KR101452309B1 - 환원수 및 홍삼추출물을 포함하는 식품 조성물 - Google Patents
환원수 및 홍삼추출물을 포함하는 식품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 환원수, 홍삼 추출물, 오가피 추출물 및 녹차 폴리페놀을 포함하는 식품조성물에 관한 것이다.
멜라민, DNA 손상, 조성물
Description
본 발명은 환원수, 홍삼 추출물, 오가피 추출물 및 녹차 폴리페놀을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
멜라민(1,3,5-Triazine-2,4,6-triamine)은 66%의 질소함량을 가진 무색의 결정성 물질이다. 멜라민은 주로 합성수지를 만드는 출발물질로 사용되며 특히 포름알데히드와 반응시키면 분자량이 큰 수지성 화합물을 생성할 수 있다. 이러한 수지들은 내수성과 내열성을 가지며 접시류, 그릇류, 조리용 기구류, 핸들로 가공되거나 목재, 종이와 직물류의 피복제나 라미네이팅 시약으로 사용된다. 멜라민 수지로 만든 제품의 잘 알려진 상품명으로는 포르미카와 멜맥이 유명하다.
멜라민은 높은 질소 함량을 가지고 있기 때문에 1950-1960년대에 작물의 비료로서 사용되기도 했으며, 목장에서 "비단백질 질소(NPN)" 사료로 사용되기도 했으나, 토양이나 반추동물의 위에서 멜라민의 가수분해 반응이 매우 느려서 널리 사용되지는 못한 것으로 알려져 있다. 멜라민이 식품에 첨가되면 질소함량에 의거한 표준검사에서 단백질 양이 높은 식품으로 오인할 수 있으므로 불법적으로 식품에 첨가되기도 한다.
소량의 멜라민은 독성이 매우 약하지만 멜라민이 시아누릭산(cyanuric acid)과 결합하여 멜라민 시아누레이트가 형성되면 신장결석을 유발할 수 있다. 멜라민은 삼키거나, 흡입하거나, 피부를 통해 흡수되면 인체에 해로우며 만성적인 멜라민 섭취는 생식기 피해나 방광 또는 신장결석 및 방광암을 유발할 수 있다. 또한 멜라민과 시아누릭산이 함유된 동물사료가 고양이의 급성신부전을 일으킨다는 연구가 발표되었다.
FDA에서는 멜라민과 시아누릭산이 혈액 내로 침투되면 신장 미세소관들과 작용하여 결정을 형성함으로써 신장 세포의 손상을 가져온다고 설명하였다.
멜라민은 래트 실험 결과 구강 투여시 3248 mg/kg에서 50% 치사한다고 보고되었으며, 토끼 실험에서 1000 mg/kg 이상일 때 50%의 치사율을 나타내었다는보고가 있다. 또한, 멜라민 또는 시아누릭산 단독 섭취보다 멜라민 시아누레이트 형태가 더 유독한 것으로 알려져 있다. 최근 수만명의 어린이가 멜라민이 첨가된 분유를 먹고 치료를 받거나 사망한 중국 멜라민 분유사건으로 전세계가 충격에 빠져 있다.
이와 같이 멜라민의 독성에 대해서는 일반적 독성 자료 외에는 구체적인 독성 기전이 거의 연구되어 있지 않다.
세포 내 DNA 손상 정도를 측정하는 것은 인체에 유해한 독성물질에 의한 유전독성의 발생 여부를 알아내는 좋은 도구일 뿐 아니라, 암, 동맥경화와 같은 퇴행 성 질환의 유병 여부를 초기에 판단할 수 있는 방법으로 알려져 있다. 따라서, 인체 조직에서의 DNA 손상은 인구 집단의 바이오모니터링(biomonitoring) 연구 또는 분자역학 연구에서 효과적인 생물학적 마이오마커로 이용되고 있다.
