CN108902128B - 一种低温下动物组织和细胞的保存溶液及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种低温下动物组织和细胞的保存溶液及其使用方法，是以水、多元醇、Collin′s液、UW液、HTK液、Euro‑collin′s液之中的一种或几种作为基础溶液，添加多酚、柠檬酸、泊洛沙姆和维生素E，配合波长在20KHz‑1MHz范围内且声强不大于3W/cm2的超声波进行辐照处理，可以通过调节保存溶液中不同组分的配比，以及控制超声波的波长、声强和辐照时间，提高动物组织和细胞在低温环境下的生存能力和生物学活性。

Description

一种低温下动物组织和细胞的保存溶液及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种动物组织和细胞的保存的方法，特别涉及在低温环境下动物组织细胞的体外保存溶液及其使用方法。
背景技术
通常，人们采用低温或冷冻保存方式来维持动物组织和细胞的活性，但是已有报道的动物组织和细胞体外保存溶液，容易降低原组织和细胞活性。研究发现，经低温或冻存保存后的动物组织或细胞的活性显著降低，无法满足临床治疗的需要。
随着近年来开发出了多种动物组织和细胞的体外保存溶液，但这些体外保存溶液对于动物组织和细胞的保存效果均不理想，不仅保存时间短，并且活性损失大。由于动物组织和细胞的特殊性，一般的体外保存溶液不能长时间保持动物组织和细胞的生物学活性，因此急需开发一种动物组织和细胞的体外保存溶液。
自由基是由氧化反应而产生的对身体有害物质。它几乎攻击体内的所有细胞。造成人体组织、器官遭到破坏，加速机体衰老和致病。多酚类化合物具有抗氧化和清除自由基的重要功能。多酚结构中有多个共轭双键，可以依靠共轭效应增加活性分子的结构稳定，从而保护细胞，同时多酚类化合物还具有清除多种自由基的功能。在农学研究中发现，多酚类化合物配合具有抗氧化、抗菌的作用的有机弱酸(如柠檬酸、泊洛沙姆等)使用，能有效降低水果中二氧化碳的释放率和乙烯释放率，防止水分散失，推迟花色素苷的降解，降低多酚氧化酶、过氧化物酶的活性变化，常温下能够有效延长荔枝等易变质水果的保鲜期。但是应用多酚类化合物和有机弱酸对于动物组织和细胞的保存是否有促进效果，目前尚未见研究报道。
为了满足临床治疗的需要，动物组织和细胞的体外保存溶液也需要符合以下要求：(1)配合细胞低温或冻存方式应用，保存时间长；(2)不影响动物组织和细胞的正常功能和生物活性；(3)容易被清洗去除，不会对机体产生副作用；(4)制备成本低，制备方法简便。
目前尚未见到满足以上所有要求的动物组织和细胞的体外保存溶液的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点(即一般的动物组织和细胞的体外保存溶液不能长时间保持其正常功能和生物学活性)，提供一种低温下动物组织和细胞的保存溶液，为保证其生存能力和生物学活性提供最大的微环境保障，同时满足针对动物组织和细胞的体外保存溶液的各项要求，为实现临床治疗的安全、有效、便捷、经济奠定基础。
本发明的一种低温下动物组织和细胞的保存溶液及其使用方法，上述的保存溶液是以水、多元醇、Collin′s液、UW液、HTK液、Euro-collin′s液之中的一种或几种作为基础溶液，基础溶液中添加多酚、柠檬酸、泊洛沙姆和维生素E，上述的使用方法是应用波长在20KHz-1MHz范围内且声强不大于3W/cm2的超声波进行辐照处理，可以通过调节保存溶液中不同组分的配比，以及控制超声波的波长、声强和辐照时间，提高动物组织和细胞在低温环境下的生存能力和生物学活性。
上述的多元醇包括：乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇。
