CN107593685B

CN107593685B - 马尾松树皮提取物在制备移植器官保存液中的应用

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Publication number: CN107593685B
Application number: CN201710685544.XA
Authority: CN
Inventors: 崔映宇; 李梦琪; 李响; 李俊; 陈义汉
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2037-08-11
Also published as: CN107593685A

Abstract

本发明涉及一种马尾松树皮提取物在制备移植器官保存液中的应用，所述的保存液包括马尾松树皮提取物(PMBE)和HTK液，其中，PMBE的浓度为100μg/mL，移植器官的保存温度为4℃，所使用的移植器官可以为大鼠心脏等。与现有技术相比，本发明的由PMBE制成的保存液可以协同维持氧化还原稳态，阻止线粒体膜电位的下降，防止心肌细胞凋亡，进而发挥其对心肌细胞的低温保护效应。

Description

马尾松树皮提取物在制备移植器官保存液中的应用

技术领域

本发明涉及一种器官保存液及其应用，尤其是涉及一种马尾松树皮提取物在制备移植器官保存液中的应用。

背景技术

马尾松(Pinus massoniana Lamb)，俗称“青松”，松科常绿乔木，树体高可达 45米，胸径可达1.5米，树皮红褐色，下部灰褐色。树枝平展或斜展，树冠宽塔形或伞形，针叶细柔，微扭曲，两面有气孔线，边缘有细锯齿，叶束丛生于枝条末端，飘散细长，可达12-20厘米，一束束形似马尾，因而得名马尾松。马尾松分布极广，生长在东南亚地区，尤以越南、印度北部、中国长江流域及华南居多。北自河南及山东南部，南至两广、湖南、台湾，东自沿海，西至四川中部及贵州，遍布于祖国各地，是中国南部重要材用树种，经济价值高^[1]。

马尾松树皮提取物(Pinus massoniana bark extract，PMBE)，源自马尾松树干表皮，呈红褐色精细粉末，易溶于水，乙醇和二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO) 等有机溶剂。

松树成分入药在我国有着悠久历史，《本草纲目》、《名医别录》等医典都记载有松树的功效，其树皮、针叶可用于治疗感冒、高血压、风湿性关节痛、神经衰弱、冻疮等疾病。近年来，法国海松树皮提取物

，因具有抗氧化性而用于保健品的制备和生产，可缓解痛经、淡化色斑、延缓衰老，预防和治疗动脉硬化、类风湿性关节炎、阿兹海默症、心肌炎等疾病。Grimm等用HPLC检测口服 Pycnogenol后血浆中代谢产物发现，除了Pycnogenol已知的五种代谢物—儿茶素、咖啡酸、阿魏酸、花旗松素及δ-(3,4-二羟基苯酚)-γ-戊二酯外，还有其他十种代谢产物，如：香豆酸、没食子酸、4-羟基苯甲酸、原儿茶酸等。

PMBE是一种新兴的植物提取物，呈红褐色粉末，易溶于水，乙醇和二甲基亚砜等有机溶剂，由单体、二聚体、寡聚体和多聚体等天然类黄酮混合组成，其主活性成分是原花青素(Pas，含量≥95％，此外，还含有其他四十余种水溶性成分，如咖啡酸、阿魏酸、原儿茶酸、没食子酸、香草酸等有机酸，以及葡萄糖脂和其他对人体有用的生物活性成分)使PMBE具有强大的抗氧化能力，可以清除活性氧自由基 (reactive oxygen species，ROS)，防止细胞内DNA、蛋白质、脂类的氧化损伤，维持氧化还原稳态。PMBE的强抗氧化性吸引了国内外学者的关注，目前，PMBE 在多个体外细胞实验及体内动物实验中显示出强抗癌活性，主要表现为诱导癌细胞凋亡，不同阶段阻滞细胞周期和抑制癌细胞的迁移。此外，经国内外研究者发现， PMBE还具有缓解男性功能障碍的潜能，并有提高牙本质的耐酸蚀脱矿能力，这预示着PMBE可以作为口服保健品加入到日常膳食中。

