KR20120122331A

KR20120122331A - 계란 난백 ｏｖｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ의 분리정제방법과 항암 기능성 약제학 조성물

Info

Publication number: KR20120122331A
Application number: KR1020110040419A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 안동욱; 박은주; 문선희; 김정미; 백지연
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2011-04-28
Publication date: 2012-11-07

Abstract

본 발명은 계란의 난백에 증류수를 가하여 희석한 후 pH를 조절하여 에탄올을 첨가한 후 원심분리하고 그 잔사에서 철분(Fe³ ⁺)을 제거하기 위해 AG1-X₂ 이온교환수지를 이용하여 여과함을 특징으로 하는 철분이 제거된 것을 특징으로 하는 ovotransferrin의 신규한 제조방법과 상기 물질의 천연 항암제로서의 신규 용도를 개시한다.

Description

계란 난백 ｏｖｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ의 분리정제방법과 항암 기능성 약제학 조성물{A method for manufacturing egg white ovotransferrin and anti-cancer use of the same}

본 발명은 완전식품인 계란 난백 ovotransferrin의 분리정제방법과 그를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 천연 의약품으로서의 항암 기능성 의약용도에 관한 것이다.

21세기 식품생명과학의 발달, 건강에 대한 국민의 욕구 증대 등 보건 환경의 변화는 식품에 대한 인식을 새롭게 바꾸었다. 과거 양적인 면을 강조하던 시대는 식품수급, 식량안보가 그 대상이었다. 그러나 오늘날 세계 공중보건의 주요한 주제는 질적인 면에서 두 가지 축으로 움직이고 있다. 그 하나는 식품 안전성이며 이와 다른 하나는 식품 기능성이다. 특히 건강관리에 대한 관심이 고조되고 생활습관이 변화됨에 따라 삶의 질 향상을 위한 소비자의 노력이 증가하고 있으며, 의약품의 안전성 등에 대한 관심 또한 고조되고 있다. 삶의 질 향상과 의료 서비스의 개선으로 수명이 연장됨에 따라 심장질환, 암, 당뇨, 정신질환 등 만성 또는 난치성 질환이 증가하고 있어 이런 만성 질환에 대한 예방적 개념이 도입되고 있으며, 따라서 치료형에서 예방형으로의 변화에 따른 전통 의약의 역할 또한 증대되고 있다.

우리나라의 경우 노령화 사회 진입이나 만성질환 유병률 증가로 학계, 산업계 뿐 만 아니라 일반 국민들도 식품 기능성에 대하여 더욱 주목하게 되었다. 전 세계적으로 사망 원인의 1, 2위를 차지하고 있는 암에 대한 치료는 대부분 합성 화학약품을 이용한 치료요법으로 조혈 및 면역기능에 이상을 초래하고 암세포 이외의 정상세포에도 독성을 나타내고 있어, 특이적이며 선택적인 항암제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

일반적인 암세포 증식억제 측정방법인 MTT assay는 동물세포의 성장을 확인하는 방법 중 하나로 yallow tetrazolium salt MTT는 살아있는 세포에서 물에 녹지 않는 formazan crystal(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenol-tetrazolium bromide)로 환원되고 이 크리스탈은 나중에 DMSO로 녹여서 생성된 크리스탈의 양을 흡광도로 측정하는 방법이다. 살아있는 세포의 수가 많을수록 이 크리스탈의 생성도 많아지므로 이러한 방법을 통해 세포의 성장을 쉽게 측정할 수 있다. 환원된 formazan의 농도로서 약 50% 정도 세포가 살아있다고 판단될 때, 이 값을 IC₅₀이라 부르며, IC₅₀값 이상 되어야 암세포에 대한 항암효과가 있다고 판단한다.

