CN117286091A - 一种姜黄外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种姜黄外泌体及其制备方法与应用。本发明姜黄外泌体的制备方法包括以下步骤：新鲜姜黄打碎榨汁，过滤得到第一上清液；将第一上清液进行差速离心，得到第二上清液；将第二上清液通过微孔滤膜过滤，得到外泌体初步滤液；将初步滤液和聚乙二醇溶液混合后进行孵育处理，得到反应液；将反应液离心，弃上清，重悬沉淀，得到含姜黄外泌体重悬液；将重悬液离心，取上清液；将上清液转移到超滤管中，离心后，将PBS溶液加入所述超滤管中，离心，得到姜黄外泌体。本发明分离出的姜黄外泌体的纯度与浓度高，生物活性显著，操作简单易行，生产成本低，为姜黄及其他植物外泌体的大规模生产提供重要的参考价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种姜黄外泌体及其制备方法与应用。
背景技术
植物外泌体通常称为植物来源外泌体样纳米颗粒(Plant-derived exosome-likenanoparticles，PELNs)。PELNs是从植物组织中分离得到的一类30～300nm的膜性小泡，含有蛋白质、脂质和核酸等成分。PELNs作为植物体的组成部分，对植物自身物质代谢、生理功能维持和病害防御等有重要意义，还可以跨界调控细胞活动，介导不同物种之间的通讯，在生理过程、防病治病和营养供给等环节具有重要作用和应用价值，能够起到疾病干预和药物递送功能。相比于动物外泌体，PELNs具有原料来源广泛、容易大规模生产等特点，在生物医药领域展现出广阔的应用前景。
PELNs的制备主要参照动物外泌体标准来进行，目前分离PELNs最常用的方法是超速离心法。超速离心是指转速在30000rpm以上，对应仪器称为超高速冷冻离心机，价格一般在百万元以上。超速离心法整个过程虽然操作简单，但需要大量样本、昂贵的仪器、耗时较长且易存在核糖蛋白和聚集蛋白污染，分离得到的PELNs纯度不高，不利于后续PELNs研究的开展。此外，在PELNs的生物医药应用中，对外泌体的纯度和完整度、外泌体的浓度和产量要求均较高，超速离心法尚不能满足规模化生产的需求。因此，为了克服现有PELNs超速离心分离方法的不足，亟待开发一种便携、低成本且能够大规模运用的PELNs制备方法，以实现低成本、可重复地制备高产率、高纯度的PELNs，保证PELNs满足临床转化的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足而提供一种姜黄外泌体及其制备方法与应用，以实现高纯度姜黄外泌体的分离纯化，保证其较高的生物活性，并且操作方法简单易行，能有效降低分离姜黄外泌体的成本。
为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种姜黄外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜姜黄，打碎榨汁，过滤得到第一上清液；
(2)将第一上清液进行差速离心，得到第二上清液；
(3)将第二上清液通过微孔滤膜过滤，得到外泌体初步滤液；
(4)将外泌体初步滤液和聚乙二醇溶液混合后进行孵育处理，得到反应液；
(5)将反应液离心，弃上清，重悬沉淀，得到含姜黄外泌体重悬液；
(6)将含姜黄外泌体重悬液离心，取上清液；
(7)将步骤(6)所得的上清液转移到超滤管中，离心后，将PBS溶液加入所述超滤管中，离心，得到姜黄外泌体。
本发明所述的姜黄外泌体制备方法通过差速离心(≤12000rpm)及微孔滤膜进行初步过滤，再通过聚乙二醇沉淀技术沉淀姜黄外泌体，重悬后用超滤管进一步纯化姜黄外泌体，实现了高纯度姜黄外泌体的分离纯化，并且避免了昂贵的超高速冷冻离心机等专业设备以及高成本的商业纯化柱或试剂盒的使用，仅需实验室常见的常规冷冻高速离心机以及价格低廉的微孔滤膜和超滤管，可操作性强，操作方法简单易行，降低了姜黄外泌体的制备成本。
作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(2)中，差速离心包括如下步骤：先在2500rpm-3500rpm条件下离心25-35min，取上清，再在8000rpm-10000rpm条件下离心25-35min，取上清，最后在10000rpm-12000rpm条件下离心20-40min，得到第二上清液，差速离心的温度均为2-6℃。
