CN115651076A - 人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物及其应用，涉及生物技术领域，通过对不同传代次数的人骨髓间充质干细胞来源的凋亡囊泡进行蛋白质谱数据分析，筛选出ITGA10为候选凋亡囊泡骨活性表面标志物。本发明将ITGA10作为囊泡骨活性特异性的表面标志物，特异性地在促成骨能力强的囊泡中高表达中，并定位在凋亡囊泡表面，从而可以将促成骨能力强的囊泡由普通混合细胞中分离纯化出来；在采用ITGA10作为表面标志物时可以有效地判断凋亡囊泡是否适用于骨组织工程，并分离出高表达ITGA10囊泡，增强其可应用性，本发明的凋亡囊泡表面标志物填补其骨活性标志物的空缺并使其更加符合骨组织工程应用的要求。

Description

人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物及其应用。

背景技术

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，包括明显的细胞收缩、染色质凝结和胞浆起泡，人体内每天有超过500亿个细胞发生凋亡，是维持组织稳态所必需的。在这一过程中产生了大量的凋亡囊泡(apoVs)，其中包含蛋白质、DNA、RNA、脂类和代谢产物。凋亡囊泡是一种异质的纳米囊泡群体，具有不同的货物、大小和生产机制。以往的研究主要集中在凋亡小体(直径1-5μm)，而最近的研究发现了更小的囊泡，包括凋亡囊泡(直径0.1-1μm)和凋亡外泌体(直径<150 nm)。越来越多的证据表明，凋亡囊泡作为旁分泌的一个重要组成部分，通过促进细胞间通讯参与多种生理和病理生理事件。

骨间充质干细胞(BMSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能细胞，被认为在骨形成中发挥重要作用。因为移植可以直接补足由于各种原因导致的骨髓间充质干细胞数量不足和功能障碍，骨髓间充质干细胞移植成为骨病领域的研究热点，被认为有可能从根本上逆转骨质流失。然而，骨髓间充质干细胞的衰老对其治疗功能有深远影响。单层培养会极大地影响细胞行为，导致细胞衰老并损害多能性。众所周知，BMSCs衰老会导致增殖率降低和功能障碍，从成骨分化明显转变为成脂分化，从而大大降低活体成骨效率。

有趣的是，BMSCs衍生的apoVs可能有助于BMSC介导的治疗效果。我们已经证明，静脉注射BMSCs衍生的apoV可以通过挽救内源性BMSCs的干细胞特性来改善骨质减少。然而，apoVs的成分和功能强烈依赖于其亲代细胞的身份。不同传代次数的BMSCs衍生ApoVs可能包含不同的内容物，并在骨代谢中表现出不同的功能，这限制了它们在骨组织工程中的应用。因此，需要可靠的标记物来识别BMSCs衍生的apoVs的骨活性，并将促成骨能力强的apoVs进行分离纯化。

发明内容

解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物及其应用，解决了骨髓间充质干细胞源性凋亡囊泡的骨活性标记物仍不明确的问题。

技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物，通过对不同传代次数的人骨髓间充质干细胞来源的凋亡囊泡进行蛋白质谱数据分析，筛选出ITGA10为候选凋亡囊泡骨活性表面标志物。

优选地，所述ITGA10是整合素家族的成员，由1167个氨基酸组成，是单通道I型膜蛋白。

本发明还提供人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物在骨组织工程中的应用，ITGA10定位于凋亡囊泡表面，ITGA10在促成骨能力强的骨髓间充质干细胞源性凋亡囊泡中高表达，而ITGA10在促成骨能力弱的复制性老化细胞源性凋亡囊泡中表达量显著降低。ITGA10可用于检测和鉴定凋亡囊泡体外促进间充质干细胞成骨活性，并可用于将成骨活性强的凋亡囊泡从混合囊泡中分离出来以提高治疗效果。

优选地，人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的制备方法，包括以下操作：

S1：体外分离并提纯人骨髓间充质干细胞；

S2：以培养液重悬，在培养液中加入星形孢菌素诱导人骨髓间充质干细胞凋亡，用于重悬的培养液为MEMα培养基；

S3：收集上清液，通过梯度离心法分离得到凋亡囊泡，所述的梯度离心法包括以下步骤：

S31：将所述上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；

S32：将所述上清液于4℃，以2000g离心10min，取上清液，获得第二离心上清液；

S33：将所述第一离心上清液于4℃，以16000g离心30min，取沉淀物，即得粗制凋亡囊泡；

S34：将所述粗制凋亡囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得凋亡囊泡纯品。

优选地，所述S34中获得的凋亡囊泡呈双面凹的圆盘状，粒径为100-1000nm。

优选地，提纯不同传代次数人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡，并对其所包含的蛋白进行测序分析，包括以下步骤：

