CN114540297A - 一种间充质干细胞外泌体的分离和miRNA分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞外泌体制备技术领域，公开了一种间充质干细胞外泌体的分离和miRNA分析方法。本发明分离方法包括：从儿童包皮中获取并培养儿童包皮间充质干细胞，离心去除死细胞和细胞碎片，再经超速离心得儿童包皮间充质干细胞外泌体。miRNA的分析方法采用高通量测序法。本发明使用的儿童包皮组织属于手术废弃物，获取时不涉及伦理问题，且儿童包皮组织含有大量的间充质干细胞，通过超速离心法可分离出大量纯净的外泌体，高通量测序发现这些外泌体中表达更多的免疫抑制相关基因和趋化基因，对治疗炎症相关疾病具有指导作用。

Description

一种间充质干细胞外泌体的分离和miRNA分析方法
技术领域
本发明属于细胞外泌体制备技术领域，具体涉及一种间充质干细胞外泌体的分离和miRNA分析方法。
背景技术
近年来，外泌体被发现在生理病理调控与临床转化中均有重要作用，可广泛参与多种疾病的发生(如肿瘤转移、心血管疾病等)与生理调节(如免疫调控等)，尤其是对炎症因子的调控具有明显作用，因此外泌体对疾病的影响与调控作用已成为研究热点，但前提是要获取产量和纯度高的外泌体。外泌体可以由多种细胞分泌，有学者将间充质干细胞和外泌体结合起来，以研究间充质干细胞分泌的外泌体对炎症相关疾病的影响与调控，如通过获取人脐带来源的间充质干细胞来分离相应的外泌体，但是由于脐带只能在婴儿出生时获得，时间限制性强，来源较少，获得的间充质干细胞也较少，因此从脐带间充质干细胞分离的外泌体也较少，在临床应用中有一定限制。
因此希望寻找一种能分离大量纯度较高的外泌体的方法，以满足在临床上用间充质干细胞分泌的外泌体来治疗炎症相关疾病的需求。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种间充质干细胞外泌体的分离方法，能够分离出大量的外泌体。
本发明还提出一种上述分离出的外泌体的miRNA分析方法。
根据本发明的一个方面，提出了一种间充质干细胞外泌体的分离方法，包括以下步骤：
S1：从儿童包皮中获取并培养儿童包皮间充质干细胞；
S2：取步骤S1所述的儿童包皮间充质干细胞，离心以去除死细胞和细胞碎片；
S3：取步骤S2经所述离心后获得的上清液进行超速离心，得儿童包皮间充质干细胞外泌体。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
本发明使用的儿童包皮组织，是在儿童包皮环切术后获得的，属于手术废弃物，获取时不涉及伦理问题，且包皮来源的间充质干细胞十分丰富，因此会分泌大量的外泌体；超速离心法可以高效地分离外泌体，由于外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，通过高转速的离心可以将其他细胞器及杂蛋白分离出去，只留下外泌体，使用该方法分离的外泌体得率和纯度都较高。儿童包皮间充质干细胞来源充足，与超速离心法搭配可分离出大量纯净的外泌体，以供治疗炎症相关疾病时使用。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1获取所述儿童包皮间充质干细胞，首先将经包皮环切术切割下来的儿童包皮用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1获取所述儿童包皮间充质干细胞，需将所述儿童包皮进行纵向切片以扩散组织，分离表皮和真皮，切割所述真皮形成真皮组织匀浆。
在本发明的一些实施方式中，需将所述真皮组织匀浆接种于培养瓶中，加入培养基进行培养以获取所述儿童包皮间充质干细胞。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中将获取的所述儿童包皮间充质干细胞培养3～5代后建立儿童包皮间充质干细胞库。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中将获取的所述儿童包皮间充质干细胞培养3代后建立儿童包皮间充质干细胞库。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，首先将所述儿童包皮间充质干细胞于4℃～6℃，1800×g～2200×g条件下离心28min～35min，以去除所述死细胞，收集第一上清液。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中，首先将所述儿童包皮间充质干细胞于4℃，2000×g条件下离心30min，以去除所述死细胞，收集第一上清液。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，将收集的所述第一上清液于4℃～6℃，10000×g～12000×g条件下离心35min～45min，以去除所述细胞碎片，收集上清液。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中，将第一次离心后收集的所述第一上清液于4℃，12000×g条件下离心45min，以去除所述细胞碎片，收集上清液。