CN112807288B - 一种特异靶向感染部位的中性粒细胞膜仿生纳米材料的制备方法 - Google Patents
一种特异靶向感染部位的中性粒细胞膜仿生纳米材料的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种特异靶向感染部位的中性粒细胞膜仿生纳米材料的制备方法,包括如下步骤:将中性粒细胞膜与载药纳米粒混合,对得到的混合物进行超声混合,随后通过体积排阻色谱法将游离的细胞膜微球以及载药纳米粒分离,得到纯化的中性粒细胞膜仿生纳米材料。该制备方法操作简单,成本低,制备周期短。制备得到的中性粒细胞膜仿生纳米材料,以PLGA作为纳米粒的外壳,其内包裹治疗药物,外壳表面包裹中性粒细胞膜,使纳米粒具有主动靶向感染部位的体内寻靶能力,达到提高关节假体周围感染组织中药物浓度的目的,从而提高药物对感染部位的靶向治疗作用。
Description
技术领域
本发明属于中性粒细胞膜仿生纳米材料领域,尤其涉及一种特异靶向感染部位的中性粒细胞膜仿生纳米材料的制备方法。
背景技术
人工关节置换术后关节假体周围感染是造成关节置换手术失败的主要原因之一。细菌在假体与人体组织界面繁殖能够对骨质直接造成破坏,反复出现的感染以及炎症能够诱导破骨细胞激活,改变成骨微环境,引起关节假体周围骨质丢失,继而出现假体的松动,使得人工关节手术失败。由于假体与人体组织之间的界面血供较差,静脉给药方式往往无法使抗生素在局部保持有效杀菌浓度;而局部注射给药虽然能使药物较为集中地达到病变部位,但假体周围感染灶往往位置较深,局部注射不易操作且反复局部注射则不仅会加重患者痛苦,更是极大地增加了感染灶扩散的风险,导致更加严重并发症的发生。因此,如何增加治疗药物在感染部位的血药浓度,提高治疗效果,是骨科临床上急需解决的重要科学问题。
载药纳米粒技术是将合成或天然的高分子材料作为载体材料,其内包裹液态或固态药物,形成粒径为纳米级的载药体。载药纳米粒技术是重要的药物或生物小分子缓释方式,能延缓药物的起始突释剂量、延长药物的半衰期、增加药物稳定性和溶解度,并能使载体纳米粒具备了一定的缓释效果和被动靶向性。聚乳酸羟基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)是已经获FDA批准可应用于注射型药物控释制剂的最常用材料之一。其大小可控,粒径可控制在几十纳米到几十微米之间,生物相容性好,性质稳定,制备方法简单,具有包裹药物和免疫抗体的能力,目前已经广泛用作控释和缓释给药系统的载体材料。
利用细胞膜对纳米粒的表面进行修饰改性,可以将细胞膜及其外周蛋白易位提供给纳米粒表面,为纳米粒提供靶向性,提高其对目标靶点的作用能力,大大减少了肝肾代谢及Kupffer细胞吞噬等降解途径对药物的降解。同时,细胞膜为多种细菌外毒素攻击靶点,在中和毒素的同时能够聚集在感染部位,使其包裹的药物在感染部位集中释放,达到靶向作用。因此,细胞膜包裹的纳米粒具有减少肝脏代谢清除率,保护药物靶向感染部位释放、中和细菌毒素以及药物缓释的多重潜力。中性粒细胞作为免疫系统的一部分,其细胞膜对感染部位的定位靶向功能更强。此外,中性粒细胞膜还具有部分中性粒细胞独特的识别信号功能,主要的表现为对炎症部位以及病原体的靶向和趋势作用。如能使用中性粒细胞膜包裹PLGA核心的纳米粒,可有效靶向炎症部位并抑制膝关节的滑膜炎症,使得纳米药物颗粒在感染部位的主动浓聚成为可能,提升感染部位的药物浓度,从而达到更好的治疗效果。
然而,由于中性粒细胞膜仿生纳米材料一般要用于抗肿瘤治疗,现有的制备方法中往往需要将中性粒细胞膜进行一系列活化流程以使其具备免疫特性,制备上流程较复杂,且活化步骤耗费成本较高。因此,研究一种操作简单,成本低,制备周期短的制备中性粒细胞膜仿生纳米材料的方法,具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,克服以上背景技术中提到的不足和缺陷,提供一种操作简单、成本低、制备周期短的特异靶向感染部位的中性粒细胞膜仿生纳米材料的制备方法。
