KR20010084165A

KR20010084165A - 녹차카테킨(ｇｔｃ)을 유효성분으로 하는 ｄｎａ 산화적손상 억제제

Info

Publication number: KR20010084165A
Application number: KR1020000008987A
Authority: KR
Inventors: 허문영; 윤여표; 박종범; 박현주
Original assignee: 허계성; 삼아약품 주식회사
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2001-09-06
Also published as: KR100398318B1

Abstract

본 발명은 녹차카테킨(Green tea catechins, GTC)을 유효성분으로 하는 DNA 산화적 손상 억제제에 관한 것이다. 본 발명의 GTC는 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)로부터 추출되며, 에피갈로카테킨 갈레이트를 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨을 8 내지 27%(w/w), 에피카테킨 갈레이트를 3 내지 7%(w/w) 함유한다. 전기 GTC가 항산화 효과, 자유라디칼 소거작용 및 활성산소종에 의한 DNA 산화적 손상에 억제작용이 있음을 확인하였는 바, 녹차로부터 분리한 GTC는 약제학적으로 허용되는 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제 등의 담체와 함께, DNA 산화적 손상 억제제의 유효성분으로서 사용될 수 있을 것이다.

Description

녹차카테킨(ＧＴＣ)을 유효성분으로 하는 ＤＮＡ 산화적 손상 억제제{Inhibitor for Oxidative DNA Damage Comprising Green Tea Catechins as an Active Ingredient}

본 발명은 녹차카테킨(Green tea catechins, GTC)을 유효성분으로 하는 DNA 산화적 손상 억제제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)로부터 추출되며, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG)를 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC)을 8 내지 27%(w/w), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate, ECG)를 3 내지 7%(w/w) 함유하는 GTC를 유효성분으로 하는 DNA 산화적 손상억제제에 관한 것이다.

DNA 손상을 일으키는 4가지 중요한 요인은 산화(oxidation), 메틸화(methyl-ation), 탈아민화(deamination) 및 탈퓨린화(depurination)로서, 이 중에서 산화가 가장 주된 원인이며, 사람의 경우 하루에 세포 1개당 DNA 산화적 손상의 빈도는 10⁴로, 핵 DNA에서는 1/130,000의 빈도로, 미토콘드리아 DNA에서는 1/8,000의 빈도로 손상이 일어나고 있다(참조: Ames B.N.,Mutation Res., 214:41, 1989). 아울러, DNA 산화는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의하여 주로 발생하며, DNA의 산화적 손상이 지속된 상태에서 세포가 분열을 계속하면 DNA 염기에 점돌연변이(point mutation), 쉬프트돌연변이(shift mutation) 등이 일어나 유전인자에 변화를 초래할 수 있다. 예를 들어, 산소자유라디칼(oxygen free radical)이 DNA를 공격하면 구아닌 염기의 8번 부위가 수산화되어 8-하이드록시 -2'-데옥시구아노신(8-hydroxy-2'-deoxy-guanosine, 8-OH2'dG)로 변화하며, 생체내에서도 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신은 하루에 세포 1개당 거의 4,000 분자의 비율로 생성된다. 따라서, 과다하게 생성된 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신을 DNA 손상의 생물학적 표지로 삼을 수 있을 뿐만 아니라, 실제 암, 각종 퇴행성 질환 및 노화 등의 질환에서도 생물학적 표지로서 활용할 수 있다(참조: Fenech M. et al.,Mutagenesis,14(6):605, 1999).

한편, 녹차는 차나무(Theae sinensisL.,Theaceae)의 잎을 말린 것으로서, 녹차 중의 카테킨류에 대하여 혈압강하작용(참조: Hara Y. et al.,Nippon nogeikagaku kaishi, 61:803, 1987), 암 예방작용(참조: Xu Y. et al.,Cancer Res., 52:3875, 1992), 충치예방(참조: Otake S. et al.,Cancer Res., 25:438, 1991), 혈소판응집저해활성(참조: Sagesaka-mitane Y. et al.,Chem. Pharm. Bull., 38:790, 1990), 혈당강하작용(참조: Natsuki Matsumoto et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 57:525, 1993) 등 다양한 생리활성이 보고되었다. 아울러, 헤테로고리의 아민이 항산화작용을 가지며, 이때 녹차추출물이 부가적으로 시너지효과를 나타낸다는 사실이 밝혀졌으나(참조: Hirose M. et al.,Eur J. Cancer Prev., 7(1):61, 1998), 녹차추출물 단독으로 DNA 산화적 손상에 대한 억제효과의 여부는 아직까지 밝혀진 바가 없다.

