CN107467014A - 一种脐带组织冻存、复苏的方法 - Google Patents

一种脐带组织冻存、复苏的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脐带组织冻存、复苏的方法，采用细胞团块而非单个细胞进行冻存，可以降低细胞受损凋亡的概率、提高存活率；通过添加细胞粘附分子，可以促进细胞之间相互粘合，从而进一步减少单个细胞、提高细胞的存活率；为保证冷冻保护液和复苏保存液可以充分渗透到细胞间隙中，事先对其进行超声处理，以便将液体分散成小液滴、提高其渗透性；细胞活性抑制剂可以对细胞内的一些生理活动进行可逆的抑制，在不影响细胞活性的前提下提高冻存效果。通过上述手段，可以降低冷冻过程和复苏过程对细胞造成的物理性和化学性的伤害，从而提高细胞存活率和冻存的复苏率，以便后续使用。

Description

一种脐带组织冻存、复苏的方法
技术领域
本发明属于人体组织冻存复苏技术领域，特别涉及一种脐带组织冻存、复苏的方法。
背景技术
脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构。脐带血中含有丰富的间充质干细胞，间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称为“万用细胞”，适用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的种子细胞。因此，对间充质干细胞进行存储，可以提供重要的医学材料。传统的程序化冻存由于容易使液体产生结晶，往往会对细胞造成机械性损伤；新式的玻璃化冻存可以完全避免结晶问题，从而大大提高冻存细胞的复苏率。但是，玻璃化冻需要使用具有细胞毒性的二甲基亚砜，容易对细胞造成化学性伤害
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种脐带组织冻存、复苏的方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明一方面提供了一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括如下步骤：
S1：用生理盐水对新鲜脐带进行清洗，并剪碎成小块，贴壁培养36h～48h，并对得到的细胞进行传代培养6～8d；
将细胞克隆成细胞团后再进行保存，可显著降低单个细胞受损凋亡的概率，从而显著提高细胞的存活率和复苏的成功率；
S2：将步骤S1得到的传代细胞置于DMEM培养基中，于2～5℃下加入预先经超声处理过的冻存保护液，低速离心并轻轻振荡混匀，所述冻存保护液中添加有至少一种细胞粘附分子以及至少一种细胞活性抑制剂；
由于团块结构会显著影响单个细胞与冻存保护液的接触，因此首先通过超声处理、使冻存保护液内部分散成小液滴，从而提高冷冻保护液在细胞团块内的渗透性；
细胞粘附分子是使相邻细胞表面发生作用、从而相互粘附的跨膜蛋白，可以使单个细胞进一步粘合成团块、以防止散失；通过低速离心，促进细胞粘附分子与细胞接触、从而提高细胞相互粘附的概率；离心后需要轻轻振荡混匀，以便冻存保护液与细胞充分接触；
细胞活性抑制剂可以对细胞内的一些生理活动进行可逆的抑制，在不影响细胞活性的前提下提高冻存效果；
S3：将步骤S2得到的细胞混合液置于液氮中，降温至-196℃下保存；
S4：将冻存的细胞取出，立即转移至37℃水浴箱中放置1～2min，取出后用PBS缓冲液洗涤2～4次，离心、弃去洗涤液；
S5：向步骤S4得到细胞中加入预先经超声处理过的复苏保存液，轻轻振荡混匀，得到细胞悬液，所述复苏保存液中添加有至少一种细胞粘附解除分子以及至少一种细胞活性激活剂；
通过超声处理，使复苏保存液内部分散成小液滴，从而提高复苏保存液在细胞团快内的渗透性；
细胞粘合解除分子，可以解除细胞间的相互粘合，有助于细胞相互分离，以便后续的使用；
细胞活性激活剂，可以解除细胞生理活性受到的抑制，从而恢复细胞活性、提高复苏率。
进一步地，所述步骤S1包括如下步骤：
S1.1：取新鲜脐带，用生理盐水清洗干净，采集华通氏胶并剪成1～2mm的碎块，平铺至细胞培养瓶中，加入5mL原代培养基，置于5％CO2、37℃的培养箱中进行培养，每3～4d更换一次培养基，所述原代培养基为添加有体积分数8～12％的胎牛血清以及100mg/L链霉素的DMEM培养液；
S1.2：当细胞融合度达到80～90％时，收集贴壁细胞，消化后加入5mL传代培养基，置于5％CO2、37℃的培养箱中进行培养，培养至细胞融合度达到80～90％时为止，所述传代培养基为添加有体积分数12～15％的胎牛血清以及2～5mg/L的柑浓素的DMEM培养基。
柑浓素是从柑橘皮中提取的一种天然混合物，具有极强的抗菌的作用，能抑制细菌等的生长增殖，并且无毒副作用、不会对细胞的生长造成影响，也不会使病原微生物产生抗药性。
