JP7054956B2 - リゾビウム属細菌由来のナノ小胞およびその用途 - Google Patents

リゾビウム属細菌由来のナノ小胞およびその用途 Download PDF

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Description

本発明は、リゾビウム属細菌由来のナノ小胞およびその用途に関し、より具体的に、リゾビウム属細菌に由来するナノ小胞を用いた胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症などの診断方法、および前記小胞を含む前記疾患の予防、改善または治療用組成物に関する。
２１世紀に入ってから、過去には伝染病と認識された急性感染性疾患の重要性が減る一方、ヒトとマイクロバイオームとの不調和によって発生する免疫機能の異常を伴った慢性疾患が生活の質とヒトの寿命を決定する主な疾患となり疾病パターンが変わった。２１世紀の難治性慢性疾患として、癌、心血管疾患、慢性肺疾患、代謝疾患、および神経精神疾患がヒトの寿命と生活の質を決定する主な疾患として国民保健に大きい問題になっている。前記難治性慢性疾患は、原因因子による免疫機能の異常を伴った慢性炎症を特徴とする。
人体に共生する微生物は１００兆に至り、ヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒトの遺伝子数の１００倍を超えることが知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいは、ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた生息域に存在する真正細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言う。
人体に共生する細菌および周辺環境に存在する細菌は、他の細胞への遺伝子、低分子化合物、タンパク質などの情報を交換するために、ナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成しており、粘膜に共生する細菌である場合には、粘膜を通過しないが、細菌由来の小胞は、サイズが１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通じて上皮細胞を通過して人体に吸収される。局所的に分泌された細菌由来の小胞は、粘膜の上皮細胞を通じて吸収されて局所炎症反応を誘導すると共に、上皮細胞を通過した小胞は、リンパ管を通じて全身的に吸収されて各臓器に分布し、分布した臓器で免疫および炎症反応を調節する。例えば、大腸菌（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような病原性グラム陰性細菌に由来する小胞は、局所的に大腸炎を起こし、血管に吸収された場合に、血管内皮細胞の炎症反応を通じて全身的な炎症反応および血液凝固を促進させ、また、インスリンが作用する筋肉細胞などに吸収されて、インスリン抵抗性と糖尿病を誘発する。反面、有益な細菌に由来する小胞は、病原性小胞による免疫機能および代謝機能の異常を調節して疾病を調節することができる。
細菌に由来する小胞などの因子に対する免疫反応は、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、以下、ＩＬという）－１７サイトカインの分泌を特徴とするＴｈ１７免疫反応が発生するが、これは、細菌由来の小胞に露出時にＩＬ－６が分泌され、これにより、Ｔｈ１７免疫反応を誘導する。Ｔｈ１７免疫反応による炎症は、好中球の浸潤を特徴とし、炎症が発生する過程でマクロファージなどのような炎症細胞から分泌される腫瘍壊死因子－アルファ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ、以下、ＴＮＦ－αという）が重要な役割を担当する。
リゾビウム属細菌は、土壌から窒素を吸収するグラム陰性細菌であって、種実類などの根に共生しつつ、大気中の窒素をアンモニアに転換させた後、グルタミンなどの窒素化合物を植物に提供する。しかしながら、まだリゾビウム属細菌が細胞外に小胞を分泌するという事実が報告されておらず、特に癌、神経疾患、または代謝疾患などのような難治性疾患の診断および治療に応用した事例は、報告されたことがない。
本発明者らは、前述のような従来の問題点を解決するために、鋭意研究した結果、メタゲノム分析を通してリゾビウム属細菌由来の小胞が、正常ヒトに比べて胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および認知症患者の臨床サンプルで有意に減少していることを確認し、疾患を診断することができることを確認した。また、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）から小胞を分離してマクロファージに処理したとき、病原性小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌を顕著に抑制することを確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
これより、本発明は、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病または認知症の診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、リゾビウム属細菌由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および認知症の予防、改善または治療用組成物を提供することを他の目的とする。
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記のステップを含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌由来の細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症に分類するステップ。
本発明は、下記のステップを含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病または認知症の診断方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌由来の細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症と判定するステップ。
本発明の一具現例において、前記ステップ（ａ）でのサンプルは、血液または尿でありうる。
本発明の他の具現例において、前記ステップ（ｂ）でのプライマーペアは、配列番号１および配列番号２のプライマーでありうる。
また、本発明は、リゾビウム属細菌由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、リゾビウム属細菌由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症の予防または改善用食品組成物を提供する。
また、本発明は、リゾビウム属細菌由来の小胞を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症の予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、リゾビウム属細菌由来の小胞の、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症の予防または治療用途を提供する。
本発明の一具現例において、前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍのものでありうる。
本発明の他の具現例において、前記小胞は、リゾビウム属細菌から自然的にまたは人工的に分泌されるものでありうる。
本発明のさらに他の具現例において、前記リゾビウム属細菌由来の小胞は、リゾビウム・レグミノサーラム由来の小胞でありうる。