同时，器官移植是治疗终末期器官衰竭的根治手段。低温(4℃)可减慢细胞的代谢速率，降低能量损耗，自1937年首次使用低温保存移植器官时，发现低温导致细胞坏死。随后发现，低温会诱导大鼠等动物的肝脏细胞、肾脏细胞、脑细胞、心脏细胞等的凋亡，且低温引起的细胞损伤与低温诱导胞内ROS的累积密切相关。因此在器官移植中用器官保存液配合低温来延长供体器官的效能时间。判断器官保存液优劣的五项标准之一就是看其在低温时能否防止ROS对器官的损伤。

心脏是血液循环系统的中枢，心血管疾病的终极根源。心脏正常功能的发挥，对个体生命稳态的维持至关重要。目前，心脏移植术已被广泛用于慢性末期心脏病的治疗，但由于受体心脏需求的增长与供体心脏的缺乏，如何提高供体心脏保存的质量、延长供体心脏效能的时间、降低移植后再灌注损伤、降低手术费用以造福更多病患等，是需要被关注的问题。其中，是否合理保存离体的供体心脏，是影响病患移植后生活质量的重要因素。目前，临床常用的器官保存液有UW液、HTK液 (赫特金)和St.Thomas液等，其中，HTK液是目前临床最常应用的心脏保存液， Saitoh等和Ku等的研究均提示HTK液的心脏保存效果优于UW液等其他同类保存液。然而，心脏保存液能改善心脏的保存效能，但并未彻底解决心功能及心肌受损问题。为解决这些问题，国内的多家医疗研究所也在积极投入新型心脏保存液的研发中，以期能够更好地保护供体心脏维持正常心功能，减少再灌注损伤，延长离体心脏保存时间，降低手术成本。

总的来说，虽然关于PMBE阻滞癌细胞周期、延迟癌细胞生长和增殖、诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞迁移的功效先后被报道，提示其可作为候选抗癌药物先导物的潜能。然而，国内外尚未见PMBE低温效应的相关研究。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种马尾松树皮提取物在制备移植器官保存液中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种马尾松树皮提取物在制备移植器官保存液中的应用。

优选的，所述的移植器官保存液包括马尾松树皮提取物和HTK液。移植器官保存液也可以根据实际情况将PMBE与其他保存液混合进而进行改良优化。PMBE 可以采用常规市售产品即可，优选购自N.B.C.生物有限公司。

更优选的，所述移植器官保存液中，马尾松树皮提取物的浓度为1～150μg/mL。

进一步更优选的，所述移植器官保存液中，马尾松树皮提取物的浓度为100 μg/mL。

优选的，所述的移植器官保存液中的工作温度为4℃。

优选的，所述的移植器官为大鼠心脏。

一种移植器官保存液，包括马尾松树皮提取物和HTK液。PMBE可以采用常规市售产品即可，优选购自N.B.C.生物有限公司。HTK液可以根据实际情况由其他常用保存液替代。

优选的，所述的移植器官保存液中，马尾松树皮提取物的浓度为1～150μg/mL。

更优选的，马尾松树皮提取物的浓度为100μg/mL。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)通过将PMBE加入HTK液中，制得新的移植器官保存液，当将其用于如大鼠心脏等的低温保护时，相比于单HTK液而言，在心功能指标(LVSP、LVDP 及RPP等)和心肌改变层面，均更具低温保护效应。

(2)PMBE来源广泛，基本无生物毒性。

(3)PMBE除了对H9c2细胞具低温保护效应，对人胚肾HEK293细胞系和人正常肝L-02细胞系也具低温保护效应，这为PMBE所制成的保存液用于人体肾脏和肝脏等器官的低温保存提供了实验依据。

(4)PMBE可以清除自由基和强抗氧化性抵御低温导致的过氧化等损伤，协同维持氧化还原稳态，阻止线粒体膜电位的下降，防止心肌细胞凋亡，进而发挥其对心肌细胞的低温保护效应。