따라서, 녹차추출물의 활성산소종에 의한 DNA 산화 억제효과 존재 여부를 확인하고, 녹차추출물 중 DNA 산화 억제효과를 보이는 활성성분이 어떠한 성분인지 규명한 다음, DNA 산화적 억제 손상 억제 효과를 가지는 성분을 함유한 DNA 산화 억제제제로서의 의약품을 개발해야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 녹차로부터 DNA 산화적 손상억제제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)로부터 에피갈로카테킨 갈레이트를 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨을 8 내지 27%(w/w), 에피카테킨 갈레이트를 3 내지 7%(w/w) 함유하는 GTC를 분리하여, 전기 GTC가 항산화 효과, 자유라디칼 소거작용 및 활성산소종에 의한 DNA 산화적 손상에 억제작용이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 녹차로부터 에피갈로카테킨 갈레이트를 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨을 8 내지 27%(w/w), 에피카테킨 갈레이트를 3 내지 7%(w/w) 함유하는 녹차카테킨(GTC)을 유효성분으로 하는 DNA 산화적 손상억제제를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 GTC의 성분 중 에피갈로카테킨 갈레이트의 HPLC 스펙트럼이다.

도 2는 본 발명의 GTC의 성분 중 에피갈로카테킨의 HPLC 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 GTC의 성분 중 에피카테킨 갈레이트의 HPLC 스펙트럼이다.

도 4는 본 발명의 GTC의 HPLC 스펙트럼이다.

본 발명의 녹차카테킨(GTC)은 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)의 잎에서 추출하여 만든 건조엑스로서 1g이 원생약 10g에 상당하며, 그 중 에피갈로카테킨 갈레이트(C₂₂H₁₈O₁₁; 458.4) 33 내지 89%(w/w), 에피갈로 카테킨(C₁₅H₁₄O₇; 306.3) 8 내지 27%(w/w) 및 에피카테킨 갈레이트(C₂₂H₁₈O₁₀; 442.5) 3 내지 7%(w/w)를 함유하는 물질로서, 녹차를 유기용매로 추출한 후, 농축하여 정제과정을 통하여 얻은 액을 동결건조하여 황색결정의 GTC를 수득하였다. 전기 수득된 GTC 및 GTC의 주요 성분인 EGCG의 항산화 효과를 펜턴 시약(Fenton's reagent)을 사용하여 측정하고, 1,1-디페닐-2-피크릴 하이드라질(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazil, DPPH)에 대한 자유라디칼 소거작용을 확인하였다. 아울러, 세포주를 이용한 DNA 산화적 손상에 대한측정을 다음의 두가지 방법으로 실시하였다: 우선, GTC 또는 EGCG의 과산화수소 유도 DNA 산화적 손상에 대한 억제작용은 차이니즈햄스터 폐섬유아세포를 대상으로 단일세포전기영동에 의한 코멧 분석(Comet assay)(참조: Singh N.P.,Cell Res., 175:184, 1988)법으로 측정하였으며, 그 다음으로 송아지흉선의 DNA를 대상으로 GTC 또는 EGCG의 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신 생성 억제효과를 비타민 E와 비교하였다. 결과적으로, 본 발명의 GTC 및 전기 GTC의 주요성분인 EGCG는 자유라디칼 소거작용 및 활성산소종에 의한 DNA 산화적 손상 억제작용을 가지며, 에피갈로카테킨 갈레이트를 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨을 8 내지 27%(w/w), 에피카테킨 갈레이트를 3 내지 7%(w/w) 함유한 GTC는 단일물질 EGCG에 버금가는 DNA 산화적 손상 억제작용을 가지므로, 천연물추출에 있어서, 단일물질로 분리정제하는 단계를 단순화하여 경제적일 뿐만 아니라, 전기 GTC에 약제학적으로 허용가능한 담체를 가하여 DNA 산화적 손상억제제로 제조할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 녹차카테킨(GTC)의 수득