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，将所述上清液于4℃～6℃，100000×g～110000×g条件下离心2h～2.5h，以去除其他细胞器，得外泌体沉淀，所述外泌体沉淀含有杂蛋白。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S3中，将所述上清液于4℃，110000×g条件下离心2h，以去除其他细胞器，得外泌体沉淀。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，用PBS重悬所述外泌体沉淀后，继续于4℃～6℃，100000×g～110000×g条件下离心2h～2.5h，以去除所述杂蛋白，得所述儿童包皮间充质干细胞外泌体。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S3中，用PBS重悬所述外泌体沉淀后，继续于4℃，110000×g条件下离心2h，以去除所述杂蛋白。
根据本发明的再一个方面，提出了利用所述分离方法分离得到的儿童包皮间充质干细胞外泌体的miRNA分析方法，包括以下步骤：
A1：构建儿童包皮间充质干细胞外泌体的高通量测序DNA文库；
A2：上机测序，对测序数据进行去接头、去低质量序列、去污染处理得可信目标序列，经统计分析获取到所述儿童包皮间充质干细胞外泌体表达的miRNA。
根据本发明的一种优选的实施方式的miRNA分析方法，至少具有以下有益效果：
外泌体是细胞分泌的纳米级膜性小囊泡，富含来源细胞的蛋白质、脂质、DNA和RNA(miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA)，由于外泌体特殊的膜结构能够保护其内部的RNA免受酶的降解，因此外泌体中各类RNA的含量相对于体液RNA来说更为稳定，浓度更高。有研究表明miRNA在外泌体中所占的比例比它们的来源细胞更高，因此通过高通量测序对儿童包皮间充质干细胞外泌体表达的miRNA进行分析，可以找到相应高表达的miRNA，对后续寻找用儿童包皮间充质干细胞外泌体治疗炎症相关疾病的方法具有指导作用。
在本发明的一些实施方式中，步骤A1所述的构建儿童包皮间充质干细胞外泌体的高通量测序DNA文库的方法包括：提取所述儿童包皮间充质干细胞外泌体的总RNA，对所述总RNA的5’端和3’端进行连接修饰，对修饰的总RNA进行逆转录形成互补DNA(cDNA)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述互补DNA得到DNA扩增产物，最后经电泳分离出目的DNA，获得所述儿童包皮间充质干细胞外泌体的高通量测序DNA文库。
在本发明的一些实施方式中，步骤A2中的所述统计分析，具体方法包括：选取GO富集分析参与的生物过程、细胞组分和分子功能；选取KEGG通路数据库对差异miRNA进行通路富集分析；选取TargetScan靶基因预测数据库对部分miRNA的相关靶基因进行预测。
在本发明的一些实施方式中，对所述儿童包皮间充质干细胞外泌体miRNA分析前，需对所述儿童包皮间充质干细胞外泌体进行鉴定，鉴定方法包括：透射电子显微镜观察外泌体的形态，粒径分析外泌体的大小，蛋白质印迹分析检测标志性蛋白的表达。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述透射电子显微镜下观察到所述儿童包皮间充质干细胞外泌体呈茶托形态或凹陷饼状形态，中间较暗，边缘有一较亮的圈。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述粒径分析采用纳米颗粒追踪分析(NTA)法，经分析，所述儿童包皮间充质干细胞外泌体的粒径为30nm～150nm。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述标志性蛋白包括CD9、CD81。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体和对比例1分离的儿童脐带间充质干细胞外泌体的透射电子显微成像图；其中，A为儿童脐带间充质干细胞外泌体的显微成像图，B为儿童包皮间充质干细胞外泌体的显微成像图；比例尺都为100nm；
图2为本发明实施例4和对比例1对外泌体标志物CD9和CD81表达的蛋白质印迹检测结果图；图中左侧一列代表分子量，M为蛋白标记物(Marker)的条带，1代表脐带干细胞外泌体，2代表儿童包皮间充质干细胞外泌体，对照代表293T细胞；
图3为本发明实施例5使用GO功能对差异表达的miRNA靶基因参与的生物过程、细胞组分和分子功能的富集分析结果图；其中，横坐标为GO level2等级的term，纵坐标为每个term富集的-log10(P-value)；
图4为本发明实施例5使用KEGG通路数据库对差异表达对miRNA靶基因的富集分析结果图；其中，横坐标为通路(pathway)名称，纵坐标为每个通路富集的-log10(P-value)；
