CN108587998B - 一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备皮肤浅表性肿瘤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备皮肤浅表性肿瘤的药物中的应用。具体涉及对大肠杆菌进行Trail基因转化从而表达Trail蛋白,提取其外泌体,溶菌酶处理后,再用靶向肽修饰纳米粒并装载光敏感剂吲哚氰绿ICG。将该纳米粒透皮给药后,采用近红外光触发ICG发热并释放单线态氧,与Trail蛋白协同杀死肿瘤细胞。该外泌体的制备方法克服了传统方法的不足,具有产量高、周期短、成本低、载药简便,载药量高等优点。目前尚无将外泌体应用于透皮给药的报道,该外泌体能高效透皮,为治疗皮肤疾病提供了新策略。此外,临床上尚无治愈黑色素瘤的疗法,该外泌体透皮后,可以结合光热与生物疗法协同抑制黑色素瘤的发展与转移,具有良好的体内治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,尤其涉及一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备皮肤浅表性肿瘤的药物中的应用。
背景技术
经皮给药是指将药物直接作用于皮肤表面,使药物穿透皮肤进入人体血液循环,或作用于患者局部皮肤部位,从而发挥治疗作用的一种给药方法。对于皮肤性疾病,尤其是浅表性肿瘤是一种较理想的给药途径。因为这种经皮给药方式具有将药物直接送达病灶,增强给药靶向性,减少对全身的毒副作用;避免肝脏的首过效应,提高了药物的生物利用度;给药方式简单,对人体伤害较小,在发生不良反应时可以随时停止给药等优势。
然而,皮肤致密的角质层是药物穿透皮肤的最大障碍,限制了绝大部分药物的经皮渗透。只有一小部分小分子药物才能直接进入表皮层,大分子药物,如蛋白质,核酸,多肽等,由于其自身的亲水性、较大的粒径等,几乎无法穿透角质层。促进大分子药物穿透皮肤的方法有物理促渗法,如离子导入法、电穿孔、微针法、超声波法等,缺点是技术繁琐,成本昂贵,普遍应用性较差;化学促渗法,如使用氮酮,表面活性剂等,具有皮肤刺激性大,促渗效果不理想的缺点。近些年来,大量的研究报道了使用纳米药物载体携载药物促进药物透皮的方法,它主要是通过影响角质层脂质流动性能,提高药物的分配系数或溶解度等方式改变药物的渗透能力。然而这些纳米粒子的透皮效果不是很理想,绝大部分还需要结合外加磁场或光热治疗等物理手段来促进透皮效果;生物相容性差,也会给皮肤造成一定的刺激性。因此亟需发明一种透皮效果理想,生物相容性好的纳米粒子来携载药物进入皮肤。
外泌体是指由细胞分泌到细胞外微环境的一种具有膜结构的直径约为20-200nm的囊泡,是细胞在向外出芽和细胞膜裂变的过程中释放出的含有胞膜成分的微小颗粒。其中含有蛋白质,核酸等多种关键组分,参与细胞间的通讯并调控细胞功能,具有良好的生物相容性、储存和运输方便、能增加被包裹药物的稳定性、减小用药剂量及可以通过修饰粒子表面产生主动靶向等性质。由于外泌体是来源于细胞膜的纳米囊泡,其成分与细胞膜具有高度的相似性,根据相似相溶和膜融合原理,外泌体应具有细胞和组织穿透的独特优势,而且其粒径较小,易于通过毛细血管,血脑屏障等生物屏障,因此外泌体在经皮给药这一给药途径中可能具有很大的潜力,目前还没有将外泌体应用于经皮给药的研究。
真核细胞外泌体的制备工艺繁琐,生产效率低,成本高,难以产业化。大肠杆菌能够分泌外泌体,分泌速度快,产量高,且制备方法相对简单,周期短,可快速获得大量的外泌体。采用溶菌酶处理大肠杆菌外泌体,通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁溶解破裂,大大减小大肠杆菌源外泌体的免疫原性。此外,目前外泌体载药方式为电穿孔或超声振动方式,具有技术要求高,操作复杂,成本昂贵,载药量低等瓶颈问题。由于外泌体中含有大量母细胞中的成分,包括含有母细胞中转染成功表达的蛋白质,核酸等大分子药物,可以采用将目的基因直接转染母细胞,提取其外泌体的方式进行外泌体载药。大肠杆菌是高效制备重组蛋白的较理想的工程菌。采用Trail基因转化大肠杆菌的方法可产生大量Trail目标蛋白,用于后续的肿瘤治疗。
