CN115184246A - 一种利用cd155评价间充质干细胞生物学效力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法，使用荧光标记的抗体标记间充质干细胞表面的膜蛋白CD155，并采用流式细胞仪检测细胞CD155的阳性率和平均荧光强度MFI，通过检测间充质干细胞表面CD155的表达水平来评价该间充质干细胞的生物学效力，所述生物学效力是指间充质干细胞的免疫抑制活性，通过间充质干细胞与活化外周血单个核细胞共培养，对外周血单个核细胞分泌IFN‑γ和TNF‑α的抑制能力，本发明不同于以往通过ELISA检测细胞因子或蛋白来评估间充质干细胞生物学效力的方法，本发明通过流式细胞仪检测间充质干细胞表面CD155的表达水平即可快速判断该细胞的生物学效力，简便快捷，具有较好的应用前景，有利于推广应用。

Description

一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法。

背景技术

间充质干细胞是一群具有自我更新、多向分化的异质性的亚全能干细胞。已知的间充质干细胞具有免疫调控、促进血管新生、促进组织损伤修复等作用，其免疫调控主要通过旁分泌和直接接触介导，但具体机制尚不明确。目前已知的间充质干细胞介导免疫调控主要通过旁分泌的细胞因子完成，如PGE2，IDO，IL-10，TGF-beta等，同时其细胞表面的膜蛋白也被报道参与免疫调控过程，如ICAM-1，VCAM-1，TLR3，TLR4，PD-L1和PD-L2等（Mesenchymal stem cell immunomodulation: mechanisms and therapeuticpotential. Trends Pharmacol Sci.2020 Sep;41(9):653-664）。鉴于间充质干细胞的多种生物学功能，其具备药物属性，但由于其介导免疫调控的作用机理非常复杂并且难以确定标准品，而使得其生物效力评价成为其质量控制的难题。目前对于间充质干细胞药物的质量评价方法主要是检测其对活化外周血单个核细胞的增殖抑制和分泌TNF-α的抑制水平，以及对特定淋巴细胞亚群的检测（Th1/Treg/Th17），操作内容复杂且造价很高。考虑到间充质干细胞药物的批量检测的高额成本，企业和学校的科研工作者尝试使用替代性的功能指标来对间充质干细胞的生物学效力进行评估，即用其自身表达的关键的细胞因子或蛋白与其生物学效力建立联系，并以此作为其质量评价的方法。目前已知的用于评价间充质干细胞生物学效力的替代性标志物，包括公开号为CN109576334A的发明专利公开的PGE2，公开号为CN110938668的发明专利公开的TNFRI，公开号为CN102643909B的发明专利公开的Galectin-3等。但细胞因子的ELISA检测存在诸多问题，如细胞培养和细胞因子收集过程需要较长时间，且人为操作较多，步骤繁琐容易污染，细胞因子自身不稳定极容易降解，ELISA试剂盒的批间差异等。根据国际细胞治疗协会的建议，间充质干细胞免疫抑制活性可以作为其生物学效率的检测方法。为了缩短检测时间，减少误差，我们开发了本方法，通过流式细胞仪检测细胞表面的关键膜蛋白CD155来直接判断其生物学效力，方便快捷。

CD155（PVR）是Nectin样分子家族中的第五个成员，起着脊髓灰质炎病毒受体的作用，也被称为necl-5或PVR（脊髓灰质炎病毒受体）。CD155是作为免疫球蛋白样的粘附分子，被报道参与细胞运动、自然杀伤细胞（NK cells）和T细胞介导的免疫(Poliovirusreceptor: More than a simple viral receptor. Virus Res. 2017 Oct 15;242:1-6.)。最新的研究表明，CD155/TIGIT也是一个新的人类癌症的免疫检查点(CD155/TIGIT,anovel immune checkpoint in human cancers (Review). Oncol Rep.2021 Mar;45(3):835-845)。CD155在肿瘤进展过程中被上调，通过作用表达在自然杀伤 （NK）、CD8⁺ T、CD4⁺ T和调节性 T (Treg) 细胞上的抑制性检查点受体TIGIT，抑制T细胞和NK细胞的功能(Tightin cancer immunotherapy. J Immunother Cancer.2020 Sep;8(2):e000957)，促进肿瘤细胞的增殖和迁移(The CD155/TIGIT axis promotes and maintains immune evasionin neoantigen-expressing pancreatic cancer. Cancer Cell. 2021 Oct11;39(10):1342-1360.)。