作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的最优实施方式，在所述步骤(2)中，差速离心包括如下步骤：先在3000rpm条件下离心30min，取上清，再在10000rpm条件下离心30min，最后在12000rpm条件下离心30min，得到第二上清液，差速离心的温度均为4℃。
新鲜姜黄根状茎经过打碎，初步过滤得到第一上清液，此时上清液中含有大量大颗粒物质和细胞碎片等不同密度的杂质组分，通过差速离心有助于实现不同组分的逐步分离，而离心力以及离心时间的控制是让不同杂质组分有效分离的关键，逐步增加合适的离心力可以使得各个杂质组分在适当时间内沉淀到不同位置，从而获得更好的分离效果。本发明经试验探究发现，通过先在2500rpm-3500rpm条件下离心25-35min，取上清，再在8000rpm-10000rpm条件下离心25-35min，取上清，最后在10000rpm-12000rpm条件下离心20-40min三次差速离心(≤12000rpm)，能有效去除上清液中的细胞碎片和大颗粒物，减少杂质对后续外泌体纯化的干扰，同时保留较小的外泌体颗粒物，提高了姜黄外泌体的分离纯化效果；而在3000rpm条件下离心30min，取上清，再在10000rpm条件下离心30min，取上清，最后在12000rpm条件下离心30min三次差速离心的分离纯化效果最佳。
作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(3)中，所述微孔滤膜过滤包括如下步骤：通过孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，得到外泌体初步滤液。
微孔滤膜具有更细微的孔径，可以进一步过滤除去上清液中残留的微小颗粒。本发明通过0.45μm、0.22μm两级微孔滤膜进行初步过滤，能进一步去除残留的固体颗粒、微生物、细胞等微小颗粒，实现姜黄外泌体更彻底的分离和纯化。
作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(4)中，所述外泌体初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比为1：(0.9-1.2)。
作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(4)中，所述聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量浓度为15-20％；所述聚乙二醇的分子量为5000-10000。
在聚乙二醇沉淀法中，聚乙二醇的分子量和浓度是影响外泌体沉淀效果的重要因素。聚乙二醇的分子量决定了其与生物分子的相互作用力，较高分子量的聚乙二醇会增加与目标生物分子的相互作用，从而促进外泌体的沉淀；聚乙二醇的浓度直接影响外泌体的沉淀效果，较高的聚乙二醇浓度可以促使外泌体形成较大的颗粒，并加速其沉降速度，从而有助于沉淀和分离，而过高的聚乙二醇浓度可能会导致非特异性的沉淀，降低纯化效果。本发明经过大量试验探究发现，当聚乙二醇溶液中聚乙二醇分子量为5000-10000，聚乙二醇的质量浓度为15-20％，且外泌体初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比在1：(0.9-1.2)范围内时，姜黄外泌体的纯化效果更佳。
作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(4)中，所述孵育时间为10-14h。
作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，步骤(5)的离心条件为：离心转速12000rpm，离心时间60min；
步骤(6)的离心条件为：离心转速12000rpm，离心时间10min；
步骤(7)的两次离心条件均为：离心转速6000rpm，离心时间15min；
在步骤(5)、(6)、(7)中，所述离心温度均为4℃。