为了增强药物杀灭肿瘤细胞的作用,将光热疗法与生物疗法结合协同杀灭肿瘤细胞这一策略可能会有很大的应用潜力。光热疗法是利用光动力治疗结合热效应,即利用单线态氧诱导肿瘤细胞凋亡,同时将肿瘤区加热至有效治疗温度,杀灭肿瘤细胞。光热疗法所需的光敏剂能够吸收特定波长的光的能量发热,并传递给周围的氧分子,产生化学性质很活泼的单线态氧,单线态氧易与生物大分子作用,破坏细胞和细胞器的结构与功能,从而杀伤癌细胞。吲哚菁绿(ICG)是目前唯一被美国食品药物管理局(FDA)批准用于临床的近红外成像试剂,具有近红外吸收和发射荧光特性,能够强烈地吸收光能将其转化为热能并产生单线态氧,可用于光热治疗。本发明将ICG结合到外泌体上,经皮递送到肿瘤病灶后,在近红外光的刺激下激发ICG发热并释放单线态氧,辅助杀死肿瘤细胞。
发明内容
本发明的目的在于解决现有制备方式的不足以及现有治疗浅表性肿瘤手段缺乏的问题,提供了一种生产快捷方便,载药简单高效的外泌体的制备方法及其在在制备皮肤浅表性肿瘤的药物中的应用,制备得到的外泌体经皮给药后结合光热疗法治疗浅表性肿瘤,首次将外泌体应用于透皮给药,并且首次提出将药物透皮给药后,光热疗法和生物疗法协同治疗浅表性肿瘤的新策略。
本发明所采用的技术方案如下:一种外泌体,所述外泌体为由Trail基因转染的大肠杆菌来源的外泌体。
进一步的,所述外泌体的制备方法包括如下步骤:
步骤(1):用热激法将含有Trail蛋白的质粒导入大肠杆菌,然后进行培养;
步骤(2):收集步骤(1)中培养液,采用差速离心法收集外泌体,即得到载有Trail蛋白的外泌体;
步骤(3):在步骤(2)获得的载有Trail蛋白的外泌体中加溶菌酶(1~8mg/mL),置于20~33℃摇床中,80~200rpm振荡1~3h,即可获得。
本发明还提供上述制备得到的外泌体在制备治疗皮肤浅表性肿瘤的药物中的应用。
进一步的,药物的制备方法包括以下步骤:
步骤(1):向外泌体中分别加入靶向黑色素瘤细胞的多肽iRGD(10~30μg/mL)和多肽 PEP(10~30μg/mL),置于20~33℃摇床中,80~200rpm振荡1~3h;于4℃,离心,弃去上清,得到iRGD接枝的外膜囊泡和PEP多肽接枝的外膜囊泡;其中,多肽iRGD为棕榈酸修饰的序列为CRGDRGPDC的氨基酸,PEP为棕榈酸修饰的序列为KWRNMGGAGIVRRADRAAVV 的氨基酸;
步骤(2):向步骤(1)得到的外膜囊泡中加入红外光热剂吲哚菁绿ICG(0.1-2mg/mL),置于20~33℃摇床中,80~200rpm振荡1~3h;
步骤(3):离心收获得到药物。
进一步的,所制备得到的药物的给药方式为透皮给药。
进一步的,所制备得到的药物在近红外光(NIR)刺激下会发热并释放出Trail蛋白。
进一步的,所述步骤(1)和(3)中的离心的离心力为100000g~200000g。
本发明的有益效果在于:本发明所提供的方法能够高效快速制备外泌体,并且使外泌体简便有效的载药。该大肠杆菌源外泌体能够大量透过皮肤,修饰靶向肽和光热剂后,不仅能够有效的将Trail等蛋白类药物传递给黑色素瘤细胞,而且在近红外光的刺激下负载于外泌体的光热剂ICG可以发热,协同Trail蛋白一同杀灭肿瘤细胞。本发明不仅首次将外泌体应用于透皮制剂,并且提出了将药物透皮给药后,生物疗法和光热疗法联合应用的给药策略可以应用于浅表性肿瘤的治疗。此外,通过溶菌酶处理,大大的降低了大肠杆菌源外泌体的免疫原性,有效的解决了其可能会引起机体炎症的问题。
附图说明