进一步地，所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：配置冻存保护液，并在2～10℃、40～100Hz条件下超声振荡5～10min；
S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于8～10％的DMEM培养基中浸泡，超声结束后立即将所述冻存保护液按8～10％的浓度加入所述传代细胞中；
由于超声处理只是暂时改变了液体的物理形态，因此在超声结束后应立即将冻存保护液加入细胞中，以保证冻存保护液的渗透性；
S2.3：将上述混合体系在1000～1500rpm/min条件下离心5min，离心结束后轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞混合液。
进一步地，所述冻存保护液中包含如下重量份数的成分：10～12份渗透性冷冻保护剂、6～8份非渗透性冷冻保护剂、0.05～0.1份细胞活性抑制剂以及0.1～0.2份细胞粘附分子；
所述渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:2:1～3的二甲基亚砜、甘油以及聚乙二醇；
所述非渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:1～2的海藻糖以及聚蔗糖；
二甲基亚砜是最常用的冷冻保护剂，效果优异但毒性较大，因此本发明中采用上述组合，以便减少二甲基亚砜的用量、降低细胞毒性，同时不影响冷冻保护剂的效果；
所述细胞活性抑制剂包括细胞松弛素D、诺考达唑、衣霉素、几夫碱、布雷非德菌素A、CP-10447以及奥曲肽中的至少一种；
所述细胞粘附分子包括E-选择素、P-钙黏素、ICAM-1、肽F9以及RGD肽中的至少一种。
进一步地，所述细胞活性抑制剂包括重量份数比为1:1:1的细胞松弛素D、衣霉素以及奥曲肽。
细胞松弛素D可引起G1-S转化过程中的细胞周期阻滞，衣霉素可诱导内质网应激、抑制N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶、引起G1期阻滞，奥曲肽是一种生长激素抑制素的类似物，可抑制一些内源性肽的分泌；上述细胞活性抑制剂可以有效抑制细胞的生理活动，并且不会影响细胞的活性。
进一步地，所述细胞粘附分子包括重量份数比为1:1的E-选择素和ICAM-1。
E-选择素是结合糖部分的单链跨膜糖蛋白，ICAM-1是依赖钙离子行使功能的1型跨膜蛋白，两者联合使用可以有效促进细胞之间的相互粘附，同时不会对细胞的生理活性造成影响。
进一步地，所述步骤S5包括如下步骤：
S5.1：配置复苏保存液，并在2～10℃、40～100Hz条件下超声振荡5～10min；
S5.2：超声结束后，立即将所述复苏保存液按8～10％的浓度加入步骤S4得到的细胞中，轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞悬液。
由于超声处理只是暂时改变了液体的物理形态，因此在超声结束后应立即将复苏保存液加入细胞中，以保证复苏保存液的渗透性；并且加入复苏保存液后还需进行振荡，以便使复苏保存液进一步渗透到细胞之间。
进一步地，所述复苏保存液包括如下重量份数的成分：
15～20份植物源重组人血清白蛋白、0.5～2份γ-球蛋白、0.8～1份氯化钠、0.8～1.2份糖类、0.05～0.1份细胞活性激活剂以及0.1～0.2份细胞粘附解除分子。
目前常规的细胞保存液主要使用胎牛血清或人血清白蛋白，细胞珍贵程度越高、对营养的要求就越高，上述成分的用量也越高；植物源重组人血清白蛋白基于植物生产制造，能够提供与血清相当的营养成分，可以替代胎牛血清，从而可降低成本；为保证细胞获得充足的营养，保存液中还添加γ-球蛋白、糖分和盐分，以便提供近似于人体内环境的营养全面、渗透压适中的环境，以利于细胞的存活。
进一步地，所述细胞活性激活剂包括重量份数比为1:1:1的紫杉醇、牛磺脱氧胆碱以及分泌素；所述细胞粘附解除分子为A-205804。
紫杉醇可促进微管组装并抑制微管蛋白分解，牛磺脱氧胆碱可抑制内质网应激、使脂质和膜结合蛋白增溶，分泌素可引起剂量依赖性的cAMP积累，上述细胞活性激活剂可以有效解除细胞生理活动收到的抑制，从而使细胞恢复活性；A-205804可以特异性地抑制E-选择素和ICAM-1表达、从而解除细胞间的相互粘附。
本发明另一方面提供了上述方法在脐带组织冻存、复苏中的应用。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种脐带组织冻存、复苏的方法，采用细胞团块而非单个细胞进行冻存，可以降低细胞受损凋亡的概率、提高存活率；通过添加细胞粘附分子，可以促进细胞之间相互粘合，从而进一步减少单个细胞、提高细胞的存活率；为保证冷冻保护液和复苏保存液可以充分渗透到细胞间隙中，事先对其进行超声处理，以便将液体分散成小液滴、提高其渗透性；细胞活性抑制剂可以对细胞内的一些生理活动进行可逆的抑制，在不影响细胞活性的前提下提高冻存效果。通过上述手段，可以降低冷冻过程和复苏过程对细胞造成的物理性和化学性的伤害，从而提高细胞存活率和冻存的复苏率，以便后续使用。
