CN116870171A - 一种牡蛎源外泌体样囊泡及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米生物材料技术领域，公开了一种牡蛎源外泌体样囊泡及其制备方法与应用，具体公开了一种牡蛎源外泌体样囊泡，所述牡蛎源外泌体样囊泡由牡蛎肉中分离出来；所述外泌体样囊泡中含有成骨矿物元素。本发明首次公开了牡蛎源外泌体样囊泡，该牡蛎源外泌体样囊泡为纳米级别的膜囊泡，呈现典型的茶托状形态，平均粒径小于150nm，能携带钙磷等成骨矿物元素，可以有效被成骨细胞摄取，具有促成骨细胞增殖与分化的作用，且具有改善骨质疏松的作用，可作为有益的膳食补充剂用于延缓骨质流失相关功能性食品中。

Description

一种牡蛎源外泌体样囊泡及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米生物材料技术领域，具体涉及一种牡蛎源外泌体样囊泡及其制备方法与应用。
背景技术
骨质疏松症是一种以骨小梁微结构退化，数量减少导致的骨密度和质量降低，并伴随着骨折发生风险增高为特征的全身代谢性慢病。世卫组织数据显示，全球超过2亿人罹患骨质疏松症，随着老龄化社会的加重，骨质疏松已成为重要的公共健康问题。然而现存的多种合成药物，都有一定的副作用，不利于长期服用，合理摄取具有良好促成骨作用的食源性活性成分，对防治及辅助治疗骨质疏松症具有重要意义。
外泌体是细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的纳米级囊泡，携带有蛋白、脂质、核酸、小分子等多种生物活性物质，能够介导细胞间通讯及信号转导。近年发现，动植物性食物中富含外泌体样纳米囊泡，可以携带功能蛋白质、黄酮、多酚等多种生物活性物质。值得注意的是，食物源外泌体样纳米囊泡经口摄入可以不受酶和pH等消化道环境的影响，使其携带的生物活性成分不经降解而直接吸收入血，并具有改善肠炎、抗癌、促骨生成、保肝、改善记忆力等多种生物学作用。
牡蛎富含蛋白质、多不饱和脂肪酸及大量有益骨骼生长的矿物微量元素等营养成分，具有重要的食用和药用价值。中草药古籍及现代科学研究均显示，牡蛎具有促进骨骼健康的功效，可以减少骨骼流失的速度、降低骨质疏松的风险。因此开发骨保护相关牡蛎源外泌体样囊泡具有良好的应用前景。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种牡蛎源外泌体样囊泡。
本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的牡蛎源外泌体样囊泡的制备方法。
本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的牡蛎源外泌体样囊泡和/或第二方面的制备方法的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。
本发明第五方面的目的，在于提供一种培养基。
本发明第六方面的目的，在于提供一种提高成骨细胞的增殖能力和/或分化能力的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，在于提供一种牡蛎源外泌体样囊泡，所述牡蛎源外泌体样囊泡由牡蛎肉中分离出来，所述外泌体样囊泡中含有成骨矿物元素。
优选地，所述牡蛎源外泌体样囊泡的平均粒径为80～150nm。
进一步优选地，所述牡蛎源外泌体样囊泡的平均粒径为143.0±5.5nm。
优选地，所述牡蛎源外泌体样囊泡为纳米级囊泡，其形态呈典型的茶托状结构。
优选地，所述成骨矿物元素包括钙和磷。