本発明者らは、腸内細菌である場合には、体内に吸収されないが、細菌由来の小胞である場合には、上皮細胞を通じて体内に吸収されて、全身的に分布し、腎臓、肝臓、肺を通じて体外に排泄されることを確認し、患者の血液または尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を通して胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および認知症患者の血液または尿などの臨床サンプルに存在するリゾビウム属細菌由来の小胞が、正常ヒトに比べて有意に減少していることを確認した。また、リゾビウム属細菌の一種であるリゾビウム・レグミノサーラムを体外で培養して小胞を分離して、体外で炎症細胞に投与したとき、病原性小胞による炎症メディエーターの分泌を有意に抑制することを観察したところ、本発明によるリゾビウム属細菌由来の小胞は、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症に対する診断方法、および前記疾患に対する予防、改善または治療用組成物に有用に用いられるものと期待される。
図１ａは、マウスに細菌と細菌由来の小胞（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、口腔で投与した後１２時間目に、尿、腎臓、肝臓、および様々な臓器を摘出して、細菌と小胞の体内分布様相を評価した図である。 図２は、胃癌患者および正常ヒトの尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図３は、大腸癌患者および正常ヒトの尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図４は、乳癌患者および正常ヒトの尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図５は、卵巣癌患者および正常ヒトの尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図６は、膀胱癌患者および正常ヒトの尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図７は、前立腺癌患者および正常ヒトの尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図８は、喘息患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図９は、糖尿病患者および正常ヒトの尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図１０は、パーキンソン病患者および正常ヒトの尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図１１は、認知症患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム分析を実施した後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図１２は、リゾビウム・レグミノサーラム由来の小胞の抗炎症および免疫調節効果を評価するために、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＶ）の処理前にリゾビウム菌由来の小胞を前処理して、大腸菌小胞による炎症メディエーターであるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌に及ぼす影響を評価した結果である（ＮＣ：ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；ＰＣ：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＶ １μｇ／ｍｌ；ＬＰ＿１．０：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＥＶ １．０μｇ／ｍｌ；ＲＬ＿０．１、１．０、１０：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ＥＶ ０．１、１．０、１０μｇ／ｍｌ）。
本発明は、リゾビウム属細菌由来の小胞およびその用途に関する。
本発明者らは、メタゲノム分析を通してリゾビウム属細菌由来の小胞が、正常ヒトに比べて胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および認知症患者の臨床サンプルで有意に減少していることを確認し、疾患を診断することができることを確認した。また、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）から小胞を分離し、特性を分析した結果、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症などの疾患に対する予防、改善または治療用組成物として用いることができることを確認した。
これより、本発明は、下記のステップを含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌由来の細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症に分類するステップ。
本発明において使用される用語「診断」とは、広い意味では、患者の病の実態をすべての面にわたって判断することを意味する。判断の内容は、病名、病因、病型、軽重、病状の詳細な様子、合併症の有無、および予後などである。本発明において診断は、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および／または認知症などの発病の有無および疾患のレベルなどを判断することである。
本発明において使用される用語「ナノ小胞（Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）あるいは小胞（Ｖｅｓｉｃｌｅ）」とは、多様な細菌から分泌されるナノサイズの膜からなる構造物を意味する。グラム陰性菌（ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の小胞、または外膜小胞体（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＯＭＶｓ）は、内毒素（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）だけでなく、毒性タンパク質および細菌ＤＮＡとＲＮＡも有しており、グラム陽性菌（ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の小胞は、タンパク質と核酸の他にも、細菌の細胞壁の構成成分であるペプチドグリカンとリポタイコ酸も有している。本発明において、ナノ小胞あるいは小胞は、マイクロコッカス属細菌から自然的に分泌されたり、または人工的に生産されるものであって、球形の形態であり、１０～２００ｎｍの平均直径を有している。
本発明において使用される用語「メタゲノム」とは、「群遺伝子」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、カビなどを含む遺伝子の総和を意味するものであって、主に培養できない微生物を分析するために、シーケンサーを使用して一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝子の概念に使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノム、遺伝子を言うものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝子であって、一種の混合遺伝子を言う。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には、高速配列分析法を利用して、種に関係なく、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を解明する技法の対象である。
本発明において、前記サンプルは、血液または尿でありうるが、これに制限されるものではない。
本発明の他の様態として、本発明は、リゾビウム属細菌由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症の予防、治療または改善用組成物を提供する。前記組成物は、食品組成物および薬学的組成物を含み、本発明において食品組成物は、健康機能食品組成物を含む。本発明の組成物は、口腔噴霧剤または吸入剤の剤形でありうる。
本発明において使用される用語「予防」とは、本発明による組成物の投与により胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および／または認知症などを抑制したり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
