCs (三次，四次或五次输注MSCs，总共约3x106,4x106,5x106或9x107/Kg，12x107/Kg，15x107/Kg)甚至对小鼠有害。额外剂量的MSCs 在MRL/lpr小鼠中诱导显着的淋巴样增殖并导致早期死亡。淋巴组 织的组织学未显示移植后淋巴组织增生性疾病或淋巴恶性肿瘤的特 征。这些小鼠比未处理的对照死亡得更快，并且具有较低MSC细胞 剂量的小鼠，无论治疗是在疾病的早期(8周)或晚期(11周)阶 段开始的。在临床应用中，MSC剂量范围从1x106/Kg到1x109/Kg 已被用于患有难治性GVHD的人类受试者。
两剂量的MSCs能够抑制致病性CD3+CD4-CD8-T-和CD19+B- 淋巴细胞，无论它们是在早期还是晚期都给予。没有注意到剂量依 赖性反应模式。较高的细胞剂量和晚期治疗组与较高程度的抑制无 关。由于仍然未知的原因，与磷酸缓冲盐溶液对照相比，较高剂量 的MSC诱导CD8+T-，CD3+CD4+CD8+T-和CD19+B-淋巴细胞的 逆转反应模式，无论早期或晚期给予MSC。
高剂量(≥3x)MSCs未能诱导免疫抑制的机制仍有待探索。在 MRL/lpr小鼠模型中，9x107/Kg可能太多。狼疮中的T细胞和B细 胞是自身反应性的，当它们被MSC最佳抑制时，它可能对小鼠有益。 在本试验例中，CD19+B细胞未被高剂量的MSCs抑制，特别是在 晚期治疗组(11wk)。我们还注意到高剂量晚期治疗组(3x11周) 血清中的抗dsDNA水平高于磷酸缓冲盐溶液对照或其他亚组，这可 能是由扩增和分化的活性B细胞引起的。
在本试验例中，发现MSNC的中间剂量(2x)在MRL/lpr小鼠 中应用于不同疾病阶段时会产生不同的效果。由于MRL/lpr小鼠通 常在出生后6至8周开始出现轻微的蛋白尿或皮肤改变，我们将其 定义为早期阶段。虽然在11周内，几乎已经有了SLE的全面临床特 征，因此我们将其定义为晚期。似乎如果在疾病的早期阶段施用MSC， 它们起到有效抑制剂的作用。然而，当疾病完全成熟时，MSCs的这 种免疫调节作用不能转化为显着的表型改善。显示在疾病过程中早 期(8周)给予中间剂量(2x)的MSCs在几乎所有参数中产生最一 致的表型改善。因此，同种异体MSCs系统地主要发挥免疫抑制功 能，并且很少(如果有的话)通过分化参与组织修复。
总之，如果在正确的时间以正确的剂量给予同种异体MSC，则 它可以对具有SLE表现的小鼠诱导显着的体内有益反应。正确操纵 MSCs的这些免疫抑制特性将提供一种新的基于细胞的治疗设备，用 于控制各种难治性自身免疫疾病。结果表明，MSCs的免疫调节特性 是复杂的并且具有潜在的并发症。体内模型证明，MSCs对免疫系统 的双重作用表明，必须谨慎设计和监测基于MSC的最佳细胞剂量和 时间表。
由上述内容可知，本发明的间充质干细胞的制备方法没有诱导 细胞的过早分化，还大幅提高了细胞增殖速度，为细胞提供了更充 足的营养，促进了蛋白质的合成，促进了细胞的增殖，抑制细胞的 分化；提高了分离的速度跟效果，也降低了操作上的难度。利用本发明方法，可建立起快速稳定的分离方法及和高效的扩增体系，在 生命科学及医学领域将具有非常广阔的临床应用前景。
本发明能更好的促进细胞增殖的作用，利用本发明的方法培养 的细胞，不同批次之间的差异小，成本低，利于分离细胞下游产品， 安全性好。本发明提供的间充质干细胞的制备方法无需特殊设备， 操作简单可行；大大降低了反复加液引起的污染概率，缩短了细胞 操作时间，显著提高细胞培养的成功率，从而极大地降低了同种异 体移植时免疫排斥反应的风险。
本发明的间充质干细胞(BMSCs)具有调节紊乱的免疫功能，减 缓或改变疾病进程，对病患效果十分明显，病人病情改善情况令人 满意，并且安全有效、无任何不良副作用。此外，本发明的间充质 干细胞(BMSCs)来源广，治疗费用较为合理。
本发明可以获取具有旺盛生理功能的细胞，利于组织构建。可 以提高其成活率和临床疗效。
本发明把密度梯度离心、贴壁培养和消化时间控制相结合，具 有操作简单，快速，实用等优点。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形 式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容 加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技 术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修 改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和胫骨收集等分的骨髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在无菌条件下进行的；
(2)通过Ficoll-Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；
(3)在37℃下和5％CO2的75-cm2烧瓶中，在补充有体积分数为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改良的EAG培养基(MEM-α)中进行培养；
(4)每4-5天更换一次含有非贴壁细胞的培养基；
(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白酶消化收获贴壁细胞；在这种条件下，Sca-1阳性细胞超过96.67％。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，进行密度梯度离心法时首先将置于离心管中的骨髓抽吸物用与所述骨髓抽吸物等体积的磷酸缓冲盐溶液进行3遍洗涤。
3.根据权利要求2所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述离心管是采用SepMateTM离心管，安装有插件；离心是以2800-3200r/min的转速进行离心操作30-40min。
4.根据权利要求1-3所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述Ficoll-Paque为Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO的产品；所述链霉素为Sigma Chemical Co.的产品；进行胰蛋白酶消化时采用质量分数为0.25％胰蛋白酶-EDTA，为Sigma Chemical Co.的产品。
5.根据权利要求1-4所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)和(3)之间好包括分选纯化的步骤，采用CD14-和CD105+双标分选纯化。
6.根据权利要求5所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，EAG培养基的pH值为7.2-7.4。
7.根据权利要求1-6所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，进行胰蛋白酶消化的时间为3.5-4.5分钟min。
8.一种间充质干细胞的应用，其特征在于，所述间充质干细胞根据权利要求1-7的方法制备，所述间充质干细胞在疾病的早期输注到染病个体中，用药量为2剂量，每1剂量为1×106/染病个体/输注。
9.根据权利要求8所述的间充质干细胞的应用，其特征在于，疾病的早期是指染病开始的8周时间。
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