CN111529504A - 功能性嵌合凋亡小体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

提供一种功能性嵌合凋亡小体，所述功能性嵌合凋亡小体包含凋亡小体膜和包裹于所述凋亡小体膜中的介孔二氧化硅纳米粒子，所述凋亡小体膜为来源于免疫细胞的凋亡小体膜，所述介孔二氧化硅纳米粒子负载有MicroRNA‑21。为构建具有靶向运载功能和精确药物释放功能的特异性治疗产品提供有效的手段。

Description

功能性嵌合凋亡小体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种功能性嵌合凋亡小体及其制备方法和应用。

背景技术

细胞外囊泡（Extracellular vesicles ，EVs）是细胞间通讯中传递信号转导分子的载体，可携带核酸、蛋白质、脂类等多种功能分子发挥作用。同时，天然膜赋予细胞外囊泡免疫原性低、同源靶向性强、循环时间长、生物屏障可达等诸多优点，是人工材料无法比拟的。受这些卓越性能的启发，细胞外囊泡被视为新一代的交付系统。制备具有多种生物活性分子或靶向配体修饰的工程化细胞外囊泡，在理想位点产生治疗效果，成为疾病治疗的一种有吸引力的策略。

凋亡小体(Apoptotic bodies，ABs)是由凋亡细胞分泌的一种细胞外囊泡，由细胞膜向外起泡产生。有确凿的证据表明，吞噬凋亡细胞可以调节免疫应答的抗炎方向。类似的结果也只反映在凋亡细胞/囊泡膜的吞噬，这可能与表面的磷脂酰丝氨酸密切相关。

工程化细胞外囊泡的制备采用了多种治疗性分子加载方法，主要包括电穿孔法、预络合法、胞外囊泡分离前亲代细胞转染法、皂素渗透法和超声法。然而，现有的方法在以下方面仍有相当大的局限性，比如，无法去除与治疗目的无关的残留成分，可能导致潜在的威胁；现有方法中在表面生化偶联各种功能分子可能会破坏细胞外囊泡的靶向性结构和功能；缺乏智能性的胞内控制开关，保证工程化细胞外囊泡运载的功能性治疗分子准确有效的释放。

溃疡性结肠炎是一种病因和发病机制尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性病因，发病率在我国逐年上升，其发病机制并不明确。其病变部位主要局限于结肠黏膜和黏膜下层，发病时结肠黏膜充血、水肿，呈弥漫性炎症反应，现有的治疗手段很难将溃疡性结肠炎完全根除。溃疡性结肠炎反复发作和难以治愈一方面影响了患者的生活质量，另一方面还增加了癌变的可能，严重威胁到患者的生命健康。针对溃疡性结肠炎的治疗也缺乏特异性方法，成为近些年消化领域的热点。目前可用的治疗方法是减少炎症、减轻症状，并在最好的情况下导致长期缓解。然而，长期使用这些药物会带来多种副作用，如感染、肾脏或肝脏损害。

同时，传统和现有的治疗皮肤损伤和溃疡性结肠炎的药物不仅对其他组织器官有副作用而且治疗效果欠佳，需要一种有特定治疗功能的药物来代替以达到更好的效果且减轻或消除药物本身带来的副作用。因此，需要合适的具有天然生物功能和靶向性的原始细胞外囊泡以及新颖的制造策略来解决这些问题。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种功能性嵌合凋亡小体及其制备方法和应用，为构建具有靶向运载功能和精确药物释放功能的特异性治疗产品提供有效的手段。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一方面，提供一种功能性嵌合凋亡小体，所述功能性嵌合凋亡小体包含凋亡小体膜和包裹于所述凋亡小体膜中的介孔二氧化硅纳米粒子，所述凋亡小体膜为来源于免疫细胞的凋亡小体膜，所述介孔二氧化硅纳米粒子负载有MicroRNA-21。

优选地，所述免疫细胞选自淋巴细胞，所述淋巴细胞选自T细胞、B淋巴细胞或NK淋巴细胞。

优选地，所述MicroRNA-21通过静电作用负载在所述介孔二氧化硅纳米粒子上。

优选地，所述MicroRNA-21通过靶细胞内多肽的作用可响应性释放于靶细胞内。

优选地，所述MicroRNA-21上标记有Cy5。以便于通过检测荧光强度来进行跟踪检测。

优选地，所述MicroRNA-21通过靶细胞胞浆中的谷胱甘肽破坏二硫键导致MicroRNA-21释放于靶细胞内。

MicroRNA-21是免疫调节的非编码微小RNA之一，MicroRNA-21通过调节巨噬细胞表型在炎症消退中起着重要作用，因此，选择MicroRNA-21作为模型药物，通过该靶向响应性释放系统构建的模块化系统实现了MicroRNA-21的有效传递。