图5为本发明试验例中分析的差异表达基因对火山图；其中，横坐标为表达量倍数差异，图中2条竖虚线为2倍表达差异阈值，横虚线为P-value＝0.05阈值；第1条竖虚线左侧和横虚线上侧构成的区域中的点表示下调基因，第2条竖虚线右侧和横虚线上侧构成的区域中的点表示上调基因，剩余的点表示非显著差异表达基因。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，培养、离心等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、材料或者方法包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、材料或者方法可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例分离了儿童包皮间充质干细胞外泌体，具体过程为：
(1)获取并培养儿童包皮间充质干细胞：收集包皮环切术后的废弃物儿童包皮(不涉及伦理问题)1g，用无菌PBS清洗后置于培养皿中，对上述儿童包皮进行纵向切片以扩散组织，分离表皮和真皮，将真皮切成小块形成真皮组织匀浆；将真皮组织匀浆接种于培养瓶中，平置培养瓶使组织块尽量均匀地分布于整个培养瓶底面，加入间充质干细胞培养基进行原代培养；
原代培养至5～10天完全更换一次间充质干细胞培养基，继续进行培养，当培养到贴壁的包皮间充质干细胞达到亚融合状态时，进行传代培养，培养至第3代后对细胞计数，继续传代培养到第5代建立儿童包皮间充质干细胞库。
(2)分离儿童包皮间充质干细胞外泌体：取步骤(1)培养好的儿童包皮间充质干细胞于干净的离心管中，于2000×g，4℃条件下离心30min，以去除死细胞，收集第一上清液于新的离心管中，于12000×g，4℃条件下离心45min，去除细胞碎片，收集上清液，用20mL预冷的1×PBS重悬后经0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
将滤液转移至干净的超速离心管中，置于超速离心机(超速离心机型号：OptimaXPN-80，转子型号：Type 70Ti)中，于110000×g，4℃条件下超速离心2h，去除上清液(含其他细胞器)，得外泌体沉淀，此时的外泌体沉淀中含有杂蛋白；用3mL预冷的1×PBS重悬外泌体沉淀，再次于110000×g，4℃条件下超速离心2h，去除上清液，即去除杂蛋白，用100μL预冷的1×PBS重悬沉淀，即得儿童包皮间充质干细胞外泌体。
实施例2
本实施例对实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体进行了透射电子显微镜观察鉴定，具体过程为：
(1)取实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体5μL，加1×PBS稀释到10μl，混匀，将10μL样品滴加于铜网上，静置1min，用滤纸吸去浮液，于暖灯下放置直至晾干；
(2)在铜网上再滴加10μL磷酸钨，静置1min，用滤纸吸去浮液，于暖灯下放置直至晾干；电压选择580kv进行透射电子显微镜成像并拍照保存，结果如图1所示。图1中，可观察到分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体呈茶托形态或凹陷饼状形态，中间略暗，边缘有一略亮的圈。
实施例3
本实施例对实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体进行了粒径分析，具体过程为：
取实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体5μL，加1×PBS稀释到300μl，混匀，将样品转移至Zetasizer Nano S纳米粒度分析仪的特定样品槽内，放入检测器进行检测。其中，Zetasizer Nano S纳米粒度分析仪的制造商为英国Malvem公司，设置的参数为粒径范围50nm～200nm，分子量范围1000Da～20107Da，温度25℃，激光器4.0mV He-Ne激光器，波长633nm。每份样品连续分析3次，使用brookhaven instruments的NanoSight NTA数据分析软件分析数据。分析结果显示，儿童包皮间充质干细胞外泌体的平均粒径为120nm。
实施例4
本实施例对实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体进行了蛋白质印迹法分析鉴定，分别检测外泌体标志物CD9和CD81的表达，同时检测钙粘蛋白(Calnexin)的表达，该蛋白为阴性对照，具体过程为：
(1)取实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体20μL，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30min，于12000×g，4℃条件下离心15min，取上清液，即得外泌体蛋白样品；
(2)测定蛋白浓度，取20μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜和抗体孵育，采用Typhoon扫描仪(波长473nm，电压485V)成像，拍照保存，结果如图2所示。图2中，以293T细胞中CD9和CD81蛋白的表达情况作为对照，可以看出对照组中CD9和CD81均未表达，而儿童包皮间充质干细胞外泌体(即图中的2)中CD9和CD81都有表达，表明本发明制备的外泌体是较纯净的，同时也表明CD9和CD81是外泌体的标志物。