有意思的是，不同组织来源的间充质干细胞也被报道表达CD155，如骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells of the bone marrow and natural killer cells:cell interactions and cross modulation. J Cell Commun Signal. 2018 Dec;12(4):673-688)，脐带间充质干细胞(Immunological impact of Wharton’s Jelly mesenchymalstromal cells and natural killer cell co-culture. Mol Cell Biochem. 2018 Oct;447(1-2):111-124)，包皮间充质干细胞(Immunomodulatory effects of foreskinmesenchymal stromal cells on natural killer cells. J Cell Physiol. 2018 Jul;233(7):5243-5254)，脂肪间充质干细胞(The impact of cell-expansion andinflammation on the immune-biology of human adipose tissue-derivedmesenchymal stromal cells. J Clin Med. 2020 Mar4;9(3):696.)，但诸多研究主要集中于细胞表型的探索。仅有一篇研究论文表明MSC与IL2/IL15活化的NK细胞共培养时，CD155的表达可被下调，提示可能参与到MSC对NK细胞生物学活性的调控中（Mesenchymalstem cell-natural killer cell interactions: evidence that activated NK cellsare capable of killing MSCs, whereas MSCs can inhibit IL-2-induced NK-cellproliferation. Blood.2006 Feb15;107(4):1484-90）。

基于目前对于CD155在间充质干细胞中的研究及应用并不多，主要集中在间充质干细胞的表型研究上以及间充质干细胞对NK细胞的作用方面，而CD155用于评价间充质干细胞生物学效力尚未有相关报道，且用流式细胞术分析CD155的阳性率（positive rate）和平均荧光强度（MFI）来评估间充质干细胞生物学效力尚未有相关报道。MFI高低代表靶抗原表达丰度的高低，通过流式检测，比常规ELISA检测更方便。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法，不同于以往通过ELISA检测细胞因子或蛋白来评估间充质干细胞生物学效力，本发明通过流式细胞仪检测间充质干细胞表面CD155的表达水平即可快速判断该细胞的生物学效力，简便快捷，具有广阔的应用前景，有利于推广应用。

为了实现上述目的，本发明提供的一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法，使用抗体标记间充质干细胞表面的膜蛋白CD155，并采用流式细胞仪检测细胞CD155的阳性率和平均荧光强度MFI，通过检测间充质干细胞表面CD155的表达水平来评价该间充质干细胞的生物学效力，所述生物学效力是指间充质干细胞的免疫抑制活性，通过间充质干细胞与活化的外周血单个核细胞共培养，对外周血单个核细胞分泌TNF-α和IFN-γ的抑制能力。

优选地，所述间充质干细胞为脐带、骨髓、胎盘或脂肪来源的间充质干细胞。

优选地，所述间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞。

优选地，具体包括如下步骤：

S1：收集待测细胞：消化收集培养的间充质干细胞，细胞计数后转至流式管中；

S2：标记流式抗体：将细胞悬液离心，去掉上清液，向细胞沉淀中分别加入荧光标记的抗体，涡旋混匀后放置于室温避光孵育或4℃冰箱内孵育，加入流式细胞洗液洗掉未结合的抗体，离心后加入流式细胞洗液重悬细胞，利用过滤膜过滤掉细胞团块后等待检测；

S3：流式细胞仪检测：利用流式细胞仪检测间充质干细胞表面CD155的阳性率和MFI；

S4：当间充质干细胞表面CD155的阳性率>90%且CD155 MFI>228时，判定该细胞具有免疫抑制的生物学效力。

优选地，所述S2中，细胞悬液的离心转速为1000-2500 rpm/5-10 min。

优选地，所述S2中，细胞悬液的离心转速为2000rpm/5min。

优选地，所述S2中，流式细胞洗液为添加2% FBS或2%白蛋白的PBS或DPBS。

优选地，所述S2中，清洗抗体后的离心转速为1000-2500 rpm/5-10 min。

优选地，所述S2中，清洗抗体后的离心转速为2000rpm/5min。

优选地，所述S2中，室温避光孵育时间为20-60min，4℃冰箱内孵育时间为30min-60min或过夜。

优选地，所述S2中，4℃冰箱内孵育时间为30min。

本发明提供的一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法，具有如下有益效果。

1．相比于以往收集细胞分泌的上清，再用ELISA方法检测上清中细胞因子的方法，本发明直接消化收集细胞标记CD155抗体就可以进行流式检测获得CD155的阳性率和MFI。本发明省略了细胞培养、收集培养上清、分装冻存再复融、ELISA检测等步骤，避免了因为细胞因子不稳定容易降解的问题，操作步骤更加简便快捷，省时节力，在时间上更加经济高效，同时避免了可能存在的人为污染问题，且膜蛋白指标比细胞因子指标更加稳定，不易降解，容易检测。该方法可以应用在主细胞库、工作细胞库和成品阶段，直接检测抽样的样品，检测结果可以代表样本的真实情况。