녹차(Theae sinensisL.,Theaceae-var. bohea 中 yabugida, 제주도산) 1000g에 70%(v/v) 에탄올수용액 10ℓ로 85 내지 90℃에서 3시간 동안 1차 추출한 다음, 동일한 용매 5ℓ로 동일한 조건하에 2차 추출을 완료하여, 진공회전증발기에서 약 1000㎖이 될 때까지 농축하였다. 전기 농축액에 물을 가하여 2 내지 3배로 희석시키고, 14,000rpm에서 20분간 원심분리하여 고형성분을 완전히 제거한 다음, 모아진 상등액을 1.2배의 클로로포름으로 2회 추출하였다. 그런 다음, 클로로포름층을 제거하고, 수층을 1.2배의 에틸아세테이트로 4회 추출하여 얻은 액을 합한 후, 추출용매가 완전히 없어질 때까지 감압건조시켰다. 전기 건조물을 소량의 물로 용해시키고 동결건조하여 GTC 분말을 수득하였다.

실시예 2: GTC, EGCG, EGC 또는 ECG 정성 및 정량

실시예 2-1: GTC 중 총카테킨의 정량

GTC 분말 25㎎에 열수를 80㎖을 가하고 80℃ 이상의 수욕조에서 30분간 추출하고, 물을 가하여 부피를 100㎖로 조정한 후, 초류액 20㎖를 제외하고 여과한 액을 시험용액으로 사용하였다. 그런 다음, 2개의 25㎖ 용량 플라스크에 물 5㎖를 각각 가하고, 이에 주석산 철시약 5㎖씩을 첨가한 다음, 인산완충용액을 가하여 최종부피를 25㎖로 하고 충분히 혼합하였다. 이때, 사용된 주석산철시약은 황산 제 1철(7수화물) 0.1g 및 주석산칼륨나트륨 0.5g을 물에 용해시켜 부피를 100㎖로 하였고, 인산완충용액은 0.066M 인산이나트륨용액 및 0.066M 인산일칼륨용액을 잘 혼합하여 pH 7.5로 조정하였다. 이어서, 물을 사용한 것을 대조액으로 하여 액층 1㎝, 파장 540㎚에서 흡광도를 측정하고, 표준용액의 농도(㎎/㎖)에 대한 흡광도를 하기와 같은 방법으로 표준곡선을 작성하였다. 즉, 표준품인 몰식자산에틸 100㎎에 물을 가하여 부피를 100㎖로 조정한 후, 전기 액 5, 10, 15, 20 및 25㎖를 각각 취하고 물을 가하여 최종 부피가 100㎖이 되도록 표준액을 제조하여, 물을 사용한 것을 대조액으로 액층 1㎝, 파장 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그리고, 함량(%) = C ×1.5×(100/검체의 채취량(㎎))×100 의 식에 따라서 총카테킨의 함량을 구하였으며 이때, C는 표준곡선에서 얻어진 시험용액의 몰식자산에틸의 농도(㎎/㎖)를 나타내고, 1.5는 몰식자산에틸 1㎎이 나타내는 흡광도가 차카테킨 1.5㎎의 흡광도에 상당함을 나타내는 수치이다.

실시예 2-2: GTC 중 EGCG, EGC 또는 EGC의 정량

GTC 분말 25㎎을 취하여 50㎖ 갈색 용량플라스크에 취하고, 이동상의 용매로 용해시킨 후 표선을 채워 검액으로 사용하였다. 그 후, EGCG, EGC 또는 ECG 표준품을 2 내지 3㎎을 취하여 25㎖의 갈색 용량플라스크에 취하고, 이동상의 용매로 용해시켜, 표선을 채워 표준액으로 사용하였다. 검액 및 표준액 각 3㎕씩을 취하여 하기의 HPLC 분석조건에 따라 시험하였다:

측정기기: HP 1050 series(Hewlett-Packard, U.S.A.)

분리컬럼: Hypersil BDS C18(250×4mm, 5㎛)

컬럼온도: 40℃

측정파장: 280nm

이동상: 메탄올과 6% 아세테이트 15:85(v/v)의 혼합액

잔류시간: 15분

검액 및 표준액의 피크 면적으로부터, 하기 식을 이용하여 EGCG, EGC 및 ECG의 함량을 구하였다.

