CN117757733A - 一种综合评价人脐带间充质干细胞制剂生物学特性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组评价人脐带间充质干细胞制剂生物学特性的方法，该方法包括诱导分化、免疫调控和抗炎作用三个方面。通过对人脐带间充质干细胞进行三系分化鉴定、免疫调控能力和抗炎作用实验，综合评价人脐带间充质干细胞制剂的生物学特性，为其临床应用及疗效评价提供依据。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及评价人脐带间充质干细胞制剂生物学特性的方法。
背景技术
人脐带间充质干细胞（umbilical mesenchymal stem cells, UC-MSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，是目前临床应用研究较多的一类干细胞。人脐带间充质干细胞通过多向分化与旁分泌作用发挥组织再生与损伤保护作用，而间充质干细胞独特的免疫调节功能也是其临床应用的基础之一。人脐带间充质干细胞相比其他来源的间充质干细胞具有诸多优势，如免疫原性更低、扩增速率更快、分化潜能更强等；尤其是人脐带间充质干细胞取材容易，无道德伦理争议，能够大量产业化扩增存储而被广泛关注。近年来，人脐带间充质干细胞在移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮、糖尿病及其并发症等自身免疫相关性疾病的治疗中的应用引起了人们的广泛关注。然而，用人脐带间充质干细胞治疗自身免疫相关性疾病时，存在着个体差异和治疗效果不稳定的问题，所以需要一种评价人脐带间充质干细胞制剂生物学有效性的方法，在临床应用前对干细胞进行筛选。
目前，国际细胞治疗协会（ISCT）规定间充质干细胞需满足3点要求：①在标准培养条件下黏附于塑料制品生长；②体外能分化为成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞；③表达CD105、CD73及CD90，不表达CD45、CD34、CD14（或CD11b）、CD19和HLA-DR。这些条件是目前国内外公认的鉴定间充质干细胞的标准。但该方法无法有效评价间充质干细胞的生物学特性，也就无法评估人脐带间充质干细胞制剂的可能临床疗效。
因此，迫切需要一种能够有效评价人脐带间充质干细胞制剂生物学特性的方法，来研究人脐带间充质干细胞制剂在临床上运用的生物学有效性。
发明内容
本发明的目的是提供一组评价人脐带间充质干细胞制剂生物学特性的检测方法。人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）是一种多能干细胞，具有强大的增殖能力和免疫调节功能，可以分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等多种细胞类型。UC-MSCs可以从健康足月分娩的新生儿脐带中分离得到，具有取材方便、无损伤、无污染、无免疫排斥等优点，因此被广泛应用于组织工程、细胞治疗和基因治疗等领域。然而，目前还缺乏一种快速有效的方法来评价UC-MSCs制剂的生物学特性，从而预测其在临床应用中的治疗效果。
本发明采用自主分离技术分离UC-MSCs，在满足国际细胞治疗协会（ISCT）规定的三个条件标准下，设计了一组基于体外直接接触共培养的检测方法。该方法通过流式细胞仪检测UC-MSCs对人外周血单个核细胞（PBMCs）增殖的抑制率，以及ELISA检测共培养体系中淋巴细胞分泌的炎症因子水平，从而评价UC-MSCs制剂的免疫调节水平。该方法具有操作简便、结果直观、灵敏度高等特点，可以作为筛选UC-MSCs制剂生物学有效性的一种有效手段，为其临床应用提供参考依据。
为了实现本发明的目的，采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种评价人脐带间充质干细胞制剂生物学有效性的检测方法，其特征在于包括以下步骤：按照ISCT规定的三个条件标准分离和鉴定UC-MSCs，即：①贴壁生长；②表达CD73、CD90和CD105等表面标志物，不表达CD34、CD45、HLA-DR等表面标志物；③具有向成骨、脂肪和软骨方向分化的潜能；UC-MSCs进行细菌，真菌，支原体检测；取志愿者外周血，提取PBMCs；建立促进PBMCs增殖的方法；将扩增培养的P5代UC-MSCs与PHA刺激后的PBMCs按照不同比例混合，并在37℃、5%CO2条件下共培养48小时；检测共培养体系中淋巴细胞分泌的炎症因子水平。
