KR100497003B1

KR100497003B1 - 안구표면 질환 치료용 양막을 보존하기 위한 양막보존액 조성물

Info

Publication number: KR100497003B1
Application number: KR10-2002-0052012A
Authority: KR
Inventors: 김기호; 양은경; 고강일; 김성포; 김재찬; 이희구; 박정극
Original assignee: 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2005-06-23
Also published as: KR20040020413A

Abstract

본 발명은 안구표면 질환 치료용 양막을 보존하기 위한 양막보존액 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기존의 배지와 냉동보호제로 이루어진 양막보존액에 양막 세포에 대해 독성이 전혀 없고 세포재생 효과가 있을 뿐만 아니라 염증 및 자극을 완화시키는 작용이 입증된 EGCG(epigallocatechin gallate)와 마치현(portulaca oleracea) 추출물을 특정량으로 첨가 사용함으로써 기존의 보존액에 비해 조직에 스트레스와 손상을 줄이는 동시에 보호의 역할을 하여 최적의 상태에서 조직을 보존할 수 있을 뿐 아니라 안구 상피세포의 재생을 촉진하는 안구표면 질환 치료용 양막을 보존하기 위한 양막보존액 조성물에 관한 것이다.

Description

안구표면 질환 치료용 양막을 보존하기 위한 양막보존액 조성물{The cryopreservative composites of amniotic membrane for healing ocular surface diseases}

양막은 융모막(chorion laeve membrane)이 붙어있으며, 태아를 보호하고 떠 받혀주기 위한 양수로 채워져 있는 태반을 구성하고 있는 가장 안쪽에 있는 투명하고 얇은 막으로 1900년대 초기에 화상치료용 드레싱으로 사용되기 시작하여 그 효능의 우수성이 알려짐에 따라 근래에 와서는 화상뿐만 아니라 피부 찰상(dermabrasion), 궤양 말기(lower extremity ulcers), 나병으로 인한 피부장애(leprotic dermal lesions), 스티븐-존슨 증후군(stevens-johnson syndrom), 복구를 위한 외과 수술, 후두학, 안과학 등과 선천적 질병, 파킨스 증후군(parkinson syndrom), 말초와 중앙신경의 축색(axonal)의 재생을 촉진하는데 사용되고 있다[tyszkiewicz et.al, amnion allografts prepared in the central tissue bank in warsaw, annals of transplantation, vol.4, no.3-4, 1999, pp.85-90].

현재, 양막은 환자의 혈액, 뇨, 태반 등과 같이 수술 시 적출, 폐기되어 산업적으로 이용할 수 있게 되어 있다. 예를 들어, 양막을 포함하는 태반은 여러 제약회사에서 제약생산에 이용되어 제품화되었다.

양막의 사용 중 특히, 양막의 눈에 적용하는 기술은 세계최초로, 심하게 손상받은 안구조직에 양막 기질을 이식하여 간질의 염증을 억제하고 신생혈관 및 혼탁을 억제하는 효과를 발표하였다[Transplantation of Preserved Human Amniotic Membrane for Surface Reconstruction in Membrane for Surface Reconstruction in Severely Damaged Rabbit Corneas, CORNEA 14(5):473-484, 1995]. 또한, 지속성 상피결손과 화상, 난치성 각막염에 양막을 일시적으로 패칭(patching)하거나 이식 수술을 하여 실명될 환자를 성공적으로 치료한 결과들이 계속하여 발표되고 있다[kinmerly C.. sippel, MD, Josepph J.K.Ma,MD, Amniotic membrane surgery, Current Opinion In Ophthalmology 2001, 12:269-281/ J.S. Kim et al, Amniotic membrane patching promotes healing and inhibits proteinase activity on wound healing following acute corneal alkali burn, Exp. Eye Res. (2000) 70, 329-337/Renato et al., Amniotic membrane transplantation for symptomatic bullous keratopathy, Arch Ophthalmol. 1999; 117 : 1291-1297/ J. C .Kim et al. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction, Jonural of the RIMSK : Vol. 30, No. 3, 1998,/이우재 외, 양수막의 생체조직적 합성과 양수막 이식이 각막 신생혈관억제에 미치는 효과, 대한 안과학회지 별책 제38권 제7호 1997,/김정환 외, 각막천공 및 천공직전에서의 양막이식, 대한안과학회지 :제40권 제6호 1999 등].