另一方面，提供上述的功能性嵌合凋亡小体的制备方法，包括以下步骤：

1）负载MicroRNA-21的介孔二氧化硅纳米粒子制备：将介孔二氧化硅纳米粒子和3-巯基丙基三甲氧基硅烷加入乙醇溶液中，超声混合10min后，在60℃、氮气条件下搅拌8-14小时，然后加入2,2'-二硫基联吡啶和2-二甲胺基乙硫醇，继续反应10-12h，获得反应产物；反应产物使用乙醇清洗数次后离心获得沉淀，将所述沉淀在真空下干燥，获得活化的介孔二氧化硅纳米粒子，将0.06mg 活化的介孔二氧化硅纳米粒子和15nmol MicroRNA-21加入无酶水中，在4℃条件下吹打混匀，离心后弃去上清液，即得负载MicroRNA-21的介孔二氧化硅纳米粒子；

2）功能性嵌合凋亡小体的制备：将负载MicroRNA-21的介孔二氧化硅纳米粒子与凋亡小体膜混合，然后间歇性地超声2min，在5000g条件下离心10min，取沉淀即获得功能性嵌合凋亡小体，重悬于水中4℃储存。

优选地，步骤2）中，所述活化的介孔二氧化硅纳米粒子和凋亡小体膜的质量比为1:2。

优选地，所述凋亡小体膜由以下方法制备而成：将-80℃保存的凋亡小体解冻，在1000g条件下离心10min进行沉淀，重悬于低渗裂解液中，4℃下低渗处理1h，然后低功率超声5s，在100g条件下离心10min除去碎屑后，再在10000g条件下离心10 min取沉淀，然后用水洗涤，直至囊泡内的成分去除为止，将收集的凋亡小体膜重悬在水中，4℃保存备用。

优选地，所述低渗裂解液的组分为：10mM 三羟甲基氨基甲烷、10 mM MgCl₂和1mM苯甲基磺酰氟。

再一方面，提供上述的功能性嵌合凋亡小体在制备治疗炎症疾病产品中的用途。

优选地，所述炎症疾病包括皮肤炎症、结肠炎、肺炎、肝炎或肾炎。

进一步地，提供一种用于治疗炎症疾病的药物，所述药物包含上述的功能性嵌合凋亡小体和药学上可接受的载体。

优选地，所述药学上可接受的载体选自水、PBS缓冲液或者生理盐水。

术语解释：

凋亡小体膜：是指将凋亡小体中的内容物去除掉以后，获得的一种囊泡膜。

介孔二氧化硅纳米粒子：是指以二氧化硅为原料制备的具有较大比表面积和吸附容量的纳米级微型颗粒。

T细胞：即T淋巴细胞。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明所述功能性嵌合凋亡小体利用T 细胞的潜在炎症靶向作用和来源于T细胞的凋亡小体膜的炎症调节特性，将来源于T细胞的凋亡小体膜与介孔纳米粒子传递系统融合，构建了可以靶向传递MicroRNA-21的功能性嵌合凋亡小体，所述功能性嵌合凋亡小体去除了凋亡小体中的包内成分，同时保持了凋亡小体膜的靶向性和炎症调节特性，能够在靶细胞中准确释放MicroRNA-21，避免了负载microRNA-21的功能性嵌合凋亡小体发生脱靶效应或者MicroRNA-21泄露，同时构建的功能性嵌合凋亡小体继承了天然凋亡小体膜的优势，能够主动靶向到炎症部位和巨噬细胞，解决了传统药物治疗效果欠佳，对其他组织器官副作用大的问题；并解决了使用普通的凋亡小体膜构建的功能性嵌合凋亡小体在受体细胞内启动下游的信号传导后，受体细胞内的内溶酶体系统对内化的功能性嵌合凋亡小体的内吞和处置会极大地降低功能性嵌合凋亡小体所装载microRNA-21的利用效率的问题，极大的提高了microRNA-21在受体细胞内的传递效率和利用率。

此外，凋亡小体膜与介孔纳米粒子传递在融合之前，通过静电作用将介孔纳米粒子预加载microRNA-21，并与各种刺激响应分子进一步修饰，通过细胞内谷胱甘肽破坏二硫键使microRNA-21在细胞内响应性释放，从而保证microRNA-21能够准确释放于靶细胞内，有效调控巨噬细胞表型，以改善炎症。

进一步地，为制造具有模块化设计和特定治疗功能的标准化工程细胞外囊泡提供了有效的策略。在不改变本发明构思的情况下，根据本发明设计的介孔纳米粒子负载活性物质并在靶细胞内响应性的释放的基本原理，可以针对不同负载物质设计不同的负载方法和不同功能的功能性嵌合凋亡小体。

