CN1184883C

CN1184883C - 动物细胞或器官的保存剂及其保存方法

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Publication number: CN1184883C
Application number: CNB001087789A
Authority: CN
Inventors: 玄丞烋
Original assignee: MG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: BMC Corp
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2005-01-19
Anticipated expiration: 2020-06-02
Also published as: JP2000344602A; US7951590B2; KR20010029692A; EP1057405A1; EP1057405B1; DE60012628T2; JP5230042B2; US20020164795A1; CN1276152A; DE60012628D1

Abstract

为了长时间保存动物细胞，采用在非常低的温度下冷冻保存的方法，但是熔解后的生存率很低仅为10-30%。另外，移植用器官的保存时间也因器官的种类而不同，为4小时至40小时，非常短。本发明就是要解决这些问题，也就是说可以不冷冻动物细胞而进行保存，并将移植用器官的保存时间至少比以前可以保存的时间提高数倍。通过向现有的细胞培养液或器官保存液中添加多酚，解决了课题。

Description

动物细胞或器官的保存剂及其保存方法

本发明涉及动物细胞或器官的保存剂。详细的说，涉及动物细胞、移植用器官及血液、血细胞、血小板等的保存剂，蛋白质的稳定剂，或在器官移植后预防、治疗、改善器官障碍等的保存剂。

通常，为了保存细胞是在-196℃的极低温度下冷冻保存，必要时将这些冷冻细胞迅速解冻得到活细胞。但是，虽然这种冷冻·熔解后的生存率依赖于细胞的种类和实验者的熟练程度，可是除癌以外的正常有用细胞，例如胰岛及肝细胞的生存率极低，至多为10～30％。

另外，由于血细胞成分及血小板不能冷冻保存，所以其有效期为12～72小时，非常短。加上虽然器官移植的病例增加，而移植器官的保存方法却仍为一项重要研究课题而被遗留，这与细胞增殖和细胞障碍有很大关系。

随着近年来外科手术和免疫抑制剂的发展，器官移植的病例日益增加。对于这种器官移植，理想的是由供者(donor)摘除的器官直接移植给受者(recipient)，但是未必能够直接进行移植手术。因而伴随移植手术的紧急性，贵重器官的保存问题就显得非常重要了。目前，作为器官保存的方法使用的是以抑制器官代谢为目的的低温保存法和以维持代谢为目的的灌流保存法，为此开发了各种保存液在临床上应用。

在早期移植使用Euro-Collin’s液，但是器官的保存时间即使是肝脏也不超过24小时，这就需要能更长时间保存的保存液。但是，最近美国Wisconsin大学的课题组开发出作为胰脏移植保存液的UW液(University of Wisconsin，Wahlberg，J.A.，et al.，Transplantation，43，pp.5-8，1987)，这种保存液不仅可以保存胰脏，也可以作为肝脏和肾脏的保存液使用，肝脏可以保存24小时。

但是，仍然不能满足需要，因而非常需要开发一种能长时间保持器官生存能力(viability)、具有更优良的器官保存效果的保存液。

各种器官共同之处在于由于缺血以及血流再灌注时产生的自由基，促进生物膜的脂质过氧化，引起生物膜障碍，结果造成移植器官的功能障碍。所以，如果能够防止由于产生这种过氧化脂质而出现的细胞障碍，就可以开发出更有效的保存液。

近年来，报道了大量关于自由基对生物体影响的研究，对于抗氧化物质也逐渐清楚。作为目前已知的主要抗氧化物质有酶类的超氧化物歧化酶(SOD)，以及非酶类的维生素E、维生素C、谷胱甘肽、类胡萝卜素、黄酮类、糖类、铁的螯合剂、尿酸、白蛋白等。

已知关于利用这些抗氧化物质抑制组织增殖及保存器官的研究还不是很多，但是，最近报道发现绿茶多酚具有抗氧化作用、除臭作用、抗菌作用及抗癌作用。近年来，这种绿茶多酚作为功能性食品原料大量、廉价生产。