附图说明
图1：UC-MSCs在特定条件下分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。
图2：植物血凝素刺激人外周血单核细胞（PBMCs）增殖的实验结果图。
图3：UC-MSCs抑制PBMCs增殖的实验结果图，显示了UC-MSCs对免疫调节的作用。
图4：UC-MSCs抗炎作用的实验结果图，显示了UC-MSCs对炎症因子水平的影响。
具体实施方式
下文将结合具体实施案例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1
人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的分离、制备和鉴定
取质检合格并取得捐献者知情同意和医疗机构伦理批件的10～15cm足月剖腹产新生儿的脐带于无菌培养皿中，将华通氏胶切成约3-5mm3的小块，组织片段用生理盐水洗涤后以350g离心5分钟。将组织片段重悬于10mL完全培养基(Lonza，MD，Walkersville)中，并均匀接种到培养皿中，置于37℃，5％ CO2浓度的培养箱中培养，培养观察，第7天镜下观察可见细胞爬出，培养至第12天，0.25％胰酶消化传至P1代，当细胞融合度达到90％-95％时，消化传至P2代，后按1:10比例传代，每代扩增时间为3天，传代扩增至P5代。
实施例2
将P5代UC-MSCs进行细菌，真菌，支原体检测
将UC-MSCs液体滴到哥伦比亚血琼脂平板(检测细菌)中，设置阴性和阳性对照组，37℃恒温培养箱中培养3天，观察并记录结果。
UC-MSCs液体滴到沙保罗琼脂平板(检测真菌)中，设置阴性和阳性对照组，放置在37℃恒温培养箱中培养3天，观察并记录结果。
UC-MSCs液体加入支原体分离鉴别培养管小瓶中，盖上瓶盖，摇匀小瓶；设置阴性和阳性对照组，放在37℃培养箱培养，48小时后，观察结果并记录。本研究所使用的细菌，真菌，支原体试剂概述如下：
支原体分离鉴别管(厂家：珠海银科医学工程有限公司)，
哥伦比亚血琼脂平板(厂家：河南美凯生物科技有限公司)，
沙保罗琼脂平板(厂家：河南美凯生物科技有限公司)。
实施例3
将P5代UC-MSCs进行成脂，成骨，成软骨三系分化鉴定
实验中使用了P5代UC-MSCs。为确认UC-MSCs的诱导分化作用，使用油红O染色确认脂肪形成，使用茜素红染色验证成骨，使用阿辛蓝染色检查软骨形成。结果见图1。
实施例4
将扩增培养的UC-MSCs的P5代细胞进行表型鉴定
UC-MSCs的P5代细胞通过流式细胞术检测UC-MSCs相关的细胞表面标志物，例如CD19，CD34，CD45，HLA-DR，CD105，CD90，CD44和CD73(Biolegend，美国)。
实施例5
取志愿者外周血，志愿者已签署知情同意书，提取PBMC
采用Ficoll(GE Healthcare公司，美国)密度梯度离心法分离提取PBMC。提取出来的PBMC重悬于含体积分数为10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中待用。
实施例6
建立促进PBMC增殖的方法
PBMC适当密度种在12孔板当中，在PBMC中加入植物血凝素(终质量浓度为10mg/L)和白细胞介素(终浓度为200IU/mL)刺激PBMC增长，设置对照组，每孔加入CFSE染液(终浓度为0.2μmol/L)，37℃避光孵育1.0-2.0min标记细胞，培养3d后，用流式细胞仪FITC通道检测PBMC增殖情况。数据表示为Mean±SEM。体外实验至少重复三次。使用GraphPad Prism 5制作结果数据图。*P<0.05，**P<0.01。结果见图2。
实施例7
将扩增培养的P5代UC-MSCs和免疫细胞(PBMC)体外直接接触共培养用流式细胞仪进行免疫抑制鉴定，实验分为PBMC单独培养组、植物血凝素刺激PBMC增殖组、PBMC+UC-MSCs共培养组(密度1：10)，共培养组将UC-MSCs提前种在12孔板当中，再加入PBMC,共培养5d后，用植物血凝素刺激PBMC增殖组和PBMC+UC-MSCs共培养组每孔加入植物血凝素(终质量浓度为10mg/L)和白细胞介素(终浓度为200IU/mL)，分别在每孔加入CFSE染液(终浓度为0.2μmol/L)，用流式细胞仪FITC通道检测免疫调控情况。数据表示为Mean±SEM。体外实验至少重复三次。使用GraphPad Prism 5制作结果数据图。*P<0.05，**P<0.01。结果见图3。
实施例8
ELISA实验检测炎症因子TNF-α的水平
