CN117122736A - 一种凋亡囊泡自组装改性plga多孔微球复合材料及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学工程技术领域，涉及一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料及其用途。所述的复合材料是由带正电荷的碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球，以及带负电荷的凋亡囊泡通过静电自组装作用形成。利用本发明的凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料及其用途，能够高效负载凋亡囊泡，并且可以在体内长期促进骨再生。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，涉及一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料及其用途。
背景技术
凋亡囊泡(apoptotic vesicles,apoVs)是干细胞凋亡后释放的细胞外囊泡。apoVs继承了亲代干细胞特征的蛋白质、表面受体、mRNA和microRNA等，这使得它不仅发挥了和干细胞相似的治疗效果且不会致瘤。其中，骨髓间充质干细胞来源的apoVs具有调节骨代谢的功能，是一种有潜能的促进颌面部骨再生的生物活性因子。但是，直接植入apoVs等胞外小泡，手术过程中不可避免的产生大量流失，导致植入效率较低。
国内外以apoVs为中心的研究表明，为了负载更多的apoVs，可将apoVs吸附在PLGA等聚合物膜材料上，或者将apoVs直接混合在凝胶中植入骨缺损部位。但是，由于聚合物的疏水性和负电性等，单纯的粘附结合凋亡囊泡的效率很低，而凝胶则在体内降解较快，均不利于骨缺损的修复。这些手段增加了手术时长和感染的风险，也不能获得理想的骨再生效果。
因此，研发一种新型的高效负载apoVs并且可以在体内长期促进骨再生的生物材料，可为临床骨缺损的治疗提供有效的方法，具有深切的社会和医学意义。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，以能够高效负载凋亡囊泡，并且可以在体内长期促进骨再生。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，所述的复合材料是由带正电荷的碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球，以及带负电荷的凋亡囊泡通过静电自组装作用形成。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中未改性的所述的PLGA多孔微球的制备方法包括如下步骤：
(11)在搅拌下，在PLGA溶解后的溶液中加入碳酸氢铵溶液以形成初乳；
(12)在搅拌下，将所述的初乳加入聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌一段时间；
(13)除去上清，得到PLGA多孔微球沉淀。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中：
步骤(11)中，用二氯甲烷溶解PLGA，所述的碳酸氢铵溶液的浓度为0.8-1.5wt％；
步骤(12)中，所述的聚乙烯醇水溶液的浓度为0.08-0.15wt％，所述的继续搅拌的时间为3-4h。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中：
所述的PLGA中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为1:1，所述的PLGA的分子量为3-5万；
所述的制备方法制备得到的未改性的所述的PLGA多孔微球的平均粒径为140-230μm，平均孔径为7-32μm。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中所述的碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球的制备方法包括如下步骤：
(21)将所述的PLGA多孔微球加入丝素蛋白溶液中，混悬一定时间后除去上清，继续搅拌一定时间；
(22)加入无水乙醇，使丝素蛋白改性并包被在所述的PLGA多孔微球形成的支架上；
(23)将丝素蛋白改性的PLGA多孔微球浸泡在氯化锶水溶液中，加入碳酸氢铵水溶液，静置得到碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中所述的碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球的电位在15.0-20.0mV。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中：
步骤(21)中，所述的丝素蛋白溶液的浓度为2-4mg/mL，所述的混悬一定时间为混悬2-4h，所述的继续搅拌的转速为300-500rpm，所述的继续搅拌的时间为1-2h；