附图说明

图1为不同心脏保存液低温保存离体大鼠心脏1h后的左心室压图；

图2为不同心脏保存液低温保存离体大鼠心脏后的血流动力学基础值的回复率；

图3为不同心脏保存液低温保存离体大鼠心脏后的心肌组织HE染色照片；

图4为细胞计数法绘制的H9c2细胞生长曲线；

图5为MTT法绘制的H9c2细胞生长曲线；

图6为不同低温时间处理后的H9c2细胞形态的光学显微镜照片；

图7为低温下不同浓度PMBE处理后的H9c2细胞形态图；

图8为不同细胞系下不同保护处理的光学显微镜照片；

图9为H9c2细胞在不同处理条件下的凋亡变化的荧光显微镜照片；

图10为荧光显微镜下H9c2细胞在不同处理条件的线粒体膜电位变化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明中，PMBE可以采用常规市售产品即可，优选购自N.B.C.生物有限公司。经检测，PMBE中包含≥95％的原花青素(proanthocyanidins，PAs)，此外还含有其他四十余种水溶性成分，如咖啡酸、阿魏酸、原儿茶酸、没食子酸、香草酸等有机酸，以及葡萄糖脂和其他对人体有用的生物活性成分。经反向高效液相色谱检测 (High Performance LiquidChromatography，HPLC)，PMBE中的PAs包含24.18％的单体，50.11％的二聚体，20.32％的三聚体及5.39％的多聚体。

实施例1

PMBE保存液对心脏器官的保护效果说明

1.1实验动物：

SD大鼠(SPF级)24只，健康雄性，六周龄，约170g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证SCXK(沪)2013-0016。饲养于同济大学附属东方医院动物房，饲养至体重220-260g，分为四组，分别对应的保存液为HTK液、低浓度PMBE改良液、中浓度PMBE改良液和高浓度PMBE改良液。

1.2主要试剂

PMBE粉末	N.B.C.生物有限公司
		DMSO	Amresco公司
赫特金(HTK液)	福州海王福药制药有限公司
		PBS	Hyclone公司
肝素	上海思吉生物
		水合氯醛	上海国药
PFA粉末	Sigma公司
		氯化钠	上海国药
氯化钾	上海国药
		磷酸二氢钾	上海国药
七水硫酸镁	上海国药
		碳酸氢钠	上海国药
葡萄糖	上海国药
		氯化钙	上海国药
中性树胶	上海国药
		苏木素染液	南京建成科技
伊红染液	南京建成科技

1.3主要溶液配方

1.4保存实验方案

1.4.1 Langendorff模型建立

(1-1)于实验30min前用95％O₂+5％CO₂预充K-H灌流液；

(1-2)大鼠称重，于麻醉前20min，腹腔注射肝素(100U/KG)；

(1-3)同时，排净Langendorff管路中气体，以免空气挤入主动脉，造成空气栓塞；

(1-4)大鼠腹腔注射10％水合氯醛(4mL/kg)，等待麻醉；

(1-5)将大鼠仰卧位固定，迅速开胸取心，置于冰上K-H液中轻轻按压，挤出残血，修剪并游离主动脉根部，迅速转移、固定于Langendorff灌流装置上；

(1-6)经主动脉根部恒流恒温灌注K-H液，流速12mL/min，灌流液温度维持37℃；

(1-7)稳定5min，观察心脏搏动良好后，将连接PowerLab数据采集系统的球囊经左心房、二尖瓣送入左心室；

(1-8)向球囊内缓慢注射生理盐水(55-70μL)，使左室舒张压维持于4-10 mmHg；

(1-9)平衡20min，待心脏搏动达到稳定状态，测定低温处理前心脏的血流动力学基础值：心率(heart rate，HR)、左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)，共记录10min。

1.4.2离体鼠心复灌的血流动力学基础值检测

(2-1)检测完成后，经主动脉根部单次灌注4℃的心脏保存液(HTK组灌注 HTK液，三个PMBE组灌注不同浓度的PMBE改良液)，灌注时间2min；

(2-2)待心脏停搏后，将鼠心分别置于对应的4℃心脏保存液中1h，保存期间不进行重复灌注；

(2-3)重新将鼠心移至Langendorff装置上，灌注K-H液使心脏逐渐复温至 37℃；

(2-4)复温后心脏开始复跳，持续灌注K-H液20min，待心脏搏动达到稳定状态，再次测定并记录上述血流动力学基础值，计算左心室压-心率乘积 (Rate-pressureproduct，RPP)，再计算以上指标保存前/后的恢复率。恢复率＝保存后各指标数值/保存前各指标数值×100％。

图1为采用上述实施方案的不同心脏保存液低温保存离体鼠心1h后的左心室压图，图中从上到下分别为低温处理前组，HTK液组，低(1μg/mL)、中(10μg/mL)、高(100μg/mL)PMBE改良液组。可知，相比于低温处理前，经HTK液低温保存 1h后的大鼠心脏左心室压很低，提示心肌受损。随着PMBE浓度数量级的提高，左心室压明显升高，且当PMBE终浓度为100μg/mL时，左心室压与低温处理前最接近，提示100μg/mL的PMBE改良液对心脏低温保护效应最佳。即在一定浓度范围内，PMBE改良液中的PMBE浓度越高，其对心脏的低温保护效应也越佳。