图1为大肠杆菌源外泌体的透射电镜图;
图2为大肠杆菌源外泌体的粒径分布图;
图3为大肠杆菌源外泌体的Western-blot图;
图4(a)为外泌体和用溶菌酶处理的外泌体对于巨噬细胞分泌的炎症因子IL-6的影响;
图4(b)为外泌体和用溶菌酶处理的外泌体对于巨噬细胞分泌的炎症因子TNF-α的影响;
图5为大肠杆菌源外泌体的细胞摄取图;
图6为大肠杆菌源外泌体对于黑色素瘤细胞B16F10的毒性评价图;
图7为大肠杆菌源外泌体的透皮电镜图;
图8为大肠杆菌源外泌体的透皮荧光图;
图9为大肠杆菌源外泌体的透皮药量曲线图;
图10为大肠杆菌源外泌体体内应用的抑瘤效果图;
图11为大肠杆菌源外泌体体内应用后荷瘤小鼠的生存率图;
图12为大肠杆菌源外泌体体内应用后荷瘤小鼠的HE切片图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更清楚的理解,对本方案进行以下详细的说明,但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
1、热激法将含有Trail的质粒导入大肠杆菌:取出1管制备好的感受态细胞,放在冰上融化。每100μL感受态细胞加入约20ng质粒DNA,轻轻混匀,在冰上放置30分钟。将离心管放置42℃水浴,热激90s。快速将离心管转移至冰浴,放置1-2分钟;每管加400μL LB培养基,在33℃摇床温和摇动温育45分钟,使细菌复苏;取适当体积均匀涂布于含有抗生素的LB平板上。倒置培养皿,于33℃培养12-16h即可观察到白色的菌落,即为转化子。
2、所述的外泌体按以下方法制备而得:
实施例1:
将冻存好的转染成功的大肠杆菌复苏过夜。将收集的培养液于4℃,5000g离心5分钟,以去除死细胞和大的碎片。将上清液用0.22μm的滤膜过滤,进一步除去细菌等杂质。将上清液转移到无菌超速离心管中,于4℃,100000g超速离心2h,弃去上清。用PBS清洗,于4℃,100000g超速离心2h,得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同,酌情加入注射用生理盐水重悬,用BCA试剂盒检测总蛋白浓度,-80度分装保存。
外泌体中加溶菌酶(2mg/mL)置于33℃摇床中,100rpm振荡1h。然后再分别加入靶向黑色素瘤的多肽iRGD(25μg/mL)和多肽PEP(25μg/mL),其中,多肽iRGD为棕榈酸修饰的序列为CRGDRGPDC的氨基酸,棕榈酸修饰在C位点上;PEP为棕榈酸修饰的序列为KWRNMGGAGIVRRADRAAVV的氨基酸,棕榈酸修饰在K位点上;置于33℃摇床中,100rpm 振荡1h。于4℃,100000g超速离心2h,弃去上清,得到iRGD接枝的外膜囊泡(OMV-RGD) 和PEP多肽接枝的外膜囊泡(OMV-PEP)。再加入红外光热剂吲哚菁绿ICG(1mg/mL),置于33℃摇床中,100rpm振荡1h;于4℃,100000g超速离心2h,弃去上清,得到iRGD 和ICG接枝的外膜囊泡(OMV-RGD-ICG)和PEP多肽和ICG接枝的外膜囊泡(OMV-PEP-ICG)。
实施例2:
将冻存好的转染成功的大肠杆菌复苏过夜。将收集的培养液于4℃,5000g离心5分钟,以去除死细胞和大的碎片。将上清液用0.22μm的滤膜过滤,进一步除去细菌等杂质。将上清液转移到无菌超速离心管中,于4℃,100000g超速离心2h,弃去上清。用PBS清洗,于4℃,100000g超速离心2h,得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同,酌情加入注射用生理盐水重悬,用BCA试剂盒检测总蛋白浓度,-80度分装保存。