按照ELISA试剂盒(厂家：碧云天生物技术研究所)制造商的说明书检测共培养体系中淋巴细胞分泌的炎症因子水平的TNF-α。
实验分为PBMC单独培养组和PBMC+UC-MSCs共培养组(密度1：10)，按照实例7操作的共培养方法，添加试剂，共培养5d后，收细胞上清，按照ELISA试剂盒的说明书检测炎性因子。数据表示为Mean±SEM。体外实验至少重复三次。使用GraphPad Prism 5制作结果数据图。*P<0.05，**P<0.01。结果见图4。
实施例9
分析与讨论
本发明提供了一种评价人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)制剂生物学有效性的方法，该方法包括以下三个方面：诱导分化、免疫调控和抗炎作用。具体实施过程如下：
从健康足月分娩新生儿的脐带中分离出UC-MSCs，经过无菌检测，确保无细菌、真菌、支原体等污染。
对UC-MSCs进行表型鉴定，使用流式细胞仪检测第五代UC-MSCs细胞表面抗原的表达情况，结果显示CD105、CD73和CD90表达呈强阳性(>98％)，而CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR表达则呈阴性(<2％)。
对UC-MSCs进行三系分化鉴定，分别诱导UC-MSCs分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞，并通过油红O染色、茜素红染色、阿辛蓝染色等方法观察分化效果，结果显示UC-MSCs具有成脂、成骨、成软骨的分化潜能。
对UC-MSCs进行免疫调控实验，设置三个组别：外周血单个核细胞(PBMCs)单独培养组、植物血凝素(PHA)刺激PBMCs增殖组、PBMCs与UC-MSCs共培养组(PBMCs+PHA+UC-MSCs)。通过流式细胞法检测各组细胞的增殖情况，结果显示UC-MSCs能够抑制PHA刺激的PBMCs的增殖。
对UC-MSCs进行抗炎作用实验，采用ELISA法检测各组培养液中促炎细胞因子TNF-α的含量，结果显示UC-MSCs能够降低PBMCs释放的TNF-α的水平，表现出较好的抗炎作用。
通过以上实验，本发明提供了一组简便有效的综合评价人脐带间充质干细胞制剂生物学特性的方法。
Claims (9)
1.一种综合评价人脐带间充质干细胞制剂生物学特性的方法。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：鉴定干细胞的分化潜能、对免疫细胞的调节能力、分泌特定细胞因子，判断人脐带间充质干细胞制剂的生物学特性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：本发明提供了一组综合评价人脐带间充质干细胞制剂生物学特性的检测方法，该方法基于UC-MSCs和PBMCs的体外直接接触共培养，能够直观地反映UC-MSCs对免疫细胞增殖和炎症因子分泌的调节作用，从而评价UC-MSCs制剂的免疫调节水平。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：本发明采用流式细胞仪检测UC-MSCs对PBMCs增殖的抑制率，该方法具有操作简便、结果客观、灵敏度高等特点，可以快速准确地测定UC-MSCs制剂的免疫抑制能力。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：本发明采用ELISA检测共培养体系中淋巴细胞分泌的炎症因子水平，该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点，可以全面地评价UC-MSCs制剂对免疫细胞功能的影响。
6.根据权利要求2-3所述的应用，其特征在于：UC-MSCs和PBMCs的体外直接接触共培养72小时。
7.根据权利要求4所述的用于评价人脐带间充质干细胞制剂，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞制剂能够降低促炎因子TNF-α的表达水平，表现出较好的抗炎作用。
8.根据权利要求2-6所述的用于评价人脐带间充质干细胞制剂，其特征在于：所述的干细胞制剂为第5代的人脐带间充质干细胞制剂。
9.根据权利要求2-8所述的用于评价人脐带间充质干细胞制剂，其特征在于：提供了一种筛选UC-MSCs制剂生物学有效性的有效手段，为其临床应用提供参考依据，可以提高其在治疗各种免疫相关疾病中的效果。
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