作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(7)中，超滤管采用截留分子量100KD的超滤管。
第二方面，本发明提供上述制备方法制得的姜黄外泌体。
第三方面，本发明提供上述姜黄外泌体在制备治疗人骨肉瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明在使用聚乙二醇沉淀技术前后分别通过微滤法和超滤法进行过滤和纯化，起到多重纯化的作用，提高了姜黄外泌体纯度，并且避免了昂贵的超高速冷冻离心机等专业设备以及高成本的商业纯化柱或试剂盒的使用，仅需实验室常见的常规冷冻高速离心机以及价格低廉的微孔滤膜和超滤管，可操作性强，操作方法简单易行，降低了分离姜黄外泌体的成本。
2、本发明分离效率高，经鉴定表征，证实了提取的姜黄外泌体具有典型的茶托样或半球样结构和理想粒径(平均粒径为150.9nm)，电荷主要集中在-38.31±0.59mV，浓度为1.7E+11Particles/mL，且其蛋白浓度达到8.917μg/μL，纯度极高。
3、本发明获得的高纯度姜黄外泌体在一定浓度范围内(2～10μL，蛋白浓度约为17.8～89μg/μL)具有明显的细胞毒性，抑制143B人骨肉瘤细胞的生长。
4、本发明获得的高纯度姜黄外泌体显著提高了143B人骨肉瘤细胞中RAF1、FAS、PRKCB三个基因的表达水平，说明其对肿瘤细胞具有明显的生物活性影响。
附图说明
图1-6为姜黄外泌体的TEM透射电子显微镜图。其中图1-2为本发明实施例1中所得姜黄外泌体，图1标尺为200nm，图2标尺为500nm；图3-4为对比例4通过聚乙二醇沉淀结合高成本的商业纯化柱所得姜黄外泌体，图3标尺为100nm，图4标尺为500nm；图5-6为对比例5通过高成本的动物细胞上清液外泌体提取试剂盒结合超滤管所得姜黄外泌体，图5标尺为100nm，图6标尺为200nm。
图7为姜黄外泌体的NTA粒径分析结果图。其中，A图为本发明实施例1中所得姜黄外泌体的NTA粒径分析结果；B图为对比例4通过聚乙二醇沉淀结合高成本的商业纯化柱所得姜黄外泌体的NTA粒径分析结果；C图为对比例7通过高成本的动物细胞上清液外泌体提取试剂盒结合超滤管所得姜黄外泌体的NTA粒径分析结果。
图8为本发明实施例1中所得姜黄外泌体处理143B人骨肉瘤细胞的OD(450nm)结果图。
图9为本发明实施例1中所得姜黄外泌体处理143B人骨肉瘤细胞的基因RT-PCR结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的内容，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
选择姜黄根状茎(仲恺农业工程学院白云农场种植)用于姜黄外泌体的提取与纯化。
实施例1
本实施例提供了一种姜黄外泌体的制备方法，该方法的具体步骤如下：
(1)取新鲜干净姜黄根状茎，加入PBS溶液浸没后打碎榨汁，纱布过滤得到第一上清液；
(2)将第一上清液在3000rpm、4℃下，离心30min，随后取上清，在10000rpm、4℃下，离心30min，取上清，再在12000rpm、4℃下，离心30min，取离心上清液，弃沉淀。
(3)采用0.45μm和0.22μm微孔滤膜依次过滤，得到外泌体初步滤液。
(4)在外泌体初步滤液中加入质量浓度为16％的聚乙二醇溶液，聚乙二醇分子量为8000，初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比为1:1，颠倒充分混合，4℃孵育12h，得到反应液。
(5)将反应液在12000rpm、4℃下，离心60min，收集含有姜黄外泌体的沉淀，加入1mL 1×PBS重悬沉淀。
(6)重悬液转移到1.5mL离心管，12000rpm，4℃，离心10min，取上清。
(7)1×PBS缓冲液湿润100KD(MWCO)超滤管，将上清加入到超滤管中，6000rpm，4℃，离心15min，弃收集管溶液，在超滤管上层截留溶液中加入1×PBS缓冲液直至加满进行洗涤，6000rpm，4℃，离心15min，上层截留即为姜黄外泌体，于-80℃保存。
实施例2-3
实施例2-3分别提供了一种姜黄外泌体的制备方法，实施例2-3与实施例1的不同之处在于：
实施例2在步骤(4)中，初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比为1:0.9；