在本发明中，“外泌体样囊泡”是指由细胞分泌到胞外空间的纳米尺寸的胞外囊泡。所述囊泡包括外泌体并以最广泛的概念使用，包括在纳米尺寸泡状结构和组合物中与外泌体相似的囊泡。
在本发明中，“牡蛎源外泌体样囊泡”是指由牡蛎细胞所分泌的纳米尺寸外泌体样囊泡。所述外泌体样囊泡可以从牡蛎胞外液中分离出来，并且所述外泌体样囊泡可以从现有组织或细胞中完全地或部分地以物理分离出来。
所述外泌体样囊泡的膜组分可以进行化学或物理修饰，以便有效地在标靶细胞中执行期望的功能。例如，所述外泌体样囊泡的膜组分可以使用硫醇基(-SH)或胺基(-NH2)，或通过使诱导物质、融合剂、聚乙二醇以化学方法结合至外泌体样囊泡来进行化学修饰。
本发明第二个方面，在于提供本发明第一方面的牡蛎源外泌体样囊泡的制备方法，包括以下步骤：将牡蛎与提取液混合，匀浆，固液分离，即得到牡蛎源外泌体样囊泡。
优选地，所述牡蛎和提取液的质量体积比为1:(1～20)；进一步为1:(1～10)；更进一步为1:(5～10)。
优选地，所述提取液包括磷酸盐缓冲液。
优选地，所述提取液还包括蛋白酶。
优选的，所述提取液还包括10～30units蛋白酶。
优选地，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一种。
优选地，所述牡蛎与提取液混合前，将牡蛎去壳后，于冰上剪碎组织。
优选地，所述牡蛎与提取液混合后于35～40℃条件下消化0.5～24h；进一步为37～40℃条件下消化0.5～24h。
优选地，在所述匀浆之前将牡蛎与提取液的混合物于冰水浴中搅拌10～20min。
优选的，所述匀浆采用间歇式匀浆。
优选地，所述匀浆为在500～1000rpm条件下匀浆，每次匀浆时间为2～4s，间歇时间为30～40s，共匀浆1～3次。
优选地，所述固液分离包括采用超速离心、差速离心、平衡密度离心、密度梯度离心、过滤、透析和自由流动电泳中的至少一种方法进行。
目前进行外泌体分离的普遍方法是差速离心。一方面，所述差速离心法可以与过滤、超速离心等一起使用。另一方面，凝胶过滤或超滤可用于分离外泌体样囊泡。另一方面，可以使用透析代替过滤以除去小尺寸分子。另一方面，可使用自由流动电泳。另一方面，可以使用密度梯度离心，所述外泌体样囊泡由于密度不同可用密度梯度来分离，如可以使用密度梯度物质如聚蔗糖(Ficoll)、甘油、蔗糖，氯化铯、碘克沙醇等，但不限于此。
优选地，所述固液离心的条件如下：1～4℃条件下，300×g离心10～20min，收集上清；3000×g、1～4℃条件下离心10～20min，收集上清；10000×g、1～4℃条件下离心15～30min，收集上清；10 0000×g、1～4℃条件下离心70～120min，收集沉淀。
优选地，将固液分离收集到的沉淀用缓冲溶液重悬后利用滤膜过滤，然后10 0000×g、1～4℃条件下离心70～120min。
本发明第三个方面，在于提供本发明第一方面的牡蛎源外泌体样囊泡和/或第二方面的制备方法在(1)～(9)中任一项中的应用：
(1)制备治疗和/或辅助治疗骨质疏松的药物；
(2)制备延缓骨质流失的产品；
(3)制备降低骨质疏松的风险的产品；
(4)制备提高骨密度的产品；
(5)制备补充成骨矿物元素的产品；
(6)提高成骨细胞增殖能力；
(7)制备提高成骨细胞增殖能力的产品；
(8)提高成骨细胞分化能力；
(9)制备提高成骨细胞分化能力的产品。
优选地，所述产品包括食品、药物、试剂中的任意一种。
本发明第四个方面，在于提供一种包含本发明第一方面的牡蛎源外泌体样囊泡产品。
优选地，所述产品中还包括载体、辅料或稀释剂，本领域技术人员可以通过本领域专业书籍获知这些在药学上可接受的药用载体、辅料或稀释剂。