함량(%) = 표준액의 농도(㎎/㎖)××표준품의 순도(%)

아울러, 도 1, 2, 3 및 4는 각각 본 발명의 GTC의 성분 중 에피갈로카테킨 갈레이트의 HPLC 스펙트럼, 본 발명의 GTC의 성분 중 에피갈로카테킨의 HPLC 스펙트럼, 본 발명의 GTC의 성분 중 에피카테킨 갈레이트의 HPLC 스펙트럼 및 본 발명의 GTC의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다.

실시예 3: GTC의 항산화 작용

에틸리놀레이트를 사용한 펜턴시약에 의하여 생성된 수산화라디칼의 지질과산화작용에 대한 GTC 또는 EGCG의 억제효과 여부를 하기와 같은 방법으로 측정하였다: 즉, 2% 소디움도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate), 0.79mM 염화칼륨, pH7.4의 0.25mM 트리즈마(Trizma), 1μM 염화제일철(FeCl₂) 및 0.025mM 과산화수소로 구성된 반응용액 4.89㎖에 10㎕의 에틸리놀레이트를 첨가하고, 미리 제조한 검체를 소정의 농도로 0.1㎖씩 분주하여 시료 전체 부피를 5㎖로 조정하였다. 그런 다음, 전체 시료를 즉시 혼합하고 빛을 차단시키기 위하여 알루미늄박으로 감싸서 16시간 동안 55℃에서 배양시킨 후, 각각의 시료에 4% BHT(butylated hydroxytoluene) 에탄올 용액을 50㎕ 분주하여 산화반응을 종료한 다음, TBA(thiobarbituric acid)법으로 시료의 흡광도를 측정하였다.

표 1은 GTC, EGCG 또는 비타민 E의 항산화 작용을 나타낸 것이다. 하기 표 1에서 보듯이, GTC, EGCG(Sigma Chemical Co., U.S.A.) 또는 비타민 E(Sigma Chemical Co., U.S.A.)는 투여농도에서 유의성 있는 항산화작용을 나타내었다. 즉, 50% 억제농도(IC₅₀)를 비교하면, GTC는 29.3 ㎍/㎖, EGCG는 15.4㎍/㎖, 비타민 E는 234.4㎍/㎖로서 비타민 E에 비하여 GTC는 약 0.125배 농도에서 IC₅₀을 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서, 에틸리놀레이트를 사용한 펜턴시약에 의하여 생성된 수산화라디칼의 지질과산화작용에 대한 억제효과를 관찰한 결과, EGCG 또는 EGCG를 함유한 GTC는 강한 지질과산화 억제작용이 있음을 확인할 수 있었다.

GTC, EGCG 또는 비타민 E의 항산화 작용

처리농도(㎍/㎖)	535nm에서의 흡광도(Mean ±S.D.)	억제도(%)	50% 억제농도(㎍/㎖)
GTC 01050100500	0.361±0.0010.274±0.0040.197±0.0190.133±0.0010.075±0.051	33.7355.0873.0187.25	29.3
EGCG 01050100	0.399±0.0060.270±0.0490.223±0.0130.135±0.014	42.6169.1788.73	15.4
비타민 E 01050100	0.361±0.0010.326±0.0010.306±0.0020.234±0.007	20.6126.3446.40	234.4

실시예 4: GTC의 자유라디칼 소거작용

분자내 라디칼을 함유하고 있어 수산화라디칼과 유사한 작용을 나타내는 1,1-디페닐-2-피크릴 하이드라질을 60μM 농도로 하여 2㎖를 취하고, 시료의 소정 농도용액 2㎖를 가하여 5분간 혼합하고 30분간 방치한 후, 520nm에서 흡광도를 측정하였다.

표 2는 GTC 및 EGCG를 비타민 E와 비교하여, 투여 농도에서 자유라디칼 소거작용을 나타낸 것이다. 표 2에서 보듯이, 50% 소거농도(50% scavenging concentration, SC₅₀)는 GTC가 4.0㎍/㎖, EGCG는 0.9㎍/㎖, 비타민 E는 185.4㎍/㎖로서, 비타민 E에 비하여 GTC 및 EGCG가 각각 0.026배, 0.005배의 농도에서 50% 소거작용을 나타내었다. 또한, GTC에 비하여 EGCG는 0.225배의 농도에서 50% 소거작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.