코멧 에세이(comet assay)는 암 발생의 전단계인 세포 내 DNA 손상도를 측정하는 방법 중 하나로 단일 세포에서 DNA 손상 정도를 직접 측정할 수 있는 매우 유용한 연구 방법이다. 이 분석법은 pH 12.3 이상의 높은 pH에서 알칼리 풀림, 알칼리 용해, 알칼리 당 침전 과정을 순서대로 거치게 되며, 마지막 전기영동 과정에서 손상된 DNA 절편은 anode쪽으로 이동하여 혜성(comet) 모양을 띄게 된다. 즉, DNA 손상이 증가할수록 핵으로부터 anode 쪽으로 이동한 DNA가 많아 꼬리 부분의 형광 강도와 길이는 절단된 DNA 나선 수에 비례하며, 반면 손상되지 않은 세포는 꼬리가 없는 원형 그대로의 핵 모양이 유지되는 원리를 이용한 것이다.

한편, 천연의 완전식품으로 잘 알려진 계란은 하나의 생명체가 자라는 데 필요한 모든 영양소와 방어체계를 위한 물질들을 보유하고 있는 것으로서 단순히 영양을 공급하는 식품으로서가 아닌 인체의 건강과 질병에 관련한 생물 활성을 지닌 다양한 성분을 함유한 새로운 소재로 각광받고 있다. 오래 전부터 산업계에서 실용화한 성분으로는 라이소자임이나 애비딘, 레시틴 등이 있지만 아직도 새롭게 생물활성을 지닌 계란 성분의 기능이 밝혀지고 있어 이용 범위는 더욱 확대될 것이다.

계란 난백 ovotransferrin은 난 단백질에서 두 번째로 많은 양을 차지하고 있으며 단일체 당단백질로서 한 분자 당 2개의 철 이온과 결합할 수 있는 능력을 지닌 transferrin의 일종이다. 하지만 ovotransferrin의 분리조건이 복잡하고 까다롭기 때문에 소규모 분리 정제방법 만이 연구되어 있으며, 대규모 생산은 어려운 실정이므로 현재 ovotransferrin에 대한 국내 연구는 아주 미흡한 실정이다. Ovotransferrin의 단백질로서의 기능적 특성, 분리방법에 대한 논문과 연구보고서는 보고되어 있지만 특허는 아직 등록사항 조차 없는 실정이다. 국외에선 ovotransferrin의 관련 논문이 300여 편 이상이며 수년 동안 ovotransferrin의 구조분석, 기능적 특성, 추출방법 등으로 연구가 꾸준히 이루어져 왔다. 현재 ovotransferrin의 추출, 분리에 의한 상품화가 북미, 일본 및 유럽 각국을 중심으로 이루어지고 있으며, 점점 시장이 커지고 있는 추세이다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로 계란 난백 단백질에서 Fe³ ⁺ 이온을 흡착시켜 에탄올 침전에 의해 ovotransferrin을 분리 정제하고 항암 기능성을 평가하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 계란 난백에 가수하여 희석하는 단계와; FeCl₃를 첨가하고 pH를 조절하는 단계와; 에탄올을 첨가하고 원심분리하는 단계와; 잔사를 취하여 물에 희석하여 pH를 조절하는 단계와; AG1-X₂ 이온교환수지를 이용하여 철분을 제거하고 여과하는 단계로 구성된다.

본 발명은 ovotransferrin으로부터 Fe³ ⁺이 제거된 신규한 의약품 소재용 천연물질을 제공하는 효과가 있고, 천연항암제로서의 신규한 용도를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명 Ovotransferrin의 분리정제방법의 개략적인 공정도이다.
도 2는 본 발명 Ovotransferrin의 암세포 성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 Ovotransferrin의 암발생 전단계인 세포내 DNA 손상정도를 보인 그래프이다.
이하, 본 발명의 구체적인 내용을 도면을 참고하여 상세히 설명한다.

Ovotransferrin 의 제조

본 발명에 따른 Ovotransferrin의 바람직한 제조 공정은 도 1에 도시한 바와 같이 난백을 난황과 분리시킨 후, 증류수(H₂O)로 동량 비율로 혼합하였다. 이 때, FeCl₃?6H₂O을 3mL/ 100mL ovotransferrin solution 첨가하고 pH 7.0 로 조정한 후 다시 에탄올을 최종 농노가 50%가 되도록 넣은 다음 원심분리하여 추출하였다. 분리잔사에서 Fe³ ⁺를 제거하기 위해, AG1-X₂ ion exchange resin을 이용하며 혼합한 후 동결건조하였다.