上述的多酚包括：茶多酚、酚酸、花青素、花黄素、葡多酚、类黄酮、异黄酮、黄烷醇、花色甙、白藜芦醇、苹果多酚。
上述的基础溶液中可以进一步加入糖，包括：蔗糖、乳糖、半乳糖、核糖、脱氧核糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、山梨糖、木糖、棉籽糖、甘露糖、淀粉、糊精。
上述的基础溶液中多酚的质量百分含量为0.001％-0.5％、柠檬酸的质量百分含量为0.001％-0.5％、泊洛沙姆的质量百分含量1％-10％、维生素E的质量百分含量0.001％-0.5％、糖的质量百分含量0.1％-10％。
上述的超声波的频率为50KHz-1MHz、声强为0.1W/cm2-2W/cm2、辐照时间为10s-10min。
上述的超声波进行辐照处理，可以是单次辐照处理或多次辐照处理。
上述的低温是指0℃-15℃之间的温度。
上述的动物组织包括：动物的神经、血管、皮肤、膀胱、肾脏、肝脏、心脏、脊髓、脑、角膜。
上述的动物细胞包括上皮细胞、内皮细胞、粘膜细胞、血细胞、肌肉细胞、小肠绒毛细胞、精细胞、卵细胞、脂肪细胞、胰岛细胞。
本发明的一种低温环境下动物组织和细胞的体外保存溶液与现有的动物组织和细胞保存溶液相比，具有以下优点：①不使用任何化学或酶交联剂，不会产生因交联剂残留导致的毒副反应；②具有无种属特异性、无毒性的特性；③使用的溶液具备抗氧化、抑菌效果；④配合低频超声波处理应用，能最大程度地保持动物组织和细胞的生存能力和生物学活性，提高临床移植治疗的成功率；⑤使用便捷、安全和高效。
具体实施方式
下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例1动物组织和细胞的体外保存溶液的制备
按照表1的组分比例，配制动物组织和细胞的保存溶液，各个实验组是根据本申请权利要求项保护范围内的组分和比例配置的，而各个对照组是某项组分缺失或组分质量百分含量超出本申请权利要求项保护的范围。
表1动物组织和细胞的保存溶液的组成和超声波辐照处理参数
Figure BSA0000164954360000031
Figure BSA0000164954360000041
注：“/”代表该项不存在，“*”代表该项指标超出本申请权利要求项保护的范围。
实施例2小鼠肝细胞保存溶液处理后的活性评价
本实施例应用实施例1的制备的动物组织和细胞的保存溶液用于原代小鼠肝细胞保存的效果评价。
采用两步胶原酶灌流法，分离得到原代小鼠肝细胞，平均等分成若干份，分别置于表1不同实验组和对照组的保存溶液中，在0℃、4℃、10℃、15℃、37℃的不同培养箱中培养6天，每24h更换一次保存溶液，换液后立即进行超声波辐照处理(操作参数见表1)，6天后采用台盼蓝染色法评价小鼠肝细胞的活性，结果见表2。
从表2结果可见，各实验组在0℃～15℃范围内小鼠肝细胞的活性均大于50％，说明实验组均具有较好小鼠肝细胞低温保护能力，而在37℃条件下小鼠肝细胞活性低于50％，表明实验组在超过15℃的温度条件下对小鼠肝细胞的保护能力降低。对照组的结果表明，0℃～15℃范围内小鼠肝细胞的活性均小于50％，说明对照组对于小鼠肝细胞不具备低温保护能力，即本申请权利要求项保护的组分和比例范围外的保存溶液不具备对动物组织和细胞低温保护能力。在37℃条件下对照组的结果与实验组接近，但仍然小于50％，表明对照组在37℃条件下对动物组织和细胞的保护能力与实验组无显著差异。
表2小鼠肝细胞的评价结果
Figure BSA0000164954360000051
注：50％以上的细胞活性认为具有较好的小鼠肝细胞保护能力。
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (7)

