CN108753683B - 一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系，是以水、多元醇之中的一种或几种作为基础溶液，基础溶液中添加多酚、柠檬酸、泊洛沙姆和维生素E，将组织器官和细胞置于该溶液体系中进行冻存，冻存后应用波长在20KHz‑1MHz范围内且声强不大于3W/cm2的超声波对细胞进行辐照处理，通过调节溶液中不同组分的配比，以及控制超声波的波长、声强和辐照时间，提高冻存组织器官和细胞的复苏后的生物学活性。

Description

一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系
技术领域
本发明涉及一种组织器官和细胞活性复苏的方法，特别涉及在低温环境下组织器官细胞的体外保存溶液及其使用方法。
背景技术
当前，维持动物器官、组织和细胞活性的最主要方式就是采用极低温度进行长时间的冷冻保存，使用时再经解冻复苏处理，得到活细胞，但是这种冷冻保存方式易降低细胞活性，例如胰岛及肝细胞的生存率仅为10-30％。
随着近年来外科手术和免疫抑制剂的发展，器官移植的病例日益增加。对于器官移植和细胞移植的治疗，最理想的方式是由供体摘除后的器官或分离纯化后的细胞立即直接移植给受体。但是，现实中由于诸多因素的限制，很难实现即时的直接移植手术。因此组织器官和细胞的保存问题就显得至关重要。在早期移植时，有研究者使用了Euro-Collin’s液，但是单纯的Euro-Collin’s保存液无法实现组织器官和细胞的长期保存，即使是肝脏也不超过24小时。美国Wisconsin大学的课题组开发出了UW液，尽管该溶液作为肝脏和肾脏的保存液肝脏的保存时间超过24小时，但也不能保证组织器官和细胞长时间维持生物学活性。
目前一些公司开发出了多种冷冻保存溶液，但其保存时间和复苏活性均不理想，急需开发一种能长时间保持组织器官和细胞的生物学活性的保存溶液体系。
为了满足临床治疗的需要，理想的促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系需要符合以下要求：(1)配合冷冻保存方式应用，保存时间长；(2)不影响组织器官和细胞的正常功能和生物活性；(3)容易被清洗去除，不会对机体产生副作用；(4)制备成本低，制备方法简便。
目前尚未见到满足以上所有要求的组织器官和细胞冷冻保存溶液体系的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点(即已有的冻存保护溶液不能保持组织器官和细胞长期冻存后的生物学活性)，提供促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系，为长时间保持组织器官和细胞长期冻存后生物学活性提供最大的微环境保障，同时满足理想的促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系的各项要求，为实现临床治疗的安全、有效、便捷、经济奠定基础。
本发明的一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系，该溶液体系是以水、多元醇之中的一种或几种作为基础溶液，基础溶液中添加多酚、柠檬酸、泊洛沙姆和维生素E，将组织器官和细胞置于上述溶液体系中进行冻存，冻存后应用波长在20KHz-1MHz范围内且声强不大于3W/cm2的超声波对细胞进行辐照处理，通过调节溶液中不同组分的配比，以及控制超声波的波长、声强和辐照时间，提高冻存组织器官和细胞的复苏后的生物学活性。
上述的多元醇包括：乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇。
上述的多酚包括：茶多酚、酚酸、花青素、花黄素、葡多酚、类黄酮、异黄酮、黄烷醇、花色甙、白藜芦醇、苹果多酚。
上述的基础溶液中可以进一步加入糖，包括：蔗糖、乳糖、半乳糖、核糖、脱氧核糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、山梨糖、木糖、棉籽糖、甘露糖、淀粉、糊精。
上述的基础溶液中多酚的质量百分含量为0.001％-0.5％、柠檬酸的质量百分含量为0.001％-0.5％、泊洛沙姆的质量百分含量15％-60％、维生素E的质量百分含量0.001％-0.5％、糖的质量百分含量0.1％-10％。
上述的超声波的频率为50KHz-1MHz、声强为0.1W/cm2-2W/cm2、辐照时间为10s-10min。
上述的超声波进行辐照处理，可以是单次辐照处理或多次辐照处理。
上述的冻存是指采用0℃以下温度的冷冻过程。
上述的组织器官包括：动物的神经、血管、皮肤、膀胱、肾脏、肝脏、心脏、脊髓、脑、角膜。
上述的细胞包括上皮细胞、内皮细胞、粘膜细胞、血细胞、肌肉细胞、小肠绒毛细胞、精细胞、卵细胞、脂肪细胞、胰岛细胞。
本发明的一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系与现有的组织器官和细胞保存溶液相比，具有以下优点：①不使用任何化学或酶交联剂，不会产生因交联剂残留导致的毒副反应；②具有无种属特异性、无毒性的特性；③使用的溶液具备抗氧化、抑菌效果；④配合低频超声波处理应用，能最大程度地保持组织器官和细胞长期冻存后的生物学活性，提高临床移植治疗的成功率；⑤使用便捷、安全和高效。
具体实施方式
下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合，从而达到更好的技术效果。
实施例1促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系的制备
按照表1的组分比例，配制促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系，各个实验组是根据本申请权利要求项保护范围内的组分和比例配置的，而各个对照组是某项组分缺失或组分质量百分含量超出本申请权利要求项保护的范围。
表1促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系的组成和超声波辐照处理参数
Figure BSA0000164903260000031
Figure BSA0000164903260000041
注：“/”代表该项不存在，“*”代表该项指标超出本申请权利要求项保护的范围。
实施例2大鼠肝脏的活性评价
本实施例应用实施例1的制备的促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系用于大鼠肝脏保存的效果评价。
SD大鼠若干只，分离得到大鼠肝脏，分别置于表1不同实验组和对照组的溶液中，在-80℃、-40℃、-20℃、-5℃的不同条件下冷冻保存6天，取出后立即进行超声波辐照处理进行复苏(操作参数见表1)，采用台盼蓝染色法评价大鼠肝脏的活性，结果见表2。
表2大鼠肝脏的评价结果
Figure BSA0000164903260000042
Figure BSA0000164903260000051
注：30％以上活性认为具有较好的大鼠肝脏保护能力。
从表2结果可见，各实验组在-80℃～-5℃范围内大鼠肝脏组织的活性均大于30％，说明实验组均具有较好大鼠肝脏组织冻存后的活性复苏能力。对照组的结果表明，-80℃～-5℃范围内大鼠肝脏组织的活性均小于30％，说明对照组对于大鼠肝脏组织不具备冻存后的活性复苏能力，即本申请权利要求项保护的组分和比例范围外的溶液体系对组织器官和细胞冻存后的活性复苏能力差。
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (5)