步骤(22)中，所述的无水乙醇的滴加速度为25-35mL/h；
步骤(23)中，所述的氯化锶水溶液的浓度为0.08-0.15mol/L，所述的碳酸氢铵水溶液的浓度为0.08-0.15mol/L。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中所述的凋亡囊泡的制备方法包括如下步骤：
(31)在培养了干细胞的培养基中加入诱导剂诱导干细胞凋亡；
(32)诱导凋亡后，提取凋亡的干细胞囊泡。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中：
步骤(31)中，所述的干细胞为人骨髓间充质干细胞，所述的诱导剂为浓度为8-15nM的星形孢菌素，诱导干细胞凋亡的时间为10 -12h；
步骤(32)中，采用差速离心法提取凋亡的干细胞囊泡；
制备所得凋亡囊泡粒径小于1μm，电位在-30.0mV至-40.0mV之间。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中所述的凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料的电位在-8.0mV至-12.0mV之间。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中所述的复合材料在通过静电自组装作用形成后还与光引发剂一起加入到明胶中，在光照下进行固化，以将所述的复合材料包裹在固化的明胶中。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其中：
所述的明胶为氨基取代度为25-35％的甲基丙烯酰化明胶；
所述的光引发剂选自2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦、2-羟基-甲基苯基丙烷-1-酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯中的一种或者多种；
所述的光照的波长为380-420nm；
所述的固化的时间为20-40s。
本发明的第二个目的是提供上述复合材料用作骨缺损的充填材料，或用作需植骨的手术前期的活性修复材料的用途，以能够高效负载凋亡囊泡，并且可以在体内长期促进骨再生。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供上述复合材料用作骨缺损的充填材料，或用作需植骨的手术前期的活性修复材料的用途。
在一种优选的实施方案中，本发明提供上述复合材料用作骨缺损的充填材料，或用作需植骨的手术前期的活性修复材料的用途，其中所述的骨缺损选自上颌骨、下颌骨、颅骨、股骨的不同程度的骨缺损中的一种或者多种；所述的需植骨的手术选自牙种植术和/或颌面部手术。
本发明的有益效果在于，利用本发明的凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料及其用途，能够高效负载凋亡囊泡，并且可以在体内长期促进骨再生。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料由碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球，人骨髓间充质干细胞来源的凋亡囊泡复合而成。PLGA多孔微球易于获取、降解速率可控，且具有高度互联的多孔结构，为组织再生提供了三维空间，是复合材料的基础结构；天然的丝素蛋白改性PLGA多孔微球改变了支架表面的亲水性，中和了PLGA的酸性降解产物，也提供了大量的氨基酸位点，加强了细胞的粘附和增殖；进一步化学沉积碳酸锶，缓释锶离子增强材料的成骨效应，同时改变材料为正电性；人骨髓间充质干细胞apoVs可以调节骨代谢，招募内源干细胞修复骨缺损；通过静电吸引，巧妙的将带负电性的apoVs与支架材料有机结合在一起，形成一种多效应促进成骨的生物活性复合材料。
本发明的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料兼具PLGA多孔微球和凋亡囊泡优点，可以适应任意形状和尺寸的骨缺损，材料降解产物无毒，降解时间可控，可长期有效缓释锶离子，并且可以招募周围干细胞协同修复骨缺损。该凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料应用静电自组装原理，制备过程中减少了各种试剂的使用，绿色环保，有较高的生物安全性，同时具有多重促进骨再生性能。
附图说明
图1为实施例1的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料制备流程图。A图为碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球的制备流程图，B图为人骨髓间充质干细胞来源的凋亡囊泡的制备流程图，C图为明胶中前两者自组装结合形成凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料的示意图。