使用本发明提供的功能性嵌合凋亡小体的制备方法制备得到的功能性嵌合凋亡小体去除了凋亡小体中的包内成分，同时保持了凋亡小体膜的靶向性和炎症调节特性，能够在靶细胞中准确释放MicroRNA-21，避免了负载microRNA-21的功能性嵌合凋亡小体发生脱靶效应或者MicroRNA-21泄露，同时构建的功能性嵌合凋亡小体继承了天然凋亡小体膜的优势，能够主动靶向到炎症部位和巨噬细胞。

通过实施例中的实验数据可以证明本发明提供的功能性嵌合凋亡小体可以用于制备治疗炎症疾病的药物，尤其是可以用于制备治疗皮肤炎症、结肠炎、肺炎、肝炎或肾炎的药物。

附图说明

图1显示了嵌合凋亡小体在透射电子显微镜下的核-壳结构；

图2A 为嵌合凋亡小体和介孔二氧化硅纳米粒子分别在水中和PBS中的稳定性检测结果统计图；

图2B显示了嵌合凋亡小体冻干前和冻干重悬后的稳定性检测结果；

图2C显示了嵌合凋亡小体和介孔二氧化硅纳米粒子在血清中的稳定性检测结果；

图3A显示了实施例7中PBS组（对照组）的巨噬细胞标志物F4/80染色图；

图3B显示了实施例7中PBS组（对照组）的PKH26/RhB染色图；

图3C显示了实施例7中PBS组（对照组）的Hoechst染色图；

图3D显示了实施例7中PBS组（对照组）的Merge图；

图3E显示了实施例7中凋亡小体膜组的巨噬细胞标志物F4/80染色图；

图3F显示了实施例7中凋亡小体膜组的PKH26标记的凋亡小体膜染色图；

图3G显示了实施例7中凋亡小体膜组的Hoechst染色图；

图3H显示了实施例7中凋亡小体膜组的Merge图；

图3I显示了实施例7中介孔二氧化硅纳米粒子组的巨噬细胞标志物F4/80染色图；

图3J显示了实施例7中介孔二氧化硅纳米粒子组的RhB标记的介孔二氧化硅纳米粒子染色图；

图3K显示了实施例7中介孔二氧化硅纳米粒子组的Hoechst染色图；

图3L显示了实施例7中介孔二氧化硅纳米粒子组的Merge图；

图3M显示了实施例7中嵌合凋亡小体组的巨噬细胞标志物F4/80的染色图；

图3N显示了实施例7中嵌合凋亡小体组的RhB标记的嵌合凋亡小体的染色图；

图3O显示了实施例7中嵌合凋亡小体组的Hoechst染色图；

图3P显示了实施例7中嵌合凋亡小体组的Merge图；

图4A为实施例8中TNF-α的检测结果；

图4B为实施例8中IL-6的检测结果；

图4C为实施例8中TGF-β的检测结果；

图4D为实施例8中IL-10的检测结果；

图5为实施例9中谷胱甘肽触发释放MicroRNA-21的检测结果；

图6为实施例10中酯酶降解聚二甲基丙烯酸甘油酯以启动姜黄素的释放曲线；

图7为实施例12中皮肤炎症损伤模型损伤部位的生物分布检测结果；

图8为皮肤炎症损伤模型伤口愈合检测结果；

图9A-9E分别为正常皮肤组、PBS组、cABs组、cABs^MicroRNA-21组和cABs^Cur组皮肤损伤部位的HE染色结果；

图10为实施例15中不同给药组溃疡性结肠炎模型损伤部位的生物分布；

图11A为实施例16不同给药组小鼠体重的监测结果；

图11B为实施例16中不同给药组结肠长度检测结果；

图12A-12E 分别为正常组、PBS组、cABs组、cABs^MicroRNA-21组和cABs^Cur结肠组织的HE染色结果。

具体实施例

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1 负载有MicroRNA-21的靶向响应性释放系统

提供一种靶向响应性释放系统，所述靶向响应性释放系统包含嵌合凋亡小体，所述嵌合凋亡小体包含凋亡小体膜和包裹于所述凋亡小体膜中的介孔二氧化硅纳米粒子，所述凋亡小体膜为来源于T细胞的凋亡小体膜，所述介孔二氧化硅纳米粒子负载有MicroRNA-21。在一些实施例中，MicroRNA-21通过静电作用或物理吸附作用负载在所述介孔纳米粒子上。在一些实施例中，MicroRNA-21通过靶细胞胞浆中的谷胱甘肽破坏二硫键导致MicroRNA-21释放于靶细胞内。在一个优选实施例中，所述MicroRNA-21上标记有Cy5。