인체의 DNA 손상을 모니터링하는 방법으로 그동안 DNA 부가생성물(adduct), 염색체 이상(chromosomal aberration), 자매 염색분체 교환(sister chromatid exchanges), 소핵(micronuclei), 8-하이드록시-데옥시-구아노신(8-hydroxy-deoxy-guanosine) 등 여러 가지 방법이 사용되어 왔으나, 지금까지 사용되었던 방법들보다 쉽고 DNA 손상을 민감하게 감지할 수 있는 방법으로 최근 소개되고 있는 것이 코멧 분석법(comet assay) 또는 단세포 젤 전기영동(single cell gel electrophoresis, SCGE) 분석법이다. 코멧 분석법은 간편하고 신속하게 다양한 재료들을 이용해 DNA 손상 여부를 세포 수준에서 감지할 수 있어 분자역학적 연구에 있어서 매우 유용한 방법이며, 이제까지 DNA 손상 인간 모니터링법으로 많이 사용되어왔던 SCE 분석법에 비해 훨씬 간단하고 민감한 것으로 보고되고 있다.
코멧 분석법의 원리는 핵 내의 DNA가 수퍼코일되어 타이트하게 모여 있는 상태에서 고농도의 염분으로 용균(lysis)하면 핵 단백질이 빠져나가게 되어 핵 모양을 지니면서 내부에 DNA를 포함하는 핵상체(nucleoid)로 된다. 이때 기존에는 핵 내의 단백질 등이 완전히 제거되는 것으로 여겼으나, 실제로는 남아 있는 단백질 등이 테일(tail)의 형성을 방해할 수 있다는 이론에 따라 프로티나제 K(proteinase K)를 이용하여 단백질 등을 완전히 제거해 주고 있다. 핵은 수퍼코일이 완화된 오픈 루프(open loop) 구조들이 일련의 더 높은 수준(higher order)의 구조를 이루고 있게 된다. 이때 핵상체(nucleoid) 내에 가닥 절단(strand breakage)이 있는 경우 알칼리 상태에서 DNA 염기쌍이 분리되면서 DNA 가닥이 서로 분리되어 분자 양쪽 끝이 서로 풀리게 되면서 구조가 변형되어 수퍼코일 상태가 완화되면서 결과적으로 DNA의 구조가 이완되고 음극이 외부로 노출되어 전기영동시 양극 쪽으로 이동되어 원래구조로부터 확장된 테일의 형태를 보임으로써 젤 전기영동에 의해 쉽게 감지될 수 있도록 한 것이다. 즉, 세포를 아가로즈 젤에 섞어 슬라이드에 직접 분주하여 젤 층(gel layer)을 만들고 용균용액(lysis solution)을 처리하여 핵 모양의 핵상체만 남긴 후 전기영동하면 DNA 절단 등의 손상을 입은 세포의 경우 그 절편이 양극쪽으로 끌려가고, 이를 형광을 발하는 DNA 인터칼레이팅제(intercalating agent)인 에티듐 브로마이드(Ethidium Bromide) 등으로 처리하여 핵의 모양을 좀더 가시화시켜 DNA 가닥 절단에 의해 만들어진 코멧 테일(comet tail)을 측정하므로 해서 단일세포 전체의 DNA 손상을 정량화할 수 있다. 상해를 받은 세포는 밝은 형광을 나타내는 헤드 부분과 테일로서 나타나게 되고 손상을 받지 않은 세포는 완전한 형태로 헤드만 보이게 된다. 처리물질에 의한 손상정도는 테일의 길이와 테일의 형광 강도 즉 DNA 양과 관련이 있으며, 특정 처리 물질과 세포종류를 가지고 실험실 테일의 길이가 처리 물질의 농도가 증가함에 따라 증가되는 것이 아니고 일정길이까지 진행되면 더 이상 진행되지 않으므로, 손상을 측정하는 데는 테일에 존재하는 DNA 양을 측정하는 것이 좀더 정확한 방법이라고 할 수 있겠다. 이 분석법의 이론은 근본적으로 분자량에 따라 그 이동속도가 반비례하는 전기영동의 원리에 기초하고 있다. 즉, DNA 손상을 입은 세포는 용균처리하여 핵만 남긴 후 전기영동을 하게 되면 절단된 DNA 분자량의 크기가 작을수록 핵으로부터 멀리 이동하게 될 것이다. 이때 반드시 고려해야 할 점은 핵은 DNA로만 이루어져 있는 것이 아니라 히스톤과 그 외의 여러 단백질이 결합되어 있는 매우 잘 정렬된 크로마틴 구조로 되어 있다는 점이다. 그러므로 DNA가 손상을 입었더라도 이 결합구조를 풀어주지 않으면 전기영동을 행하더라도 진정한 의미의 DNA 손상을 정량화하는 것은 불가능하다. 이에 따라 손상을 좀더 민감하게 감지하기 위하여 DNA를 푸는데 일반적으로 pH 12.3 이상의 알칼리 조건 완충용액을 사용하여 한 가닥 절단(single strand breakage)을 정량화하고 있고 이러한 방식을 알칼리 분석(Alkaline assay)방법이라 부르기도 한다.