2．本发明首次阐明间充质干细胞表面CD155的表达水平在一定范围内与其生物学效力水平（对外周血活化淋巴细胞分泌TNF-α和IFN-γ的抑制水平）呈显著正相关，并首次采用流式细胞术检测CD155阳性率和MFI的方法来评价间充干细胞的生物学效力。

附图说明

图1为对多样本间充质干细胞生物学效力和其基因转录组水平的FPKM值（FPKM即每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片）进行相关性分析图；

图2 为对多样本脐带间充质干细胞进行CD155阳性率和平均荧光强度的流式细胞检测和分析示意图；

图3 为满足优选条件的多样本脐带间充质干细胞生物学效力和CD155表达量的相关性分析示意图（CD155阳性率>90%且CD155 MFI>228时，可以保证该间充质干细胞对活化PBMC分泌IFN-γ和TNF-α的抑制水平均超过70%）。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。

本发明提供的一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法，使用抗体标记间充质干细胞表面的膜蛋白CD155，并采用流式细胞仪检测细胞CD155的阳性率和平均荧光强度MFI，通过检测间充质干细胞表面CD155的表达水平来评价该间充质干细胞的生物学效力，所述生物学效力是指间充质干细胞的免疫抑制活性，通过间充质干细胞与活化的外周血单个核细胞共培养，对外周血单个核细胞分泌IFN-γ和TNF-α的抑制能力。所述间充质干细胞为脐带、骨髓、胎盘或脂肪来源的间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞。

具体包括如下步骤：

S1：收集待测细胞：消化收集培养的间充质干细胞，细胞计数后转至流式管中；

S2：标记流式抗体：将细胞悬液离心，去掉上清液，向细胞沉淀中分别加入PE-IgG和PE-CD155抗体，涡旋混匀后放置于室温避光孵育或4℃冰箱内孵育，加入流式细胞洗液洗掉未结合的抗体，离心后加入流式细胞洗液重悬细胞，利用过滤膜过滤掉细胞团块后等待检测；细胞悬液的离心转速为1000-2500 rpm/5-10 min。优选地，细胞悬液的离心转速为2000rpm/5min。流式细胞洗液为添加2% FBS或2%白蛋白的PBS或DPBS。清洗抗体后的离心转速为1000-2500 rpm/5-10 min。优选地，清洗抗体后的离心转速为2000rpm/5min。室温避光孵育时间为20-60min，4℃冰箱内孵育时间为30min-60min或过夜。优选地，4℃冰箱内孵育时间为30min。

S3：流式细胞仪检测：利用流式细胞仪检测间充质干细胞表面CD155的阳性率和MFI；

S4：当间充质干细胞表面CD155的阳性率>90%且CD155 MFI>228时，判定该细胞具有免疫抑制的生物学效力。

实施例1

对多样本间充质干细胞进行转录组测序及旁分泌生物学效力检测（n=20），具体实施方法为：

（1）准备24h条件培养基（24h-MSC-CM）：按照2.67×10⁴/cm²将细胞种于T75，待细胞贴壁后分别给予不同处理：不刺激组和刺激组（用细胞因子组合刺激24h）。收集培养上清，离心2000 rpm/10 min去掉细胞碎片后，将上清分装后冻存于-80 ℃；

（2）旁分泌效力检测：将制备的条件培养基预先放至4 ℃环境融化。用DF12无酚红完全培养基将外周血淋巴细胞（PBMCs）悬成10⁶/ml的细胞悬液。按照100 μl PBMCs悬液混合100 μl 24h-MSC-CM种于96孔板后混匀放置于二氧化碳培养箱培养24h。取部分未加PHA刺激的PBMC悬液作为阴性对照，剩余PBMC细胞悬液加入一定浓度的PHA刺激使其终浓度为10μg/ml。收取24h培养的上清，按照2000 rpm/10 min离心去掉细胞碎片，将上清分装后冻存于-80 ℃待测。阴性对照组为单纯PBMC未加刺激，阳性对照组为植物凝集素（PHA）刺激的PBMC，实验组为多样本MSC的24h分泌组培养的经PHA活化的PBMC。

