CN116024157A

CN116024157A - 一种生姜外泌体的制备方法

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Publication number: CN116024157A
Application number: CN202310068158.1A
Authority: CN
Inventors: 郑磊; 操雅棋; 颜玲; 殷李芬; 刘长虹
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2023-02-06
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明涉及一种生姜外泌体的制备方法及应用，属于生物技术领域。制备操作如下：（1）将生姜去皮洗净，切成小块状，榨汁并将汁液分离；（2）采用差速高速离心法，将收集的汁液在4℃下差速高速离心分离，去除沉淀；结合聚乙二醇沉淀法，将上清液加入相应量的聚乙二醇溶液，旋涡混匀，在4℃下孵育、离心、沉淀纳米颗粒；（3）将纳米颗粒悬浮，过滤，纯化柱纯化，收集纯化液，即得到生姜外泌体。生姜外泌体的粒径为120～192 nm，生姜外泌体的表面负电荷为‑31.6～‑21.6 mV，生姜外泌体的蛋白浓度为2391.43±750 ng/μL。生姜外泌体在肠细胞中的有效内化作用主要与巨胞饮和小窝蛋白介导的内吞作用相关，有效抑制LPS诱导的肠细胞中NF‑κB和炎症细胞因子的过度表达，有望抑制或缓解肠道炎症。

Description

一种生姜外泌体的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生姜外泌体的制备方法。

背景技术

植物源外泌体纳米颗粒是一种由细胞分泌的微小膜泡，约30-300nm，类似于哺乳动物的外泌体，具有脂质双层膜结构，封装了蛋白质、脂质、DNA和各种RNA等。近年来，外泌体凭借其个体微小且性状稳定等优势在参与细胞间通讯、疾病诊断、疾病治疗等方面发挥重要作用。几乎所有的细胞都可以产生外泌体，不同细胞来源的外泌体中既包含与细胞形成、结构和物质转运相关的共有成分，也包含与来源细胞的生物功能相关的特异分子。在世界范围内，生姜是一种多年生植物，在食品和饮料中被广泛用作饮食调味品。研究表明，生姜的有益作用包括降低血小板聚集的风险，降低内皮功能障碍的风险，以及改善消化道疾病。生姜不仅富含膳食纤维、挥发性化合物和非挥发性生物活性物质，而且还含有与外泌体相似的纳米囊泡。在过去的几年里，植物外泌体已经被广泛发现，并有望作为一种新的天然生物活性成分来改善人类健康。

当我们进食时，食物中所含的外泌体可被人体内特殊的宿主细胞自然吸收，并进行信息的传递。人的胃肠道不可避免地会与植物外泌体发生接触，因而植物外泌体与肠道细胞的相互作用引起了广泛的关注。目前，植物外泌体介导的肠道疾病治疗进展缓慢，这主要是由于对植物外泌体与肠细胞的相互作用理解有限。植物外泌体的跨界调控功能可能是通过其所包含的货物，特别microRNAs (miRNAs)，从供体细胞到受体细胞，以及外泌体与细胞表面受体的结合来实现的。miRNAs是一类大小约22个核苷酸的非编码RNA，通过识别和切割靶mRNA或抑制翻译过程来影响靶基因的表达，从而参与调节多种生物途径。因此，人们对miRNAs在人类健康和疾病中的作用产生了浓厚的兴趣。然而，由于人工合成的miRNAs存在严重的靶内或脱靶等副作用，其使用一直存在争议。值得注意的是，植物外泌体中的miRNAs是稳定的、无毒的、且具有生物可利用性的。它们可以通过外泌体的运输到达目标组织，并在靶点处表现出极强的生物活性。因此，发明一种提取生姜外泌体（GELNs）的方法，并将所提取的GELNs应用于脂多糖（LPS）诱导的肠道炎症治疗即为本发明的研究重点。

发明内容

为了实现高效提取大量高纯度的生姜外泌体（GELNs），并有效抑制肠道炎症，本发明提供一种生姜外泌体（GELNs）的制备方法。

一种生姜外泌体（GELNs）的制备操作步骤如下：

（1）将生姜去皮洗净，切成小块状，榨汁，并将汁液分离；

（2）采用差速高速离心法，将收集的汁液在4000 g（离心力）、8000 g、12000 g、18000 g，4℃离心条件下分别各离心60min，去除细胞和细胞碎屑；采用聚乙二醇沉淀法，在20 mL上清液中加入5 mL聚乙二醇（PEG）溶液，旋涡混匀；在4℃下孵育2小时；然后在18000g，4℃离心条件下，离心60 min，得到沉淀的纳米颗粒；