实施例2 负载有姜黄素的靶向响应性释放系统

提供一种靶向响应性释放系统，所述靶向响应性释放系统包含嵌合凋亡小体，所述嵌合凋亡小体包含凋亡小体膜和包裹于所述凋亡小体膜中的介孔二氧化硅纳米粒子，所述凋亡小体膜为来源于T细胞的凋亡小体膜，所述介孔二氧化硅纳米粒子负载有姜黄素。

在一些实施例中，所述姜黄素通过物理吸附作用负载在介孔二氧化硅纳米粒子的孔隙中后，所述介孔二氧化硅纳米粒子用聚二甲基丙烯酸甘油酯包封。

在一些实施例中，所述姜黄素通过靶细胞内的酶降解所述聚二甲基丙烯酸甘油酯，从而响应性释放于靶细胞内。

实施例3：凋亡小体膜的制备

1.T细胞分离、活化及鉴定

原代T细胞来源于C57BL/6小鼠脾细胞并且用含20% FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基培养。首先，接种2μg /ml CD3ε抗体在6孔板中，37℃培养4 h。分离取出小鼠脾脏，用无菌注射器柄充分研磨脾脏，过滤形成细胞悬液，加入无菌红细胞裂解液轻柔充分吹打混匀，于冰上裂解10min，裂解结束后进行细胞离心，再用培养基重悬细胞。然后将细胞悬液用100μm滤器过滤除去细胞团块，加入2μg /mlCD28抗体后再接种到预包被CD3ε抗体的6孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24-72h后T细胞被激活，然后将1μg /ml脂多糖加入到培养体系中作用12 h刺激T细胞。在倒置显微镜下观察T细胞激活前后的形态变化。

2.巨噬细胞分离及鉴定

原代巨噬细胞来源于C57BL/6小鼠的骨髓单核细胞，其培养在含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基中。具体而言，小鼠脱颈处死之后浸泡在75%乙醇溶液中消毒，使用无菌的剪刀、镊子沿小鼠后肢剪开皮肤，分离取出股骨和胫骨，在冰PBS中剥离干净表面附着的软组织，减去骨两侧的骨骺端，用PBS冲洗骨髓，收集悬液充分吹打形成单细胞悬液，加入红细胞裂解液裂解2-3min后，在800rpm条件下离心5min收集细胞，完全培养基重悬细胞接种在6孔板中，以20ng/ml的浓度加入重组鼠巨噬细胞集落刺激因子诱导细胞分化，诱导7天后成为成熟巨噬细胞，备用。

3.凋亡小体的分离及鉴定

用0.5μM星孢菌素处理T 细胞3-4h，诱导T 细胞凋亡，收集细胞上清液，50g离心5 min，去除细胞和碎片，重复上述步骤两次，将上清液1000g离心10min，收集沉淀即凋亡小体，PBS清洗2-3次后重悬，用BCA蛋白检测试剂盒测定凋亡小体的蛋白浓度，而后-80℃保存备用。

4.凋亡小体膜的制备

将-80℃保存的凋亡小体解冻，在1000g条件下离心10min，取沉淀重悬于低渗裂解液中，4℃下低渗处理1h，然后低功率超声5s，在100g条件下离心10min除去碎屑后，再在10000g条件下离心10 min取沉淀，然后用水洗涤至少3次，直至囊泡内的成分去除为止，将收集的凋亡小体膜重悬在水中，4℃保存备用。上述低渗裂解液的组分为：10mM 三羟甲基氨基甲烷，10 mM MgCl₂和1mM 苯甲基磺酰氟。

实施例4 介孔二氧化硅纳米粒子的制备

介孔二氧化硅纳米粒子由以下方法制备而成：用52.8 mL氨水溶液将1000 mL去离子水的pH值调节至11，加热至50℃时，加入1.12 g 十六烷基三甲基溴化铵，待其完全溶解后，快速搅拌下逐滴添加5.8 mL 正硅酸乙酯，2h后，将混合物室温静置过夜，然后离心并用蒸馏水和乙醇彻底洗涤收集产物；在70°C下使用酸性甲醇萃取来去除表面活性剂，将其进一步离心收集沉淀，用乙醇洗涤数次，并在真空下干燥20h，即可获得粒径分布较均匀的介孔二氧化硅纳米粒子。

实施例5：嵌合凋亡小体的构建

为了确保将凋亡小体膜完全覆盖在介孔二氧化硅纳米粒子表面，将1mg介孔二氧化硅纳米粒子与2mg凋亡小体膜混合，然后把混合液在超声仪中间歇性地超声2min，处理后的悬液在5000g条件下离心10min取沉淀即嵌合凋亡小体，重悬于水中4℃储存。