具体实施方式
主要试剂及培养基的配制
A.DMEM培养基：具体成分如下：
B.PBS缓冲液：
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌(至少20分钟)，保存于室温或4℃冰箱中。
C.生理盐水：
称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。需要说明的是，以下实施例中所述的DMEM培养基采用上述A中所述配方，“还添加”是指在A中所述的DMEM培养基的基础上进行添加。以下实施例中所述的DEME培养基、PBS缓冲液以及生理盐水均采用上述配方。
实施例1
一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括如下步骤：
S1：用生理盐水对新鲜脐带进行清洗，并剪碎成小块，贴壁培养36h，并对得到的细胞进行传代培养6d；
S2：将步骤S1得到的传代细胞置于DMEM培养基中，于2℃下加入预先经超声处理过的冻存保护液，低速离心并轻轻振荡混匀，所述冻存保护液中添加有至少一种细胞粘附分子以及至少一种细胞活性抑制剂；
S3：将步骤S2得到的细胞混合液置于液氮中，降温至-196℃下保存；
S4：将冻存的细胞取出，立即转移至37℃水浴箱中放置1min，取出后用PBS缓冲液洗涤2次，离心、弃去洗涤液；
S5：向步骤S4得到细胞中加入预先经超声处理过的复苏保存液，轻轻振荡混匀，得到细胞悬液，所述复苏保存液中添加有至少一种细胞粘附解除分子以及至少一种细胞活性激活剂。
实施例2
一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括如下步骤：
S1：用生理盐水对新鲜脐带进行清洗，并剪碎成小块，贴壁培养48h，并对得到的细胞进行传代培养8d；
S2：将步骤S1得到的传代细胞置于DMEM培养基中，于5℃下加入预先经超声处理过的冻存保护液，低速离心并轻轻振荡混匀，所述冻存保护液中添加有至少一种细胞粘附分子以及至少一种细胞活性抑制剂；
S3：将步骤S2得到的细胞混合液置于液氮中，降温至-196℃下保存；
S4：将冻存的细胞取出，立即转移至37℃水浴箱中放置2min，取出后用PBS缓冲液洗涤4次，离心、弃去洗涤液；
S5：向步骤S4得到细胞中加入预先经超声处理过的复苏保存液，轻轻振荡混匀，得到细胞悬液，所述复苏保存液中添加有至少一种细胞粘附解除分子以及至少一种细胞活性激活剂。
实施例3
一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括实施例1所述各步骤，其中步骤S1的具体方法如下：
S1.1：取新鲜脐带，用生理盐水清洗干净，采集华通氏胶并剪成1～2mm的碎块，平铺至细胞培养瓶中，加入5mL原代培养基，置于5％CO2、37℃的培养箱中进行培养，每3～4d更换一次培养基，所述原代培养基为添加有体积分数8％的胎牛血清以及100mg/L链霉素的DMEM培养液；
S1.2：当细胞融合度达到80～90％时，收集贴壁细胞，消化后加入5mL传代培养基，置于5％CO2、37℃的培养箱中进行培养，培养至细胞融合度达到80～90％时为止，所述传代培养基为添加有体积分数12％的胎牛血清以及2～5mg/L的柑浓素的DMEM培养基。
实施例4
一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括实施例2所述各步骤，其中步骤S1的具体方法如下：
S1.1：取新鲜脐带，用生理盐水清洗干净，采集华通氏胶并剪成1～2mm的碎块，平铺至细胞培养瓶中，加入5mL原代培养基，置于5％CO2、37℃的培养箱中进行培养，每3～4d更换一次培养基，所述原代培养基为添加有体积分数12％的胎牛血清以及100mg/L链霉素的DMEM培养液；
S1.2：当细胞融合度达到80～90％时，收集贴壁细胞，消化后加入5mL传代培养基，置于5％CO2、37℃的培养箱中进行培养，培养至细胞融合度达到80～90％时为止，所述传代培养基为添加有体积分数15％的胎牛血清以及2～5mg/L的柑浓素的DMEM培养基。
实施例5
一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括实施例3所述各步骤，所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：配置冻存保护液，并在2℃、100Hz条件下超声振荡5min；