为解决上述技术问题,本发明提出的技术方案为:
一种特异靶向感染部位的中性粒细胞膜仿生纳米材料的制备方法,所述中性粒细胞膜仿生纳米材料包括载药纳米粒,以及包裹在所述载药纳米粒表面的中性粒细胞膜,所述制备方法包括如下步骤:将中性粒细胞膜与载药纳米粒混合,对得到的混合物进行超声混合,随后通过体积排阻色谱法将游离的细胞膜微球以及载药纳米粒分离,得到纯化的中性粒细胞膜仿生纳米材料。
上述的制备方法,优选的,所述中性粒细胞膜为小鼠骨髓中的中性粒细胞膜。
本发明利用中性粒细胞对感染部位具有高度的驱化能力,能聚集在感染部位等特性,创造性的将中性粒细胞膜包裹在载药纳米粒的表面,制备成具有体内寻靶能力的中性粒细胞膜靶向纳米粒,可以达到提高关节假体周围感染组织中药物浓度的目的,从而提高药物对感染部位的靶向治疗作用。
更优选的,所述中性粒细胞膜的制备方法包括如下步骤:收集小鼠骨髓液,用40-70μm的滤网过滤骨髓液,700-2000rpm离心7-12min后弃上清,用DPBS重悬;然后依次注入淋巴细胞分离液及核细胞和粒细胞分离液,600-800g离心20-40min后吸取离心管中白色雾状层液体,加入到DPBS中,1400-2000rpm离心7-15min,重悬即得中性粒细胞悬液;将所述中性粒细胞膜悬液放入液氮中迅速冷冻30-60秒,取出后放入37℃水浴锅5-10分钟,继续放入液氮中迅速冷冻,反复冻融2-5次后,在4℃下10000-12000g离心7-15min,分离上清液即得中性粒细胞膜悬液。
更优选的,所述收集小鼠骨髓液的方法具体包括如下步骤:将小鼠股骨和/或胫骨放入装有DPBS/肝素混合液的培养皿中,剪去股骨、胫骨的两端,使用DPBS/肝素混合液冲洗骨髓腔,收集骨髓液;所述DPBS/肝素混合液中肝素与DPBS的体积比为1:1000,置于冰上预冷备用。
优选的,所述载药纳米粒为PLGA纳米粒。
更优选的,所述PLGA纳米粒的制备方法包括如下步骤:将PLGA溶解在二氯甲烷中,加入PVA溶液,声振混合2min,加入双蒸水定容至20mL,磁力搅拌至溶剂挥发完全,4000rmp离心10min,得到的上清液10000rpm离心7min,得到的沉淀用PBS重悬即得PLGA纳米粒悬液。
更优选的,所述PVA溶液的质量百分比为4%。
优选的,所述中性粒细胞膜与载药纳米粒按照膜蛋白与纳米粒的质量比为1:1的配比混合。
优选的,所述超声混合时采用的超声能量设置为50%。
优选的,在超声混合的过程中,每工作30s暂停30s,共工作2min。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1、本发明的制备方法,操作简单,成本低,制备周期短。
2、本发明制备得到的中性粒细胞膜仿生纳米材料,以PLGA作为纳米粒的外壳,其内包裹治疗药物,外壳表面包裹中性粒细胞膜,使纳米粒具有主动靶向感染部位的体内寻靶能力,达到提高关节假体周围感染组织中药物浓度的目的,从而提高药物对感染部位的靶向治疗作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1-图3是从骨髓中提取的中性粒细胞的流式细胞检测图;
图4是PLGA纳米粒透射电镜图;
图5是中性粒细胞膜包裹(PLGA-NM)纳米粒和PLGA纳米粒的粒径对比图;
图6是中性粒细胞膜包裹(PLGA-NM)纳米粒和PLGA纳米粒表面的电位对比图;
图7是中性粒细胞膜仿生纳米粒(DIR@PLGA-NM NPs)体内主动靶向感染部位能力检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义,下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1:
一种特异靶向感染部位的中性粒细胞膜仿生纳米材料,包括PLGA纳米粒,以及包裹在PLGA纳米粒表面的中性粒细胞膜,其制备方法如下:
1、使用材料