使用到的抗体及稀释倍数如表1所示。
表1
Figure BDA0003559203440000081
从实施例2、3和4可以看出，透射电子显微镜下观察到的形态，平均粒径大小以及CD9、CD81蛋白的表达，都是符合外泌体的特征的，表明实施例1分离到的的确是儿童包皮间充质干细胞外泌体，采用实施例1的分离方法是合适的。
实施例5
本实施例对实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体的miRNA进行了分析，具体过程为：
(1)取实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体30μL，使用Norgen5800试剂盒提取儿童包皮间充质干细胞外泌体的总RNA。
(2)使用文库构建试剂盒(TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(llumina,SanDiego,USA))，先对总RNA的5’端和3’端进行连接修饰，然后对修饰的RNA进行反转录的cDNA，通过PCR扩增cDNA得DNA扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳分离出目的DNA，即构建好儿童包皮间充质干细胞外泌体的高通量测序DNA文库。
(3)将构建好的文库按照novaseq6000测序仪操作指南进行上机测序，对测序数据进行去接头、去低质量序列、去污染处理，得到可信的备用分析的目标序列，对目标序列进行统计分析，miRNA主要通过互补配对结合到靶位点。使用线虫mRNA的3’UTR序列为目标序列，对差异表达的miRNA序列进行靶基因预测，共计预测到靶基因的miRNA数为26个，靶基因数为12788个，靶点位数为41015个；使用topGO进行GO富集分析，分析时利用GO term注释的差异miRNA靶基因对每个term的miRNA靶基因列表和miRNA靶基因数目进行计算，然后通过超几何分布方法计算P值(显著富集的标准为P-value<0.05)，找出与整个基因组背景相比，差异miRNA靶基因显著富集的GO term，从而确定差异miRNA靶基因行使的主要生物学功能。对差异表达的miRNA靶基因的GO富集分析结果，按照分子功能MF、生物过程BP和细胞组分CC进行GO分类，挑选每个GO分类中P值最小即富集最显著的前10个GO term条目进行展示，结果如图3所示。图3中，差异表达的miRNA靶基因主要参与的生物学过程BP包括神经系统发育(nervous system development)、定位调控(regulation of localization)等，主要涉及的分子功能为质膜成分的整合(integral component of plasma membrane)；
根据差异表达的miRNA靶基因的KEGG富集分析结果，挑选P值最小即富集最显著的前30个Pathway进行展示，结果如图4所示。图4中，前30条通路中细胞黏附分子(Celladhesion molecules)通路的富集程度最高，所含靶基因数为147，其次为钙信号通路(Calcium signaling pathway)，所含靶基因数为237，移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease)、癌症中的微RNA(MicroRNAs in cancer)等通路上也存在显著富集。
对比例1
本对比例分离了儿童脐带间充质干细胞外泌体，与实施例1的区别在于，本对比例的间充质干细胞来源于儿童脐带。具体过程为：
(1)获取并培养儿童脐带包皮间充质干细胞：收集术后的废弃物脐带(不涉及伦理问题)1g，用无菌PBS清洗后置于培养皿中，用剪刀从脐静脉内侧剖开脐带，用带齿镊子把脐静脉、脐动脉及脐带包膜去除，防止杂细胞混入；用剪刀剪碎脐带组织，用0.1％Ⅱ型胶原酶4℃过夜消化；待组织块完全分开后，加入少量间充质干细胞培养基继续培养；传代培养到第5代建立脐带间充质干细胞库。
(2)分离儿童脐带间充质干细胞外泌体：取步骤(1)培养好的脐带间充质干细胞于干净的离心管中，于2000×g，4℃条件下离心30min，以去除死细胞，收集第一上清液于新的离心管中，于12000×g，4℃条件下离心45min，去除细胞碎片，收集上清液，用20mL预冷的1×PBS重悬后经0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
将滤液转移至干净的超速离心管中，置于超速离心机中，于110000×g，4℃条件下超速离心2h，去除上清液(含其他细胞器)，得外泌体沉淀，此时的外泌体沉淀中含有杂蛋白；用3mL预冷的1×PBS重悬外泌体沉淀，再次于110000×g，4℃条件下超速离心2h，去除上清液，即去除杂蛋白，用100μL预冷的1×PBS重悬沉淀，即得儿童脐带间充质干细胞外泌体。
对分离的儿童脐带间充质干细胞外泌体进行鉴定，其透射电子显微镜成像结构如图1的A所示，对外泌体标志物的表达的检测如图2所示，可以看出CD9和CD81都有表达，且平均粒径为110nm。这些都是符合外泌体的特征的，表明对比例1分离到的的确是儿童脐带间充质干细胞外泌体。
试验例