본 발명은 환원수, 홍삼 추출물, 오가피 추출물 및 녹차 폴리페놀을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 멜라민이 사람 혈구세포(임파구, 백혈구)의 DNA에 손상을 유발함을 코멧 분석을 사용하여 밝혔다. 다양한 생약재 등을 처리하여 코멧 분석한 결과, 멜라민에 의한 혈구세포(임파구, 백혈구)의 DNA에 유발된 손상을 홍삼, 오가피, 녹차 폴리페놀 또는 환원전리수를 포함하는 조성물이 완화할 수 있음을 밝혀내었다.
따라서, 본 발명은 홍삼 추출물, 오가피 추출물, 녹차 폴리페놀 및 환원전리수를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
상기 본 발명의 조성물에 있어서, 홍삼, 오가피 및 녹차 폴리페놀은 상업적으로 구입할 수 있는 통상의 생약 원물을 사용할 수 있고, 이들 생약의 전초, 가지, 껍질, 잎, 순, 뿌리, 내피 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 이를 분말화하거나 추출물을 제조하여 사용할 수 있다.
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본 발명의 홍삼, 오가피 및 녹차 폴리페놀 추출물은 물 또는 C1~4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 사용할 수 있다. 상기 홍삼, 오가피 및 녹차 폴리페놀 추출물은 50~90% 에탄올 추출물이나 열수 추출물을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 추출은 열탕추출, 소니케이션 등 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 이 추출물의 동결건조물을 형성하여 본 발명의 조성물에 사용할 수도 있다. 또한 상기 추출물은 통상의 분획법 또는 크로마토그라피에 의해 좀더 정제된 상태로 사용할 수 있으며, 이러한 분획물 또는 정제물 또한 본 발명의 범위에 속함은 자명하다.
본 발명의 환원전리수(cathodic electrolyzed water)는 물을 전기분해할 때 캐쏘드로부터 수거되는 환원수를 의미한다. 전리수(electrolyzed water)는 전기분해에 의해서 pH나 산화·환원전위(oxidation-reduction potential)를 조절한 수용액이다.
본 발명의 조성물은 각각의 성분을 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상 혼합하여 사용하는 것도 가능하다.
본 발명은 상기 천연물 조성물을 유효성분으로 하는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다. 상기 건강 기능성 식품 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 바와 같이 분말형, 액상, 고형 등 다양하게 제제화할 수 있고, 필요에 따라 곡분 등 다른 영양성분이나 비타민, 무기질 등의 미량 영양성분, 향료, 천연 식용색소 등을 부가하여 제조할 수 있다.
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본 발명은 인체에 유효한 성분을 포함하는 홍삼, 오가피, 녹차 폴리페놀 및 환원전리수를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하 는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
<실시예 1: 시험시료 제조>
홍삼분말은 충남 홍성 소재 엔티앤비티(주)에서 오가피 분말은 충남 천안소재 수신오가피(주)에서 제공받았으며 녹차폴리페놀은 통상적인 녹차폴리페놀 추출법에 의하여 추출한 것이다. 홍삼 분말, 녹차 폴리페놀, 오가피 뿌리 분말은 최종 농도가 3ug/ml가 되도록 수용액을 제조하였다.