聚乳酸-羟基乙酸(PLGA,lactide/glycolide ratio 50:50,Mn=10000);聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol,PVA);二氯甲烷(Dichloromethane);磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBuffer Saline,PBS);肝素(1000U/mL);杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco's PhosphateBuffered Saline,DPBS);淋巴细胞分离液;核细胞和粒细胞分离液。
2、步骤按顺序进行
(1)PLGA纳米粒的制备:使用单乳法制备PLGA纳米粒,PLGA(50mg)溶解在二氯甲烷(1.5mL)中,加入4%PVA溶液,声振混合2min,加入双蒸水定容至20mL,磁力搅拌至溶剂挥发完全;4000rmp离心10min,上清液10000rpm离心7min。沉淀用5mL PBS重悬即得PLGA纳米粒悬液。
(2)中性粒细胞的收集:中性粒细胞收集自bal/c小鼠骨髓,收集骨髓前,经腹腔经腹腔注射10ml/kg肝素钠,30min后经腹腔注射2ml/kg 3%戊巴比妥钠,麻醉后处死小鼠;充分消毒后完整分离股骨和胫骨,将取出的股骨及胫骨放入装有DPBS/肝素混合液(肝素:DPBS=1:1000配置,置于冰上预冷)的培养皿中,剪去股骨、胫骨的两端,使用DPBS/肝素混合液冲洗骨髓腔;收集骨髓液后,用70um的滤网过滤骨髓液。1500rpm,离心10min后,弃上清,用3ml DPBS重悬,依次注入淋巴细胞分离液3ml及核细胞和粒细胞分离液3ml,700g离心30min,吸取离心管中白色雾状层液体,加入10mLDPBS中,1500rpm离心10min,重复3次;重悬即得中性粒细胞悬液。
(3)中性粒细胞膜的制备:将中性粒细胞膜悬液放入液氮中迅速冷冻30秒,取出后放入37℃水浴锅5分钟,继续放入液氮中迅速冷冻,反复冻融3次后,4℃下10000g离心10分钟,分离上清液即得细胞膜悬液。
(4)中性粒细胞仿生纳米粒制备:超声法整合PLGA纳米粒核心与中性粒细胞膜:中性粒细胞膜与PLGA纳米粒按照膜蛋白与纳米粒的质量比为1:2配比混合,用超声声振仪对混合物超声混合2min。随后通过体积排阻色谱法将游离的细胞膜微球以及PLGA纳米粒分离,得到纯化的中性粒细胞膜仿生纳米粒。
3、中性粒细胞的测定
使用流式细胞术对步骤(2)后从骨髓中提取的中性粒细胞进行检测,检测结果见图1、图2、图3。
由图1可知,流式分析显示中性粒细胞占比约62.1%;由图2可知,流式分析显示中性粒细胞存活率为99.6%;由图3可知,有活性的中性粒细胞占比约68.7%。
4、制备的中性粒细胞膜可包裹在PLGA纳米粒外层
将本实施例制备得到的中性粒细胞膜仿生纳米粒进行透射电镜检测,激光粒度仪进行粒径检测,Zeta电位仪进行表面电位检测。透射电镜检测结果见图4,粒径分布检测结果见图5,表面电位检测见图6。
由图4-6可知,所制备的中性粒细胞膜仿生纳米粒为大小均一、外观圆整的球形结构,可清晰分辨出装载了药物得到PLGA内核,以及外包被了较暗的中性粒细胞膜脂质层。纳米粒包被中性粒细胞膜前后粒径均在250nm左右,中性粒细胞膜的包被使纳米粒的粒径增大了50nm左右,Zeta电位由原来的-4mV左右变为-8mV左右,与中性粒细胞膜囊泡的特性相一致。
5、本实施例制备得到的中性粒细胞膜仿生纳米粒在体内寻靶能力的检测
(1)建立小鼠皮下软组织感染动物模型
取10只近交雌性BALB/C小鼠,10%水合氯醛腹腔麻醉,脱毛膏脱去背部毛发,消毒2遍,取右侧背部为造模区域,用注射器向小鼠皮下注射细菌悬液(OD600=0.6)500μL,形成皮丘。消毒注射区域并观察皮丘形状及颜色,术后连续观察7天,测量皮丘直径并记录局部皮肤情况,当注射部位开始出现局部皮肤破溃时,视为动物造模成功。
(2)中性粒细胞膜仿生纳米粒体内寻靶能力的检测