S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于8％的DMEM培养基中浸泡，超声结束后立即将冻存保护液按8％的浓度加入所述传代细胞中；
S2.3：将上述混合体系在1000rpm/min条件下离心5min，离心结束后轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞混合液。
冻存保护液中包含如下重量份数的成分：12份渗透性冷冻保护剂、6份非渗透性冷冻保护剂、0.05份细胞活性抑制剂以及0.2份细胞粘附分子；
渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:2:3的二甲基亚砜、甘油以及聚乙二醇；
非渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:2的海藻糖以及聚蔗糖；
细胞活性抑制剂包括重量份数比为1:1:1的细胞松弛素D、衣霉素以及奥曲肽；
细胞粘附分子包括重量份数比为1:1的E-选择素和ICAM-1。
实施例6
一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括实施例4所述各步骤，所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：配置冻存保护液，并在10℃、40Hz条件下超声振荡10min；
S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于10％的DMEM培养基中浸泡，超声结束后立即将所述冻存保护液按10％的浓度加入所述传代细胞中；
S2.3：将上述混合体系在1500rpm/min条件下离心5min，离心结束后轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞混合液。
冻存保护液中包含如下重量份数的成分：10份渗透性冷冻保护剂、8份非渗透性冷冻保护剂、0.1份细胞活性抑制剂以及0.1份细胞粘附分子；
渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:2:1的二甲基亚砜、甘油以及聚乙二醇；
非渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:1的海藻糖以及聚蔗糖；
细胞活性抑制剂包括重量份数比为1:1:1的细胞松弛素D、衣霉素以及奥曲肽；
细胞粘附分子包括重量份数比为1:1的E-选择素和ICAM-1。
实施例7
一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括实施例5所述各步骤，所述步骤S5包括如下步骤：
S5.1：配置复苏保存液，并在2℃、100Hz条件下超声振荡5min；
S5.2：超声结束后，立即将所述复苏保存液按8％的浓度加入步骤S4得到的细胞中，轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞悬液。
复苏保存液包括如下重量份数的成分：
20份植物源重组人血清白蛋白、0.5份γ-球蛋白、0.8～1份氯化钠、0.8份糖类、0.05份细胞活性激活剂以及0.1份细胞粘附解除分子；
细胞活性激活剂包括重量份数比为1:1:1的紫杉醇、牛磺脱氧胆碱以及分泌素；所述细胞粘附解除分子为A-205804。
实施例8
一种脐带组织冻存、复苏的方法，包括实施例6所述各步骤，所述步骤S5包括如下步骤：
S5.1：配置复苏保存液，并在10℃、40Hz条件下超声振荡10min；
S5.2：超声结束后，立即将所述复苏保存液按10％的浓度加入步骤S4得到的细胞中，轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞悬液。
复苏保存液包括如下重量份数的成分：
15份植物源重组人血清白蛋白、2份γ-球蛋白、0.8份氯化钠、1.2份糖类、0.1份细胞活性激活剂以及0.2份细胞粘附解除分子；
细胞活性激活剂包括重量份数比为1:1:1的紫杉醇、牛磺脱氧胆碱以及分泌素；所述细胞粘附解除分子为A-205804。
实验例1
复苏率实验
分别以实施例3和5提供的冻存液作为实验组1～2，以常规程序化冻存法以及常规玻璃化冻存法分别作为对照组1～2，对同一来源的脐带组织分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL前文所述的传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养120h，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据增值率＝培养后细胞总数/(3*105)计算增值率，即为复苏率。结果如表1所示。