用透射电子显微镜确定嵌合凋亡小体的形态。将4ul浓度为1mg / ml的嵌合凋亡小体溶液置于碳涂层400平方目铜网格上进行沉积处理，沉积10min后，用去离子水水冲洗铜网，然后使用1％磷钨酸负染30秒，去离子水冲洗铜网后自然干燥，使用透射电镜进行观察。检测结果如图1所示，图1为透射电子显微镜图像直接显示了嵌合凋亡小体的核-壳结构。

实施例6：嵌合凋亡小体的稳定性检测

对于短期存储稳定性，我们将介孔二氧化硅纳米粒子和嵌合凋亡小体分别重悬于水和PBS中，利用DLS检测纳米微球在不同介质中的尺寸大小，持续1周。检测结果如图2A所示，结果显示，嵌合凋亡小体在两种溶液中均显示7天内大小均匀。而介孔二氧化硅纳米粒子仅在水中稳定，其在PBS中聚集成1〜2μm大小。

为了评估长期储存稳定性，我们检测了冻干前和重悬后的嵌合凋亡小体的大小。检测结果如图2B所示，结果显示，冷冻干燥前和重悬后的嵌合凋亡小体尺寸几乎相同。

为了评估血清稳定性，我们将嵌合凋亡小体以0.1 mg / ml的浓度悬浮在100％血清中进行血清稳定性检测，水作为对照组。使用分光光度计检测在重悬于血清后，在560 nm检测不同时间点（1min、5min、10min、15min、30min、60min、90min）的吸光度。吸光度的变化是由于纳米粒子在血清中的稳定性较差而造成的。检测结果如图2C所示，在100％血清中重悬后，嵌合凋亡小体的吸光度变化很小，而介孔二氧化硅纳米粒子有明显的增加。

实施例7：巨噬细胞对cABs的体外吞噬能力检测

为了验证巨噬细胞对嵌合凋亡小体的特异性吞噬能力，将浓度为50μg/ ml PKH26标记的凋亡小体膜、RhB标记的介孔二氧化硅纳米粒子和RhB标记的嵌合凋亡小体加入巨噬细胞中处理3h，以PBS为对照。然后将细胞用4％PFA固定过夜，然后在37℃条件下用山羊血清封闭30min。最后使用F4 / 80抗体和FITC标记二抗室温孵育1h后，用Hoechst 33342对核进行复染后，通过CLSM观察荧光成像。检测结果如图3所示，与对照组和介孔二氧化硅纳米粒子组相比，凋亡小体膜和嵌合凋亡小体组均中存在明显的红色荧光信号，该结果表明巨噬细胞对嵌合凋亡小体的特异性吞噬作用与凋亡小体膜是相同的。

实施例8：凋亡小体膜的免疫调节作用

为了探索由凋亡小体膜介导的免疫调节作用，用浓度为1μg/ ml 的脂多糖（LPS）处理巨噬细胞来诱导炎性巨噬细胞在体外模拟炎症。同时，将浓度为25μg/ ml的凋亡小体膜、介孔二氧化硅纳米粒子和嵌合凋亡小体添加至培养系统中，同时未刺激的巨噬细胞和PBS组作为对照。24h后，收集培养细胞的上清液在-80℃保存直至检测细胞因子水平。使用ELISA试剂盒根据说明检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-6、转化生长因子（TGF-β）、IL-10的水平。促炎细胞因子：TNF-α、IL-6；抗炎细胞因子：TGF-β、IL-10。检测结果如图4A到图4D所示：图4A为TNF-α的检测结果；图4B为IL-6的检测结果；图4C为TGF-β的检测结果；图4D为IL-10的检测结果。结果表明，LPS的刺激显著的促进了TNF-α和IL-6的释放，其水平远高于未刺激的对照组；凋亡小体膜的加入抑制了炎症爆发，并促进了TGF-β和IL-10的分泌，同样的嵌合凋亡小体组中也发现相同的结果，这意味着嵌合凋亡小体的处理使得炎症得到了缓解。

实施例9：负载有MicroRNA-21的靶向响应性释放系统的构建

MicroRNA-21通过静电相互作用负载在介孔二氧化硅纳米粒子上。具体地，取50mg 介孔二氧化硅纳米粒子和200ul 3-巯基丙基三甲氧基硅烷混悬在20ml乙醇溶液中，在100W超声10min促进完全分散。混悬液将在60℃、氮气条件下过夜搅拌。随后，将225mg 2,2'-二硫基联吡啶和145mg 2-二甲胺基乙硫醇加入上述溶液继续反应12h。反应产物使用乙醇清洗数次后离心获得沉淀，在真空下干燥得到接枝有二甲胺的介孔二氧化硅纳米粒子（简写为：MSN+）。接下来，将0.06mg MSN+ 和15nmol MicroRNA-21混匀在60ul无酶水中在4℃条件下吹打混匀1h。反应产物使用无酶水清洗数次后离心获得负载MicroRNA-21的介孔二氧化硅纳米粒子 （简写为：MSN^MicroRNA-21）。同样的步骤合成负载Cy5标记的MicroRNA-21的介孔二氧化硅纳米粒子（简写为：MSN^{MicroRNA-21-cy5}）。