另一方面，细胞与组织的障碍与在细胞线粒体中由三磷酸腺苷(ATP)转换成的次黄嘌呤(hypoxanthin)转变成黄嘌呤(xanthine)过程中产生的活性氧(O^- ₂)有很大关系。由这种障碍最严重的结果是发生癌变，癌的产生过程被认为是经过癌症引发和癌症增进过程产生的。在癌症引发中，各种致癌物质对细胞DNA引起障碍导致突变，细胞无限增殖造成组织癌变。这种突变也受活性氧的影响。除此以外，产生这种活性氧的过氧化物也是老化及各种疾病的重要原因之一。

在本发明中，通过自由控制各种动物细胞的增殖，在了解细胞增殖机理的同时，开发出保存用于器官移植的各种器官以及保存血液时，将以往的可保存时间延长至少2倍以上的保存液，同时提高了蛋白质的保存稳定性。

具体的说，能够控制正常有用细胞的增殖，不冷冻而长时间保存，通过控制与细胞增殖分裂有很大关系的自由基，自由控制细胞的增殖·分裂。

本发明提供含有作为有效成分的多酚，用于细胞学及组织学领域的动物细胞或移植用器官的保存剂。另外还提供了使用该保存剂，保存动物细胞或器官的方法。

本发明的多酚例如绿茶酚的主要成分儿茶素类及鞣酸等。

特别是多酚优选儿茶素类，其中包括作为3，3，4，5，7-黄戊醇已知的儿茶素、具有3，4-二羟基苯基骨架的儿茶酚胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺，特别优选以表棓儿茶素为主要成分的儿茶素类。

其他优选的多酚例如鞣酸。这里，所谓鞣酸是指通过水解生成没食子酸的多酚化合物。一般的，例如药典中的鞣酸是8个没食子酸基结合在葡萄糖残基的周围，其构象在同一平面，另外有2个没食子酸基在垂直方向结合的物质。

但是，化合物的中心部分未必只限于是葡萄糖，也可以是纤维素类化合物，也可以使用鞣酸水解得到的没食子酸二缩酸酐(didebrisidegallate)等。

在我们平常喜爱喝的绿茶、红茶、及红酒中含有大量本发明保存剂的有效成分多酚，例如绿茶多酚可以用水、乙醇或乙酸乙酯等有机溶剂从绿茶的叶萃取、精制得到，其主要成分是以表棓儿茶素(EGCg)为主体的儿茶素类。

本发明的优选方式是将本发明中使用多酚作为有效成分的保存剂加入到通常用作细胞培养基的各种培养液及用于保存器官的保存液中。

本发明中使用的培养液及用于保存器官的保存液可以使用公知的物质，例如可以使用Euro-Collins液(Euro-Collins液，Squifflet，J.P.，et al.，Transplant Proc.，13，693，1981)、UW液等。

通常，多酚容易得到纯度在60％以上的制品，作为本发明细胞及器官保存剂的多酚也可以使用纯度为60％以上的制品，但是纯度在85％以上的精制品更适合。当然，如果纯度更高，效果会更好。因此，作为本发明保存剂的有效成分，与纯度无关，包括所有多酚。

本发明的保存剂用于保存动物细胞时，在目前各种细胞培养中使用的各种培养液及用于保存器官的保存液中优选添加多酚0.1-50wt％，更优选添加1-30wt％。

例如，本发明的保存剂用于保存器官时，向以往临床上用作移植用器官保存液的Euro-Collins液及UW液中，进一步以上述多酚0.1-50wt％的浓度，更优选以1-30wt％的浓度添加即可。

另外，用作血液、血细胞及血小板的保存剂时，向在保存剂中预先添加或在后添加市售葡萄糖及磷酸盐得到的液体、或在保存剂中预先添加或在后添加聚氧乙烯类非离子表面活性剂的液体中，添加0.1-50wt％本发明的多酚后使用。