GTC 또는 EGCG의 자유라디칼 소거작용

처리농도(㎍/㎖)	535nm에서의 흡광도(Mean ±S.D.)	억제도(%)	50% 소거농도(㎍/㎖)
GTC 01050100500	0.307±0.0040.148±0.0060.057±0.0060.027±0.0010.035±0.005	52.6682.6392.7393.81	4.0
EGCG 01050100	0.307±0.0040.086±0.0040.019±0.0020.015±0.000	73.2994.4695.44	0.9
비타민 E 01050100	0.348±0.0170.309±0.0000.290±0.0020.211±0.004	25.5528.8051.29	185.4

실시예 5: 코멧분석에 의한 GTC의 DNA 산화적 손상에 대한 억제효과 분석

자유라디칼을 생성할 수 있는 과산화수소를 처리하고, 단일세포전기영동 (single cell gel electrophoresis)을 통한 코멧분석(Comet assay)법으로 DNA 산화적 손상에 대한 억제효과를 측정하였다. 우선, 차이니즈 햄스터폐섬유아세포를 10%(w/v) FBS(GIBCO-BRL, U.S.A.), 1%(w/v) 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신(GIBCO-BRL, U.S.A.)를 함유한 최소필수배지(MEM, GIBCO-BRL, U.S.A.)를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건의 배양기에서 배양한 후, 1500rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다. 전기 수득된 세포를 24웰에 각각의 웰 당 5×10⁴개의 세포가 되도록 분주하고, 24시간 후에 GTC, EGCG 또는 비타민 E를 농도별로 전처리한 다음, 12시간 후에 양성대조물질인 10^-2M의 과산화수소를 처리하였다. 30분이 경과한 후, 각각의 웰에 트립신을 2㎖ 가하고 세포를 시험관에 취한 다음, 1500rpm으로 10분간 원심분리하였다. 이어, 염소이온 및 마그네슘이온이 없는 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, 다시 1500rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, 0.5%(w/v)의 저융해점아가로즈(low melting point agarose)를 200㎕ 가하여 10초간 혼합해주었다. 그런 다음, 0.65% 정상융해점아가로즈(normal melting point agarose) 10㎕를 미리 입힌 슬라이드에 전기한 액을 50㎕ 점적한 후, 커버슬라이드로 덮고 4℃에서 15분간 굳혔다. 이어, 커버슬라이드를 제거하고, 2.5M 염화나트륨, 100mM Na₂EDTA, pH 10의 10mM 트리스, 10% DMSO 및 1% Triton X-100으로 구성된 완충용액에 담가서 약 1시간 용해시킨 후, 300mM 수산화나트륨 및 pH 13의 1mM Na₂EDTA로 구성된 전기영동 완충액에 담가 20분 동안 방치하고, 25V 및 300mA에서 15분간 전기영동하였다. 슬라이드를 꺼내 10분간 3회씩 pH 7.5의 0.4M 트리스 완충용액에 담근 다음, 15분 건조시키고 2㎍/㎖의 에티디움브로마이드를 20㎕씩 떨어뜨려 염색한 후, 515 내지 560nm의 여기 여과기(excitation filter)와 590nm의 차단 여과기(barrier filter)가 장착된 형광현미경으로 관찰하고, 이미지 분석기인 KOMET 3.1(Kinetic Imaging, England)를 사용하여 분석하였다.

표 3은 과산화수소유도 DNA 산화적 손상에 대한 억제 효과를 농도별로 나타낸 것이다. 표 3에서 보듯이, GTC의 처리농도가 증가함에 따라서 과산화수소 유도 DNA 산화적 손상이 억제되고, GTC의 함유성분인 EGCG도 처리농도 45㎍/㎖에서 12.9%의 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

GTC 및 EGCG의 과산화 유도 DNA 산화적 손상에 대한 억제작용

처리농도(㎍/㎖)	Tail length(㎛), OD_535nm(Mean ±S.D.)	억제도(%)
GTC 010100200	168.2±13.6141.7± 8.8138.0± 0.7118.5± 8.3	-15.717.929.5
EGCG 00.454.545	168.2±13.6168.2±33.6170.6±28.7146.4±33.3	-0012.9
비타민 E 00.434.343	168.2±13.6163.3±13.3139.1± 4.6109.3±24.9	-2.917.335.0

실시예 6: 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신 정량에 의한 GTC의 DNA 산화적 손상에 대한 억제작용