图2则为PMBE终浓度为100μg/mL的HTK改良液的低温保存组的血流动力学基础值图，其中，血流动力学基础值：心率(HR)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张压(LVDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)，计算左心室压-心率乘积(RPP)，并计算各指标在低温保存前/后的恢复率：恢复率＝保存后各指标数值/保存前各指标数值×100％。从图中可以看出，PMBE终浓度为100μg/mL的HTK改良液组各血流动力学基础值的恢复率都显著高于HTK液组，且LVSP、LVDP及RPP具极显著差异。提示从心功能指标层面，PMBE对离体大鼠心脏具低温保护效应。

1.4.3心肌组织病理学检测

(3-1)固定：血流动力学基础值检测完毕后，各组均随机留取两个心脏，迅速浸泡在装满4％PFA溶液的50mL离心管中，4℃摇床过夜；

(3-2)洗涤：将固定后的鼠心用PBS清洗3次，每次5min；

(3-3)脱水：将鼠心依次经30％、50％、75％各级乙醇溶液脱水，每次2h，再放入95％乙醇中过夜。第二天用100％乙醇脱水2次，每次2h；

(3-4)浸蜡：将鼠心浸泡在二甲苯和石蜡1：1的混合液中40min，再浸泡在石蜡包埋机(55-60℃)的液体石蜡中，每2h更换一次液体石蜡，共3次；

(3-5)包埋：将浸蜡后的鼠心放入蜡模中，放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡；

(3-6)切片：将石蜡块置于轮转式切片机上，调整切片厚度为8μm，进行切片；

(3-7)展片：将切片后的蜡带放于39℃水浴摊片机上，充分展开；

(3-8)贴片：取洁净的载玻片，捞起展开的切片使其贴片，标记后37℃过夜；

(3-9)脱蜡：切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10min；

(3-10)脱水：切片放入100％、95％、90％、80％各级乙醇溶液中各5min，再放入蒸馏水中5min，洗两次；

(3-11)染色：苏木素染色5min，水洗；

(3-12)分化：1％盐酸乙醇溶液分化45s，伊红染色5min，水洗；

(3-13)封片：再次梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡切片至透明，取中性树脂封片；

(3-14)观察：显微镜下观察心肌结构的改变并拍照。

采用上述方法，选用PMBE浓度为100μg/mL的PMBE改良液组，并以未经低温处理的心肌组织和经HTK液低温保存的心肌组织作为对照组，从图3的HE 染色结果可以看出，未经低温处理的心肌细胞排列整齐，心肌横纹清晰。HTK液组心肌纤维排列紊乱，心肌有断裂，较多心肌细胞空泡变性，组织间质水肿，心肌损伤严重。PMBE终浓度为100μg/mL的HTK改良液组心肌排列尚整齐，存在少量空泡变性，整体状态明显优于HTK组。提示从心肌改变层面，PMBE对离体大鼠心脏具低温保护效应。

经过本实施例1的Langendorff离体心脏灌注法所测试药物对心脏功能的影响，综合上述结果，可以知道，低温HTK液保存1h后的心肌细胞改变明显，损伤较重，而用终浓度100μg/mL PMBE改良后的HTK液，低温保存1h后心肌细胞改变相对较轻，且血流动力学指标改善显著，这表明PMBE的心脏低温保护效应明显。该保护效应可能归因于PMBE中的强抗氧化成分作为氧自由基清除剂，在再灌注开始时有效地防止了氧化应激损伤及心肌细胞凋亡，起到心肌保护作用。

实施例2

PMBE对大鼠心肌H9c2细胞的低温保护效果说明实验

2.1实验细胞系

大鼠心肌H9c2细胞系、人胚肾HEK293细胞系、以及人正常肝L02细胞系。

2.2主要试剂

2.3主要试剂配方

2.4细胞培养及生长曲线测定

2.4.1细胞复苏

(1-1)液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴锅中快速晃动，使细胞冻存液快速融化；

(1-2)将液体转移至15mL离心管中，加入4mL培养液，1200rpm，离心5 min；

(1-3)离心结束后吸弃上清液，取1mL培养液轻柔吹打沉淀，制成单细胞悬液；

(1-4)取培养皿，加入9mL培养液，再将1mL的单细胞重悬液转移至培养皿中；

(1-5)轻晃培养皿使细胞均匀分布于皿底，标记细胞系名称、日期、培养人等信息，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.4.2细胞传代