S1：提取凋亡囊泡蛋白并加载于SDS–PAGE胶，蛋白质样品进入堆叠凝胶后停止电泳，含有蛋白质的凝胶部分被切除并用考马斯亮蓝染色；

S2：将凝胶切片切成1×1 mm片，放置在含有1 ml水的1.5 ml微型离心管中，并孵育30分钟；

S3：将水替换为200µl 250 mm碳酸氢铵和25µl 45 mm二硫苏糖醇，并在50°C下孵育样品30分钟；

S4：样品冷却至室温，添加25µl 100 mM碘乙酰胺并孵育30分钟进行烷基化；

S5：凝胶切片在水中洗涤两次；

S6：在室温下在1 ml 50 mM碳酸氢铵/乙腈的50:50溶液中孵育1小时，将溶液用200µl乙腈替换并孵育，直到凝胶切片变成不透明的白色；

S7：除去乙腈，在Speed Vac中进一步干燥凝胶切片；

S8：凝胶切片在100µl含0.01%蛋白酶MAX表面活性剂和2 ng/µl胰蛋白酶的50 mM碳酸氢铵溶液中再水合，37℃下孵育21小时；

S9：上清液转移到新鲜的1.5-ml试管中，凝胶切片用200µl 80:20乙腈/1%甲酸溶液进一步脱水后与每个样品的上清液混合；

S10：在Speed Vac中干燥含有消化蛋白质的合并上清液，并用25µl 5%乙腈在0.1%三氟乙酸中再溶解颗粒；

S11：将3.5µl等分试样直接注入定制包装的2 cm×100µm C18 Magic 5µm颗粒捕集柱，在Waters Nano Acquity UPLC系统上，以每分钟300 nl的流速从定制填充的发射器上进行数据相关采集。

本发明还提供人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物在骨组织工程中的应用，使用免疫吸附柱分选所述S34中获得的凋亡囊泡，包括以下步骤：

S1:apoVs用无菌FAS buffer重悬；

S2:加入抗人ITGA10一抗(1:100,Millipore, USA)，4℃孵育30min，无菌PBS洗涤一次, FAS buffer重悬；

S3:加入PE荧光信号偶联山羊抗兔二抗IgG (H+L) (1:100, Proteintech, USA)，4℃孵育30min，无菌PBS洗涤一次，FAS buffer重悬；

S4:加入抗PE磁珠(1:20, Miltenyi Biotec, Germany)，4℃孵育20min，无菌PBS洗涤一次；

S5:磁场中通过一个吸附柱，流下的部分定义为ITGA10阴性囊泡亚群，被吸附的部分定义为ITGA10阳性囊泡亚群。

优选地，ITGA10阳性囊泡亚群比ITGA10阴性囊泡亚群更显著地促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化。

有益效果

本发明具有以下有益效果：ITGA10作为骨髓间充质干细胞骨活性特异性的表面标志物，定位在细胞表面，特异性地在促成骨能力强的囊泡中高表达中，从而可以将促成骨能力强的囊泡由普通混合囊泡中分离纯化出来；在采用ITGA10作为表面标志物时可以有效地判断凋亡囊泡是否适用于骨组织工程，并分离出ITGA10阳性囊泡，使其在骨组织工程中的可应用性增强，本发明的凋亡囊泡表面标志物填补其骨活性标志物的空缺并使其更加符合骨组织工程应用的要求。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为人骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 体外诱导凋亡、提取凋亡囊泡 (apoVs) 流程，以及免疫吸附柱分选凋亡囊泡的示意图；

图2为第5代BMSCs是来源的凋亡囊泡(P5 apoVs)和第15代BMSCs是来源的凋亡囊泡(P15 apoVs)的透射电镜结果显示图；

图3为P5 apoVs和P15 apoVs的纳米颗粒跟踪分析检测结果显示图；

图4 为P5 apoVs和P15 apoVs的差异蛋白聚类热图；

图5 为P5 apoVs和P15 apoVs的差异蛋白火山图；

图6为鉴别高表达ITGA10的凋亡囊泡(ITGA10+apoVs)和低表达ITGA10的凋亡囊泡(ITGA10-apoVs)的免疫电镜结果显示图；

图7为apoVs促进人骨髓充质干细胞体外成骨向分化图；其中，A为PM茜素红染色图，B为OM茜素红染色图，C为OM+ 500 ng/mL ITGA10+apoVs茜素红染色图；D为OM+ 500 ng/mL ITGA10-apoVs茜素红染色图；