송아지흉선 DNA 1mg을 pH 7.4인 Na₂HPO₄에 용해시키고, 전기 용액 100㎕에 GTC, EGCG 및 비타민 E를 농도별로 처리하여 3시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 양성 대조군으로 10^-3mM의 과산화수소 50㎕를 가하여 산화적 손상을 준 다음, 30분 동안 얼음속에서 물여과(water filtration, 2-4mm of water on a glass slide)를 통해서 백열등에 노출시켰다. 이어, 3M의 아세트산나트륨 10㎕ 및 0.25M의 염화마그네슘 10㎕를 가하여 5분간 끓이고, 5 내지 10분 동안 냉각시킨 다음, 0.5㎎/㎖의 핵산가수분해효소(nuclease) P1 10㎕를 가하여 50℃에서 30분간 배양하고, pH 10.6인 1M 트리스 10㎕를 가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그런 다음, 5.8M의 아세트산을 4㎕를 가한 후, 0.2㎛ 여과기로 여과하여 이를 전자화학 검출기와 자외선 검출기를 장착한 고성능 액체크로마토그래피로 C-18 컬럼을 사용하여, 8-하이드로데옥시-2'-데옥시구아노신 및 2'-데옥시구아노신을 동시에 분리정량하였다.

표 4는 GTC 및 EGCG의 과산화수소 유도 8-OH2'dG 생성에 대한 억제작용을 나타낸 것이다. 표 4에서 보듯이, GTC의 처리농도가 증가함에 따라 과산화수소 유도 DNA 산화적 손상을 억제시키며, 함유성분인 EGCG도 처리농도 4.5, 45㎍/ml에서 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서, GTC는 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 갈레이트가 포함된 추출물임에도 불구하고, 비타민 E에 버금가는 히드록실라디칼에 의한 DNA 산화적 손상억제제로서 작용함을 확인할 수 있었다.

GTC 및 EGCG의 과산화수소 유도 DNA 산화적 손상에 대한 억제작용

처리농도(㎍/㎖)	8-OH2'dG/10⁵2'dG,535nm에서의 흡광도(Mean ±S.D.)	억제도(%)
GTC 010100200	68.1±19.859.6±17.560.8± 1.560.0± 1.2	-12.410.711.0
EGCG 00.454.545	68.1±19.869.6±18.054.1± 9.963.4± 0.8	-020.56.9
비타민 E 00.434.343	112.0±19.291.6± 8.394.5±13.193.4±27.3	-18.215.616.6

본 발명의 GTC는 통상의 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제 등의 담체와 혼합하여 약학적 제제를 제조할 수 있다.

이하에서는 제제의 제조예를 실시예로서 예시하였다.

실시예 1: 정제의 제조

GTC 60㎎

비타민 C 4㎎

유당 77㎎

미결정셀룰로오스 50㎎

경질무수규산 1㎎

크로스포비돈 6㎎

스테아린산마그네슘 2㎎

상기의 성분을 통상의 정제 제조방법에 따라서, 200㎎의 정제로 타정하여 정제를 제조하였다.

실시예 2: 캅셀제의 제조

GTC 60㎎

구연산 4㎎

유당 196㎎

비타민 C 4㎎

경질무수규산 4.8㎎

스테아린산마그네슘 1.2㎎

상기의 성분을 통상의 캅셀제 제조방법에 따라서, 1 캅셀에 270㎎이 함유되도록 충진하였다.

실시예 3: 연질캅셀제의 제조

(1) 충진조성물

GTC 60㎎

레시틴 20㎎

콩기름 149.4㎎

야자경화유 38㎎

황납 12㎎

(2) 건조한 외피조성물

젤라틴 247.2㎎

농글리세린 78㎎

디소르비톨액 70% 90.05㎎

파라옥시안식향산메틸 0.28㎎

파라옥시안식향산프로필 0.07㎎

에칠바닐린 적당량

청색 1호 적당량

황색 203호 적당량

산화티탄 적당량

분획야자유 적당량

상기의 (1)과 (2)의 성분을 통상의 연질캅셀제 제조방법에 따라서, 1캅셀이 695㎎이 되도록 연질캅셀제를 충진하였다.

실시예 4: 액제의 제조

GTC 100㎎

구연산 4㎎

벌꿀 20㎎

비타민 C 4㎎

액상과당 58㎎

니코틴산아미드 20㎎

안식향산나트륨 70㎎

포비돈 적당량

황색 203호, 청색 1호 적당량

멘톨후라보노향MSW 적당량

정제수 적당량

상기의 성분을 통상의 액제 제조방법에 따라서 제조하고, 100㎖ 용량의 갈색병에 충진, 밀봉하여 저온살균 처리하였다.