(2-1)于光学显微镜下观察细胞状态，当细胞形态正常且覆盖率大于85％时可传代；

(2-2)吸弃培养残液，加入2mL PBS轻洗细胞后吸弃；

(2-3)逐滴加入500μL胰酶，使胰酶覆盖培养皿各个角落。将其置于37℃培养箱孵育约2min，消化细胞；

(2-4)显微镜下观察细胞被消化变圆，即可加入4mL培养液终止消化，并反复吹打使细胞脱离皿底，制成单细胞悬液；

(2-5)将单细胞悬液转移至15mL离心管中，1200rpm，离心5min；

(2-6)离心结束后吸弃上清液，取2mL培养液重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液；

(2-7)取两个培养皿，各加入9mL培养液及1mL均匀吹打后的单细胞悬液；

(2-8)轻晃培养皿使细胞均匀分布于皿底，标记细胞系名称、日期、培养人等信息，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.4.3细胞冻存

(3-1)显微镜下观察细胞状态，当细胞形态正常且覆盖率大于85％时即可冻存；

(3-2)吸弃培养残液，加入2mL PBS轻洗细胞后吸弃；

(3-3)逐滴加入500μL胰酶，使胰酶覆盖培养皿各个角落。将其置于37℃培养箱孵育约2min，消化细胞；

(3-4)显微镜下观察细胞被消化变圆，即可加入4mL培养液终止消化，并反复吹打使细胞脱离皿底，制成单细胞悬液；

(3-5)将单细胞悬液转移至15mL离心管中，1200rpm，离心5min；

(3-6)离心结束后吸弃上清液，取1mL细胞冻存液重悬细胞，并转移到冻存管中，标记细胞系名称、日期、冻存人等信息，将其放入冻存盒内，-80℃过夜；

(3-7)次日，将冻存管转移到液氮罐中保存。

2.4.4细胞计数法绘制H9c2细胞生长曲线

(4-1)显微镜下观察细胞状态，当细胞形态正常且覆盖率大于85％时即可铺板；

(4-2)吸弃培养残液，加入2mL PBS轻洗细胞后吸弃；

(4-3)逐滴加入500μL胰酶，使胰酶覆盖培养皿各个角落。置于37℃培养箱孵育约2min，消化细胞；

(4-4)显微镜下观察细胞被消化变圆，即可加入4mL培养液终止消化，并反复吹打使细胞脱离皿底，制成单细胞悬液；

(4-5)将单细胞悬液转移至15mL离心管中，1200rpm，离心5min；

(4-6)离心结束后吸弃上清液，取1mL低糖培养液重悬细胞沉淀；

(4-7)将细胞悬液以适当倍数稀释后，取少量细胞悬液缓慢滴至细胞计数板，盖上盖玻片，于显微镜下观察格子内的细胞并计数：细胞密度＝4大格细胞总数 /4×10000×稀释倍数(个/mL)；

(4-8)将2×10⁵个细胞/mL的单细胞悬液按1.5mL/孔均匀接种于24孔板中，每天3个重复孔，共检测7天，总计接种21孔。接种后将24孔板放至37℃培养箱培养；

(4-9)接种当天为第0天，每隔24h，从培养箱中取出24孔板，显微镜下观察当天3孔细胞形态；

(4-10)吸弃当天3孔中的培养残液，加入300μL PBS清洗细胞后吸弃；

(4-11)加入100μL胰酶，培养箱消化1min，加入500μL低糖培养液终止消化，轻柔吹打皿底细胞，使细胞悬浮成为单细胞悬液；

(4-12)将单细胞悬液转移至1.5mL EP管中，取少量滴至细胞计数板，进行细胞计数并记录结果。操作完成后将24孔板放回37℃培养箱中继续培养；

(4-13)汇总7天的计数结果，以时间为横轴，细胞数量为纵轴，绘制细胞生长曲线，判断细胞的对数生长期。

2.4.5MTT法绘制H9c2细胞生长曲线

(5-1)将2.5×10⁵个细胞/mL的细胞悬液按200μL/孔均匀接种于96孔板中，每天6个重复孔，共检测7天，总计接种42孔。接种后将96孔板放至37℃培养箱培养；