图2为实施例2的碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球的扫描电镜图及其表征。A、B、C图为扫描电镜图像，D图为能谱分析图像。
图3为实施例2的人骨髓间充质干细胞来源的凋亡囊泡的透射电镜图及其表征。A图为凋亡囊泡的透射电镜图像，B图为凋亡囊泡的粒径分析图。
图4为实施例2的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料的Zeta电位图。
图5为实施例2的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料的锶离子体外释放及累积释放量图像。
图6为实施例2的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料的杨氏模量图。A图为PLGA多孔微球组，B图为丝素蛋白改性的PLGA多孔微球组，C图为碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球组。
图7为实施例3中PLGA粘附凋亡囊泡材料和凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料的扫描电镜图像和免疫荧光染色图像。A、B图为扫描电镜图像，C、D图为免疫荧光染色图像。
图8为大鼠颅骨骨缺损处分别植入实施例1的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料，实施例3的PLGA粘附凋亡囊泡材料和明胶8周后，骨再生的锥形束CT图像，左侧为明胶对照组，中间为PLGA粘附凋亡囊泡材料对照组，右侧为实验组。A、B、C图为颅骨缺损区域的锥形束CT矢状面图像，D、E、F图为锥形束CT冠状面三维重建图像。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
实施例1：凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料的制备
如图1的制备流程所示，一种凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料，由碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球，静电自组装人骨髓间充质干细胞来源的凋亡囊泡复合而成。其中锶离子的浓度为10mM，丝素蛋白的浓度为3mg/mL，PLGA多孔微球的平均粒径为170μm和平均孔径为16μm，凋亡囊泡的浓度为200ng/mL。制得的复合材料还与光引发剂一起加入到氨基取代度为30％的甲基丙烯酰化明胶中，在光照下进行固化，以将复合材料包裹在固化的明胶中。
如图1A中所示，通过复乳-溶剂挥发法制备PLGA多孔微球，滴加无水乙醇将丝素蛋白沉积在PLGA多孔微球表面，得到丝素蛋白改性的PLGA多孔微球。进一步，通过化学置换反正，将碳酸锶沉积在丝素蛋白改性的PLGA多孔微球上，得到双重改性的PLGA多孔微球。取样品，Zeta电位测试为18.0mV，显示正电性。
具体制备过程为：
1)用8mL二氯甲烷充分溶解200mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(其分子量为5万，其中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为1:1)；
2)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液高速匀浆状态下，滴入2.5mL 1wt％的碳酸氢铵，形成初乳；
3)将初乳缓慢倒入200mL 0.1wt％的聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌3-4h；
4)静置后去掉上清液，得到PLGA多孔微球沉淀；
5)把PLGA多孔微球加入3mg/mL的丝素蛋白溶液中，常温混悬2-4h；
6)静置去上清液，加入磁子，400rpm搅拌1-2h；
7)以30mL/h的速率滴加无水乙醇，使丝素蛋白改性并包被在PLGA多孔微球支架上；
8)冻干得到丝素蛋白改性的PLGA多孔微球；
9)把丝素蛋白改性的PLGA多孔微球浸泡在浓度为0.1M的六水合氯化锶水溶液中，加入浓度为0.1M的碳酸氢铵水溶液，静置得到双重改性的PLGA多孔微球。
凋亡囊泡的制备如图1B中所示，在人骨髓间充质干细胞培养皿中加入10nM星形孢菌素，诱导10-12小时，使人骨髓间充质干细胞凋亡后，收集培养皿中的上清液。在800g，4℃条件下，离心10min，收集上清液；将收集的上清液于2000g，4℃条件下，离心10min，再次收集上清液；将第二次收集的上清液于16000g，4℃条件下，离心30min，收集沉淀。将最后收集的沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后，再次在16000g，4℃条件下，离心30min，重复磷酸盐缓冲液洗涤和离心操作一次，得到人骨髓间充质干细胞来源的凋亡囊泡。取样品，Zeta电位测试为-34.0mV，显示负电性。