在谷胱甘肽响应性释放系统的实验中，首先在室温下，将一定量的MSNs^{MicroRNA -21-cy5}分别分散在400μl含和不含谷胱甘肽的无酶水中。随后，10000rpm离心10min，获取上清液。使用荧光酶标仪（HH3400，PerkinElmer）检测上清液中的荧光强度来确定MicroRNA-21-cy5从纳米颗粒向溶液中的释放量（激发波长＝ 649nm /发射波长＝ 670nm）。

最后，将1mg MSN^{MicroRNA-21-cy5} 与2mg 凋亡小体膜混合，然后把混合液在超声仪中间歇性地超声2min。处理后的悬液在5000g条件下离心10min取沉淀即得负载有MicroRNA-21的靶向响应性释放系统（简写为：cABs ^MicroRNA-21），重悬于水中4℃储存，用于后续实验。

具体而言，MicroRNA-21通过静电相互作用与带正电的介孔二氧化硅纳米粒子结合，其中带正电的二甲胺基团通过二硫键连接在介孔二氧化硅纳米粒子上。 因此，巨噬细胞将嵌合凋亡小体内化后，靶细胞胞浆中高浓度的谷胱甘肽会破坏二硫键，从而导致MicroRNA-21快速释放。

检测结果如图5所示：图5为谷胱甘肽触发释放MicroRNA-21的检测，结果表明，对照组组7天后MicroRNA-21的最终释放比例小于20％。相反地，在存在谷胱甘肽的情况下，MicroRNA-21的释放随时间延长显着增加，在7天后达到90％。确定了介孔二氧化硅纳米粒子上具有负载MicroRNA-21的能力。

实施例10：负载姜黄素的靶向响应性释放系统的构建

将10mg 介孔二氧化硅纳米粒子、1mg姜黄素和10ul二甲基丙烯酸甘油酯完全混匀在10ul水中，在100W超声20min充分混匀。在真空条件下通过抽真空3次、每次10min，生成二甲基丙烯酸甘油酯和姜黄素共负载的介孔二氧化硅纳米粒子。同时，将24mg过硫酸溶解在氮气下溶于3ml水中20min，然后将80ul四甲基乙二胺溶解在800ul水中。之后，在氮气下将2500μl 过硫酸铵溶液和440ul 四甲基乙二胺溶液与二甲基丙烯酸甘油酯和姜黄素共负载的介孔二氧化硅纳米粒子混匀，产生聚合反应生成聚二甲基丙烯酸甘油酯和姜黄素共负载的介孔二氧化硅纳米粒子（简写为：MSN^{-Cur-polyster}），防止姜黄素泄露。混悬液在氮气、室温条件下搅拌1h来促进聚合反应。产生的纳米粒子用水清洗3次，在50℃、真空条件下下过夜干燥。

使用透射电镜观察介孔二氧化硅纳米粒子和包裹了聚酯的介孔二氧化硅纳米粒子（简写为：MSN-polyester）。

姜黄素的胞内释放可以用荧光分光光度计进行体外检测。具体而言，将10mg MSN^{-Cur-polyster}在37℃、摇晃下分别分散于10mL含酯酶和无酯酶的PBS中，然后在不同时间点离心收集上清，并检测上清液的荧光强度以获得体外释放结果。

最后，将1mg MSN-Cur-polyster与2mg 凋亡小体膜混合，然后把混合液在超声仪中间歇性地超声2min。处理后的悬液在5000g条件下离心10min取沉淀即得负载姜黄素的靶向响应性释放系统（简写为：cABs^Cur ），重悬于水中4℃储存。

具体而言，将姜黄素通过物理吸附作用负载在介孔二氧化硅纳米粒子的孔隙中，然后用聚二甲基丙烯酸甘油酯包封防止纳米粒子在循环期间造成姜黄素泄漏。当其靶向到炎症部位并被巨噬细胞吞噬后，聚二甲基丙烯酸甘油酯可被细胞中的酯酶降解以启动姜黄素的释放。

检测结果如图6所示：图6为MSN^Cur的释放曲线，结果表明其释放性能高度依赖于酯酶的酶解反应。

实施例11：皮肤炎症损伤模型的建立

脱毛前使用1%戊巴比妥钠以70mg/kg的用量经腹腔注射麻醉，弯刀剪毛，再用8%的硫化钠脱去动物背部及周围的毛，数分钟后轻轻刮去，用清水擦净。将小鼠俯卧固定在操作板上，背部中央75%酒精消毒，再用碘伏消毒，划出直径为1.0cm痕迹，建立相等大小的全层圆形皮肤炎症损伤模型。