(5-2)接种当天为第0天，接种20h后，在第1天的6孔中分别加入20μL MTT 溶液；

(5-3)4h后吸弃6孔中液体，再分别加入150μL DMSO溶液，于2000rpm 摇床振摇10min；

(5-4)在酶标仪上读取6孔的OD值，检测波长为492nm。操作完成后将96 孔板放回37℃培养箱中继续培养；

(5-5)汇总7天的OD值，以时间为横轴，OD值为纵轴，绘制细胞生长曲线，判断细胞的对数生长期。

图4和图5分别为采用细胞计数法和MTT法绘制的H9c2细胞生长曲线，从图中可以看出，H9c2细胞在第二天生长速度最快，，提示第二天为H9c2细胞的对数生长期。

2.5低温时间和PMBE浓度影响

取两组同皿传代且处于对数生长期的H9c2细胞，对照皿孵育温度为37℃，实验皿组(添加不同浓度的PMBE工作液)孵育温度为4℃，于低温处理3、6、9、 12h后，分别在普通光学显微镜下观察细胞形态，选择合适的低温处理时间。

图6显示了光学显微镜下不同低温时间处理后的H9c2细胞形态，从从图中可以看出，空白对照组的心肌细胞呈单层饱满梭形，贴壁正常。低温下，心肌细胞开始皱缩，细胞间隙大，形状不规则，出现大量心肌细胞脱落悬浮，且随着低温时间的延长，细胞形态愈加糟糕，12h后贴壁细胞极少。说明低温对细胞造成损伤，且损伤程度与低温时间呈正相关。

考虑到在器官移植时，由于路程、手术前准备工作等因素均会造成时间的损耗，供体器官多放于低温器官保存液中4-5h后才进行移植操作。综合考虑低温时间梯度的实验结果及保存液的改良，我们选择高于4-5h的9h作为后续研究的低温处理时间，探索PMBE对心肌细胞的低温保护机制。

图7显示了低温下不同浓度PMBE(μg/mL)处理后的H9c2细胞形态，从图中可以发现，空白对照组心肌细胞形态正常，呈单层饱满梭形。低温对照组细胞皱缩，细胞间隙大，部分破裂，大量脱落悬浮。在低温的同时，随着PMBE浓度的升高，细胞的皱缩程度有所下降，当PMBE浓度为140μg/mL时，细胞形态明显趋于对照组形态。

继续选用含有终浓度140μg/mL PMBE的高糖培养液，于4℃处理对数生长期的人胚肾HEK293细胞；以含有终浓度140μg/mL PMBE的1640培养液，于4℃处理对数生长期的人正常肝L-02细胞。处理9h后，在普通光学显微镜下观察细胞形态，其结果如图8所示。从图8中可以看出，HEK293细胞的对照组形态为上皮细胞样，贴壁正常；低温组细胞皱缩受损，呈拉丝状，且大量漂浮；PMBE组细胞与对照组形态相似，极少量细胞漂浮。L-02细胞的对照组形态为成纤维细胞样，贴壁正常；低温组细胞皱缩变小，大量漂浮；PMBE组细胞对照组形态相似，少数有皱缩趋势。表明PMBE在低温环境下对HEK293、L-02细胞也有保护效应，减少了低温对细胞的损伤。这表明，PMBE保存液具有扩展应用到人体肾脏器官或肝器官的低温保存的可能性。

2.6PMBE低温保护H9c2细胞学机制

2.6.1Annexin V-FITC法检测细胞凋亡

按照试剂盒说明书，大致步骤如下：

(1-1)将2×10⁵个细胞/mL的单细胞悬液按1mL/孔均匀接种于两板24孔板中，共接种2板，一板为对照组，铺1孔，一板为实验组，铺2孔。接种后于37℃培养箱培养；

(1-2)细胞融合率达80％时，对照组更换低糖培养液，继续于37℃培养。实验组分别更换低糖培养液和PMBE终浓度140μg/mL的培养液，于4℃培养；

(1-3)9h后吸弃培养残液，各孔各加入1mL PBS洗涤细胞后吸弃；

(1-4)各孔均加入195μL Annexin V-FITC结合液，再加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；