优选地，所述产品包括食品、药物、试剂中的任意一种。
优选的，所述产品中牡蛎源外泌体样囊泡的浓度为5～500μg/mL；进一步为10～200μg/mL；更进一步为20～80μg/mL。
本发明第五个方面，在于提供一种包含本发明第一方面的牡蛎源外泌体样囊泡培养基。
优选地，所述培养基中牡蛎源外泌体样囊泡的浓度为5～500μg/mL；进一步为10～200μg/mL；更进一步为20～80μg/mL。
优选地，所述培养基中还包含本领域技术人员可以通过本领域专业书籍获知的细胞所需的营养成分。
本发明第六个方面，在于提供一种提高成骨细胞的增殖能力、分化能力和/或对外源钙离子的摄取能力的方法，包括使用本发明第一方面的牡蛎源外泌体样囊泡处理成骨细胞的步骤；或使用本发明第五方面的培养基培养成骨细胞。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了牡蛎源外泌体样囊泡，该牡蛎源外泌体样囊泡为纳米级别的膜囊泡，呈现典型的茶托状形态，平均粒径小于150nm，能携带钙磷等成骨矿物元素，可以有效被成骨细胞摄取，具有促成骨细胞增殖与分化的作用，且具有改善骨质疏松的作用，可作为有益的膳食补充剂用于延缓骨质流失相关功能性食品中。
本发明制备过程中不需添加任何化学试剂，且制备方法简单。牡蛎是一种常见的水产品，以牡蛎为原料取材容易，可满足大规模生产的需要。
附图说明
图1为牡蛎源外泌体样囊泡的制备方法的流程图。
图2为实施例1～3的牡蛎源外泌体样囊泡的提取率结果统计图。
图3为牡蛎源外泌体样囊泡的粒径大小分析结果图。
图4为牡蛎源外泌体样囊泡的透射电镜图。
图5为牡蛎源外泌体样囊泡的微量矿物元素含量分析结果图。
图6为牡蛎源外泌体样囊泡对成骨细胞增殖能力的影响结果统计图，图中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
图7为牡蛎源外泌体样囊泡对成骨细胞分化能力的影响结果统计图，图中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
图8为牡蛎源外泌体样囊泡对去卵巢小鼠股骨micro-CT调控的变化图，其中，a为牡蛎源外泌体样囊泡对骨质疏松小鼠骨密度(BMD)的影响结果统计图，b为牡蛎源外泌体样囊泡对骨质疏松小鼠骨体积与骨组织体积比(BV/TV)的影响结果统计图，c为牡蛎源外泌体样囊泡对骨质疏松小鼠骨表面积密度(BS/TV)的影响结果统计图，d为牡蛎源外泌体样囊泡对骨质疏松小鼠骨小梁数(Tb.N)的影响结果统计图，图中##表示正常对照组和骨质疏松模型组相比p＜0.01，**表示骨质疏松模型组和牡蛎源外泌体样囊泡干预组相比p＜0.01。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1
一种牡蛎源外泌体样囊泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜牡蛎，冰上运输至实验室，开壳取牡蛎肉，使用剪刀剪碎成小块(2mm×2mm)，按照料液比1:8加入预冷PBS，冰水浴中磁力搅拌10min后，于1000rpm条件下匀浆，每次匀浆时间为3s，间歇时间为30s，总共匀浆3次，得牡蛎匀浆液；