图8为茜素红定量图；

图9为ITGA10+apoVs和ITGA10-apoVs促进成骨关键基因RUNX2，OPN和OSX表达的RT-qPCR结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参考图1-9，实施例1：人骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的凋亡囊泡(apoVs)的高效提取

人骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的凋亡囊泡(apoVs)的高效提取：在以培养液中加入500 nM STS进行凋亡诱导，通过梯度离心法获取BMSCs来源的apoVs，使用纳米颗粒跟踪分析检测其浓度，BCA法检测其蛋白量，获得最优化的提取条件，建立标准的提取流程。

具体如下：

S1：将细胞培养液清液于4℃，以800g离心10min，以去除培养液上清液中的细胞碎片，取上清液，获得第一离心上清液；

S2：将细胞培养液清液于4℃，以2000g离心10min，以去除培养液上清液中的细胞碎片，取上清液，获得第二离心上清液；

S3：将所述第一离心上清液于4℃，以16000g离心30min，取沉淀物，即得粗制凋亡囊泡;

S4：将所述粗制凋亡囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃，以16000g离心30min，获得凋亡囊泡纯品。

实施例2：BMSCs来源的apoVs的特征分析

通过透射电镜明确ITGA10在apoVs中的形态学特征，通过纳米颗粒跟踪分析检测BMSCs来源的apoVs(ITGA10-apoVs)的粒径和浓度。

透射电镜：

（1）吸取5μl凋亡微囊泡悬液滴到铜网上，室温静置1min；

（2）用滤纸沿铜网外侧吸去多于液体，吸取5μl 2%醋酸铀酰滴入铜网上，室温下静置30秒；

（3）用滤纸沿铜网外侧吸去多余液体，室温下静置干燥；

（4）透射电镜下拍摄图像，电压设置为120kV。

参考图2中透射电镜观测结果显示图可以看出，BMSCs来源的apoVs均呈现为双面凹的圆盘状，直径约为100-200nm。

纳米粒径跟踪分析检测：

S1：用纳米颗粒跟踪分析仪记录布朗运动下凋亡微囊泡的运动轨迹；

S2：通过NTA分析软件进行分析。

参考图3纳米颗粒跟踪分析检测结果图可以看出，BMSCs来源的apoVs的粒径分布均为100-1000nm。

实施例3：不同传代次数的BMSCs来源的apoVs的蛋白质谱分析

S1：提取凋亡囊泡蛋白并加载于SDS–PAGE胶，蛋白质样品进入堆叠凝胶后停止电泳，含有蛋白质的凝胶部分被切除并用考马斯亮蓝染色。

S2：将凝胶切片切成1×1 mm片，放置在含有1 ml水的1.5 ml微型离心管中，并孵育30分钟。

S3：将水替换为200µl 250 mm碳酸氢铵和25µl 45 mm二硫苏糖醇，并在50°C下孵育样品30分钟。

S4：样品冷却至室温，添加25µl 100 mM碘乙酰胺并孵育30分钟进行烷基化。

S5：凝胶切片在水中洗涤两次。

S6：在室温下在1 ml 50 mM碳酸氢铵/乙腈的50:50溶液中孵育1小时，将溶液用200µl乙腈替换并孵育，直到凝胶切片变成不透明的白色。

S7：除去乙腈，在Speed Vac中进一步干燥凝胶切片。

S8：凝胶切片在100µl含0.01%蛋白酶MAX表面活性剂和2 ng/µl胰蛋白酶的50 mM碳酸氢铵溶液中再水合，37℃下孵育21小时。

S9：上清液转移到新鲜的1.5-ml试管中，凝胶切片用200µl 80:20乙腈/1%甲酸溶液进一步脱水后与每个样品的上清液混合。

S10：在Speed Vac中干燥含有消化蛋白质的合并上清液，并用25µl 5%乙腈在0.1%三氟乙酸中再溶解颗粒。

S11：将3.5µl等分试样直接注入定制包装的2 cm×100µm C18 Magic 5µm颗粒捕集柱。在Waters Nano Acquity UPLC系统上，以每分钟300 nl的流速从定制填充的发射器上进行数据相关采集。