시약 및 실험재료

세포 생존률 측정을 위한 MTT(3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 시약은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 세포주 배양에 필요한 RPMI medium 1640, DMEM medium, MEM medium, FBS(fetal bovine serum), penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NT, USA)에서 구입하였으며, 백혈구 DNA 손상억제 효과 실험에 사용된 H₂O₂(hydrogen peroxide solution), Histopaque 1077, low melting agarose, normal melting agarose, NaCl, Na₂EDTA, ethidium bromide 등은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 그 외 실험에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

세포주 및 배양

Ovotransferrin의 인체 암세포 성장억제 실험을 위해 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 7종류의 인간 유래 암 세포주를 분양받아 사용하였다. 실험에 사용된 암세포로는 후두암 세포인 Hep-2, 위암 세포인 AGS, 폐암 세포인 SK-MES, 간암세포인 HepG-2, 자궁암 세포인 MCF-7, 유방암 세포인 HeLa 및 대장암 세포인 HT-29을 이용하였다.

세포 배양을 위해 RPMI 1640 medium, DMEM medium 및 MEM medium에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 unit/mL의 penicillin, 100 μg/mL의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37°C, 5% CO₂ incubator(MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.

MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정

Ovotransferrin의 세포독성 효과를 측정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 활성화된 세포주를 2×10⁵ cells/mL로 맞추고 96-well plate에 각각 100 μL씩 첨가하여 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양한 후, cell 전용 배지에 녹인 ovotransferrin을 각각 2.5, 5, 10, 20, 40 mg/mL의 농도로 처리하였다. 이후 44시간 동안 추가 배양한 후 PBS 완충액에 녹인 MTT(2.5 mg/mL) 용액을 50 μL씩 각 well에 첨가하여 4시간 추가 배양하며 formazan 형성을 유도시키고, 반응 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 200 μL 첨가하여 녹이고 ELISA reader(Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

% 저해율로 나타내며, 저해율이 50% 이상인 경우에 종양 세포 증식 억제 효과가 있다고 판정하였다.

Ovotransferrin의 암세포 성장억제 효과는 도 2에 나타내었다. 본 실험에는 7종의 암세포주를 사용하였으며, ovotransferrin의 농도는 40 mg/mL부터 순차적으로 희석하여 사용하였다. 본 실험에서 사용한 MTT assay는 탈수소 효소에 의하여 노란색의 수용성 기질인 tetrazolium을 청자색의 비수용성 기질인 formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 방법으로 아무것도 처리하지 않은 정상군에 대한 ovotransferrin의 농도 별 처리군을 비교하였다.

실험결과, MTT assay의 경우 50% 이상 효과가 있을 시 성장억제가 있다고 간주하는데, 실험 결과 7가지 암세포에서 미흡하지만 세포 성장억제 효과가 관찰되었다. 상대적으로 낮은 농도인 2.5, 5, 10 mg/mL 처리군에서는 50%이하의 효과를 보였다. 이는 정상 대조군과 유의한 차이가 나타나지 않았다는 것을 의미한다. 하지만 암세포에 40 mg/mL ovotransferrin을 처리했을 시에는 간암 세포인 HepG-2 세포를 제외한 암 세포에서 60%이상의 효과를 나타내었으며 특히 대장암 세포인 HT-29에서 70%정도의 세포 성장억제 효과를 관찰 할 수 있었다.

이 결과로 본 발명 계란 난백에서 추출한 ovotransferrin을 암 세포에 처리했을 시 대부분의 암 세포에 대해 40 mg/mL의 농도 이상에서 성장억제 효과가 확인되었다.