(2)将牡蛎匀浆液转移至离心管中，进行梯度离心，梯度离心法的步骤如下：将60目网筛过滤后收集的上清液于300×g、4℃条件下离心10min(第一次离心)，收集上清液；将第一次离心后收集的上清液于3000×g、4℃条件下离心10min(第二次离心)，收集上清液；将第二次离心后收集的上清液于10000×g、4℃条件下离心20min(第三次离心)，收集上清液；将第三次离心后收集的上清液于10 0000×g、4℃条件下离心70min(第四次离心)，收集沉淀；将第四次离心后收集的沉淀用PBS重悬后，经过0.45μm滤膜过滤，再于10 0000×g、4℃条件下离心70min，即得牡蛎来源外泌体样囊泡。
实施例2
一种牡蛎源外泌体样囊泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜牡蛎，冰上运输至实验室，开壳取牡蛎肉，使用剪刀剪碎成小块(2mm×2mm)，按照料液比1:8加入含20units木瓜蛋白酶的PBS，于37℃条件下消化30min；然后置于冰水浴中磁力搅拌10min后，于1000rpm条件下匀浆，每次匀浆时间为3s，间歇时间为30s，总共匀浆3次，得牡蛎匀浆液；
(2)将牡蛎匀浆液转移至离心管中，进行梯度离心，梯度离心法的步骤如下：将60目网筛过滤后收集的上清液于300×g、4℃条件下离心10min(第一次离心)，收集上清液；将第一次离心后收集的上清液于3000×g、4℃条件下离心10min(第二次离心)，收集上清液；将第二次离心后收集的上清液于10000×g、4℃条件下离心20min(第三次离心)，收集上清液；将第三次离心后收集的上清液于10 0000×g、4℃条件下离心70min(第四次离心)，收集沉淀；将第四次离心后收集的沉淀用PBS重悬后，经过0.45μm滤膜过滤，再于10 0000×g、4℃条件下离心70min，即得牡蛎来源外泌体样囊泡。
实施例3
一种牡蛎源外泌体样囊泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜牡蛎，冰上运输至实验室，开壳取牡蛎肉，使用剪刀剪碎成小块(2mm×2mm)，按照料液比1:8加入含20units木瓜蛋白酶的PBS，于37℃条件下消化24h；然后置于冰水浴中磁力搅拌10min后，于1000rpm条件下匀浆，每次匀浆时间为3s，间歇时间为30s，总共匀浆3次，得牡蛎匀浆液；
(2)将牡蛎匀浆液转移至离心管中，进行梯度离心，梯度离心法的步骤如下：将60目网筛过滤后收集的上清液于300×g、4℃条件下离心10min(第一次离心)，收集上清液；将第一次离心后收集的上清液于3000×g、4℃条件下离心10min(第二次离心)，收集上清液；将第二次离心后收集的上清液于10000×g、4℃条件下离心20min(第三次离心)，收集上清液；将第三次离心后收集的上清液于10 0000×g、4℃条件下离心70min(第四次离心)，收集沉淀；将第四次离心后收集的沉淀用PBS重悬后，经过0.45μm滤膜过滤，再于10 0000×g、4℃条件下离心70min，即得牡蛎来源外泌体样囊泡。
实施例4
本实施例对所制备得到的牡蛎来源外泌体样囊泡进行各项表征。
1.蛎源外泌体样囊泡的提取率
用BCA试剂盒(BCA Protein Assay，beyotime，P0009)检测实施例1～3所制备得到的牡蛎来源外泌体样囊泡的浓度进行测定，并按照以下的公式计算实施例1～3所制备得的牡蛎源外泌体样囊泡的提取率，提取率＝牡蛎外泌体样囊泡蛋白量(mg)/牡蛎肉重量(g)。
结果如图2所示，实施例2和实施例3所制备得的牡蛎源外泌体样囊泡的提取率相差不大，且均高于实施例1，表明经过木瓜蛋白酶消化后，可以增大牡蛎源外泌体样囊泡的提取率。
2.牡蛎源外泌体样囊泡的粒径大小
通过纳米颗粒跟踪分析检测实施例1～3所制备得到的牡蛎源外泌体样囊泡的粒径大小，具体如下：将牡蛎源外泌体样囊泡的颗粒浓度稀释为适当浓度，在经过0.22μm滤膜过滤后，将其注入纳米颗粒跟踪分析仪进样检测。