实施例3在步骤(4)中，初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比为1:1.2。
实施例4-5
实施例4-5分别提供了一种姜黄外泌体的制备方法，实施例4-5与实施例1的不同之处在于：
实施例4在步骤(4)中，聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量浓度为15％；
实施例5在步骤(4)中，聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量浓度为20％；
实施例6-7
实施例6-7分别提供了一种姜黄外泌体的制备方法，实施例6-7与实施例1的不同之处在于：
实施例6在步骤(4)中，聚乙二醇的分子量为5000；
实施例7在步骤(4)中，聚乙二醇的分子量为10000。
实施例8-9
实施例8-9分别提供了一种姜黄外泌体的制备方法，实施例8-9与实施例1的不同之处在于：
实施例8在步骤(4)中，孵育时间为10h；
实施例9在步骤(4)中，孵育时间为14h。
实施例10-11
实施例10-11分别提供了一种姜黄外泌体的制备方法，实施例10-11与实施例1的不同之处在于：
实施例10在步骤(2)中，差速离心包括如下步骤：将第一上清液在2500rpm、4℃下，离心15min，随后取上清，在8000rpm、4℃下，离心15min，取上清，再在10000rpm、4℃下，离心15min，取离心上清液，弃沉淀。
实施例11在步骤(2)中，差速离心包括如下步骤：将第一上清液在3500rpm、4℃下，离心15min，随后取上清，在9000rpm、4℃下，离心15min，取上清，再在11000rpm、4℃下，离心15min，取离心上清液，弃沉淀。
对比例1-2
对比例1-2分别提供了一种姜黄外泌体的制备方法，对比例1-2与实施例1的不同之处在于：
对比例1在步骤(4)中，初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比为1:0.6；
对比例2在步骤(4)中，初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比为1:1.5。
对比例3
对比例3分别提供了一种姜黄外泌体的制备方法，对比例3与实施例1的不同之处在于：
对比例3中，聚乙二醇的分子量为3000。
对比例4
本对比例提供一种聚乙二醇沉淀结合高成本的商业纯化柱分离纯化姜黄外泌体，该方法的具体步骤如下：
(1)取新鲜干净姜黄根状茎，加入PBS溶液浸没后打碎榨汁，纱布过滤得到第一上清液；
(2)将第一上清液在3000rpm、4℃下，离心30min，随后取上清，在10000rpm、4℃下，离心30min，取上清，再在12000rpm、4℃下，离心30min，取离心上清液，弃沉淀。
(3)采用0.45μm和0.22μm微孔滤膜依次过滤，得到外泌体初步滤液。
(4)在外泌体初步滤液中加入16％聚乙二醇溶液，聚乙二醇的分子量为8000，初步滤液与聚乙二醇溶液体积比为1:1，颠倒充分混合，4℃孵育12h，得到反应液。
(5)将反应液在12000rpm、4℃下，离心60min，收集含有姜黄外泌体的沉淀，加入1mL 1×PBS重悬沉淀。
(6)重悬液转移到1.5mL离心管，12000rpm，4℃，离心10min，取上清。
(7)将上清转移到纯化柱(Umibio；Cat.No:UR52121；Exosomoe PurificationFilter)，12000rpm，离心2min，过滤到纯化柱底部，得到姜黄外泌体，于-80℃保存。
对比例5
本对比例提供一种高成本的动物细胞上清液外泌体提取试剂盒结合超滤管分离纯化姜黄外泌体，该方法的具体步骤如下：
外泌体提取纯化试剂盒(细胞上清)为Cat.No:UR52121(Umibio)
该方法的具体步骤如下：
(1)取新鲜干净姜黄根状茎，加入PBS溶液浸没后打碎榨汁，纱布过滤得到第一上清液；
(2)将第一上清液在3000rpm、4℃下，离心30min，随后取上清，在10000rpm、4℃下，离心30min，取上清，再在12000rpm、4℃下，离心30min，取离心上清液，弃沉淀。