（3）用人IFN-γELISA试剂盒检测培养上清中的IFN-γ含量，并根据如下公式计算MSC 24h旁分泌组对PHA活化PBMC分泌IFN-γ的抑制程度，以抑制率（%）表示。

IFN-γ 抑制率（%）=[1- IFN-γ（MSC组）/ IFN-γ（PHA组）]*100%

（4）转录组测序：分别取不刺激组和刺激组约2×10⁶ 的间充质干细胞，用DPBS清洗后，分别用1ml Trizol充分裂解后，冻存并以干冰寄送测序。

（5）对多样本间充质干细胞生物学效力和其基因转录组水平的FPKM值进行相关性分析，分析结果如图1所示。

由图1可知：对多样本间充质干细胞生物学效力和其基因转录组水平的FPKM值进行相关性分析，发现不论在不刺激组还是刺激组，基因CD155的转录组水平的FPKM值均与其旁分泌生物学效力呈显著正相关。该结果从转录水平提示基因CD155是评估间充质干细胞生物学效力的潜在指标。

实施例2

检测来源于不同人的脐带间充质干细胞表面CD155的阳性率及其平均荧光强度水平，具体实施步骤如下：

对多样本间充质干细胞表面CD155的表达水平进行流式细胞检测：

消化收集脐带间充质干细胞，按照2×10⁵细胞/每管转至流式管中，每种细胞准备两管。以2000 rpm/5 min离心后留细胞沉淀，加入流式细胞洗液（DPBS+2% FBS）洗细胞，再次离心后加入PE-IgG抗体和PE-CD155抗体（Biolgend），并涡旋混匀，放置于室温避光孵育20 min或4度冰箱避光孵育30min。加入流式细胞洗液清洗细胞，2000 rpm/5 min离心后加流式细胞洗液重悬后，滤膜过滤细胞团块后，采用流式细胞仪检测CD155的阳性率并计算MFI和二者相关性，结果如图2所示。

由图2可知：对多个不同人来源间充质干细胞的CD155的阳性率和MFI（A）进行流式检测和分析。结果显示不同个体来源脐带间充质干细胞表达CD155水平存在显著个体差异性，CD155的平均阳性率在92.68%±7.2%，CD155的MFI在286.6±92.9 。且对细胞表面CD155的阳性率和MFI进行Spearman相关性分析（B），结果提示二者呈显著正相关（r=0.6961,****p<0.0001）。

实施例3

对满足优选条件的多样本脐带间充质干细胞进行生物学效力评价，并结合其CD155的表达水平进行相关性分析。优选条件为间充质干细胞需满足CD155阳性率>90%且CD155 MFI>228时，具体实施方法为：

（1）对多样本间充质干细胞表面CD155的表达水平进行流式细胞检测：

消化收集脐带间充质干细胞，按照2×10⁵细胞/每管转至流式管中，每种细胞准备两管。以2000 rpm/5 min离心后留细胞沉淀，加入流式细胞洗液（DPBS+2% FBS）洗细胞，再次离心后加入PE-IgG抗体和PE-CD155抗体（Biolgend），并涡旋混匀，放置于室温避光孵育20 min或4度冰箱避光孵育30min。加入流式细胞洗液清洗细胞，2000 rpm/5 min离心后加流式细胞洗液重悬后，滤膜过滤细胞团块后，采用流式细胞仪检测CD155的阳性率和MFI；

（2）对多样本细胞进行生物学效力检测：

共培养实验：消化计数脐带间充质干细胞，用DF12完全培养基（无酚红）将其重悬，按照每孔1×10⁴细胞/100ul 铺96孔板。显微镜观察，轻轻拍动96孔板，使细胞均匀分布后，放置于二氧化碳培养箱培养。用DF12完全培养基（无酚红）重悬新鲜的外周血单个核细胞（PBMCs）。取部分未加刺激的细胞用于阴性对照，剩余细胞加入PHA促使其活化。待4-6小时，间充质干细胞贴壁后，按照每孔1×10⁵细胞/100μl 将PBMCs悬液加入MSCs中，再次混匀。阴性对照组为未活化的PBMC，阳性对照组为PHA活化的PBMC，实验组为间充质干细胞和经PHA活化的PBMC共培养。培养72h后收集上清，并按照2000rpm/10min离心，吸取细胞培养上清，并将上清分装冻存于-80 ℃，准备检测上清中IFN-γ和TNF-α的含量。