外泌体中加溶菌酶(1mg/mL)置于20℃摇床中,80rpm振荡1h。然后再分别加入靶向黑色素瘤的多肽iRGD(10μg/mL)和多肽PEP(10μg/mL),置于20℃摇床中,80rpm振荡 1h。于4℃,100000g超速离心2h,弃去上清,得到iRGD接枝的外膜囊泡(OMV-RGD)和 PEP多肽接枝的外膜囊泡(OMV-PEP)。再加入红外光热剂吲哚菁绿ICG(1mg/mL),置于 33℃摇床中,100rpm振荡1h;于4℃,100000g超速离心2h,弃去上清,得到iRGD和ICG 接枝的外膜囊泡(OMV-RGD-ICG)和PEP多肽和ICG接枝的外膜囊泡(OMV-PEP-ICG)。
实施例3:
将冻存好的转染成功的大肠杆菌复苏过夜。将收集的培养液于4℃,5000g离心5分钟,以去除死细胞和大的碎片。将上清液用0.22μm的滤膜过滤,进一步除去细菌等杂质。将上清液转移到无菌超速离心管中,于4℃,100000g超速离心2h,弃去上清。用PBS清洗,于4℃,100000g超速离心2h,得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同,酌情加入注射用生理盐水重悬,用BCA试剂盒检测总蛋白浓度,-80度分装保存。
外泌体中加溶菌酶(8mg/mL)置于33℃摇床中,200rpm振荡3h。然后再分别加入靶向黑色素瘤的多肽iRGD(30μg/mL)和多肽PEP(30μg/mL),置于33℃摇床中,200rpm 振荡3h;于4℃,200000g超速离心2h,弃去上清,得到iRGD接枝的外膜囊泡(OMV-RGD) 和PEP多肽接枝的外膜囊泡(OMV-PEP)。再加入红外光热剂吲哚菁绿ICG(1mg/mL),置于33℃摇床中,100rpm振荡1h;于4℃,100000g超速离心2h,弃去上清,得到iRGD 和ICG接枝的外膜囊泡(OMV-RGD-ICG)和PEP多肽和ICG接枝的外膜囊泡(OMV-PEP-ICG)。
3、使用透射电镜观察实施例1制备得到的外泌体的大小与形态,如图1。使用马尔文粒径电位仪测定该外泌体的粒径,如图2。如图1,2所示,透射电镜下观察到的形态均符合外泌体的特征,呈规则球形,大小较均一,粒径为100nm-200nm。
4、用Western-blot法分析Trail蛋白是否成功载入外泌体中:加适量的蛋白裂解液裂解外泌体沉淀,充分漩涡震荡;测定蛋白质浓度后,每个样取20μg,加5*SDS上样缓冲液,99℃金属浴中加热10-15min;12000g离心5min;上样,做10%SDS-PAGE;100V转膜30min,5%脱脂牛奶封闭1h;加入抗Trail的一抗(用TBS按1:500稀释),4℃孵育过夜;TBST 洗膜5分钟*4次,加相应二抗,室温孵育1.5h;TBST洗膜5分钟*4次,加ECL发光液,通过化学发光凝胶成像系统拍照。如图3所示,证实在该外泌体中含有抗肿瘤药物Trail蛋白。
5、外泌体的制备方法同实施例1。分别将LPS(终浓度为1μg/mL)以及三种外泌体按照不同浓度分别加入黑色素瘤细胞B16F10中,刺激18h后,收集培养上清,ELISA法检测培养上清中炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平。图4(a)和图4(b)结果显示,用溶菌酶处理过的外泌体能够明显的降低该两种炎症因子的表达,证明该种方法能够有效降低外泌体的炎症反应。
6、通过细胞摄取实验探究修饰有黑色素瘤细胞靶向肽的外泌体的靶向能力。按照实施例1 制备得到OMV、OMV-RGD和OMV-PEP后,与DiI膜染料避光孵育,制得OMV-DiI、OMV-RGD-DiI 和OMV-PEP-DiI。取对数生长期的黑色素瘤细胞(B16F10),用胰酶消化后,加入细胞培养液吹打分散均匀并制备成细胞悬液(约1*105个/mL)。取1mL细胞悬液加至24孔板中,于 33℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育24h。加入OMV-DiI、OMV-RGD-DiI和OMV-PEP-DiI,孵育12h后收集细胞,流式细胞仪检测B16F10对外泌体的摄取情况。图5表明,这种大肠杆菌源外泌体可以被细胞摄取,其中OMV-PEP的细胞摄取量最高,能够有效靶向黑色素瘤细胞。该实验结果进一步证实了该种外泌体易被黑色素瘤细胞摄取,表面便于修饰,连接靶向肽后具有很强的靶向性,对于治疗皮肤浅表性肿瘤具有很大的潜力。