(3)采用0.45μm和0.22μm微孔滤膜依次过滤，得到外泌体初步滤液。
(4)20mL过滤上清液加5mL ECS(Exosome Concentration Solution)，4℃静置4h。
(5)将反应液在12000rpm、4℃下，离心60min，收集含有姜黄外泌体的沉淀，加入1mL 1×PBS重悬沉淀。
(6)重悬液转移到1.5mL离心管，12000rpm，4℃，离心10min，取上清。
(7)1×PBS缓冲液湿润100KD(MWCO)超滤管，将上清加入到超滤管中，6000rpm，4℃，离心15min，弃收集管溶液。
(8)在超滤管上层截留溶液中加入1×PBS缓冲液直至加满进行洗涤，6000rpm，4℃，离心15min。上层截留即为姜黄外泌体，于-80℃保存。
效果例1
以上述实施例和对比例所制备的姜黄外泌体为样品，进行BCA蛋白定量分析，具体步骤如下：
1、配制BSA标准品体系：Albumin from bovine serum(BSA)标准品体系如表1所示，其中标准品的稀释液用1×PBS进行稀释(1×PBS为姜黄外泌体的溶解液)
表1 BSA标准品体系配制
2、微孔板检测方法(样品:BCA工作液＝1:8)
(1)姜黄外泌体稀释20倍，各取25μL标准品和姜黄外泌体加入到微孔板中；
(2)在每孔中加入200μL BCA工作液，振荡30sec，充分混匀，然后盖上微孔板，37℃孵育30min；
(3)冷却到室温后，利用酶标仪检测562nm波长的吸光度；
(4)使用所测得的BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即为最终的读数)来绘制标准曲线，然后根据标准曲线和样品的稀释倍数计算出姜黄外泌体的蛋白浓度，结果见表2。
表2姜黄外泌体蛋白浓度测定
可见，实施例1-11的姜黄外泌体分离纯化方法通过差速离心(≤12000rpm)及微孔滤膜进行初步过滤，再通过聚乙二醇沉淀技术沉淀姜黄外泌体，重悬后用超滤管进一步纯化姜黄外泌体，所得姜黄外泌体的蛋白浓度明显高于采用高成本商业纯化柱代替本发明中超滤管的对比例4以及采用高成本动物细胞上清液外泌体提取试剂盒代替本发明中聚乙二醇沉淀的对比例5，不仅实现了高纯度姜黄外泌体的分离纯化，还有效降低了分离姜黄外泌体的成本。
效果例2
以实施例1、对比例4-5所制备的姜黄外泌体为样品，进行TEM透射电镜观察，具体步骤如下：
1、吸取姜黄外泌体样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；
2、醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；
3、常温干燥数分钟；
4、100kv进行电镜检测成像；
5、获得透射电镜成像结果。
结果如图1-6所示，三种方法所获得的姜黄外泌体的囊泡结构直径在植物外泌体的30～300nm范围内，外部有明显的双层膜结构，呈现茶托样或半球样结构，符合外泌体的显微鉴别特征。
效果例3
以实施例1、对比例4-5所制备的姜黄外泌体为样品，进行NTA粒径分析，具体步骤如下：
1、取姜黄外泌体的冻存样本，25℃水浴解冻，冰上放置；
2、采用1×PBS进行稀释，直接用于NTA检测。
结果如图7所示，A图中聚乙二醇沉淀结合超滤管分离纯化获得姜黄外泌体的平均粒径为150.9nm，浓度为1.7E+11Particles/mL；B图中聚乙二醇沉淀结合高成本的商业纯化柱所得姜黄外泌体的平均粒径为141.4nm，浓度为0.8E+11Particles/mL；C图中高成本的动物细胞上清液外泌体提取试剂盒结合超滤管所得姜黄外泌体的平均粒径为165.7nm，浓度为1.5E+11Particles/mL。由此可得，本发明实例获得的姜黄外泌体(A图)与其他两种方法获得的姜黄外泌体的平均粒径相差不大(141.4～165.7nm)，均符合植物外泌体的粒径范围(30～300nm)。但本发明实例获得的姜黄外泌体的浓度(1.7E+11Particles/mL)均高于其他两种方法(7.9E+10～1.5E+11Particles/mL)，说明本发明方法的提取效率较高，获得的姜黄外泌体纯度和浓度均较高，适合于进一步的生物医学应用。另外，相比价格昂贵的商业纯化柱或试剂盒，本发明成本低，符合大规模、批量化生产姜黄外泌体的生物医学需求。
效果例4