（3）将纳米颗粒用1×PBS悬浮，通过450 nm滤头过滤；在16000g，4℃离心条件下，用纯化柱纯化10 min；收集纯化液，即得到生姜外泌体；

所述生姜外泌体的粒径为120～192 nm，生姜外泌体的表面负电荷为-31.6～-21.6 mV，生姜外泌体的蛋白浓度为2391.43±750 ng/μL。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

1. 目前，差速超高速离心是生姜外泌体提取最主要的分离纯化方式，但这种提取方式需用冷冻超高速离心机这种大型设备，成本较高，难以广泛应用。本发明采取了差速高速离心法与聚乙二醇沉淀法相结合的方法，本发明方法操作简单、绿色、无毒，可提取大量的GELNs，通过鉴定表征，证实了制备所得的GELNs具有经典的茶托状结构以及理想的粒径（120～192 nm）和表面负电荷（-31.6～-21.6 mV），且其纯度极高（蛋白浓度为2391.43±750 ng/μL）。

2.本发明制备的GELNs在经荧光染料标记后，可在激光共聚焦显微镜下观察到在肠细胞中逐渐吸收的过程，且进一步分析表明GELNs在肠细胞中的有效内化作用主要与巨胞饮和小窝蛋白介导的内吞作用相关。

3.本发明制备的GELNs可有效抑制LPS诱导的肠细胞中NF-κB和炎症细胞因子（ TNF-α， IL-8和 IL-1β）的过度表达，并且GELNs的抗炎功能与其所含的miRNA有关，有望抑制或缓解肠道炎症。

附图说明

图1为本发明实施例1中生姜外泌体（GELNs）的提取示意图及表征分析图。

图2为本发明实施例2中肠细胞（Caco-2）有效吸收GELNs的共聚焦显微镜图。

图3为本发明实施例2中不同内吞抑制剂对GELNs内化作用的影响图。

图4为本发明实施例3中GELNs对LPS诱导的Caco-2细胞炎症的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

实施例1

一种生姜外泌体（GELNs）的制备操作步骤如下：

（1）将生姜去皮洗净，切成小块状，放入榨汁机中。榨取的新鲜姜汁利用纱布过滤去除残渣，重复两次后分装于50 mL离心管中，得到汁液。

（2）采用差速高速离心法，将收集的汁液在4℃下进行梯度离心，4000 g（离心力）6000 g 、8000 g 、12000g、18000 g分别各离心1 h。采用聚乙二醇沉淀法，在20mL上清液中加入5mL 聚乙二醇沉淀，振荡混匀，4℃孵育2h。孵育完毕的混合液，在18000 g，4℃离心条件下，离心1 h，得到沉淀的纳米颗粒。

（3）将纳米颗粒用1×PBS悬浮沉淀，通过450 nm滤头过滤，并进一步将滤液置于纯化柱中，在16000g，4℃离心条件下，离心 10 min；收集纯化液，即得到生姜外泌体。将收集管中的纯化液分装至新的EP管中，并置于-80℃保存。

参见图1中的A，本实施例1 GELNs的提取示意图，GELNs的形貌，生姜外泌体的粒径及zeta电位结果如图1所示。如图1中的B所示，在透射电镜下，GELNs呈茶托状、空杯状。如图1中的C所示，制备所得的生姜外泌体的粒径范围为120～192 nm ，如图1中的D所示，表面负电荷为 -31.6～-21.6 mV。此外，以牛血清血蛋白为标品，利用BCA蛋白定量测得GELNs的蛋白浓度为2391.43±750 ng/μL。

实施例2

GELNs被Caco-2细胞有效内化的应用：

取实施例1提取的GELNs与Caco-2细胞共孵育，分析GELNs的吸收率，确定其吸收机制，具体步骤如下：

将购买所得的Caco-2株在常规细胞培养条件（37℃ 5% CO₂）下，使用完全培养基（由87%的DMEM、10% FBS、1% 青霉素、1% 链霉素、1% 非必需氨基酸组成）进行培养。利用PKH26对GELNs进行荧光染色。按照说明书的要求，取等量染色液与GELNs共孵育30 min（37℃），加入一定量1×PBS， 100000g条件下离心2h，1×PBS 悬浮沉淀。将状态良好的Caco-2细胞接种在共聚焦培养皿上，孵育过夜。细胞与已被荧光标记的GELNs共培养一定时间后，用1×PBS进行清洗，多聚甲醛进行固定，并分别利用DIO和DAPI对细胞膜和细胞核进行染色。染色完毕，再次使用1×PBS洗涤细胞，并将其置于激光共聚焦显微镜下拍摄图像。为探究GELNs的吸收机制，将内吞抑制剂（阿米洛利 50 μmol/L，吲哚美辛 100 μmol/L，氯丙嗪12.5 μmol/L）与Caco-2细胞共孵育1 h，然后再加入荧光标记的GELNs孵育6 h，重复上述染色步骤，在激光共聚焦显微镜下观察图像，结果如图2中的A所示，其中红色为PKH26标记的GELNs，绿色为3′-二十八碳六碳菁高氯酸盐（DIO）标记的Caco-2细胞膜，蓝色为4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的Caco-2细胞核；如图3所示，其中红色为PKH26标记的GELNs，绿色为DIO标记的Caco-2细胞膜，蓝色为DAPI染色的Caco-2细胞核。