이렇게 안구표면 질환에 탁월한 염증 억제 및 치료 효과를 주는 생체물질인 양막을 각막표면 질환인 간세포 손상과 윤부결핍증 환자에게 손상되지 않고 깨끗하게 가공하여 제공하는데 의의가 있다. 또한, 이러한 양막을 제공하기 위해 가공 방법뿐만 아니라 가공된 양막 보존액의 역할도 중요하다.

기존의 보존액은 글리세롤(glycerol)과 조직 배양액인 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 단순히 혼합하여 제조한 것으로 기본적으로 조직이 부서지는 것을 방지하는 기능을 가지고 있으나, 양막 조직의 생리활성 효능을 유지할 수 없어 즉, 외부 환경이나 동결, 해동시의 스트레스에 그대로 노출되어 왔다.따라서, 조직이 물리적으로는 보존되나, 그 효능이 원래의 상태로 보존되지 않아 치료의 효과가 떨어지는 문제점을 가지고 있었다.

안구표면 질환 치료용 양막의 경우 손상을 입었을 때 사용 시기가 빠를수록 좋으므로 사고나 질병에 대비하여 항상 비치해 두어야 한다. 따라서, 이러한 시간적 차이를 극복하고 신선한 양막 즉, 효능효과를 보존하고 있는 양막을 유지하기 위한 양막 보존액의 필요가 절실하다.

이에, 본 발명자들은 상기의 문제점을 극복하고, 각막 손상시 치료에 도움을 주고자 각막 세포증식효과와 항염증 효과를 가지고 있는 백여가지의 천연물 중 스크리닝한 결과, 항산화제로 알려진 차(Thea Sinthesis L.)에 다량 함유되어 있는 EGCG(epigallocatechin gallate)가 항산화 효과가 가장 크고 세포증식 효과가 우수하며, 세포 독성 또한 없어 보존액에 첨가함으로써 양막 가공과 동결과 해동시 양막에 발생되는 스트레스와 손상을 줄여 생존도와 생리활성을 유지시키는 동시에 보호의 역할을 하여 최적의 상태에서 조직을 보존할 수 있으며, 마치현 추출물은 항염증 작용과 자극완화 작용으로 인터루킨 알파(interleukin-α)의 분비를 억제하여 보존된 양막을 환부에 치료 적용시 환부의 빠른 치유와 통증을 완화시킬 수 있음을 확인하여 이들을 기존 양막보존액에 최적의 조성으로 첨가 사용하여 새로운 안구표면 질환 치료용 양막보존액 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 양막 시술 전까지 양막의 손상이 없게 하고, 시술 후 거부반응의 가능성을 줄이며, 빠른 상처치유를 하여 신선한 양막의 효능효과를 보존하기 위한 양막보존액 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