실시예 5: 연고제의 제조

GTC 30㎎

백색바세린 370㎎

경질유동파라핀 220.9㎎

세탄올 70㎎

스테아릴알콜 70㎎

모노스테아린산소르비탄 85㎎

폴리옥시에틸렌경화피마자유 55㎎

에데트산나트륨 0.1㎎

폴리소르베이트60 67㎎

파라옥시안식향산메틸 1.8㎎

파라옥시안식향산프로필 0.2㎎

구연산 적당량

수산화나트륨 적당량

정제수 적당량

상기의 성분을 통상의 연고제 제조방법에 따라서 제조하고, 30g, 50g 단위로 포장하였다.

실시예 6: 주사제의 제조

GTC 5㎎

등장화제(염화나트륨) 적당량

메타중아황산나트륨 적당량

주사용증류수 적당량

상기의 성분을 통상의 주사제 제조방법에 따라서 제조하고, 2㎖의 앰플에 충진, 밀봉하여 멸균하였다.

GTC의 급성독성실험

6 내지 7주령 된 비설치류 비글견을 대상으로 본 발명의 GTC를 경구투여하여 24시간내의 개체사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8㎏인 개체를, 수컷은 7 내지 9㎏인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 5g/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않아, 본 발명의 GTC는 kg당 5g까지도 급성독성을 관찰할 수 없을만큼 안전하므로, DNA 산화적 손상 억제제로서 생체내에 안전하게 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 DNA 산화적 손상 억제제의 유효성분으로 함유되는 GTC는 약학적으로 허용가능한 결합제(예, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스), 붕해제(예, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨), 희석제(예, 옥수수전분, 유당, 콩기름, 결정셀룰로오스, 만니톨), 활택제(예, 스테아린산 마그네슘, 탈크), 감미제(예, 백당, 과당, 솔비톨, 아스파탐), 안정제(카복시메틸셀룰로오스나트륨, 알파 또는 베타 싸이클로 덱스트린, 비타민 C, 구연산, 백납), 보존료(예, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산나트륨) 및 향료(예, 에틸바닐린, 마스킹후레바, 멘톨후라보노, 허브향)와 혼합하여 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 액제, 연고제 또는 주사제와 같은 약학적 제제로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 약제조성물 중 유효성분인 GTC의 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 5 내지 50㎎을 일일 1회 내지 3회 분복할 수 있다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 녹차(Theae sinensisL.,Theaceae)로부터, 에피갈로카테킨 갈레이트를 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨을 8 내지 27%(w/w), 에피카테킨 갈레이트를 3 내지 7%(w/w) 함유하는 GTC를 추출하여, 전기 GTC가 항산화 효과, 자유라디칼 소거작용 및 활성산소종에 의한 DNA 산화적 손상에 억제작용이 있음을 확인하였다. 따라서, 녹차로부터 분리한 GTC는 약제학적으로 허용되는 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제 등의 담체와 함께 DNA 산화적 손상 억제제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

Claims

에피갈로카테킨 갈레이트(C₂₂H₁₈O₁₁; 458.4)를 33 내지 89%(w/w), 에피갈로카테킨(C₁₅H₁₄O₇; 306.3)를 8 내지 27%(w/w), 에피카테킨 갈레이트(C₂₂H₁₈O₁₀; 442.5)를 3 내지 7%(w/w) 함유하는 녹차카테킨(Green tea catechins, GTC)을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 DNA 산화적 손상 억제제.
제 1항에 있어서,

정제인 것을 특징으로 하는

DNA 산화적 손상 억제제.
제 1항에 있어서,

캅셀제인 것을 특징으로 하는

DNA 산화적 손상 억제제.
제 1항에 있어서,

연질캅셀제인 것을 특징으로 하는

DNA 산화적 손상 억제제.
제 1항에 있어서,

액제인 것을 특징으로 하는

DNA 산화적 손상 억제제.
제 1항에 있어서,

연고제인 것을 특징으로 하는

DNA 산화적 손상 억제제.
제 1항에 있어서,

주사제인 것을 특징으로 하는

DNA 산화적 손상 억제제.