以实施例1所制备的姜黄外泌体为样品，探究姜黄外泌体对143B人骨肉瘤细胞的毒性影响，具体步骤如下：
1、取对数生长期的143B人骨肉瘤细胞，用PBS洗涤后，胰蛋白酶消化，900rpm离心3min后，弃去上清，制备单细胞悬浮液，使细胞密度为2×103细胞/孔，96孔板每孔加入100μL；
2、在5％CO2，37℃细胞培养箱培养细胞24h；
3、待细胞融合度约60％，弃掉孔中的培养基，PBS清洗一遍；
4、根据本发明实施例1所得姜黄外泌体蛋白浓度，加入不同体积1μL、2μL、10μL、20μL(蛋白浓度分别约为8.9μg/μL、17.8μg/μL、89μg/μL、178μg/μL)姜黄外泌体和培养基为实验组，未加姜黄外泌体的培养基为对照组，5个复孔，每孔100μL，在5％CO2，37℃细胞培养箱孵育24小时(1d)、72小时(3d)和120小时(5d)；
5、1d、3d和5d后，每孔加入10μL CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育2小时；
6、酶标仪于450nm测定每孔吸光度(A)值。
10μL、20μL(蛋白浓度约为89μg/μL、178μg/μL)姜黄外泌体分别处理143B细胞(100μL)，24小时(1d)后，显微镜观察到143B人骨肉瘤细胞全部死亡；如图8所示，通过CCK-8法检测姜黄外泌体对143B人骨肉瘤细胞的活性影响，1μL、2μL(蛋白浓度约为8.9μg/μL、17.8μg/μL)姜黄外泌体分别处理143B人骨肉瘤细胞1d、3d、5d后，对细胞均无显著活性影响。表明姜黄外泌体在一定浓度(2～10μL，蛋白浓度约为17.8～89μg/μL)下具有明显的细胞毒性，抑制肿瘤细胞的生长。
效果例5
以实施例1所制备的姜黄外泌体为样品，进行姜黄外泌体对143B人骨肉瘤细胞的基因表达研究，具体步骤如下：
1、取对数生长期的143B人骨肉瘤细胞，用PBS洗涤后，胰蛋白酶消化，900rpm离心3min后，弃去上清，制备单细胞悬浮液，使细胞密度为2×103细胞/孔，96孔板每孔加入100μL；
2、在5％CO2，37℃细胞培养箱培养细胞24h；
3、待细胞融合度约60％，弃掉孔中的培养基，PBS清洗一遍；
4、根据本发明实例所得姜黄外泌体蛋白浓度，加入5μL(蛋白浓度为44.5μg/μL)姜黄外泌体和培养基为实验组，未加姜黄外泌体的培养基为对照组，9个复孔，每孔100μL，在5％CO2，37℃细胞培养箱孵育24h；
5、使用Total RNA KitⅠ(Omega)试剂盒提取细胞总RNA，使用Ⅲ1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)试剂盒和2×ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02)试剂盒进行RNA逆转录及PCR扩增。RT-PCR的程序设置为：95℃3min；95℃5sec、60℃30sec，40个循环。以GAPDH作为内参基因，分别对RAF1、FAS、PRKCB三个姜黄外泌体可能调控的人类肿瘤相关靶基因进行相对定量。
结果如图9所示，5μL(蛋白浓度为44.5μg/μL)姜黄外泌体处理143B人骨肉瘤细胞24h后，细胞中RAF1、FAS、PRKCB三个基因的表达水平均显著提高，说明姜黄外泌体对143B人骨肉瘤细胞具有显著的生物活性影响。
综上，本发明提供的方法可以快速、高效地制备姜黄外泌体，利用本发明制备的姜黄外泌体，通过TEM和NTA表征符合植物外泌体的基本特征。并通过细胞毒性研究发现姜黄外泌体在一定浓度范围具有明显的细胞毒性，抑制肿瘤细胞生长。且RT-PCR定量结果表明，姜黄外泌体显著提高了143B人骨肉瘤细胞中RAF1、FAS、PRKCB三个基因的表达水平，说明其可以调控肿瘤细胞的基因表达。本发明避免了昂贵的超高速冷冻离心机等专业设备和高成本的商业纯化柱或试剂盒的使用，仅需实验室常见的常规冷冻高速离心机以及价格低廉的微孔滤膜和超滤管，可操作性强，操作方法简单易行，适合常规实验室开展包括姜黄在内的植物外泌体研究，为植物外泌体的研究提供了一种简单、有效、低成本的制备方法，具有重要的应用价值。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种姜黄外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取新鲜姜黄，打碎榨汁，过滤，得到第一上清液；