(1-5)各孔再分别加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀；

(1-6)包上锡箔纸，室温下避光孵育10-20min后，迅即完成荧光镜检，并拍照。

图9则显示了采用Annexin V-FITC法检测的H9c2细胞在荧光显微镜下的凋亡变化，图中，绿色荧光为Annexin V-FITC染色阳性细胞，被绿色荧光染色的为凋亡细胞，未被荧光染色的为正常细胞。可以看出，H9c2细胞的对照组基本没有绿色荧光；低温组绿色荧光很多，表明低温对细胞造成了一定损伤，细胞出现凋亡；而低温下的PMBE组基本没有绿色荧光。这表示PMBE阻滞了细胞凋亡，对H9c2 细胞有较好的低温保护效应。

2.6.2JC-1法检测线粒体膜电位

按试剂盒说明书进行，大致步骤如下：

(2-1)将1×10⁶个细胞/mL的单细胞悬液按2mL/孔均匀接种于两板6孔板中，共接种2板，一板为对照组，铺1孔，一板为实验组，铺2孔。接种后于37℃培养箱培养；

(2-2)细胞融合率达80％时，为对照组更换低糖培养液，继续于37℃培养。实验组分别更换低糖培养液和PMBE终浓度140μg/mL的培养液，于4℃培养；

(2-3)9h后吸弃培养残液，各孔各加入1mL PBS洗涤细胞后吸弃；

(2-4)各孔均加入1mL低糖培养液，且对照组孔内加入1μL CCCP(10mM)；

(2-5)各孔均加入1mL JC-1染色工作液，充分混匀，于37℃孵育20min；

(2-6)孵育期间，取1mL JC-1染色缓冲液(5×)，加入4mL蒸馏水，配制成JC-1染色缓冲液(1×)，置于冰上待用；

(2-7)37℃孵育结束后，吸弃残液；

(2-8)各孔均用1mL JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次，吸弃洗涤液；

(2-9)加入2mL低糖培养液，迅即完成荧光镜检，并拍照。

图10则显示了采用JC-1法检测H9c2细胞的线粒体膜电位变化，图中，红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常，绿色荧光说明线粒体膜电位下降，且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。从图中可以看出，H9c2细胞的对照组全为红色荧光，基本没有绿色荧光；低温组绿色荧光较多，红色荧光很少，表明低温使线粒体膜电位下降，线粒体膜通透性孔道开启，触发细胞凋亡。相比于低温组，PMBE组的红色荧光显著增多，绿色荧光较少。这表示了PMBE阻止了线粒体膜电位的下降，对线粒体膜电位有维护效应。

通过图9和图10的结果可以看出，PMBE很可能是通过阻止线粒体膜电位下降，防止细胞凋亡来发挥其对细胞的低温保护效应的。

总的来说，由于低温会对H9c2细胞的形态及状态都造成了损伤，细胞从饱满的梭形逐渐皱缩，细胞间的连接逐渐松散，且随着低温时间的延长，细胞的低温损伤逐渐加剧，低温处理12h后，细胞大量死亡。本实施例选用细胞具有一定程度损伤的9h作为处理时间，并通过不同终浓度PMBE的培养液处理细胞，发现随着 PMBE浓度的升高，细胞形态有所好转，当PMBE终浓度为140μg/mL时，细胞形态与正常细胞形态极其相似。最终可以确定，低温处理时间为9h、PMBE终浓度为140μg/mL是对于H9c2细胞有较佳的低温保护效应。

同时，通过对人胚肾HEK293细胞、人正常肝L-02细胞进行扩展性检验，同样发现，PMBE培养液对这两种细胞也都表现出了明显的低温保护效应，这表示了 PMBE培养液应用到人体器官保存上的可能。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种马尾松树皮提取物在制备移植器官保存液中的应用，所述的移植器官保存液包括马尾松树皮提取物和HTK液，所述移植器官保存液中，马尾松树皮提取物的浓度为100μg/mL；

所述的移植器官保存液中的工作温度为4℃。

2.根据权利要求1所述的一种马尾松树皮提取物在制备移植器官保存液中的应用，其特征在于，所述的移植器官为大鼠心脏。

3.一种移植器官保存液，其特征在于，包括马尾松树皮提取物和HTK液，所述的移植器官保存液中，马尾松树皮提取物的浓度为100μg/mL。