另外，本保存剂用作蛋白质溶液的稳定剂时，也可以向添加有市售脂肪酸酯的保存液中进一步加入0.1-50wt％的多酚，也可以加入0.1-50wt％的多酚代替这种脂肪酸酯。

而且，保存剂作为预防、治疗、改善器官移植后器官障碍的保存剂使用时，可以向市售的保存剂中添加0.1-50wt％的多酚后使用。这种保存剂的给药方法可以是常规的静脉、口服、经鼻、栓剂或透皮给药方法。另外，给药量与患者的年龄和症状等相应，并没有特别的限定。

这些培养液、保存液也可以进一步与其他抗氧化剂SOD、维生素E、C及谷胱甘肽等并用。

作为使用本发明保存剂的条件，适用温度优选0-37℃。本发明保存剂与市售品比较，适用温度比较高，没有必要冷冻，而且耐用时间比较长，适应于器官移植·手术。

本发明中的细胞包括由人或动物的组织分离得到的干细胞、皮肤细胞、粘膜细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、骨细胞、肌细胞等动物细胞，或家畜及鱼类的精子、卵子或受精卵。

本发明中的器官包括皮肤、血管、角膜、肾脏、心脏、肝脏、脐带、肠、神经、肺、胎盘或胰脏。

本发明者在数年前，对该多酚特别是其抑制癌细胞增殖的作用非常感兴趣，研究了其各种性质，发现其具有上述抗氧化物质没有的特异性质，也就是说在水、有机溶剂中有极好的溶解性，具有两亲性质，对蛋白质的吸附性优良，另外，细胞毒性极低，而且抗氧化活性是SOD的10倍以上，并能够自由控制目前还完全不了解的动物细胞增殖。

从20世纪80年代开始就有很多学者报道多酚的各种生理活性作用，例如抗癌作用、抗氧化作用、抗菌·抗病毒作用非常优良。虽然有关于多酚对细胞增殖影响的研究已有报道，但几乎都是抑制癌细胞增殖的报告。

特别是最近Nature杂志上发表的论文(J.Jankun，S.H.Selman，and R.Swiercz，“Why drinking green tea could preventcancer”，Nature， 387，5 June，561，1997Y，Cao and R.Cao，“Angiogenesis inhibited by drinking tea”，Nature， 398，1April，381，1999)引起世界瞩目。

由于绿茶多酚具有抗氧化作用、消臭作用、抗菌作用等各种各样的作用，另外还有抗龋齿性及其他生理活性(“饮食料品用机能性素材有效利用技术とリ-ズ”No.10，绿茶多酚、上村光男、甜点综合技术中心、三勇社)，所以近年来人们爱用作功能性食品。但是，对多酚保存动物细胞及器官的作用到目前为止还完全没有提示。

因而认为几乎以前所有的研究人员只是关心多酚作为抗氧化物的抗癌作用。因此，众多的研究者中没有任何一个人发现象本发明这样使用动物的各种正常细胞，能够自由控制其细胞增殖，出现“动物细胞在体温下冬眠”的现象。而且，当然也不能发现冬眠后可以再次开始正常细胞的增殖·分裂，表现出其各种机能。

了解到各种动物细胞可以这样自由控制其增殖，不仅成为细胞学基础研究的一个新突破口，而且是可以保存细胞、保存血液成分、及长时间保存器官的划时代发明。

本发明发现能够自由控制构成胰脏、肝脏及肾脏等生物组织的基本单位——各种细胞增殖的物质，提供一种通过向以前的器官保存液中添加该物质，不仅各种器官而且在血液保存方面也可以应用的技术，这对再生医学的进步作出了很大贡献。