本试验例首先对实施例1和对比例1中的间充质干细胞和外泌体进行了计数。
其中：
间充质干细胞的计数方法采用细胞计数仪；
外泌体的计数方法采用纳米颗粒追踪分析仪(NTA)法。
结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003559203440000111
表2显示，从实施例1中的1g儿童包皮获取并培养儿童包皮间充质干细胞，培养到第3代时细胞数量达21.45亿；培养到第5代时细胞数量达200亿，可产生2×1014外泌体；而从对比例1中的1g儿童脐带获取并培养儿童脐带间充质干细胞，培养到第5代时细胞数量为150亿，可产生1.5×1014外泌体。相较于儿童脐带间充质干细胞来源的外泌体，儿童包皮间充质干细胞来源的外泌体的得率更高。
其次，针对实施例1分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体和对比例1分离的儿童脐带间充质干细胞外泌体，根据各样品中miRNA的表达量数据，采用DESeq(version 1.18.0，Anders S和Huber W，2010)对miRNA进行差异表达分析，并按照表达量倍数差异(|log2FoldChange|>1)和表达差异显著性(P-value<0.05)筛选出差异的保守miRNA，见表3，表3中的对照组为对比例1中的儿童脐带间充质干细胞外泌体，处理组为实施例1中的儿童包皮间充质干细胞外泌体，表3显示，与对照组相比，处理组中显著上调和下调表达的miRNA共有26个，其中上调表达的miRNA有10个。
表3
Figure BDA0003559203440000121
表4显示了实施例1中筛选出的上调表达的10个miRNA，分别为hsa-let-7b-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-26a/b-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-326、hsa-miR-584-5p，它们的差异倍数(log)均在1～2倍的范围之间。
表4
基因ID 差异表达情况 Log2fc P-value
hsa-let-7b-5p 上调 1.184012671 0.023711996
hsa-miR-122-5p 上调 1.806013046 0.031269706
hsa-miR-151a-5p 上调 1.114472131 0.016169357
hsa-miR-15b-5p 上调 1.386697802 0.038188786
hsa-miR-223-3p 上调 1.341089012 0.001321069
hsa-miR-26a-5p 上调 1.012145671 0.023442437
hsa-miR-26b-5p 上调 1.211604902 0.013877705
hsa-miR-30e-3p 上调 2.031412124 0.028894195
hsa-miR-326 上调 1.538534141 0.006703024
hsa-miR-584-5p 上调 1.351941873 0.028886091
然后，采用R语言ggplot2软件包绘制实施例1中分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体中差异表达基因的火山图，以表示基因的表达倍数差异和显著性结果，如图5所示。图5可直观显示基因的分布情况，正常情况下，该图左右差异基因分布应大致对称，左侧为低表达基因，右侧为高表达基因，一般标准化后，基因的表达量成对成分布，即表达差异趋势不随基因表达量变化而发生偏向，同样可看出，表达上调基因为10个，下调基因为16个，与表3和表4的分析结果相同。
在实施例5的KEGG分析结果中显示儿童包皮间充质干细胞外泌体中的细胞黏附分子、钙信号等通路富集更显著，这些通路的显著富集是与上述上调表达的10个基因有关的，表明儿童包皮间充质干细胞来源的外泌体会比其他来源的间充质干细胞外泌体表达更多的免疫抑制相关基因和趋化基因，表明用儿童包皮间充质干细胞分离的外泌体可满足临床治疗炎症相关疾病的需求。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞外泌体的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：从儿童包皮中获取并培养儿童包皮间充质干细胞；
S2：取步骤S1所述的儿童包皮间充质干细胞，离心以去除死细胞和细胞碎片；
S3：取步骤S2经所述离心后获得的上清液进行超速离心，得儿童包皮间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S1获取所述儿童包皮间充质干细胞，需将所述儿童包皮进行纵向切片以扩散组织，分离表皮和真皮，切割所述真皮形成真皮组织浆液。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，形成所述真皮组织浆液后，需将所述真皮组织浆液接种于培养瓶中进行培养，培养3～5代后获取所述儿童包皮间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2中，首先将所述儿童包皮间充质干细胞于4℃～6℃，1800×g～2200×g条件下离心28min～35min，以去除所述死细胞，收集第一上清液。