삭제

본 발명은 배지와 냉동보호제로 이루어진 안구표면 질환 치료용 양막을 보존하기 위한 보존액 조성물에 있어서,상기 배지가 EMEM(Eagle's Minimal Essential Medium) 또는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 49.5 내지 85 중량%,상기 냉동보호제가 글리세롤(Glycerol) 14.5 내지 50 중량%이며,양막보존제로서 EGCG(epigallocatechin gallate) 0.0005 내지 0.0015 중량% 및 마치현(portulaca oleracea L.) 추출물 0.05 내지 0.5 중량%로 이루어진 안구표면 질환 치료용 양막을 보존하기 위한 양막보존액 조성물을 그 특징으로 한다.이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 기존의 배지와 냉동보호제로 이루어진 양막보존액에 양막 세포에 대해 독성이 전혀 없고 세포재생 효과가 있을 뿐만 아니라 염증 및 자극을 완화시키는 작용이 입증된 EGCG(epigallocatechin gallate)와 마치현(portulaca oleracea) 추출물을 특정량으로 첨가 사용함으로써 기존의 보존액에 비해 조직에 스트레스와 손상을 줄이는 동시에 보호의 역할을 하여 최적의 상태에서 조직을 보존할 수 있을 뿐 아니라 안구 상피세포의 재생을 촉진하는 안구표면 질환 치료용 양막을 보존하기 위한 양막보존액 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 양막보존액의 조성은 영양배지와 냉동보호제로 이루어져 있다. 상기 배지로는 EMEM(Eagle'S Minimal Essential Medium), RPMI 1640 또는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 등이 바람직하며, 여기에는 많은 첨가제가 포함될 수 있다. 첨가제로는 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제(antibiotics) 등이 있다. 양막냉동을 위한 배지 및 보존액은 냉동 저장 온도가 어떤 온도로 선택되더라도 발생할 수 있는 손상을 최소화시킬 수 있어야 한다. 이때, 배지는 세포영양배지로서 그 함량은 49.5 내지 85 중량%가 바람직하며, 49.5 중량% 미만이면 환자치료시 세포독성이 우려되는 문제가 있고 85 중량% 초과하면 세포보존에 문제점이 있다.

또한, 양막보존액은 글리세롤(Glycerol) 또는 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 같은 냉동보호제의 함량도 고려되어야 하는 바, 본 발명에서 그 함량은 14.5 내지 50 중량%가 바람직하며, 14.5 중량% 미만 사용시에는 결빙된 얼음에 의하여 양막의 세포막과 조직이 손상되는 문제가 있고, 50 중량% 초과 사용시에는 환자에 치료 적용할 때에 세포독성이 우려되는 문제가 있다.

그리고, 기존의 양막보존액과 달리 세포 보호효과가 탁월한 항산화제를 첨가하는데 본 발명에 특징이 있는 바, 항산화제 중 세포증식효과와 각막 및 피부상피세포의 재생능력, 피부, 각막조직의 자극완화 및 염증완화능이 탁월한 EGCG, 마치현 추출물 또는 이들의 혼합물을 첨가함으로써 기존의 보존액의 한계점인 양막조직의 물리적 보호기능에 국한하지 않고, 더 나아가 냉동 보존시의 온도차의 스트레스를 감소시키고 자극을 완화시켜서 양막을 손상없이 보존하고, 또한 안구표면 질환 치료효과를 높인다는 점에서 차이를 두었다.

EGCG의 함량은 0.0005 ∼ 0.0015 중량%가 바람직하며, 이때 0.0005 중량% 미만 사용하면 증식 효능이 없는 문제점이 있고, 0.0015 중량% 초과 사용하면 오히려 약간의 자극이 발생하는 문제가 있어 바람직하지 못하다.

또한, 염증 및 자극 완화 효과가 있는 마치현을 사용함으로써 보존액 조성물의 자극도 완화시켜 줄뿐만 아니라 항염증 활성도 가지고 있어 상처 치유에 도움을 줌으로 기존의 보존액과 차이점을 두었다. 마치현의 함량은 0.05 ∼ 0.5 중량%가 바람직하며, 이때 0.05 중량% 미만 사용하면 자극완화 활성이 감소되는 문제점이 있고, 0.5 중량% 초과 사용하여도 더 큰 염증 활성을 기대할 수 없는 문제가 있어 바람직하지 못하다.

또한, 상기 EGCG 와 마치현 추출물을 혼합사용시에는 시너지효과가 나타나 스트레스와 손상을 줄이는 동시에 보호와 세포 재생 치료 역할을 하여 최적의 상태에서 조직을 보존할 수 있어 신선한 양막을 유지할 수 있다.