또한, 본 발명에서 사용되는 환원전리수는 물을 전기분해시키는 다양한 장치 및 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 전리수를 생성하는 전리수 생성기는 분리막에 의해 애노드 및 캐쏘드가 배치되는 2개의 부분으로 구분되는 전해조를 가지며, 양극에 전류를 흐르게 하면 캐쏘드 부분에서는 환원전리수가 생성되며 애노드 부분에서는 산성전리수가 생성된다.
환원전리수의 산화환원전위와 pH는 상호 연관성을 나타내며 산화환원전위가 음의 값으로 커질수록 멜라민 독성 환원력도 커지게 되는 특성을 가지고 있다.
본 발명에서, 멜라민 독성을 개선하는데 사용되는 환원전리수의 산화환원전위는 -100mV 이하, 바람직하게는 -1000mV 내지 -200mV, 좀더 바람직하게는 -900mV 내지 -800mV, 가장 바람직하게는 -840mV 내지 -860mV이며, pH는 6이상, 바람직하게는 6 내지 11, 좀더 바람직하게는 8.5 내지 11, 가장 바람직하게는 10 내지 11이다. 환원전리수의 산화환원전위가 -100mV 이상인 경우에는 환원력이 너무 감소하게 되는 문제가 발생하게 된다.
<실시예 2: 인체 백혈구 세포 분리>
사람의 혈액을 채취하여 전혈 200ul를 1ml의 PBS와 섞은 후, 히스토페이크™(histopaque™) 1077 200ul와 함께 원심분리(1,450rpm, 5분)한 뒤 상층의 혈장과 하층의 적혈구 사이의 버피 코트(buffy coat) 부분 약 200ul를 1ml PBS와 섞어 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 임파구와 백혈구 세포만을 이후 실험에서 사용하였다.
<실시예 3: 멜라민 스트레스의 유도>
사람 백혈구 DNA에 멜라민에 의한 손상을 가하기 위해 상기 실시예 2에서 얻어진 임파구와 백혈구 세포에 멜라민의 최종 농도가 각각 30, 40, 50mM이 되도록 멜라민을 가한 후 0℃에서 5분간 반응시켰으며, 대조군으로는 PBS만을 처리하였다. 또한, 각 시험시료가 멜라민에 의한 혈액 DNA 손상에 미치는 영향을 살펴보기 위해서 각 시료를 혈구세포와 37℃에서 30분간 반응시킨 후 50mM 멜라민을 5분간 처리하였다.
<실시예 4: 코멧 분석을 이용한 백혈구 DNA 손상 측정>
멜라민에 의한 DNA의 손상과 각 시료의 처리에 의한 DNA 손상의 억제정도를 확인하기 위해 Singh 등의 방법을 변형하여 실시하였다. 준비된 백혈구를 0.7% 저온용해 아가로즈 젤(low melting agarose gel) 100ul와 혼합한 후, 1% 정상 용해 아가로즈(normal melting agarose)로 프리코팅된 슬라이드 위로 백혈구와 저온용해 아가로즈 젤의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 커버슬립으로 덮어 4℃ 냉장고에 약 30분간 보관하였다. 젤이 굳으면 커버슬립을 제거하고 그 위에 다시 0.7% LMA 용액 75ul를 슬라이드 위에 첨가한 후 다시 커버슬립을 덮어 젤이 굳을 때까지 냉장 보관하였다. 젤이 굳은 것을 확인한 뒤 커버슬립을 제거한 후 슬라이드를 차가운 알칼리 용균완충액{2.5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM 트리스, 1% 트리톤 X-100, 10% DMSO(Dimethyl sulfoxide), 1% 라우로실사코신산(Laurosylsarcosinate), pH 10}에 담그고, 4℃의 암실에서 한 시간 동안 두면서 세포 단백질을 제거하였다. 용균이 끝난 슬라이드를 알칼리 용액(300mM NaOH, 10mM Na2EDTA, pH>13)이 포함된 전기영동 탱크에 넣고 20분 동안 DNA 언와인딩(unwinding)시킨 후 25V/300mA에서 20분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 슬라이드를 0.4M 트리스(pH 7.5) 용액으로 5분씩 세 번 세척하여 중성화시켰으며 100% 에탄올로 5분간 고정시켰다.