结果如图3所示，实施例1～3制备得到的牡蛎源外泌体样囊泡的平均粒径大小之间无显著差异，表明酶消化不会影响牡蛎源外泌体样囊泡的粒径大小。因此选择实施例2为优选方案进行后续分析。
3.牡蛎源外泌体样囊泡的形态
通过透射电镜观察实施例2所制备得到的牡蛎源外泌体样囊泡的形态，具体包括以下步骤：牡蛎源外泌体样囊泡固定后，将铜网覆于样本滴上，用滤纸吸去多余液体。取10μL水铀滴成圆滴，将铜网覆在水铀滴上，室温晾干后，于透射电镜下观察并拍照。
结果如图4所示，牡蛎源外泌体样囊泡的形态为典型的茶托状形态。
4.牡蛎源外泌体样囊泡中微量矿物元素的测定
通过电感耦合等离子体光谱仪分析实施例2制备得到的牡蛎源外泌体样囊泡中微量矿物元素，结果如图5所示，实施例2制备得到的牡蛎源外泌体样囊泡携带钙、磷、铜、铁等微量矿物元素，尤其是钙元素和磷元素。
实施例5
本实施例就实施例2得到的牡蛎源外泌体样囊泡利用体外细胞实验考察牡蛎源外泌体样囊泡对成骨细胞增殖能力的影响。
采用CCK-8法检测牡蛎源外泌体样囊泡对成骨细胞增殖能力的影响，具体如下：将密度为10000个/每孔的MC3T3-E1细胞接种在96孔板中，用含有10v/v％FBS的α-MEM培养基，在5％CO2 37℃的环境中培养24h；将培养液更换为含有不同浓度的牡蛎源外泌体样囊泡培养基(0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL)，每个处理设置3个平行，于5％CO2 37℃下培养48小时；通过CCK-8试剂盒(CCK-8assay，beyotime，C0038)检测MC3T3-E1细胞活力，以观察牡蛎源外泌体样囊泡对成骨细胞增殖能力的影响。
结果如图6所示，在牡蛎源外泌体样囊泡5～160μg/mL浓度范围内，随着牡蛎源外泌体样囊泡浓度的增加，MC3T3-E1细胞活力增加，表明牡蛎来源的外泌体样囊泡对细胞增殖能力有明显的促进作用，而当牡蛎源外泌体样囊泡浓度达320μg/mL时，对细胞增殖能力的促进作用减弱。
实施例6
本实施例利用体外细胞实验考察牡蛎源外泌体样囊泡对成骨细胞分化能力的影响。
将成骨细胞(MC3T3-E1细胞)按照合适密度(2×104个/mL)接种于12孔板中，分为对照组和不同浓度的牡蛎源外泌体样囊泡组(20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL)，使用含有10v/v％FBS、1w/v％青-链霉素双抗、10nM地塞米松、0.2mM抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸钠的α-MEM培养基进行诱导；培养7天后，采用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(ALP Assay，beyotime，P0321S)进行ALP活性分析，以评价牡蛎源外泌体样囊泡对成骨细胞分化能力的影响
结果如图7所示，ALP分析结果显示加入牡蛎源外泌体样囊泡后，ALP活性相比对照组显著提高，且呈现剂量依赖性，表明牡蛎来源的外泌体样囊泡具有促进成骨分化的作用。
实施例7
本实施例用于考察牡蛎源外泌体样囊泡对骨质疏松小鼠骨质流失的调控作用。
选择12周龄小鼠C57BL6品系雌性小鼠，通过双侧去卵巢建立骨质疏松模型，设置三个不同组别，即小鼠卵巢周围脂肪摘除为假手术组(Sham)，小鼠卵巢摘除为骨质疏松模型组(OVX)，对小鼠卵巢手术摘除并使用实施例2制备得到的牡蛎源外泌体样囊泡灌胃处理的为干预组(OVX-OEV)。手术后的所有小鼠休息1周后再进行干预，OVX-OEV组灌胃的剂量为每天50mg/kg体重的牡蛎源外泌体样囊泡，OVX组和Sham组使用相同体积的生理盐水进行灌胃。总共灌胃6周后，采用Micro-CT扫描分析骨三维结构及骨组织形态计量学指标的变化。