본 발명에 따른 안구질환 치료용 양막과 원래의 상태에서 처리과정동안 손상을 입지 않도록 처리하여 더 좋은 효과를 얻을 수 있게 하였고, 양막보존액 조성물은 이러한 양막을 시술 전까지 처음의 손상되지 않은 상태로 보존하기 위해 EGCG , 마치현 추출물 또는 이들의 혼합물을 첨가하여 양막을 더 좋은 환경에서 보존하여 치료에 도움을 주도록 만든다.

이와 같은 양막보존액 조성물은 눈의 각막, 결막 등 상피층 손상으로 상피층 재생이 안되고 염증이 심화되어 시력을 잃고 치료가 어려운 경우 환자에게 적용하여 환자의 시력을 되찾는 의약품으로 활용할 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

시험예 1: 항산화제의 양막에 대한 독성시험

항산화제에 의한 양막에의 독성에 대한 영향을 보기 위하여 항산화제를 넣은 보존액(배지로 DMEM 50중량%, 냉동보호제로 Glycerol 49.999중량%)과 넣지 않은 보존액(배지로 DMEM 50중량%, 냉동보호제로 Glycerol 50중량%)을 제조하여 가공된 양막을 담근 후 -80 ℃에서 한달 간 보관 후에 조직을 고정하고 단면을 절단하여 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 실시하였다. 상기 항산화제는 EGCG, 은행잎 추출물 및 마치현 추출물을 사용하였다. 농도는 각각의 항산화제에 대하여 2가지 농도인 0.001 중량%, 0.0001 중량%를 제조하였다. 각각 제조된 보존액 15 ㎖에 2 ×2 ㎠로 가공된 양막을 담근 후 20분 정도 18 ℃에서 정치시킨 다음 -80 ℃ 온도의 급속 냉동고(deep freezer)[Sanyo, Japan]에서 한 달간 보관한 후에 H&E 염색을 실시하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, H&E 염색사진을 보면 항산화제를 첨가하지 않은 대조군(control)과 비교해 볼 때 EGCG와 마치현을 넣은 보존액에 있는 양막에는 상피층의 조직상태가 아무 변화없이 좋은 상태를 유지하고 있는 반면, 은행잎 0.001 중량%를 첨가한 양막은 상피 세포층이 손상된 것을 알 수 있었다. 이것으로 볼 때 은행잎은 약간의 독성을 가지고 있는 것으로 판단되나, EGCG와 마치현은 해당농도에서 독성이 없음을 입증하였다.

시험예 2: 항산화제의 각막 세포에 대한 영향

항산화제의 각막세포에 대한 영향을 보기 위하여 세포 생존률을 측정하였다. 세포 생존률은 MTT 분석법에 의해 실시하였다. 각막 세포는 소의 각막 상피세포(bovine cornea epithelium)로 96 웰 플레이트에 1 ×10⁴/well의 수로 파종(seeding)하였다. 5% CO₂, 37 ℃의 조건 하에서 24시간 동안 배양한 후, 항산화제인 EGCG, 은행잎, 마치현을 0.001 %, 0.0001 %의 농도로 첨가하였다. 대조군으로는 정제수를 넣었다. 5% CO₂, 37 ℃의 조건 하에서 72시간 후에 MTT를 넣은 다음 4시간 후에 가용화(solubilization) 용액을 첨가하였다. 5% CO₂, 37 ℃의 조건 하에서 16시간 후에 ELISA-리더로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

항산화제의 농도(중량%)	항산화제에 대한 세포 생존율(%)
항산화제의 농도(중량%)	EGCG	Ginkgo	Portulaca	CONTROL
0.001	201.3	106.8	101.9	100.2
0.0001	109.2	103.4	104.7	100.4

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, EGCG 0.001%를 첨가하였을 경우 가장 높은 세포 증식효과를 보였다. 따라서, 보존액에 EGCG를 첨가하면 각막의 세포에 손상을 주지 않고 오히려 세포재생에 유리한 효과를 얻을 수 있다[도 2].