如图1C所示，带正电的双重改性的PLGA多孔微球与带负电的人骨髓间充质干细胞来源的凋亡囊泡通过静电相互作用，自组装形成凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料。取样品，Zeta电位测试为-10.2mV。制得的复合材料还与光引发剂2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦一起加入到氨基取代度为30％的甲基丙烯酰化明胶中，在光照下(405nm)进行固化30s，以将复合材料包裹在固化的明胶中。
实施例2：凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料的表征
如图2所示，图2A展示了大小相对均一的实施例1所得碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球，与实施例1所得未改性的所述PLGA多孔微球的尺寸基本一致。图2B展示实施例1所得碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球具有高度互联的多孔结构。图2C可以看出，实施例1所得碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球支架表面粗糙，且有明显的颗粒状沉积物。进一步用能谱对其进行元素分析，如图2D，可以看出图中有蛋白质特征的氮元素，以及锶元素，证实碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球制备成功。
如图3所示，图3A为通过透射电镜观察人骨髓间充质来源的凋亡囊泡的形态与大小，可以看出其分散性较好，且具有双层膜状结构。使用纳米颗粒跟踪分析其粒径，如图3B所示，实施例1中所述方法提取的人骨髓间充质来源的凋亡囊泡，其粒径约均小于1μm，大多集中在119nm。
如图4所示，实施例1中所述方法提取的人骨髓间充质来源的凋亡囊泡，检测其Zeta电位约为-34.0mV，显示负电性；碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球，检测其Zeta电位约为18.0mV，显示正电性，证实两者可以通过静电自组装的方法高效结合在一起，形成实施例1中所述的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料。进一步测该复合材料的电位在-10.2mV，相较其余各组，该复合材料电位最接近电中性，可以更加稳定的发挥其骨修复作用。
如图5所示，利用实施例1中所述方法，将合成的碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球浸泡在磷酸盐缓冲液中，通过电感耦合等离子光谱仪检测其锶离子的释放效果。结果证实，该材料可以实现锶离子在磷酸盐缓冲液中长达90天的体外缓慢释放，说明该材料植入体内后，不会快速降解，并且可以缓慢释放锶离子，长期有效刺激体内干细胞成骨分化，满足体内成骨的时间要求。
如图6所示，图6A为PLGA多孔微球的杨氏模量，最大为1.2GPa；图6B为丝素蛋白改性的PLGA多孔微球的杨氏模量，最大为657.9MPa，这是由于PLGA多孔微球支架表面沉积了一层丝素蛋白，改变了材料本身的粘附性和力学性质；图6C为碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球的杨氏模量，最大达到了5.6GPa，说明进一步沉积碳酸锶后，明显增加了PLGA多孔微球支架的力学强度，使其更接近人体骨组织的力学强度，植入体内后更有利于骨组织的修复再生。通过图2-6的表征，具体的说明了实施例1中所述凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料具有优越的促进骨再生的潜能。
实施例3：PLGA粘附凋亡囊泡材料与凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料的对照研究
分别将10μL浓度为200ng/mL的凋亡囊泡加入单纯PLGA材料，和实施例1所述的双重改性PLGA材料中，制样，通过扫描电镜和免疫荧光染色分别检测两种材料负载囊泡的数量和水平。
如图7所示，7A、7B图为两种材料分别负载凋亡囊泡后的扫描电镜图像，图中箭头标识凋亡囊泡。相较图7A，可以看出图7B中有更多的凋亡囊泡粘附在材料表面。7C、7D图为两种材料分别负载凋亡囊泡后的免疫荧光染色图像，其中红色荧光(亮点)标记为凋亡囊泡。相较图7C，图7D显示有分布较为均匀且数量更多凋亡囊泡。
通过实施例3，具体的说明了与单纯PLGA材料对照，实施例1中所述的双重改性的PLGA材料可以吸引更多的凋亡囊泡，具有更强的负载凋亡囊泡的功能。
实施例4：凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料的应用
将实施例1所得的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料样品用于大鼠颅骨缺损的骨再生实验。