实施例12：皮肤损伤模型炎症的影响

采用小鼠全层皮肤损伤模型简便、快速，创面之间具有较好的均衡性，是研究药物促进创面修复作用的理想模型之一。为了评估我们构建的功能性嵌合凋亡小体在炎症性疾病中的应用，对炎症性疾病发展的影响以及治疗作用，我们使用小鼠皮肤损伤模型进行了验证，同时为小鼠皮肤损伤模型提供一种全新的、有效的治疗方法。

为了研究嵌合凋亡小体对体内炎症的影响，通过体内成像系统评估了嵌合凋亡小体的炎症定点能力。将DiR标记的介孔二氧化硅纳米粒子、凋亡小体膜、嵌合凋亡小体和PBS通过尾静脉注入小鼠体内，24h后检测其在小鼠损伤部位的生物分布，并根据成像系统的荧光强度对其进行定量统计。检测结果如图7所示，根据体内成像结果显示，与裸露的介孔二氧化硅纳米粒子相比，嵌合凋亡小体或凋亡小体膜对炎性伤口部位的靶向能力增强。结果表明体内嵌合凋亡小体的靶向能力，而介孔二氧化硅纳米粒子在炎症区域周围几乎没有积累。

实施例13：皮肤炎症损伤模型的治疗

为了评估嵌合凋亡小体对伤口愈合的影响，我们对模型小鼠进行了治疗。将皮肤炎症损伤模型小鼠随机分成四组（每组n= 6），分别为PBS组、cABs^null组组、cABs^MicroRNA-21组和cABs^Cur,于术后分别进行尾静脉注射100μl PBS、100μl PBS+100μg cABs、100μl PBS+100μgcABs^MicroRNA-21 和100μl PBS+100μg cABs^Cur。在治疗后的第0、3、5、7、10和12d测量伤口尺寸，并用图像J计算，进行统计。在终点处，对所有小鼠实施安乐死，并收集损伤部位皮肤进行组织学研究。检测结果如图8-图9E所示，图8为小鼠伤口愈合检测结果，结果显示，与cABs^null和PBS组相比，注射cABs^MicroRNA-21或cABs^Cur的小鼠的伤口闭合率显着提高，特别表明其有显著的治疗作用；图9A-9E 为不同组皮肤损伤部位的HE染色结果，皮肤组织结果显示，与PBS和嵌合凋亡小体组中观察到的情况相比，注射cABs^MicroRNA-21可以显著增强皮肤的愈合、损伤部位有良好的组织和分层神经上皮，并且胶原蛋白大量沉积。而且，与PBS组相比，cABs^MicroRNA-21组的毛囊和皮脂腺形成增加、炎性细胞浸润的减少，与正常的皮肤结构相似。同样的，cABs^Cur组的愈合皮肤中有分层的结构、炎症细胞浸润减少，并伴有皮肤附属物的产生。总之，结果表明，嵌合凋亡小体可以通过MicroRNA-21和姜黄素的转移释放，促进炎症的消退、胶原蛋白的沉积和皮下附属物的形成以及伤口愈合过程中的皮肤再生。

实施例14：溃疡性结肠炎模型的建立

为了进一步研究嵌合凋亡小体对炎症影响和治疗作用，我们建立了另一种急性炎症模型。用C57BL/6小鼠自由饮用2.5％葡聚糖硫酸钠溶液，并且连续喂养10d建立小鼠溃疡性结肠炎模型。

实施例15：溃疡性结肠炎模型炎症的影响

为了进一步研究嵌合凋亡小体对体内炎症的影响，通过体内成像系统评估了嵌合凋亡小体的炎症定点能力。将DiR标记的介孔二氧化硅纳米粒子、凋亡小体膜、嵌合凋亡小体和PBS通过尾静脉注入溃疡性结肠炎模型小鼠体内，24h后检测其在小鼠损伤部位的生物分布，并根据成像系统的荧光强度对其进行定量统计。检测结果如图10所示，根据体内成像结果显示，与裸露的介孔二氧化硅纳米粒子相比，嵌合凋亡小体或、凋亡小体膜对炎性伤口部位的靶向能力增强。结果表明体内嵌合凋亡小体的靶向能力，而介孔二氧化硅纳米粒子在炎症区域周围几乎没有积累。

实施例16：溃疡性结肠炎模型的治疗

为了进一步评估嵌合凋亡小体对伤口愈合的影响的，我们对溃疡性结肠炎模型小鼠进行了治疗。将皮肤炎症损伤模型小鼠随机分成四组（每组n= 6），与术后进行尾静脉注射，分别注射100μl PBS、100μl PBS+100μg cABs、100μl PBS+100μg cABs^MicroRNA-21 和100μl PBS+100μg cABs^Cur。在治疗后的第2、4、6、8和10 天测量小鼠体重数，并进行统计。在终点处，对所有小鼠实施安乐死，并收集损伤部位组织进行结肠长度和组织学研究。