3、通过MTT实验探究该药物对于黑色素瘤细胞的毒性作用强弱。按照实施例1制备得到 OMV-ICG、OMV-RGD-ICG和OMV-PEP-ICG。取对数生长期的黑色素瘤细胞(B16F10),以1*104个/孔的密度种在96孔板上,隔夜后,更换新鲜培养液,分别加入Trail、OMV-ICG、OMV-RGD-ICG 和OMV-PEP-ICG,并对相应组别采用808nm近红外光刺激(2W,5min)。33℃、5%CO2条件下继续培养24h,吸出旧的培养液,加入含有MTT(5mg/mL)的培养液,33℃、5%CO2条件下继续培养4h,弃去培养液,加入DMSO并振摇,测530nm处吸光值。计算公式=实验组OD值/对照组OD值*100%。图6表明,OMV-RGD-ICG+NIR组别的细胞存活率为50%,表现出较大的细胞毒性。该实验结果证实了此药物对于黑色素瘤细胞具有很强的毒性作用。
8、透皮给药后拍摄小鼠皮肤的电镜图来探究外泌体的透皮途径:将小鼠麻醉后剃去腹部 1.5*1.5cm区域的毛发后作为涂药区,吸取外泌体均匀涂布于皮肤表面,2h后使用蒸馏水去除皮肤表面残留的外泌体,颈椎脱臼法处死小鼠并取下涂药区皮肤。将取下的皮肤分别用2%戊二醛溶液和1%锇酸固定2h后,依次经30、80、90和100%的梯度乙醇脱水,经二氧化碳干燥后表面喷胶体金颗粒进行扫描电镜观察。图3中箭头指向外泌体,可看出外泌体的透皮途径为毛囊途径。
9、按照上述方法制备得到OMV后,与DiI膜染料避光孵育,制得OMV-DiI。将小鼠麻醉后剃去腹部1.5*1.5cm区域的毛发后作为涂药区,分别吸取DiI和OMV-DiI均匀涂布于皮肤表面,颈椎脱臼法处死小鼠并取下涂药区皮肤。使用多聚甲醛将皮肤组织固定后冰冻切片,在荧光显微镜下,以Ex=549nm检测DiI荧光,测定OMV透过皮肤的深度。由图8可以看出,DiI染料只停留在皮肤表面,而OMV-DiI明显可以穿过皮肤角质层,进入皮肤深部。
10、采用体外经皮渗透实验检测外泌体的透皮能力:脱去小鼠皮肤上的毛,48h后将小鼠脱颈处死,立即剥取腹部皮肤,将取下的皮肤平铺在干净的玻璃板上,角质层朝下,用手术刀小心刮下皮下脂肪层和结缔组织,然后用生理盐水冲洗至无混浊,4℃保存备用。采用改良的Franz扩散池,接受介质为PBS溶液。将处理好的小鼠皮肤外层朝上平铺固定在扩散池和接收池之间,通过取样管向接受池注入接受介质,使皮肤内层与PBS液面接触完全,排除接受池内PBS液中的气泡,吸取Trail蛋白溶液以及含有Trail蛋白的外泌体(外泌体的制备方法同实施例1)涂布于皮肤表面,室温干燥,于33℃下恒速搅拌,在实验开始后的0.5、1、 4、8、10、24小时从接受室取样200μL(及时补充相同体积的新鲜接受介质,并排除接受室内接受介质中的气泡),使用ELISA试剂盒测定测量样品中的Trail蛋白的含量。从图9外泌体的体外透皮曲线可以看出,该外泌体可以快速有效透过皮肤,1h时透过率即达到50%,然后接近匀速透过皮肤,而游离的Trail蛋白透过皮肤的量基本为0,证明外泌体可以将蛋白类药物穿透角质层,递送至皮肤内部。