1.一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系，其主要特征在于：所述的溶液体系是以水、多元醇之中的一种或几种作为基础溶液，所述基础溶液中添加：多酚的质量百分含量为0.001％-0.5％、柠檬酸的质量百分含量为0.001％-0.1％、泊洛沙姆的质量百分含量15％-60％、维生素E的质量百分含量0.001％-0.5％；将组织器官和细胞置于所述溶液体系中进行冻存，所述的冻存是指采用0℃以下温度的冷冻过程；冻存后应用频率在50KHz-1MHz范围内、声强为0.1W/cm2-2W/cm2的超声波对细胞进行辐照处理，辐照时间为10s-10min，通过调节溶液中不同组分的配比，以及控制超声波的波长、声强和辐照时间，提高冻存肝组织和细胞的复苏后的生物学活性。
2.根据权利要求1所述的一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系，其特征是：所述的多元醇选自：乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系，其特征是：所述的多酚选自：茶多酚、酚酸、花青素、花黄素、葡多酚、类黄酮、异黄酮、黄烷醇、花色甙、白藜芦醇、苹果多酚中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系，其特征是：所述的基础溶液中可以进一步加入糖，选自：蔗糖、乳糖、半乳糖、核糖、脱氧核糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、山梨糖、木糖、棉籽糖、甘露糖、淀粉、糊精中的一种或几种，所述的糖的质量百分含量0.1％-10％。
5.根据权利要求1所述的一种促进冻存组织器官和细胞活性复苏的溶液体系，其特征是：所述的超声波进行辐照处理，可以是单次辐照处理或多次辐照处理。
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