小鼠皮下软组织感染造模成功后,将中性粒细胞膜仿生纳米粒(PLGA-NM)与PLGA单纯纳米粒(PLGA)包裹DIR荧光材料,并予尾静脉注射。经过上述干预后48h,用荧光分子断层成像仪(Bruker In-vivo Fx PRO)检测实验组和对照组中小鼠皮下感染部位的荧光强度,采用激发波长720nm,发射波长为790nm。实验结果如图7所示,实验组(左侧)小鼠的皮下感染部位荧光强度明显高于对照组(右侧)。说明所制备的中性粒细胞膜纳米粒,即DIR@PLGA-NMNPs具有体内主动靶向感染部位的能力。
总的来说,本发明的制备方法,操作简单,成本低,制备周期短。制备得到的中性粒细胞膜仿生纳米材料为大小均一、外观圆整的球形结构,具有主动靶向感染部位的体内寻靶能力,达到提高关节假体周围感染组织中药物浓度的目的,从而提高药物对感染部位的靶向治疗作用。
Claims (1)
1.一种特异靶向感染部位的中性粒细胞膜仿生纳米材料的制备方法,所述中性粒细胞膜仿生纳米材料包括载药纳米粒,以及包裹在所述载药纳米粒表面的中性粒细胞膜,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:将中性粒细胞膜与载药纳米粒按照膜蛋白与纳米粒的质量比为1:2的配比混合,对得到的混合物进行超声混合,随后通过体积排阻色谱法将游离的细胞膜微球以及载药纳米粒分离,得到纯化的中性粒细胞膜仿生纳米材料;所述超声混合时采用的超声能量设置为50%,在超声混合的过程中,每工作30s暂停30s,共工作2min;
所述中性粒细胞膜为小鼠骨髓中的中性粒细胞膜;所述中性粒细胞膜的制备方法包括如下步骤:收集小鼠骨髓液,用40-70μm的滤网过滤骨髓液,700-2000rpm离心7-12min后弃上清,用DPBS重悬;然后依次注入淋巴细胞分离液及核细胞和粒细胞分离液,600-800g离心20-40min后吸取离心管中白色雾状层液体,加入到DPBS中,1400-2000rpm离心7-15min,重悬即得中性粒细胞悬液;将所述中性粒细胞膜悬液放入液氮中迅速冷冻30-60秒,取出后放入37℃水浴锅5-10分钟,继续放入液氮中迅速冷冻,反复冻融2-5次后,在4℃下10000-12000g离心7-15min,分离上清液即得中性粒细胞膜悬液;
所述收集小鼠骨髓液的方法具体包括如下步骤:将小鼠股骨和/或胫骨放入装有DPBS/肝素混合液的培养皿中,剪去股骨、胫骨的两端,使用DPBS/肝素混合液冲洗骨髓腔,收集骨髓液;所述DPBS/肝素混合液中肝素与DPBS的体积比为1:1000,置于冰上预冷备用;
所述载药纳米粒为PLGA纳米粒,所述PLGA纳米粒的制备方法包括如下步骤:将PLGA溶解在二氯甲烷中,加入质量百分比为4%的PVA溶液,声振混合2min,加入双蒸水定容至20mL,磁力搅拌至溶剂挥发完全,4000rmp离心10min,得到的上清液10000rpm离心7min,得到的沉淀用PBS重悬即得PLGA纳米粒悬液。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Long Inventor after: Li Jingyi Inventor after: Niu Chengcheng Inventor after: Hu Yihe Inventor before: Wang Long Inventor before: Li Jingyi Inventor before: Niu Chengcheng Inventor before: Hu Yihe |
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CB03 | Change of inventor or designer information | ||
GR01 | Patent grant | ||
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