本発明において使用される用語「治療」とは、本発明による組成物の投与により胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および／または認知症などに対する症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
本発明において使用される 用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。
前記小胞は、リゾビウム属細菌を含む培養液を遠心分離、超高速遠心分離、高圧処理、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍－解凍、電気穿孔、機械的分解、化学物質処理、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、およびキャピラリー電気泳動からなる群より選ばれる１種以上の方法を用いて分離することができる。また、不純物の除去のための洗浄、収得された小胞の濃縮などの過程をさらに含むことができる。
本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、または錠剤に製剤化することができる。適合した薬学的に許容される担体および製剤化に関しては、レミントンの文献に開示されている方法を用いて各成分によって好適に製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、または経口摂取剤などに製剤化することができる。
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚、鼻腔、気道に適用）することができ、投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者により適宜選択され得る。
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明による組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与され得、単一または多重投与され得る。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。
具体的に、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって変わり得、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１～１５０ｍｇ、好ましくは０．０１～１００ｍｇを毎日または隔日に投与することができ、また１日１～３回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減され得るので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の食品組成物は、健康機能食品組成物を含む。本発明による食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加したり他の食品または食品成分と共に使用され得、通常の方法によって適切に使用され得る。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）によって適宜決定され得る。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明の組成物は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかしながら、健康および衛生を目的としたりまたは健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下でありうる。
本発明の食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有すること他に、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などをさらなる成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなど；およびポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を好適に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、当業者の選択によって適切に決定され得る。
前記の他に本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。このような成分は、独立して、または組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率も、当業者によって適宜選択され得る。
本発明の一実施例では、細菌および細菌由来の小胞をマウスの経口で投与して、細菌および小胞の体内吸収、分布、および排泄様相を観察したところ、細菌である場合には、腸粘膜を通じて吸収されないのに対し、小胞は、投与５分以内に吸収されて全身的に分布し、腎臓、肝臓などを通じて排泄されることを確認した（実施例１参照）。
本発明の他の実施例では、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、糖尿病、およびパーキンソン病患者と、年齢と性別をマッチングした正常ヒトの血液または尿から分離した小胞を用いて細菌メタゲノム分析を実施した。その結果、正常ヒトのサンプルに比べて、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および認知症患者の臨床サンプルでリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（実施例３～１２参照）。
本発明のさらに他の実施例では、リゾビウム・レグミノサーラム菌株を培養し、これから分泌された小胞が免疫調節および抗炎症効果を示すかを評価したが、多様な濃度のリゾビウム・レグミノサーラム由来の小胞をマクロファージに処理した後、炎症疾患の原因因子である大腸菌由来の小胞を処理して炎症メディエーターの分泌を評価した結果、大腸菌由来の小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌をリゾビウム・レグミノサーラム由来の小胞が効率的に抑制することを確認した（実施例１３参照）。
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が制限されるものではない。
［実施例１．腸内細菌および細菌由来の小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析］
腸内細菌と細菌由来の小胞が胃腸管を通じて全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来の小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管に投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体イメージを観察した結果、図１ａに示されたように、細菌である場合には、全身的に吸収されなかったが、細菌由来の小胞である場合には、投与５分後に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。
また、腸内細菌と腸内細菌由来の小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来の小胞を前記の方法のように投与した後、投与１２時間後に、尿、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉を採取した。採取した組織で蛍光を観察した結果、図１ｂに示されたように、細菌由来の小胞が、尿、心臓、肺、肝臓、脾臓、脂肪、筋肉、腎臓に分布したが、細菌は、吸収されないことが分かった。
［実施例２．臨床サンプルで細菌由来の小胞メタゲノム分析］