参考图4聚类热图和图5火山图可以看出，不同传代次数BMSCs来源的apoVs包含大量差异蛋白，其中ITGA10在P5 apoVs中的表达量显著高于其在P15 apoVs中的表达量。

实施例4：BMSCs来源apoVs的免疫透射电镜

通过免疫透射电镜明确ITGA10在apoVs中的亚细胞定位以及表达量。

免疫透射电镜：

S1：吸取5μl凋亡微囊泡悬液滴到铜网上，在干燥环境中室温静置20min；

S2：用PBS清洗6次，每次3分钟；

S3：用50 mM甘氨酸（PBS溶解）清洗6次，每次3分钟；

S4：封闭液(5% BSA)封闭10min；

S5：将网格转移到5uL适当浓度的抗体溶液中(ITGA10，1:10,Millipore, USA)，孵育30min;

S6：用PBS清洗6次，每次2分钟；

S7：用50 mM甘氨酸（PBS溶解）清洗6次，每次2分钟；

S8：将网格转移到5uL适当浓度的免疫金颗粒溶液中（A-gold conjugates），孵育20min;

S9：用PBS清洗4次，每次2分钟；

S10：将网格转移到50μl 1%戊二醛溶液中，固定5min;

S11：用纯水清洗4次，每次2分钟；

S12：用滤纸沿铜网外侧吸去多于液体，吸取5μl 2%醋酸铀酰滴入铜网上，室温下静置30s；

S13：用滤纸沿铜网外侧吸去多余液体，室温下静置干燥；

S14：透射电镜下拍摄图像，电压设置为200kV。

参考图6中免疫透射电镜观测结果显示图可以看出，ITGA10定位于apoVs外膜，且ITGA10+apoVs表面的免疫金颗粒数量明显多于ITGA10-apoVs，说明ITGA10+apoVs膜表面的ITGA10表达量显著高于ITGA10-apoVs。

实施例5：人骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的凋亡囊泡(apoVs)的磁珠分选：通过摸索一抗、二抗以及磁珠的最适浓度以及孵育条件，获得最优化的分选条件，建立有效的凋亡囊泡筛选流程。

具体如下：

S1：apoVs用无菌FAS buffer重悬

S2：加入抗人ITGA10一抗(1:100,Millipore, USA)，4℃孵育30min，无菌PBS洗涤一次, FAS buffer重悬；

S3：加入PE荧光信号偶联山羊抗兔二抗IgG (H+L) (1:100, Proteintech, USA)，4℃孵育30min，无菌PBS洗涤一次，FAS buffer重悬；

S4：加入抗PE磁珠(1:20, Miltenyi Biotec, Germany)，4℃孵育20min，无菌PBS洗涤一次；

S5：磁场中通过一个吸附柱，流下的部分定义为ITGA10阴性囊泡亚群，被吸附的部分定义为ITGA10阳性囊泡亚群，即滞留在柱体内的部分。

实施例6：体外实验检测ITGA10阳性apoVs亚群（ITGA10+apoVs）和ITGA10阴性apoVs亚群（ITGA10-apoVs）对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响：

将人骨髓间充质干细胞分别在以下四种培养条件下培养：

1）增殖培养基（PM）：含有10%FBS和1%青-链霉素双抗的MEMα培养基。

2）成骨诱导（OM）：含有10%FBS、1%青-链霉素双抗、10mM β钠甘油磷酸酯（β-SodiumGlycerophosphate），0.2mM L-抗坏血酸（Ascorbic Acid）和100nM地塞米松（dexamethasone）的MEMα培养基。

3）成骨诱导培养基中加入 500 ng/mL ITGA10+apoVs（500ng/mL）。

4）成骨诱导培养基中加入 500 ng/mL ITGA10-apoVs（500ng/mL）。

成骨诱导14天后,通过茜素红染色检验细胞成骨分化的效果。

茜素红染色：

配制染液，称取1g粉剂（Alizarin red s, SIGMA, A5533-25G），溶解于100mlMilliQ水中；

吸尽培养基，PBS冲洗三次，95%冰乙醇固定细胞30min，弃去冰乙醇，MilliQ水冲洗三次，晾干，加入染液，染出矿化结节，染色终止后吸去染液，蒸馏水冲洗，镜下拍照。