<실시예 5: 영상 분석>
코멧 분석 결과 얻어진 영상(Comet image) 분석을 위해 50uM 농도의 에티듐 브로마이드로 핵을 형광 염색하고 커버슬립으로 덮은 뒤 형광현미경(Leica DM 2000, 독일) 상에서 관찰하였다. 그 후 CCD 카메라(Hitachi,일본)를 통해 얻어진 각각의 세포핵 영상은 Komet™ 5.5 코멧 영상 분석 시스템(Kinetic Imaging, 영국)으로 분석하였다. 코멧 분석에 의한 임파구 DNA 손상 정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리(tail length, TL)값에 케일 % DNA를 곱해준 테일 모먼트(tail moment; TM) 값을 측정하여 나타내었다. 각 시료별로 2개의 슬라이드를 만들어 각각 75개씩 총 150개의 임파구에서 DNA 손상정도를 측정하였다.
<실시예 6: 통계처리>
모든 자료의 처리는 SPSS-PC+ 통계 패키지를 사용하여 처리하였다. 각 처리군별로 150개의 세포에서 측정한 DNA 손상도(TM)의 평균값과 표준오차를 구하였다. 각 농도에서 DNA 손상 억제 정도를 비교하기 위해 시료별로 원웨이 분산분석(ANOVA)을 시행하였으며, 각 농도간의 차이는 던칸 테스트로 사후 검증하였고, 모든 통계적 유의성은 p < 0.05 수준에서 평가하였다.
<결과>
도 1은 멜라민이 사람 백혈구(임파구) DNA에 손상을 유발하고 있음을 보여준다. 멜라민에 의한 사람 백혈구 DNA 손상정도는 멜라민 농도증가에 따라 증가하였다.
도 2는 다양한 생리활성을 가지고 있다고 알려진 홍삼분말 오가피 분말, 녹차 폴리페놀이 멜라민에 의한 DNA의 손상을 억제함을 보여주고 있다.
도 3은 환원전리수 처리가 멜라민에 의한 DNA 손상을 억제함을 보여준다. 이때 환원수만 단독 처리한 경우가 일반증류수를 동일부피 첨가하여 환원전리수 비율을 줄인 경우보다 DNA 손상 복구능력이 우수하였다. 환원전리수의 산화·환원전위 와 pH는 상호 연관성을 나타내며 산화·환원전위가 음의 값으로 커질수록 환원력도 커지게 되는 특성을 가지고 있다. 산화·환원전위가 약 -200mV인 경우 pH는 6~7이고, 산화·환원전위가 -800mV인 경우 pH는 8.5 내지 10이다. 본 발명에서 멜라민에 의한 DNA 손상 억제에 사용되는 환원전리수의 산화·환원전위는 음의 산화·환원전위를 나타내거나 -1000mV 에서 -100mV 등이 바람직하고, pH는 6 내지 11이다.
도 1은 멜라민이 사람 백혈구(임파구) DNA에 미치는 영향을 나타내는 코멧 분석 그래프 및 영상이다.
도 2는 생약 중 홍삼분말, 오가피 분말, 녹차 폴리페놀이 멜라민에 의한 DNA의 손상을 억제함을 보여주는 그래프 및 영상이다.
도 3은 환원전리수 처리가 멜라민에 의한 DNA 손상을 억제함을 보여주는 그래프 및 영상이다.
Claims (4)
- 산화환원전위가 -1000~-100mV인 환원수, 홍삼 추출물, 오가피 추출물 및 녹차 폴리페놀을 모두 포함하는 식품조성물.
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Citations (2)
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2008
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