11、经皮给药后对其治疗黑色素瘤的体内抑瘤效率进行评价。先建立荷皮肤黑色素瘤的C53 小鼠模型:将200μL含有1*106个B16F10细胞的PBS溶液皮下注射至C53小鼠右前侧,待肿瘤体积达到100mm3时,随机分为4组,每组包括5只小鼠。按照实施例1制备得到OMV-ICG、OMV-RGD-ICG和OMV-PEP-ICG。每只小鼠给药剂量为10μg,涂抹体积为40μL,给小鼠肿瘤部位涂抹药物2h后,用808nm近红外光照射相应组别的小鼠(2W,5min),每天测量肿瘤体积变化,观测并统计小鼠存活状态。从图10中可以看出OMV-PEP-ICG+NIR 组别经过治疗后,25天之内保持未复发状态,证明该药物能够有效杀死黑色素瘤细胞。从图 11中小鼠的生存率可以看出,OMV-PEP-ICG+NIR组别的生存率为100%,而其他组别在第12 天均已死亡。体内药效学实验证明该药物能够明显抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠的生存期限。
12、使用H&E染色对小鼠肿瘤进行了组织学检查。按照具体实施方式(11)给药结束后,将小鼠处死,取出小鼠的黑色素瘤治疗区域,用生理盐水洗净,置于10%中性的福尔马林溶液中固定,石蜡包埋后,进行切片,使用二甲苯对切片进行拖蜡,酒精水化,最后水洗2min 即可进行H&E染色。先加入Harris苏木精染色液染色5min,水洗2次,加入70%乙醇30s,水洗10min,加入伊红染色液染色1min,水洗3次,将组织依次浸入梯度乙醇中(70%、80%、95%、100%乙醇)进行脱水,二甲苯透明2次,每次1min,封片后,在显微镜下观察肿瘤组织的内部结构与形态。从图12可以看出Trail、OMV-PEP-ICG组与PBS组相比,未出现明显不同,在肿瘤组织处肿瘤细胞分裂活跃,存在着明显的核异形和色素沉着的情况。但是在治疗组OMV-PEP-ICG+NIR中,已无明显的核异形和色素沉着,黑色素瘤细胞增殖不明显,细胞疏松,排列紊乱,皮肤纤维结构发生改变,毛囊等结构已长出。H&E染色结果进一步证实了本发明构建的药物体系能够透皮并且有效的治疗黑色素瘤。
Claims (5)
1.一种外泌体,其特征在于,所述外泌体为由Trail基因转染的大肠杆菌来源的外泌体,所述外泌体中还加入靶向黑色素瘤细胞的多肽iRGD和多肽PEP以及红外光热剂吲哚菁绿ICG,
其中多肽iRGD为棕榈酸修饰的序列为CRGDRGPDC的氨基酸,PEP为棕榈酸修饰的序列为KWRNMGGAGIVRRADRAAVV的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体,其特征在于,所述外泌体的制备方法包括如下步骤:
步骤(1):用热激法将含有Trail蛋白的质粒导入大肠杆菌,然后进行培养;
步骤(2):收集步骤(1)中培养液,采用差速离心法收集外泌体,即得到载有Trail蛋白的外泌体;
步骤(3):在步骤(2)获得的载有Trail蛋白的外泌体中加1~8 mg/mL溶菌酶,置于20~37℃摇床中,80~200 rpm振荡1~3 h,即可获得;
步骤(4):向外泌体中分别加入靶向黑色素瘤细胞的10~30 μg/mL多肽iRGD和10~30 μg/mL多肽PEP,置于20~37℃摇床中,80~200 rpm振荡1~3 h;于4 ℃,离心,弃去上清,得到iRGD接枝的外膜囊泡和PEP多肽接枝的外膜囊泡;
步骤(5):向步骤(1)得到的外膜囊泡中加入0.1-2mg/mL红外光热剂吲哚菁绿ICG,置于20~37℃摇床中,80~200 rpm振荡1~3 h;
步骤(6):离心收获即得。
3.根据权利要求1或2所述的外泌体在制备治疗皮肤浅表性黑色素瘤的药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所制备得到的药物的给药方式为透皮给药。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)和(6)中的离心的离心力为100000g~200000g。
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