5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，步骤S2中，将收集的所述第一上清液于4℃～6℃，10000×g～12000×g条件下离心35min～45min，以去除所述细胞碎片，收集上清液。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S3中，将所述上清液于4℃～6℃，100000×g～110000×g条件下离心2h～2.5h，以去除其他细胞器，得外泌体沉淀，所述外泌体沉淀含有杂蛋白。
7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，对所述外泌体沉淀进行重悬，继续于4℃～6℃，100000×g～110000×g条件下离心2h～2.5h，以去除所述杂蛋白，得所述儿童包皮间充质干细胞外泌体。
8.利用权利要求1～7任一项所述的分离方法分离得到的间充质干细胞外泌体的miRNA分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1：构建儿童包皮间充质干细胞外泌体的高通量测序DNA文库；
A2：上机测序，对测序数据进行去接头、去低质量序列、去污染处理得可信目标序列，经统计分析获取到所述儿童包皮间充质干细胞外泌体表达的miRNA。
9.根据权利要求8所述的miRNA分析方法，其特征在于，步骤A1所述的构建儿童包皮间充质干细胞外泌体的高通量测序DNA文库的方法包括：提取所述儿童包皮间充质干细胞外泌体的总RNA，对所述总RNA的5’端和3’端进行连接修饰，对修饰的总RNA进行逆转录形成互补DNA，扩增所述互补DNA得到DNA扩增产物，最后分离出目的DNA，获得所述儿童包皮间充质干细胞外泌体的高通量测序DNA文库。
10.根据权利要求8所述的miRNA分析方法，其特征在于，步骤A2中的所述统计分析，具体方法包括：选取GO富集分析参与的生物过程、细胞组分和分子功能；选取KEGG通路数据库对差异miRNA进行通路富集分析；选取TargetScan靶基因预测数据库对部分miRNA的相关靶基因进行预测。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116426648A (zh) * 2023-03-27 2023-07-14 艾一生命科技(广东)有限公司 一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合及其qRCR引物
CN116913370A (zh) * 2023-09-06 2023-10-20 佛山市妇幼保健院 人脐带间充质干细胞治疗宫腔粘连的circRNA靶点筛选方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111484972A (zh) * 2020-06-01 2020-08-04 深圳市儿童医院 一种从儿童包皮培养获得具备多向分化潜能和免疫调节功能间充质干细胞的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111484972A (zh) * 2020-06-01 2020-08-04 深圳市儿童医院 一种从儿童包皮培养获得具备多向分化潜能和免疫调节功能间充质干细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN HUANG 等: "Characterization of inflammatory factor-induced changes in mesenchymal stem cell exosomes and sequencing analysis of exosomal microRNAs.", 《WORLD JOURNAL OF STEM CELLS》, vol. 11, no. 10, pages 859 - 860 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116426648A (zh) * 2023-03-27 2023-07-14 艾一生命科技(广东)有限公司 一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合及其qRCR引物
CN116426648B (zh) * 2023-03-27 2024-03-08 艾一生命科技(广东)有限公司 一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合及其qRCR引物
CN116913370A (zh) * 2023-09-06 2023-10-20 佛山市妇幼保健院 人脐带间充质干细胞治疗宫腔粘连的circRNA靶点筛选方法
CN116913370B (zh) * 2023-09-06 2024-01-09 佛山市妇幼保健院 人脐带间充质干细胞治疗宫腔粘连的circRNA靶点筛选方法

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