尿、血液のような臨床サンプルをまず１０ｍｌのチューブに入れ、遠心分離法（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物を沈めて上澄み液のみを新しい１０ｍｌのチューブに移した。０．２２μｍのフィルターを用いて細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨てて、１０ｍｌまで濃縮させた。次に、さらに０．２２μｍのフィルター（ｆｉｌｔｅｒ）を用いてバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を用いて上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かした。
上記方法で分離した小胞１００μｌを１００℃でボイルして内部のＤＮＡを脂質の外に出るようにした後、氷上で５分間冷まし、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液のみを集め、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ ｒＤＮＡプライマーでＰＣＲを行って、前記抽出された遺伝子に細菌由来の遺伝子が存在することを確認した。
Figure 0007054956000001
前記方法で抽出したＤＮＡを前記の１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを用いて増幅した後、シーケンシングを行い（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）、その結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルに出力し、ＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を用いてＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）分析のためには、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを用いてシーケンス類似度によってクラスタリングを行い、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シーケンス類似度を基準としてクラスタリングを行い、各ＯＴＵの門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ＲＮＡシーケンスデータベース（１０８，４５３シーケンス）を用いて属レベルで９７％以上のシーケンス類似度を有する細菌をプロファイリングした（ＱＩＩＭＥ）。
［実施例３．胃癌患者の尿内細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で胃癌患者６１人の尿と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１２０人の尿を対象として、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて胃癌患者の尿でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２および図２参照）。
Figure 0007054956000002
［実施例４．大腸癌患者の尿細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で大腸癌患者３８人の尿と、正常ヒト３８人の尿を対象として、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて大腸癌患者の尿でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表３および図３参照）。
Figure 0007054956000003
［実施例５．乳癌患者の尿細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で乳癌患者１２７人の尿と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２２０人の尿を対象として、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて乳癌患者の尿でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表４および図４参照）。
Figure 0007054956000004
［実施例６．卵巣癌患者の尿細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で卵巣癌患者１３５人の尿と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１３６人の尿を対象として、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて卵巣癌患者の尿でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表５および図５参照）。
Figure 0007054956000005
［実施例７．膀胱癌患者の尿細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で膀胱癌患者４２人の尿と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１０７人の尿を対象として、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて膀胱癌患者の尿でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表６および図６参照）。
Figure 0007054956000006
［実施例８．前立腺癌患者の尿細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で前立腺癌患者５５人の尿と、正常ヒト１５９人の尿を対象として、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて前立腺癌患者の尿でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表７および図７参照）。
Figure 0007054956000007
［実施例９．喘息患者の血液細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で喘息患者１６０人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１１４人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて喘息患者の血液でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表８および図８参照）。
Figure 0007054956000008
［実施例１０．糖尿病患者の尿細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で糖尿病患者６０人の尿と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１３４人の尿を対象として、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて糖尿病患者の尿でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表９および図９参照）。
Figure 0007054956000009
［実施例１１．パーキンソン病患者の尿細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法でパーキンソン病患者３９人の尿と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト７６人の尿を対象として、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べてパーキンソン病患者の尿でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１０および図１０参照）。
Figure 0007054956000010