시험예 3: 염증, 자극이 유발된 상피세포층에 대한 마치현 추출물의 세포생존도 회복 효과(MTT conversion assay)

항산화제의 항산화기능과 항염증기능에 의한 각막과 피부의 상피세포의 세포생존도에 대한 영향을 알아보기 위해 다음과 같이 실시하였다.

우선, 기질층(또는 진피층)을 만들기 위해 TypeⅠ 콜라겐 매트릭스[Nitta Co.]와 5배로 농축된 DMEM, 그리고 2.2% NaHCO₃와 200 mM HEPES, 0.05N NaOH로 제조된 완충용액을 7 : 2 : 1로 섞어 만든 진피세포(human fibroblast cell line)를 1 ×10⁵ cells/㎖로 혼합하여 직경 10 mm의 삽입물(insert)에 각각 200 ㎕의 진피세포가 혼합된 콜라겐 용액을 넣어 기질층을 제조한다.

기질층 위에 상피세포(human epithelial cells)를 3 ×10⁵ cells/insert로 접종한다. 삽입물 밖에만 DMEM(10% FBS)와 K-SFM(supplement)를 1 : 1로 섞은 배지를 넣고 7일간의 배지에 완전히 잠겨 배양(submerge culture) 후 14일 동안 기-액 계면 배양(air-liquid interface culture)기술을 이용하여 조직배양하였다.

배양이 끝난 후 새로운 배지로 교체하고 급성 자극(acute irritancy)을 일으키기 위해 SLS(sodium lauryl sulfate, Sigma Chemical CO., St. Louis, USA)를 단회 투여(single dose) 방식으로 각 농도별로 10 ㎕ 배양된 인공상피조직 표면에 적용하였다. 38 ℃, 5% CO₂ 항온기에서 4시간 방치한 후, 각 농도의 마치현 추출물을 투여하였다. 24시간 후 배지는 인터루킨-1α를 측정하기 위해 샘플링하고, 배양된 상피조직은 MTT 전환을 이용, 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.

즉, 배양된 기질조직 위에 상피 세포를 증식 및 분화시켜 만든 인공상피조직에 각 농도의 SLS를 적용하여 급성 자극을 일으킨 후 마치현 추출물을 도포한 전후에 대하여 세포 생존율을 측정한 결과이다. 도 3의 결과에 따르면 마치현을 도포하지 않은 인공상피조직의 경우 0.05% 농도의 SLS에서 생존율이 80% 낮아진 후 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소하다가 0.3%에 이르러 약 50%까지 감소하였다. 반면 SLS 처리 후 마치현 추출물을 처리한 인공상피조직의 경우 0.05%의 SLS 농도에서 약 95%까지 생존율을 유지하였고, 0.3%의 SLS 농도에서는 60% 이상의 세포 생존율을 유지하였으므로 자극, 염증물질로 인한 상피세포층의 손상을 마치현 추출물로 회복시켰음을 입증하였다.

시험예 4: 염증, 자극이 유발된 상피세포층에 대한 마치현 추출물의 상피세포의 사이토카인 생성 억제 효과(Interleukin-1α assay)

상기 시험예 3과 같은 방법으로 제조된 인공상피조직에 10 ㎕의 자극성 test chemical, SLS를 표면에 적용하여 24시간 배양한 후, 상피조직의 대사산물이 분비된 배지를 샘플링하여 사이토카인의 양을 측정하였다. ELISA 키트[Endogen Inc. (Boston, MA, USA)에서 구입]을 이용, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 4는 실험실에서 제조한 인공상피조직에 대해 0.05 ∼ 1% 사이의 SLS 농도를 투여한 후 전염증성 조절인자(pro-inflammatory mediator)인 인터루킨 방출(interleukin release) 양상을 나타낸 그래프이다. 인터루킨-1α의 경우 SLS만을 투여한 경우 0.1% 농도의 SLS에 대해 약 100 pg/㎖의 분비를 보이다가 1%의 SLS에서 250 pg/㎖ 이상 증가하였다. SLS 처리 후 0.05% 및 0.5%의 마치현 추출물을 적용하였을 때, 0.5 중량%의 마치현 추출물을 적용하였을 때 50 pg/㎖ 이하였고, 0.05 중량%의 마치현 추출물을 적용하였을 경우에도 그 양이 상당히 감소하였다.