表1各组细胞复苏情况对比
由表1可知，实验组各组的复苏率均达到90％以上，显著高于对照组各组。表明本发明提供的脐带组织冻存和复苏的方法可以有效降低传统方法对细胞造成的物理或化学的伤害，并可以有效保存组织细胞的生理活性，从而有利于后续使用。
实验例2
细胞表面免疫表型遗传实验
分别以实施例4和6提供的方法为实验组1～2，以常规程序化冻存法以及常规玻璃化冻存法分别作为对照组1～2，对同一来源的脐带组织分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL前文所述的传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养48h，并对获得的细胞的表面抗原进行流式检测，同时以母细胞作为阳性对照。
实验结果表明，各组中CD14、CD31、CD34(HSPC及内皮细胞阳性)、CD45(白细胞阳性)、CD54(ICAM-1)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)以及HLA-DR(MHC-II类分子)等不表达造血细胞表面标志均表现为阴性，而CD29和CD44(纤维蛋白和透明脂酸盐的受体，基质细胞表达)、CD73(SH-3、4)、CD105(SH-2)、CD166(间充质细胞表达)、HLA-ABC(MHC-I类分子))和UEA-1(内皮细胞的表面标志)持续为阳性。实验组及对照组各组与阳性对照相比，细胞表面免疫表型种类均相同，并且各细胞表面抗原比例没有显著差异。由此可知经过原代培养的细胞与原脐带组织细胞具有相同的表面抗原，说明采用本发明提供的方法进行冻存、复苏处理的脐带细胞很好地再现了原脐带细胞的遗传表型，遗传稳定性良好。
实验例3
成骨分化性能实验
分别以实施例7和8提供的方法为实验组1～2，以常规程序化冻存法以及常规玻璃化冻存法分别作为对照组1～2，对同一来源的脐带组织分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL前文所述的传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养，待复苏后细胞融合度达到80～90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，按照1×103细胞/cm2的接种量接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基继续培养2～4周，每2～3天换液，培养结束后用碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成，Von Kossa染色鉴定骨结节形成。
培养1周后，细胞形态发生明显的改变，由纺锤形变为多角形，细胞周边出现丝状突出，并可向周围延伸。培养2周以上后，细胞基质中出现钙化斑，矿化物逐渐出现，并且开始形成多层小结结构，碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，达到90％以上；培养4周后，VonKossa染色可见明显黑色钙化结节。表明采用本发明提供的方法进行冻存、复苏处理的脐带细胞仍能保持良好的成骨分化潜能。
实验例4
成脂肪分化性能实验
分别以实施例7和8提供的方法为实验组1～2，以常规程序化冻存法以及常规玻璃化冻存法分别作为对照组1～2，对同一来源的脐带组织分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL前文所述的传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养，待复苏后细胞融合度达到80～90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，按照1×103细胞/cm2的接种量接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成脂肪诱导培养基继续培养2～4周，每2～3天换液，培养结束后用油红染色鉴定脂肪滴形成。
培养3天后，细胞形态即发生改变，由纺锤形逐渐收缩变短，90％以上细胞成为立方形或多角形；连续培养1周后，镜下可见细胞内有微小脂肪滴出现，并且脂肪滴随着培养时间的延长逐渐扩大、融合；培养2周后，可见融合成团的脂肪滴充满整个细胞。油红染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色。表明采用本发明提供的方法进行冻存、复苏处理的脐带细胞仍能保持良好的成脂肪分化潜能。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：用生理盐水对新鲜脐带进行清洗，并剪碎成小块，贴壁培养36h～48h，并对得到的细胞进行传代培养6～8d；