1.一种低温下动物组织和细胞保存溶液的使用方法，其主要特征在于：所述的保存溶液是以水、多元醇、Collin’s液、UW液、HTK液、Euro-collin’s液之中的一种或几种作为基础溶液，所述基础溶液中添加：多酚的质量百分含量为0.001％-0.5％、柠檬酸的质量百分含量为0.001％-0.5％、泊洛沙姆的质量百分含量1％-10％、维生素E的质量百分含量0.001％-0.5％；所述低温是指4℃-15℃之间的温度；所述保存溶液的使用方法是应用波长在20KHz-1MHz范围内且声强不大于3W/cm2的超声波进行辐照处理，通过调节保存溶液中不同组分的配比，以及控制超声波的波长、声强和辐照时间，提高动物肝组织和细胞在低温环境下的生存能力和生物学活性。
2.根据权利要求1的一种低温下动物组织和细胞保存溶液的使用方法，其特征是：所述的多元醇选自：乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇的一种或几种。
3.根据权利要求1的一种低温下动物组织和细胞保存溶液的使用方法，其特征是：所述的多酚选自：茶多酚、酚酸、花青素、花黄素、葡多酚、类黄酮、异黄酮、黄烷醇、花色甙、白藜芦醇、苹果多酚的一种或几种。
4.根据权利要求1的一种低温下动物组织和细胞保存溶液的使用方法，其特征是：所述的基础溶液中进一步加入糖，选自：蔗糖、乳糖、半乳糖、核糖、脱氧核糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、山梨糖、木糖、棉籽糖、甘露糖、淀粉、糊精的一种或几种。
5.根据权利要求4的一种低温下动物组织和细胞保存溶液的使用方法，其特征是：所述的糖的质量百分含量0.1％-10％。
6.根据权利要求1的一种低温下动物组织和细胞保存溶液的使用方法，其特征是：所述的超声波的频率为50KHz-1MHz、声强为0.1W/cm2-2W/cm2、辐照时间为10s-10min。
7.根据权利要求1的一种低温下动物组织和细胞保存溶液的使用方法，其特征是：所述的超声波进行辐照处理，是单次辐照处理或多次辐照处理。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020258156A1 (en) * 2019-06-27 2020-12-30 Nanjing Mucyte Biotechnology Co., Ltd Cell preservation and preparative medium and method for using the same
CN111034712A (zh) * 2019-12-23 2020-04-21 成都大熊猫繁育研究基地 一种大熊猫乳汁保存方法
CN112626169B (zh) * 2020-12-28 2023-11-03 苏州白垩纪生物科技有限公司 用于保存生物样本中核酸的样本保存液及其使用方法
CN113303326A (zh) * 2021-05-28 2021-08-27 吉林大学第一医院 一种器官保存液及肝脏体外保存方法
CN113293115B (zh) * 2021-07-08 2022-08-26 成都生物制品研究所有限责任公司 肺炎链球菌无动物源冻干保护剂
CN114223649B (zh) * 2021-12-24 2023-03-24 暨南大学 花色苷在冷冻保存精子中的应用、精子冷冻保存液

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1276152A (zh) * 1999-06-02 2000-12-13 Mg制药株式会社 动物细胞或器官的保存剂及其保存方法
CN102625831A (zh) * 2009-07-20 2012-08-01 通用医院公司以麻省总医院名义经营 提高低温保存细胞生活力的方法和组合物
KR101457526B1 (ko) * 2013-06-15 2014-11-03 (주)나비바이오텍 돼지 정액의 보존성 개선을 위한 희석액 조성물
CN107372460A (zh) * 2017-07-13 2017-11-24 漳州傲农现代农业开发有限公司 一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用
CN107467014A (zh) * 2017-10-12 2017-12-15 北京臻惠康生物科技有限公司 一种脐带组织冻存、复苏的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1276152A (zh) * 1999-06-02 2000-12-13 Mg制药株式会社 动物细胞或器官的保存剂及其保存方法
CN102625831A (zh) * 2009-07-20 2012-08-01 通用医院公司以麻省总医院名义经营 提高低温保存细胞生活力的方法和组合物
KR101457526B1 (ko) * 2013-06-15 2014-11-03 (주)나비바이오텍 돼지 정액의 보존성 개선을 위한 희석액 조성물
CN107372460A (zh) * 2017-07-13 2017-11-24 漳州傲农现代农业开发有限公司 一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用
CN107467014A (zh) * 2017-10-12 2017-12-15 北京臻惠康生物科技有限公司 一种脐带组织冻存、复苏的方法

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