茜素红定量：

加入等量的1%十六烷基吡啶溶液，待完全溶解后，吸取100μl至96孔板，在490nm波长下测吸光度，进行茜素红染色定量分析。

如图7所示的茜素红染色结果：培养10天后，与普通增殖培养（PM）相比，成骨诱导培养（OM）可见大量红染的矿化结节生成。在OM培养的同时加入apoVs，与对照组（OM）相比，细胞矿化结节的生成显著增加，而加入ITGA10+apoVs实验组的矿化结节生成显著强于ITGA10-apoVs试验组。说明在加入apoVs后，人骨髓间充质干细胞体外成骨向分化能力增强，且ITGA10+apoVs具有更强的促成骨性。

如图8所示，对应的茜素红定量分析结果与染色结果一致（****p＜0.0001）。

实施例7：体外实验检测apoVs促进人骨髓间充质干细胞中成骨关键基因RUNX2，OPN和OSX的表达

将细胞接种于6孔板，分别进行普通增殖培养（PM）、成骨诱导培养（OM）以及成骨诱导培养条件下加入apoVs（500 ng/mL ITGA10+apoVs或ITGA10-apoVs），培养7天时提取RNA，使用RT-qPCR检测成骨相关基因RUNX2的表达情况。

（1）细胞总RNA提取

按实验分组将细胞接种于6孔板，不同条件诱导后提RNA，具体步骤如下：

S1：吸净培养基，PBS冲洗。

S2：加入Trizol试剂（1 ml/孔），移入1.5ml的离心管中；

S3：加入200μl三氯甲烷，震荡30秒，冰上放置3分钟；

S4：4℃，12000g，离心15分钟；

S5：静置，吸取上层水相转移到另一离心管；

S6：加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10分钟；

S7：4 ℃，12000g，离心10分钟；

S8：弃上清，加入1ml预冷无水乙醇和DEPC水配制的75%乙醇，洗涤沉淀；

S9：4℃，7500g，离心5分钟；

S10：弃上清，吸净液体，室温下干燥沉淀，加入适量的DEPC水，提取的总RNA于-80℃分装保存或进行下一步实验。

（2）逆转录合成cDNA

1）逆转录反应体系为20 μl，总RNA使用量约为1000 ng。

2）取提取的总RNA 1000 ng，按照试剂盒说明书在冰上配制逆转录反应液。

3）逆转录反应条件：37℃，15分钟（逆转录反应）；85℃，5秒（逆转录酶的失活反应）；4℃保持，也可以于-20℃分装保存或进行下一步实验。

（3）实时定量PCR反应

1）每个样品每个基因检测三个副孔，八联管每孔内配置20μl反应体系，使用试剂及用量如下，其中引物序列如表1所示：

SYBR Green 10μl

cDNA 0.5μl

引物 1μl

DEPC水 8.5μl

2）PCR反应条件为：95℃热启动10分钟，95℃变性30秒；60℃退火延伸1分钟，共40个循环；

3）以GAPDH为内参，使用ΔΔCt法分析数据，实验数据以三次独立实验的平均值±标准差表示。

表1 qRT-PCR引物序列

GAPDH-F	CGGACCAATACGACCAAATCCG
		GAPDH-R	AGCCACATCGCTCAGACACC
RUNX2-F	TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT
		RUNX2-R	TGCTTTGGTCTTGAAATCACA
OPN-F	ACCCTGACCCATCTCAGAAGCA
		OPN-R	CTTGGAAGGGTCTGTGGGGCTA
OSX-F	CCTCCTCAGCTCACCTTCTC
		OSX-R	GTTGGGAGCCCAAATAGAAA

参考图9为apoVs促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化，上调成骨关键基因RUNX2、OPN和OSX表达的qRT-PCR检测结果图；从图中可以看出，在成骨诱导后，RUNX2、OPN和OSX表达水平上调，加入apoVs后，RUNX2、OPN和OSX表达水平较对照组明显上调，证明人骨髓间充质干细胞体外成骨向分化能力增加，而ITGA10+apoVs组的RUNX2、OPN和OSX表达水平较ITGA10-apoVs组明显上调，表明ITGA10+apoVs能更好的促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化（***p＜0.001,****p＜0.0001）。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (8)

1.人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物，其特征在于：通过对不同传代次数的人骨髓间充质干细胞来源的凋亡囊泡进行蛋白质谱数据分析，筛选出ITGA10为候选凋亡囊泡骨活性表面标志物。

2.根据权利要求1所述的人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物，其特征在于：所述ITGA10是整合素家族的成员，由1167个氨基酸组成，是单通道I型膜蛋白。