S2：将步骤S1得到的传代细胞置于DMEM培养基中，于2～5℃下加入预先经超声处理过的冻存保护液，低速离心并轻轻振荡混匀，所述冻存保护液中添加有至少一种细胞粘附分子以及至少一种细胞活性抑制剂；
S3：将步骤S2得到的细胞混合液置于液氮中，降温至-196℃下保存；
S4：将冻存的细胞取出，立即转移至37℃水浴箱中放置1～2min，取出后用PBS缓冲液洗涤2～4次，离心、弃去洗涤液；
S5：向步骤S4得到细胞中加入预先经超声处理过的复苏保存液，轻轻振荡混匀，得到细胞悬液，所述复苏保存液中添加有至少一种细胞粘附解除分子以及至少一种细胞活性激活剂。
2.如权利要求1所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：
S1.1：取新鲜脐带，用生理盐水清洗干净，采集华通氏胶并剪成1～2mm的碎块，平铺至细胞培养瓶中，加入5mL原代培养基、置于5％CO2、37℃的培养箱中进行培养，每3～4d更换一次培养基，所述原代培养基为添加有体积分数8～12％的胎牛血清以及100mg/L链霉素的DMEM培养液；
S1.2：当细胞融合度达到80～90％时，收集贴壁细胞，消化后加入5mL传代培养基，置于5％CO2、37℃的培养箱中进行培养，培养至细胞融合度达到80～90％时为止，所述传代培养基为添加有体积分数12～15％的胎牛血清以及2～5mg/L的柑浓素的DMEM培养基。
3.如权利要求1所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：配置冻存保护液，并在2～10℃、40～100Hz条件下超声振荡5～10min；
S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于8～10％的DMEM培养基中浸泡，超声结束后立即将所述冻存保护液按8～10％的浓度加入所述传代细胞中；
S2.3：将上述混合体系在1000～1500rpm/min条件下离心5min，离心结束后轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞混合液。
4.如权利要求3所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述冻存保护液中包含如下重量份数的成分：10～12份渗透性冷冻保护剂、6～8份非渗透性冷冻保护剂、0.05～0.1份细胞活性抑制剂以及0.1～0.2份细胞粘附分子；
所述渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:2:1～3的二甲基亚砜、甘油以及聚乙二醇；
所述非渗透性冷冻保护剂包括重量份数比为1:1～2的海藻糖以及聚蔗糖；
所述细胞活性抑制剂包括细胞松弛素D、诺考达唑、衣霉素、几夫碱、布雷非德菌素A、CP-10447以及奥曲肽中的至少一种；所述细胞粘附分子包括E-选择素、P-钙黏素、ICAM-1、肽F9以及RGD肽中的至少一种。
5.如权利要求4所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述细胞活性抑制剂包括重量份数比为1:1:1的细胞松弛素D、衣霉素以及奥曲肽。
6.如权利要求4所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述细胞粘附分子包括重量份数比为1:1的E-选择素和ICAM-1。
7.如权利要求1所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述步骤S5包括如下步骤：
S5.1：配置复苏保存液，并在2～10℃、40～100Hz条件下超声振荡5～10min；
S5.2：超声结束后，立即将所述复苏保存液按8～10％的浓度加入步骤S4得到的细胞中，轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞悬液。
8.如权利要求7所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述复苏保存液包括如下重量份数的成分：
15～20份植物源重组人血清白蛋白、0.5～2份γ-球蛋白、0.8～1份氯化钠、0.8～1.2份糖类、0.05～0.1份细胞活性激活剂以及0.1～0.2份细胞粘附解除分子。
9.如权利要求8所述的脐带组织冻存、复苏的方法，其特征在于，所述细胞活性激活剂包括重量份数比为1:1:1的紫杉醇、牛磺脱氧胆碱以及分泌素；所述细胞粘附解除分子为A-205804。
10.权利要求1～9中任一项所述的方法在脐带组织冻存、复苏中的应用。
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