检测结果如图11A-图12E所示，图11A为小鼠体重的监测结果，结果显示，control组比，PBS组随着时间的延长，表现出更明显的体重减轻，而在cABs^MicroRNA-21组和cABs^Cur组治疗可以抑制体重的急剧下降和疾病的恶化；图11B为结肠长度结果，由于葡聚糖硫酸钠给药导致结肠明显缩短，并伴有严重的充血和溃疡。而使用cABs^MicroRNA-21和cABs^Cur发挥的治疗作用可部分恢复结肠长度并改善病变；图12A-12E 为不同给药组溃疡性结肠炎模型损伤部位的HE染色结果，与 PBS组的结肠表现出巨大的透壁炎性细胞浸润、隐窝损伤和粘膜上皮完整性丧失，cABs^MicroRNA-21和cABs^Cur治疗组的结肠组织保留了正常的隐窝和肠腺结构，并减轻了炎症浸润。

本发明以上实施例所用试剂，若未进行特别说明，均为市售试剂或依据现有技术可以制造获得的试剂，所涉及相关检测装置或实验装置，若未进行特别说明，均指可以满足相关检测或实验需求的常规仪器，并均可在市场上购买得到。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出多种形式的变化，这些均属于本发明保护之列。

Claims (13)

1.功能性嵌合凋亡小体，其特征在于，所述功能性嵌合凋亡小体包含凋亡小体膜和包裹于所述凋亡小体膜中的介孔二氧化硅纳米粒子，所述凋亡小体膜为来源于免疫细胞的凋亡小体膜，所述介孔二氧化硅纳米粒子负载有MicroRNA-21。

2.根据权利要求1所述的功能性嵌合凋亡小体，其特征在于，所述免疫细胞选自淋巴细胞，所述淋巴细胞选自T细胞。

3.根据权利要求1所述的功能性嵌合凋亡小体，其特征在于，所述MicroRNA-21通过靶细胞内多肽的作用可响应性释放于靶细胞内。

4.根据权利要求1所述的功能性嵌合凋亡小体，其特征在于，所述MicroRNA-21上标记有Cy5。

5.根据权利要求3所述的功能性嵌合凋亡小体，其特征在于，所述MicroRNA-21通过靶细胞胞浆中的谷胱甘肽破坏二硫键导致MicroRNA-21释放于靶细胞内。

6.权利要求1-5任一项所述的功能性嵌合凋亡小体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）负载MicroRNA-21的介孔二氧化硅纳米粒子制备：将介孔二氧化硅纳米粒子和3-巯基丙基三甲氧基硅烷加入乙醇溶液中，超声混合10min后，在60℃、氮气条件下搅拌8-14小时，然后加入2,2'-二硫基联吡啶和2-二甲胺基乙硫醇，继续反应10-12h，获得反应产物；反应产物使用乙醇清洗数次后离心获得沉淀，将所述沉淀在真空下干燥，获得活化的介孔二氧化硅纳米粒子，将0.06mg 活化的介孔二氧化硅纳米粒子和15nmol MicroRNA-21加入无酶水中，在4℃条件下吹打混匀，离心后弃去上清液，即得负载MicroRNA-21的介孔二氧化硅纳米粒子；

2）功能性嵌合凋亡小体的制备：将负载MicroRNA-21的介孔二氧化硅纳米粒子与凋亡小体膜混合，然后间歇性地超声2min，在5000g条件下离心10min，取沉淀即获得功能性嵌合凋亡小体，重悬于水中4℃储存。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述活化的介孔二氧化硅纳米粒子和凋亡小体膜的质量比为1:2。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述凋亡小体膜由以下方法制备而成：将-80℃保存的凋亡小体解冻，在1000g条件下离心10min进行沉淀，重悬于低渗裂解液中，4℃下低渗处理1h，然后低功率超声5s，在100g条件下离心10min除去碎屑后，再在10000g条件下离心10 min取沉淀，然后用水洗涤，直至囊泡内的成分去除为止，将收集的凋亡小体膜重悬在水中，4℃保存备用。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述低渗裂解液的组分为：10mM 三羟甲基氨基甲烷、10 mM MgCl₂和1mM 苯甲基磺酰氟。

10.权利要求1-5任一项所述的功能性嵌合凋亡小体在制备治疗炎症疾病产品中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述炎症疾病包括皮肤炎症、结肠炎、肺炎、肝炎或肾炎。

12.用于治疗炎症疾病的药物，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的功能性嵌合凋亡小体和药学上可接受的载体。

13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自水、PBS缓冲液或者生理盐水。

Images