이러한 결과로 본 발명자는 SLS의 상피조직 자극에 대해 마치현 추출물의 자극완화 효능을 확인할 수 있었다.

실시예 1

EMEM 79.999 중량%, 글리세롤(세포배양급) 19.9 중량%, EGCG 0.001 중량%, 마치현 추출물 0.1 중량%를 혼합하여 양막보존액을 제조하였다. 먼저, EMEM[GIBCO 사]을 1 ℓ제조한 후 여기에 세포배양용 글리세롤[sigma 사] 248.75 ㎖, EGCG[sigma 사] 0.01 g 을 넣고, 여기에 마치현 추출물을 1.25 ㎖ 넣어 30분간 교반하였다. 클린 벤치(clean bench) 안에서 정량 송액 펌프(peristaltic pump, Master flex)를 이용하여 0.2 ㎛의 필터[Sartorius]로 여과하여 무균 상태의 양막 보존액을 제조하였다.

실시예 2

EMEM 79.999 중량%, 글리세롤(세포배양급) 20 중량%, EGCG 0.001 중량%을 혼합하여 양막보존액을 제조하였다. 먼저, EMEM[GIBCO 사]을 1 ℓ제조한 후 여기에 세포배양용 글리세롤[sigma 사] 250 ㎖, EGCG[sigma 사] 0.01 g을 넣고 30분간 교반하였다. 클린 벤치 안에서 정량 송액 펌프[Master flex]를 이용하여 0.2 ㎛의 필터[Sartorius]로 여과하여 무균 상태의 양막 보존액을 제조하였다.

실시예 3

EMEM 80 중량%, 글리세롤(세포배양급) 19.9 중량%, 마치현 추출물 0.1 중량%를 혼합하여 양막보존액을 제조하였다. 먼저, EMEM[GIBCO사]을 1 ℓ제조한 후 여기에 세포배양용 글리세롤[sigma 사] 248.75 ㎖을 넣고, 여기에 마치현 추출물을 1.25 ㎖ 넣어 30분간 교반하였다. 클린 벤치 안에서 정량 송액 펌프[Master flex]를 이용하여 0.2 ㎛의 필터[Sartorius]로 여과하여 무균 상태의 양막 보존액을 제조하였다.

비교예 1

EMEM[Gibco사]을 500 ㎖ 제조한 후 여기에 세포배양용 글리세롤[Sigma 사] 500 ㎖, FBS[Gibco 사] 10 ㎖ 을 넣고 30분간 교반하였다. 클린벤치 안에서 정량 송액 펌프[Master flex]를 이용하여 0.2 ㎛의 필터[Sartorius]로 여과하여 무균 상태의 양막 보존액을 제조하였다.

시험예 5: 양막 보존 효과(EGF 정량)

상기 비교예 1에서 얻은 양막 보존액과 상기 실시예 1, 2 및 3에서 얻은 양막보존액의 양막보존 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