以下，对本发明的实施例和比较例进行说明，但本发明并不只限于这些实施例。

实施例1和比较例1；大鼠的成纤维细胞

在Eagle公司的MEM(含卡那霉素60ml/l、Eagle’s MEMcontaining kanamycin)和10％的胎牛血清(fetal bovine serum；FBS、M.A.Bioproduct，Marylard，USA)中培养L-929成纤维细胞。在细胞密度为1.76×10⁵cell/ml的条件下进行细胞增殖测试，作为对照组(比较例1)只采用血清培养基(serum medium)，并向另一个培养系统中添加多酚(浓度为5mg/ml)(实施例1)。结果是对照组从2天后开始急剧增殖，5天后增加到2.5×10⁶cell，而添加多酚的系统中，确认1周后完全没有增殖。但是，这时如果更换培养液(medium)，只用没有添加多酚的血清培养基(比较例1)，就会重新开始增殖，1周后也增加到4.5×10⁶cell/ml。另外，这种休眠确认可以持续3个月。

实施例2和比较例2；猪的肝细胞

收集猪的肝细胞2.1×10⁵个细胞于用I型(type I)胶原包被的培养血中进行培养。对照组(比较例2)每3天更换1次Dullbecco’s改良Eagle培养基(含有胎牛血清100mg/l，青霉素50000unit/l，链霉素100mg/l，EGF 0.5mg/ml，胰岛素0.25mg/l。Dulbecco’s modifiedEagle’s medium；DMEM，containing bovine serum 100mg/ml，penicilin 50000 unit/l，stereptomycin 100mg/l，EGF0.5mg/ml，insulin 0.25mg/l)，并与添加5mg/ml多酚的系统(实施例2)比较肝细胞的增殖能力。对照组(比较例2)至第4天缓慢增殖，随后，急剧增殖，1周后也增殖到5.4×10⁶cells。另一方面，在添加多酚的系统(实施例2)中，与成纤维细胞相同，1周内完全没有变化，其后如果改变培养基就会重新开始增殖。作为肝细胞功能检测D-葡萄糖(D-glucose)和利多卡因清除率(Lidocaine clearance)，结果确认添加多酚使之休眠1周后复苏的肝细胞(实施例2)与正常肝细胞具有相同程度的肝功能。

实施例3和比较例3；大鼠胰脏的胰岛

收集由Wistar系大鼠(体重380g)胰脏得到的胰岛(拉氏岛)约2000个，培养其中的一部分200个。作为培养液使用向RPMI培养基1640(含有L-谷氨酰胺，未添加葡萄糖，RPMI Medium 1640，Gibco BRL，批号No.1019650，with L-glutamine，without glucose，LIFETECHNOLOGIES公司制造)中分别添加胎牛血清(批号#29110643，CASERA INTERNATIONAL INC.CANADA公司制造)10％的葡萄糖(glucose)100mg/ml，及抗生素-抗真菌剂(Antibiotic-Antimycotic批号No.1013807，LIFE TECHNOLOGIES公司制造)的系统。在本发明的实施例3中，向该培养液中添加多酚使浓度达到2％，另外比较对照组是在不添加多酚的系统中在37℃培养1周。比较例3的没有添加多酚的系统中在2天后已经有50％的拉氏岛被破坏，4天后100％的拉氏岛死亡。与此相对，本发明的添加多酚的系统中，确认即使经过1周后所有拉氏岛也没有被破坏，100％进行冬眠。另一方面，为了检测拉氏岛冬眠后的机能，将约2000个拉氏岛采用上述方法，通过向RPMI培养基1640中添加多酚使拉氏岛进行冬眠，冬眠1周后，除去多酚，使用胰岛素测定试验(Insulin-EIA TEST GLAZYME，和光纯药工业株式会社)，采用一步酶免疫测定法检测胰岛素的处理机能，具有与直接由大鼠胰脏采集后的拉氏岛相同的正常机能。

实施例4和比较例4；大鼠肾脏的保存

麻醉状态下摘除大鼠(Wistar，380g)的肾脏，比较保存效果。比较例4是摘除肾时用UW液洗涤后冷却保存48小时。与此相对，本发明的实施例4是用进一步向该UW液中添加了多酚(10mg/ml)的保存液进行摘除肾时的洗涤，同样冷却保存48小时。随后，用分离肾灌流装置进行90分钟的持续灌流，比较灌流量与尿量及肌酸清除率。结果与作为比较对照组的只使用UW液的保存肾相比，本发明的添加多酚的系统中，肾障碍显著减轻。