3.人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物在骨组织工程中的应用，其特征在于：将ITGA10定位在凋亡囊泡表面，ITGA10在促成骨能力强的骨髓间充质干细胞源性凋亡囊泡中高表达，而ITGA10在促成骨能力弱的复制性老化细胞源性凋亡囊泡中表达量显著降低，可用于检测和鉴定其体外促进间充质干细胞成骨活性，并可用于将成骨活性强的凋亡囊泡从混合囊泡中分离出来以提高治疗效果。

4.根据权利要求3所述的人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物在骨组织工程中的应用，其特征在于：人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的制备方法，包括以下操作：

S1：体外分离并提纯人骨髓间充质干细胞；

S2：以培养液重悬，在培养液中加入星形孢菌素诱导人骨髓间充质干细胞凋亡，用于重悬的培养液为MEMα培养基；

S3：收集上清液，通过梯度离心法分离得到凋亡囊泡，所述的梯度离心法包括以下步骤：

S31：将所述上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；

S32：将所述上清液于4℃，以2000g离心10min，取上清液，获得第二离心上清液；

S33：将所述第一离心上清液于4℃，以16000g离心30min，取沉淀物，即得粗制凋亡囊泡；

S34：将所述粗制凋亡囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得凋亡囊泡纯品。

5.根据权利要求4所述的人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物在骨组织工程中的应用，其特征在于：所述S34中获得的凋亡囊泡呈双面凹的圆盘状，粒径为100-1000nm。

6.根据权利要求4所述的人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物在骨组织工程中的应用，其特征在于:所述方法提纯不同传代次数人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡，并对其所包含的蛋白进行测序分析，包括以下步骤：

S1：提取凋亡囊泡蛋白并加载于SDS–PAGE胶，蛋白质样品进入堆叠凝胶后停止电泳，含有蛋白质的凝胶部分被切除并用考马斯亮蓝染色；

S2：将凝胶切片切成1×1 mm片，放置在含有1 ml水的1.5 ml微型离心管中，并孵育30分钟；

S3：将水替换为200µl 250 mm碳酸氢铵和25µl 45 mm二硫苏糖醇，并在50°C下孵育样品30分钟；

S4：样品冷却至室温，添加25µl 100 mM碘乙酰胺并孵育30分钟进行烷基化；

S5：凝胶切片在水中洗涤两次；

S6：在室温下在1 ml 50 mM碳酸氢铵/乙腈的50:50溶液中孵育1小时，将溶液用200µl乙腈替换并孵育，直到凝胶切片变成不透明的白色；

S7：除去乙腈，在Speed Vac中进一步干燥凝胶切片；

S8：凝胶切片在100µl含0.01%蛋白酶MAX表面活性剂和2 ng/µl胰蛋白酶的50 mM碳酸氢铵溶液中再水合，37℃下孵育21小时；

S9：上清液转移到新鲜的1.5-ml试管中，凝胶切片用200µl 80:20乙腈/1%甲酸溶液进一步脱水后与每个样品的上清液混合；

S10：在Speed Vac中干燥含有消化蛋白质的合并上清液，并用25µl 5%乙腈在0.1%三氟乙酸中再溶解颗粒；

S11：将3.5µl等分试样直接注入定制包装的2 cm×100µm C18 Magic 5µm颗粒捕集柱，在Waters Nano Acquity UPLC系统上，以每分钟300 nl的流速从定制填充的发射器上进行数据相关采集。

7.根据权利要求4所述的人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物在骨组织工程中的应用，其特征在于：使用免疫吸附柱分选所述S34中获得的凋亡囊泡，包括以下步骤：

S1:apoVs用无菌FAS buffer重悬；

S2:加入抗人ITGA10一抗，4℃孵育30min，无菌PBS洗涤一次, FAS buffer重悬；

S3:加入PE荧光信号偶联山羊抗兔二抗IgG ，4℃孵育30min，无菌PBS洗涤一次，FASbuffer重悬；

S4:加入抗PE磁珠，4℃孵育20min，无菌PBS洗涤一次；

S5:磁场中通过一个吸附柱，流下的部分定义为ITGA10阴性囊泡亚群，被吸附的部分定义为ITGA10阳性囊泡亚群。

8.根据权利要求7所述的人骨髓间充质干细胞来源凋亡囊泡的表面标志物在骨组织工程中的应用，其特征在于：ITGA10阳性囊泡亚群比ITGA10阴性囊泡亚群更显著地促进人骨髓间充质干细胞成骨向分化。

Images