(2)将第一上清液进行差速离心，得到第二上清液；
(3)将第二上清液通过微孔滤膜过滤，得到外泌体初步滤液；
(4)将外泌体初步滤液和聚乙二醇溶液混合后进行孵育处理，得到反应液；
(5)将反应液离心，弃上清，重悬沉淀，得到含姜黄外泌体重悬液；
(6)将含姜黄外泌体重悬液离心，取上清液；
(7)将步骤(6)所得的上清液转移到超滤管中，离心后，将PBS溶液加入所述超滤管中，离心，得到姜黄外泌体。
2.根据权利要求1所述姜黄外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，差速离心包括如下步骤：先在2500rpm-3500rpm条件下离心25-35min，取上清，再在8000rpm-10000rpm条件下离心25-35min，取上清，最后在10000rpm-12000rpm条件下离心20-40min，得到第二上清液，差速离心的温度为2-6℃。
3.根据权利要求2所述姜黄外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，差速离心包括如下步骤：先在3000rpm条件下离心30min，取上清，再在10000rpm条件下离心30min，取上清，最后在12000rpm条件下离心30min，得到第二上清液，差速离心的温度为4℃。
4.根据权利要求1所述姜黄外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，微孔滤膜过滤包括如下步骤：将第二上清液通过孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，取上清，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，得到外泌体初步滤液。
5.根据权利要求1所述姜黄外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，外泌体初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比为1：(0.9-1.2)。
6.根据权利要求1所述姜黄外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量浓度为15-20％；聚乙二醇的分子量为5000-10000；孵育的时间为10-14h。
7.根据权利要求1所述姜黄外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的离心条件为：离心转速12000rpm，离心时间60min；
所述步骤(6)的离心条件为：离心转速12000rpm，离心时间10min；
所述步骤(7)的离心条件均为：离心转速6000rpm，离心时间15min；
在步骤(5)、(6)、(7)中，所述离心温度均为4℃。
8.根据权利要求1所述姜黄外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中，超滤管采用截留分子量为100KD的超滤管。
9.一种姜黄外泌体，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述制备方法制得。
10.一种如权利要求9所述姜黄外泌体在制备治疗人骨肉瘤药物中的应用。
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| CN202311187295.3A Pending CN117286091A (zh) | 2023-09-14 | 2023-09-14 | 一种姜黄外泌体及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN117286091A (zh) |
-
2023
- 2023-09-14 CN CN202311187295.3A patent/CN117286091A/zh active Pending
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