코멧 에세이

Ovotransferrin의 백혈구 DNA 손상 억제 효과를 측정하기 위하여 코멧 에세이(comet assay)를 실시하였다. 건강한 성인남성 2명으로부터 채혈한 신선한 전혈 5 mL을 Histopaque 1077를 이용해 백혈구 만을 분리해 낸 후 본 실험에 사용하였다. 준비된 백혈구 세포에 PBS에 녹인 ovotransferrin 500 μg/mL을 처리하여 37°C에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 백혈구를 PBS로 세척한 후 인위적으로 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 200 μM의 H₂O₂를 백혈구에 처리하여 4°C에 5분 간 반응시킨 다음 다시 PBS로 세척하였다. Positive control을 위해 감초 시료 대신 용매인 DMSO를 처리한 후 200 μM H₂O₂를 처리하였고, negative control인 용매(DMSO) 처리 세포에는 H₂O₂를 처리하지 않았다. 코멧 에세이를 위해 반응을 끝낸 백혈구를 75 μL의 0.7% low melting agarose gel(LMA)과 섞은 후, 1.0% normal melting agarose(NMA)가 precoating된 normal slide 위로 cell suspension과 LMA의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 cover glass로 덮어 4℃ 냉장고에 보관하였다. Gel이 굳으면 cover glass를 벗기고 그 위에 다시 0.7% LMA 용액 75 μL로 한겹 더 덮었다. 미리 준비해 둔 차가운 alkali lysis buffer(2.5 M NaCl, 100 mM Na₂EDTA, 10 mM tris)에 사용 직전에 1% Triton X-100을 섞은 후 slide를 담가 저온, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 DNA의 double strand를 풀어주었다. Lysis가 끝난 후, slide를 electrophoresis tank에 배열하고 4°C의 차가운 전기영동 buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na₂EDTA, pH>13)를 채워 40분 동안 unwinding 시켜 DNA의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분 간 전기영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동 tank를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다.

전기영동이 끝난 후 0.4 M Tris buffer(pH 7.4)에 10분씩 담가 세척하는 과정을 3회 반복하여 slide를 건조시켰다. 20 μL/mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 염색하여 cover glass로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Germany) 상에서 관찰하였다. CCD camera(Nikon, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 image는 Komet 5.0 comet image analyzing system(Kinetic Imaging, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 hydrogen peroxide에 의한 DNA 손상 및 ovotransferrin에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(% Tail DNA)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 slide를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.

암 발생의 전단계인 세포 내 DNA 손상도를 측정하는 방법 중 하나인 comet assay는 단일 세포에서 DNA 손상 정도를 직접 측정할 수 있는 매우 유용한 실험 방법으로 in vitro, in vivo 연구뿐 아니라 분자 역학적으로 광범위하게 사용되는데 실험결과, ovotransferrin 처리에 의한 과산화수소로 유도된 인체 백혈구 DNA 손상 억제 효과 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 확인할 수 있는 제시된 바와 같이 200 μM의 H₂O₂를 처리한 양성 대조군은 PBS를 처리한 음성 대조군에 비해 DNA 손상이 유의적으로 높게 나타난 반면 500 μg/mL ovotransferrin을 처리한 실험군은 H₂O₂대조군에 비해 DNA 손상도가 34.5% 억제된 것을 확인할 수 있었다.

따라서 ovotransferrin은 암 세포의 성장억제 효과는 물론 암 발생의 전단계인 세포 내 백혈구 DNA 손상에 대한 보호 효과 역시 있음을 알 수 있었다.

본 실험 결과를 바탕으로 ovotransferrin은 암 세포 억제를 위한 기능성 물질로 활용할 수 있음이 확인되었다.

이상에서 명백한 바와 같이, 본 발명은 유기용매를 사용하지 않고 친환경적으로 계란으로부터 천연 기능성 물질인 ovotransferrin을 직접 추출 분리정제하는 효과가 있고 이를 유효성분으로 하는 인체 암 예방 및 치료용 항암 기능성 약제학적 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업 상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

계란의 난황과 난백을 분리시킨 후 난백에 증류수(H₂O)를 동량 혼합한 다음, FeCl₃?6H₂O를 3 mL/ 100 mL ovotransferrin solution 가한 후 pH 7.0 로 조절하고 다시 에탄올을 최종 농도가 50%가 되도록 첨가 한 다음 3,200×g로 원심분리한 후 그 잔사로부터 Fe³ ⁺를 제거하기 위해 잔사를 2-10배의 물에 녹인 후 다시 pH를 4.5-6.5로 조정한 다음, AG1-X₂ 이온교환수지를 이용하여 혼합여과하여 철분이 제거된 것이 특징인 계란 난백 ovotransferrin의 제조방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 철분이 제거된 계란 난백 ovotransferrin을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 천연 항암제.