选取8周龄健康雄性SD大鼠12只，随机分为3组，每组4只。所有大鼠均于SPF级实验室饲养，自由饮水，定时、定量摄食，采取术前适应性喂养1周。实验动物腹腔注射麻醉，消毒，备皮，切开皮肤，分离筋膜，暴露颅骨，用骨钻在颅骨上制备直径为5mm的圆形骨缺损。
对照组1实验动物，骨缺损处加入明胶；对照组2实验动物，骨缺损处加入实施例3的PLGA粘附凋亡囊泡材料；实验组实验动物，骨缺损处加入实施例1所得的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料。三组材料分别填满圆形骨缺损，光固化后，逐层对位缝合，消毒，随时观察实验动物体征。植入材料8周后，处死并对大鼠颅骨取材。
实验结果：如图8所示，明胶对照组和PLGA粘附凋亡囊泡材料对照组，从矢状面(图8A、图8B)观察骨再生效果均不明显，从冠状面(图8D、图8E)观察，仍可见大面积骨缺损；实验组，从矢状面(图8C)观察新生骨几乎与缺损边缘相连接，从冠状面(图8F)观察，形成大面积新骨组织。由此证明实施例1所得的凋亡囊泡自组装双重改性的PLGA多孔微球复合材料有显著的骨再生效果。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种凋亡囊泡自组装改性PLGA多孔微球复合材料，其特征在于：所述的复合材料是由带正电荷的碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球，以及带负电荷的凋亡囊泡通过静电自组装作用形成。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，未改性的所述的PLGA多孔微球的制备方法包括如下步骤：
(11)在搅拌下，在PLGA溶解后的溶液中加入碳酸氢铵溶液以形成初乳；
(12)在搅拌下，将所述的初乳加入聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌一段时间；
(13)除去上清，得到PLGA多孔微球沉淀。
3.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于：
步骤(11)中，用二氯甲烷溶解PLGA，所述的碳酸氢铵溶液的浓度为0.8-1.5wt％；
步骤(12)中，所述的聚乙烯醇水溶液的浓度为0.08-0.15wt％，所述的继续搅拌的时间为3-4h。
4.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于：
所述的PLGA中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为1:1，所述的PLGA的分子量为3-5万；
所述的制备方法制备得到的未改性的所述的PLGA多孔微球的平均粒径为140-230μm，平均孔径为7-32μm。
5.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述的碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球的制备方法包括如下步骤：
(21)将所述的PLGA多孔微球加入丝素蛋白溶液中，混悬一定时间后除去上清，继续搅拌一定时间；
(22)加入无水乙醇，使丝素蛋白改性并包被在所述的PLGA多孔微球形成的支架上；
(23)将丝素蛋白改性的PLGA多孔微球浸泡在氯化锶水溶液中，加入碳酸氢铵水溶液，静置得到碳酸锶和丝素蛋白双重改性的PLGA多孔微球。
6.根据权利要求5所述的复合材料，其特征在于：
步骤(21)中，所述的丝素蛋白溶液的浓度为2-4mg/mL，所述的混悬一定时间为混悬2-4h，所述的继续搅拌的转速为300-500rpm，所述的继续搅拌的时间为1-2h；
步骤(22)中，所述的无水乙醇的滴加速度为25-35mL/h；
步骤(23)中，所述的氯化锶水溶液的浓度为0.08-0.15mol/L，所述的碳酸氢铵水溶液的浓度为0.08-0.15mol/L。
7.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述的凋亡囊泡的制备方法包括如下步骤：
(31)在培养了干细胞的培养基中加入诱导剂诱导干细胞凋亡；
(32)诱导凋亡后，提取凋亡的干细胞囊泡。
8.根据权利要求7所述的复合材料，其特征在于：
步骤(31)中，所述的干细胞为人骨髓间充质干细胞，所述的诱导剂为浓度为8-15nM的星形孢菌素，诱导干细胞凋亡的时间为10-12h；
步骤(32)中，采用差速离心法提取凋亡的干细胞囊泡。
9.根据权利要求1-8之一所述的复合材料，其特征在于：所述的复合材料在通过静电自组装作用形成后还与光引发剂一起加入到明胶中，在光照下进行固化，以将所述的复合材料包裹在固化的明胶中。
10.根据权利要求1-9之一所述的复合材料用作骨缺损的充填材料，或用作需植骨的手术前期的活性修复材料的用途。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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