图8中a为牡蛎源外泌体样囊泡对骨质疏松小鼠骨密度(BMD)的影响，结果显示OVX-OEV组的BMD恢复到Sham组的水平，平均为0.078g/cm3，显著高于OVX组的0.036g/cm3；图8中b为牡蛎源外泌体样囊泡对骨质疏松小鼠骨体积与骨组织体积比(BV/TV)的影响，结果显示OVX-OEV组的BV/TV恢复到Sham组的水平，平均为12.23％，显著高于OVX组的2.17％；图8中c为牡蛎源外泌体样囊泡对骨质疏松小鼠骨表面积密度(BS/TV)的影响，结果显示OVX-OEV组的BS/TV恢复到Sham组的水平，平均为8.21 1/mm，显著高于OVX组的1.82 1/mm；图8中d为牡蛎源外泌体样囊泡对骨质疏松小鼠骨小梁数(Tb.N)的影响，结果显示OVX-OEV组的Tb.N恢复到Sham组的水平，平均为1.73 1/mm，显著高于OVX组的0.36 1/mm。
上述结果表明使用本发明制备得到的牡蛎源外泌体样囊泡对小鼠骨质疏松症有显著的防治效果。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种牡蛎源外泌体样囊泡，所述牡蛎源外泌体样囊泡由牡蛎肉中分离出来，所述外泌体样囊泡中含有成骨矿物元素。
2.根据权利要求1所述的外泌体样囊泡，其特征在于，所述牡蛎源外泌体样囊泡为纳米级囊泡，其形态呈典型的茶托状结构。
3.根据权利要求2所述的牡蛎源外泌体样囊泡，其特征在于，所述成骨矿物元素包括钙、磷。
4.权利要求1～3中任一项所述的牡蛎源外泌体样囊泡的制备方法，包括以下步骤：将牡蛎与提取液混合，匀浆，固液分离，即得到牡蛎源外泌体样囊泡。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述牡蛎和提取液的质量体积比为1:(1～20)；和/或，所述提取液包括磷酸盐缓冲液和蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述固液分离包括采用梯度离心、超速离心、差速离心、平衡密度离心、密度梯度、过滤、透析和自由流动电泳中的至少一种方法进行；和/或，所述牡蛎与提取液混合后于35～40℃条件下消化0.5～24h。
7.权利要求1～3中任一项所述的牡蛎源外泌体样囊泡和/或权利要求4～6中任一项所述制备方法在(1)～(9)中任一项中的应用：
(1)制备治疗和/或辅助治疗骨质疏松的药物；
(2)制备延缓骨质流失的产品；
(3)制备降低骨质疏松的风险的产品；
(4)制备提高骨密度的产品；
(5)制备补充成骨矿物元素的产品；
(6)提高成骨细胞增殖能力；
(7)制备提高成骨细胞增殖能力的产品；
(8)提高成骨细胞分化能力；
(9)制备提高成骨细胞分化能力的产品。
8.一种产品，包含权利要求1～3中任一项所述的牡蛎源外泌体样囊泡；优选的，所述产品中牡蛎源外泌体样囊泡的浓度为5～500μg/mL。
9.一种培养基，包含权利要求1～3中任一项所述的牡蛎源外泌体样囊泡；优选地，所述培养基中所述牡蛎源外泌体样囊泡的浓度为5～500μg/mL。
10.一种提高成骨细胞的增殖能力和/或分化能力的方法，包括使用权利要求1～3中任一项所述的牡蛎源外泌体样囊泡处理成骨细胞的步骤；或使用权利要求9所述的培养基培养成骨细胞。
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