제왕절개하여 얻은 태반에서 양막을 24 시간 안에 수거하였다. 수거된 양막을 항생제(antibiotic-antimycotic biotics) 1%가 함유된 500 ㎖ PBS에 넣어 4 ℃의 상태를 유지하여 운반하였다. 운반된 양막을 TSA배지(Tryposin soybean casein digest medium)로 미생물 배양하며, 배양은 최소 7일간 37 ℃의 온도로 배양하였다. 배양 후 미생물이 나올 경우 폐기하고, 미생물이 발견되지 않은 양막을 혈액과 혈흔을 씻어내기 위하여 멸균된 생리 식염수 500 ㎖이 함유된 병에서 진탕기(shaker)를 이용하여 회당 10분 동안 세척하였다. 3회 세척 후에 얇은 양막만을 얻기 위해 12시간 동안 침지시켰다. 침지 후 4회 세척하고, 마지막 8회 세척 시에는 증류수로 세척하였다. 양막에 붙어 있는 다른 조직을 벗겨내고 2 ×2 ㎝²의 작은 정사각형으로 절단된 멸균된 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 양막에 붙이고, 니트로셀룰로오스 막의 크기로 양막을 절단하였다. 이때, 양막의 융모막 쪽이 니트로셀룰로오스 막에 닿게 하여 붙였다. 저온 냉동이 가능한 멸균된 용기에 상기에서 제조된 양막보존액을 넣은 후 양막을 넣고, 보존액이 양막에 충분히 스며들도록 약 20분 정도 방치한 후 -80 ℃의 냉동고(Deep Freezer)에 저장하였다. 상기 모든 공정은 무균상태에서 수행해야 한다. 저장 1달 후에 보존 효과를 알아보기 위해 EGF(Epidermal Growth Factor) 정량을 실시하였다. EGF는 표피의 성장을 도와주는 활성 인자로 손상된 상처를 치료하는데 있어 중요한 인자 중 하나이다. 저장되어 있던 양막 보존액을 녹인 후에 보존액 안에 있는 양막을 각각 무게를 달고 PBS에 추출하여 양막 추출물을 얻었다. 추출물을 15,000 rpm, 5분의 조건으로 원심분리 하여 상층액을 취해 EGF 정량을 실시하였다. EGF 정량은 EGF 검출 키트[KOMA Biotech.INC, 아산제약]을 사용하여 실시한 결과는 다음 표 2와 같다.

구분	비교예 1	실시예 1	실시예 2	실시예 3
EGF 농도 (pg/㎖)	1.45	3.02	2.53	2.36

상기 표 2에서 보여주듯이, 항산화제로 EGCG 또는 마치현 추출물을 사용한 실시예 1과 2의 EGF 농도가 우수하게 나타나지만, 특히 실시예 1 에서 EGCG와 마치현 추출물을 함께 넣은 양막보존액에서 EGF 활성인자가 가장 잘 보존됨을 알 수 있었다. 이것으로 미루어 볼 때 함께 넣은 보존액에서 효과가 상승되어 각막 손상 치료와 빠른 치유에 도움을 줌을 알 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 안구질환 치료용 양막보존액 조성물은 양막 시술 사이에 양막에 효과적 영양을 공급하여 양막보존시간을 양막내피세포 및 표피세포의 손상이 없게 하고, 시술 후 거부반응의 가능성을 줄이며, 시술 후 빠른 상피재생과 상처치유를 할 수 있게 하고, 더 나아가서는 각막 손상 환자 및 실명자에게 광명을 찾게 하기 위함이다.

도 1은 항산화제 종류와 농도에 따른 양막에 미치는 영향을 나타낸 H&E 염색사진이다.

도 2는 항산화제 종류와 농도에 따른 각막세포 증식 효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 염증, 자극이 유발된 상피세포층에 대한 마치현 추출물의 세포생존도 회복 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 염증, 자극이 유발된 상피세포층에 대한 마치현 추출물의 상피세포의 사이토카인 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

Claims

배지와 냉동보호제로 이루어진 안구표면 질환 치료용 양막을 보존하기 위한 양막보존액 조성물에 있어서,

상기 배지가 이엠디엠(EMEM, Eagle's Minimal Essential Medium) 또는 디엠이엠(DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium) 49.5 내지 85 중량%,

상기 냉동보호제가 글리세롤(Glycerol) 14.5 내지 50 중량%이며,

양막보존제로서 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG, epigallocatechin gallate) 0.0005 내지 0.0015 중량% 및 마치현(portulaca oleracea L.) 추출물 0.05 내지 0.5 중량%로 이루어진 것을 특징으로 하는 안구표면 질환 치료용 양막을 보존하기 위한 양막보존액 조성물.
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