实施例5和比较例5；酶的稳定化

向β-D-半乳糖苷酶溶液中添加多酚10mg/ml(实施例5)，30℃下培养4周后，测定420nm的吸光度。不添加多酚的比较例5中，其吸光度为10％，而添加了多酚的系统中，吸光度保持90％以上。

实施例6和比较例6；血液或血细胞的保存

向人血2ml中加入预先溶解在生理盐水中的多酚10mg/ml溶液500μl(实施例6)。48小时后用自动血细胞计数仪测定颗粒数，未添加多酚的比较例6中颗粒数减少30％，而添加多酚的系统中几乎没有减少，与直接采血后的颗粒数相同。

实施例7和比较例7；血小板的保存

离心分离人血，得到多血小板血浆(PRP)。向该PRP100ml中加入预先溶解在生理盐水中的多酚10mg/ml溶液10ml，22℃下保存3天(实施例7)。未添加多酚的PRP(比较例7)中，3天后血小板的形状膨胀，凝集能力降低，而添加多酚的系统中，未发现这种现象，与初期的PRP形状及凝集能力相同。

实施例8和比较例8；静脉给药

为了进行作为预防、治疗、改善器官移植后器官障碍的保存剂的研究，尝试在大鼠的血液中给予多酚水溶液。通过每日1次、连续1周向Wistar系雄性大鼠(体重为350g)的尾静脉注射添加了多酚(10mg/ml)的生理盐水2ml给与。这1周内当然没有出现任何异常，之后的3个月内也没有出现任何异常，正常生存。

本发明通过向现有的细胞培养液中添加多酚，能够使动物的肝细胞、甚至胰岛细胞及受精卵不进行长时间冷冻而被保存。因而能够应用于动物细胞产生的细胞分裂素类、产生有用物质的细胞学及组织学中。另外，通过向现有的器官保存液中添加多酚，能够大幅延长移植用器官，例如肝脏、肾脏、胰脏、角膜及皮肤、神经、脐带等所有器官的保存时间。另外，即使血液及血细胞、血小板也可以长时间保存，而且通过向以往的血小板保存液中添加多酚，能够作为替代血浆的血小板保存液使用。另外，通过使所有蛋白质溶液与多酚在系统内共存，能够使在食品、临床、临床诊断或医学设备等中使用的各种蛋白质(酶、抗体、抗原、免疫活性物质、生理活性肽等)在溶液状态、或干燥状态下的保存稳定性提高。而且，添加多酚的液体能够用作器官障碍的预防、治疗、改善剂。

结论是本发明通过自由控制各种动物细胞的增殖，了解细胞增殖机理的同时，在保存各种用于器官移植的器官以及保存血液时，使以前可以保存的时间至少延长2倍以上。具体的说，能够控制正常有用细胞的增殖，不冷冻而长时间保存，控制与细胞分裂增殖有很大关系的自由基，从而自由控制细胞的增殖·分裂。另外，将本发明的保存剂与市售品进行比较，适用温度比较高而不用冷冻，而且耐用时间比较长，适用于器官移植·手术。

Claims

1、以下保存剂在用于在体外非冷冻保存人或动物细胞、组织、或移植用器官中的用途，所述保存剂含有

a)0.1～50wt％以儿茶素类为主要成分的多酚类，和

b)选自Euro-Collins液、UW液、血清、抗生素溶液的保存液。

2、如权利要求1所述的用途，细胞为由人或动物的组织分离得到的干细胞、皮肤细胞、粘膜细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、骨细胞或肌细胞，或家畜及鱼类的精子、卵子或受精卵。

3、如权利要求1或2所述的用途，器官为皮肤、血管、角膜、肾脏、心脏、肝脏、脐带、肠、神经、肺、胎盘或胰脏。