如图2中的A所示，Caco-2细胞与PKH26标记的GELNs孵育0.25 h时，细胞内未出现红色荧光，如图2中的B所示，当共孵育6h时，细胞内可见大量红色荧光，这表明随着时间的推移，GELNs被Caco-2细胞有效内化。

参见图3中的A，共聚焦成像结果分析显示，吲哚美辛预处理的Caco-2细胞中红色光点的数量明显减少。结果表明，GELNs的内化与小窝蛋白介导的内吞作用密切相关。参见图3中的B，阿米洛利是巨胞饮抑制剂，其预处理的细胞与对照组细胞相比，对于GELNs的摄取率下降了20.48±14.64%。然而，参见图3中的B，氯丙嗪的预处理作用几乎不影响Caco-2细胞对GELNs的吸收，这表明网格蛋白介导的内吞作用并不参与GELNs的内化过程。总的来说，GELNs可通过巨胞饮和小窝蛋白介导的内吞作用被小肠细胞吸收，这可能主要与肠细胞表面结合蛋白的数量及外泌体的自身特性相关。

实施例3

GELNs的体外抗炎活性研究：

取实施例1提取的GELNs加入LPS诱导的肠道细胞炎症模型中，分析GELNs的体外抗炎活性。具体步骤如下：

将Caco-2细胞以1×10⁵细胞/孔的密度接种于24孔板上，分别与LPS (5 μg/mL)、LPS +GELNs (60 μg/mL)、LPS + D-GELNs (60 μg/mL)孵育24 h。D-GELNs为去除RNA的GELNs。利用Trizol分离试剂提取细胞的总RNA。使用Primer-Script™RT-PCR试剂盒和SYBRPremix Ex Taq™试剂盒进行RNA逆转录及PCR扩增。RT-PCR的程序设置为：95℃30 s, 95℃5 s, 60℃ 1 min, 40个循环。采用GAPDH为内参基因,对所有样品进行归一化处理，并对目标基因进行相对定量，结果如图4所示。

参见图4中的A，与对照组相比，LPS处理显著提高了Caco-2细胞中NF-κB的mRNA水平；参见图4中的B，LPS处理显著提高了IL-1β的mRNA水平；参见图4中的C，LPS处理显著提高了IL-8的mRNA水平，参见图4中的D，LPS处理显著提高了TNF-α的mRNA水平；其中TNF-α的水平尤为显著。参见图4中的A、B、C和D，GELNs的治疗显著抑制了NF-κB（图4A）和炎症细胞因子IL-1β（图4B）、IL-8（图4C）、TNF-α（图4D）的表达，表明了GELNs可有效抑制LPS诱导的肠道细胞炎症。此外，GELNs的抗炎功能可能与其所含的miRNA有关。结果表明，GELNs提供了一种将遗传物质转移到人体肠道的自然途径，并可能通过miRNAs的跨界调控作用缓解肠道炎症。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims

1.一种生姜外泌体的制备方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）采用差速高速离心法，将收集的生姜汁液在4000 g（离心力）、8000g、12000g、18000g，4℃离心条件下分别各离心60 min，去除细胞和细胞碎屑；采用聚乙二醇沉淀法，在20 mL上清液中加入5 mL聚乙二醇（PEG）溶液，旋涡混匀；在4℃下孵育2小时；然后在18000g，4℃离心条件下，离心60 min，得到沉淀的纳米颗粒；

（2）将纳米颗粒用1×PBS悬浮，通过450 nm滤头过滤；在16000g，4℃的离心条件下，用纯化柱纯化10 min；收集纯化液，即得到生姜外泌体；

所述生姜外泌体的粒径为120～192 nm，生姜外泌体的表面负电荷为-31.6～-21.6mV，生姜外泌体的蛋白浓度为2391.43±750 ng/μL。