［実施例１２．認知症患者の血液細菌由来の小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で認知症患者６０人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト７４人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、リゾビウム属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて認知症患者の血液でリゾビウム属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１１および図１１参照）。
Figure 0007054956000011
［実施例１３．リゾビウム・レグミノサーラム由来の小胞の抗炎症効果］
前記実施例の結果に基づいて、リゾビウム属細菌に属するリゾビウム・レグミノサーラム菌株を培養した後、その小胞を分離した。リゾビウム・レグミノサーラム菌株を３７℃好気性チャンバーで吸光度（ＯＤ６００）が１．０～１．５になるまでＢＨＩ（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地で培養した後、サブカルチャー（ｓｕｂ－ｃｕｌｔｕｒｅ）した。以後、菌株が含まれていない培地の上澄み液を回収して１０，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、０．４５μｍのフィルターに濾過した後、濾過した上澄み液を１００ｋＤａ ｈｏｌｌｏｗフィルタメンブレンでＱｕｉｘＳｔａｎｄ ｂｅｎｃｈｔｏｐ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を用いて限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により２００ｍｌの体積に濃縮した。以後、濃縮させた上澄み液をさらに０．２２μｍのフィルターでフィルタリングし、濾過された上澄み液を１５０，０００ｇ、４℃で３時間の間超遠心分離した後、ペレットをＤＰＢＳで懸濁した。次に、１０％、４０％、および５０％ＯｐｔｉＰｒｅｐ溶液（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて密度勾配遠心分離を行い、低密度溶液の製造のためにＯｐｔｉＰｒｅｐ溶液をＨＥＰＥＳ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ （２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に希釈して用いた。２００，０００ｇ、４℃条件で２時間の間遠心分離を行った後、上層から１ｍｌの同じボリュームで分画された各溶液を１５０，０００ｇ、４℃条件で３時間の間さらに超遠心分離を実施した。以後、ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）アッセイを用いてタンパク質を定量し、得られた小胞に対して実験を実施した。
リゾビウム・レグミノサーラム由来の小胞が、炎症細胞で炎症メディエーターの分泌に対する影響を調べるために、マウスマクロファージ株であるＲａｗ ２６４．７細胞にリゾビウム・レグミノサーラム由来の小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、炎症疾患の病原性小胞である大腸菌由来の小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＶ）を処理して炎症メディエーター（ＩＬ－６、ＴＮＦ－αなど）の分泌量を測定した。より具体的に、Ｒａｗ ２６４．７細胞を１×１０５個ずつ２４－ｗｅｌｌ細胞培養プレートに分注した後、２４時間の間ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）完全培地で培養させた。以後、培養の上層液を１．５ｍｌのチューブに集めて、３０００ｇで５分間遠心分離して、上層液を集めて４℃に保管しておいた後、ＥＬＩＳＡ分析を行った。その結果、リゾビウム・レグミノサーラム由来の小胞を前処理した場合、大腸菌由来の小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌が顕著に抑制されることを確認した（図１２参照）。これは、大腸菌由来の小胞のような病原性小胞により誘導される炎症の発生をリゾビウム・レグミノサーラム由来の小胞が効率的に抑制することができることを意味する。
上述した本発明の説明は、例示のためのものであって、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
本発明によるリゾビウム属細菌由来の小胞は、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、または認知症に対する診断方法だけでなく、前記疾患に対する予防、改善または治療用組成物として用いられるので、関連医療および食品産業分野において有用に活用可能なものと期待される。

Claims (10)

  1. 下記のステップを含み、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病及び認知症からなる群より選ばれる１つ以上の疾患の診断のための情報提供方法：
    （ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップであって、該サンプルは血液又は尿である、ステップ；
    （ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；および
    （ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌由来の細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病及び認知症からなる群より選ばれる１つ以上の疾患に分類するステップ。
  2. リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および認知症からなる群より選ばれる１種以上の疾患の予防または治療用薬学的組成物。
  3. 前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍであることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物。
  4. 前記小胞は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌から自然的にまたは人工的に分泌されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の薬学的組成物。
  5. 前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌由来の小胞は、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）由来の小胞であることを特徴とする、請求項２～４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  6. リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病、および認知症からなる群より選ばれる１種以上の疾患の予防または改善用食品組成物。
  7. 前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍであることを特徴とする、請求項６に記載の食品組成物。
  8. 前記小胞は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌から自然的にまたは人工的に分泌されることを特徴とする、請求項６又は７に記載の食品組成物。
  9. 前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌由来の小胞は、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）由来の小胞であることを特徴とする、請求項６～８のいずれか一項に記載の食品組成物。
  10. リゾビウム属細菌由来の小胞の、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、喘息、糖尿病、パーキンソン病および認知症からなる群より選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療用薬剤の製造のための使用。
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