用人IFN-γ和TNF-αELISA试剂盒（欣博盛）检测上清中的表达水平并根据如下公式计算抑制率（%）：

IFN-γ抑制率 (%)=[1-IFN-γ（MSC组）/IFN-γ（PHA组）]*100%

TNF-α抑制率 (%)=[1-TNF-α（MSC组）/TNF-α（PHA组）]*100%

（3）对多样本间充质干细胞的CD155表达量与其对活化PBMC分泌IFN-γ和TNF-α的抑制率进行相关性分析，分析结果如图3所示。

由图3可知：对满足优选条件，即CD155阳性率>90%且CD155 MFI>228的多个不同人来源间充质干细胞的CD155的阳性率（A）进行检测并对MFI（B）进行分析。将多个样本间充质干细胞分别与活化PBMC共培养72小时，收集共培养上清检测其中TNF-α 和IFN-γ的含量并计算其对活化PBMC分泌TNF-α（C）和IFN-γ（E）的抑制率。通过对多个样本间充质干细胞CD155MFI和其对活化PBMC分泌IFN-γ和TNF-α的抑制率进行spearman相关性分析后发现，CD155MFI分别与TNF-α抑制率（D）和IFN-γ抑制率（F）呈显著正相关。同时，满足该优选条件的间充质干细胞对活化PBMC分泌TNF-α（C）和IFN-γ（E）的抑制水平超过70%。

本发明是在间充质干细胞基础研究的过程中，通过转录组测序，生物学效力分析以及流式细胞检测偶然发现的。

（1）通过流式细胞术检测多个不同个体来源的脐带间充质干细胞样本，均发现CD155在细胞表面高表达，这与其普遍具备的免疫调节功能相对应；

（2）转录组测序结合生物学效力进行相关性分析，从基因的转录水平发现间充质干细胞基因CD155的转录水平与其生物学效力呈显著正相关。

（3）对多样本的脐带间充质干细胞进行流式检测，结果提示CD155的MFI与其阳性率呈显著正相关。

（4）当CD155阳性率>90%且CD155 MFI>228时，该间充质干细胞与PHA活化PBMC共培养72小时，可以显著抑制其分泌IFN-γ和TNF-α超过70%以上。

本发明首次阐明间充质干细胞表面CD155的表达水平与其生物学效力水平（对外周血活化PBMC分泌IFN-γ和TNF-α的抑制水平）呈显著正相关，并首次采用流式细胞术检测关键膜蛋白CD155的MFI来评价间充干细胞的生物学效力。相比于以往培养细胞，收集培养上清、分装、冻存、融化，再用ELISA方法检测上清中的细胞因子，本发明取新鲜细胞后直接标记抗体检测，省略了收集培养上清、分装、冻存、融化和ELISA检测等多个步骤，直接使用抗体标记细胞表面的膜蛋白CD155后即可采用流式细胞仪检测，操作步骤更加简便快捷，省时节力，在时间上更加经济高效，同时避免了可能存在的人为污染问题，且膜蛋白指标比细胞因子指标更加稳定，不易降解，容易检测。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法，其特征在于，使用荧光标记的抗体标记间充质干细胞表面的膜蛋白CD155，并采用流式细胞仪检测细胞CD155的阳性率和平均荧光强度MFI，通过检测间充质干细胞表面CD155的表达水平来评价该间充质干细胞的生物学效力。

2.根据权利要求1所述的一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带、骨髓、胎盘或脂肪来源的间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1：收集待测细胞：消化收集培养的间充质干细胞，细胞计数后转至流式管中；

S2：标记流式抗体：将细胞悬液离心，去掉上清液，向细胞沉淀中分别加入荧光标记的抗体，涡旋混匀后放置于室温避光孵育或4℃冰箱内孵育，加入流式细胞洗液洗掉未结合的抗体，离心后加入流式细胞洗液重悬细胞，利用过滤膜过滤掉细胞团块后等待检测；

S3：流式细胞仪检测：利用流式细胞仪检测间充质干细胞表面CD155的阳性率和MFI；

S4：当间充质干细胞表面CD155的阳性率>90%且CD155 MFI>228时，判定该细胞具有免疫抑制的生物学效力。

4.一种利用CD155评价间充质干细胞生物学效力的方法，其特征在于，用于细胞库及细胞注射液质量检测标准的制定。

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