CN112941025B - 血液中中性粒细胞的分离方法和分离试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血液中中性粒细胞的分离方法和分离试剂盒，属于中性粒细胞分离技术领域。本发明提供了血液中中性粒细胞的分离方法，包括如下步骤：将中性粒细胞分离液、淋巴细胞分离液、全血依次加入离心管，使淋巴细胞分离液位于中性粒细胞分离液上方，全血位于淋巴细胞分离液上方，然后离心，即可分离得到中性粒细胞。本发明还提供了血液中中性粒细胞的分离试剂盒，含有分别独立包装的中性粒细胞分离液和淋巴细胞分离液。采用本发明分离方法或分离试剂盒，通过一次离心即可快速获得纯度为80％左右的中性粒细胞，而且可以实现一次离心同时分离中性粒细胞和红细胞，具有很好的实用价值。

Description

血液中中性粒细胞的分离方法和分离试剂盒
技术领域
本发明涉及血液中中性粒细胞的分离方法和分离试剂盒，属于中性粒细胞分离技术领域。
背景技术
中性粒细胞在机体非特异性免疫防御反应中起着十分重要的作用，是机体抵御微生物病原体，特别是化脓性细菌入侵的重要吞噬细胞。外周血白细胞以中性粒细胞为主，正常情况下中性粒细胞占人外周血白细胞的50％～70％。急性感染或炎症、广泛的组织损伤或坏死、急性溶血和失血、急性中毒以及恶性肿瘤等情况时，外周血中性粒细胞的数量增高。目前已有报道分离人和动物中性粒细胞的方法，大多采用Percoll、Ficoll等单种分离液对稀释后的外周血进行梯度离心获取。但是，上述梯度离心法对于分离液浓度、操作细致性的要求十分严格，细小改变就很容易导致细胞分离失败，而且耗时长，离心后所得细胞的纯度差异较大，通常杂质细胞较多。市面上有些公司提供了商品化的中性粒细胞分离专用试剂，但分离效果仍因不同实验因素有所影响，尤其是离心后细胞分层不清楚、混有杂细胞，使目标细胞纯度受到影响(如图1所示)。此外，也有报道通过多次离心获取纯度更高的中性粒细胞的方法，但增加离心次数、过长的离心时间都会对细胞造成一定破坏。
因此，提供一种能够快速获得高纯度中性粒细胞的分离方法和分离试剂盒，具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供血液中中性粒细胞的分离方法。本发明的另一目的在于提供血液中中性粒细胞的分离试剂盒。
本发明提供了血液中中性粒细胞的分离方法，包括如下步骤：将中性粒细胞分离液、淋巴细胞分离液、全血依次加入离心管，使淋巴细胞分离液位于中性粒细胞分离液上方，全血位于淋巴细胞分离液上方，然后离心，即可分离得到中性粒细胞。
进一步地，淋巴细胞分离液占分离液总体积的10％～20％。
进一步地，全血：分离液总体积的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。试验中发现，如果全血：分离液总体积的体积比大于1.2：0.8，分离效果有所下降。另外，当分离液用量达到分离液总体积：全血的体积比为1.2：0.8时，已足够实现有效分离。
优选地，全血：分离液总体积的体积比为1：1。
进一步地，所述中性粒细胞分离液为PolymorphPrep。
进一步地，所述离心的条件为：于15～30℃离心400～600g，30～50min，升降速为8～9。优选地，所述离心的条件为：于15～30℃离心500g，35min，升降速为9。若细胞分层欠清晰，可选择离心较长时间，如50min。
进一步地，所述的全血为外周血全血。
优选地，所述的全血为人外周血全血。
进一步优选地，所述的全血为人外周血EDTA抗凝全血。
最优选地，所述的人外周血EDTA抗凝全血在采集后于15～30℃保存且保存时间在4小时以下。
试验中发现，如果使用采集后2-8℃冷藏保存、或采集后放置过夜、或采集时使用肝素抗凝的全血，容易导致分离效果下降。
本发明提供了含有中性粒细胞分离液和淋巴细胞分离液的组合物制备血液中中性粒细胞分离试剂盒的用途。
进一步地，淋巴细胞分离液：中性粒细胞分离液的体积比为1：(4～9)。
其中，所述中性粒细胞分离液为PolymorphPrep。
其中，所述的血液为外周血全血。优选地，所述的血液为人外周血全血。进一步优选地，所述的全血为人外周血EDTA抗凝全血。最优选地，所述的人外周血EDTA抗凝全血在采集后于15～30℃保存且保存时间在4小时以下。
本发明提供了血液中中性粒细胞的分离试剂盒，含有分别独立包装的中性粒细胞分离液和淋巴细胞分离液。
进一步地，淋巴细胞分离液：中性粒细胞分离液的体积比为1：(4～9)。
其中，所述中性粒细胞分离液为PolymorphPrep。
其中，所述的血液为外周血全血。优选地，所述的血液为人外周血全血。进一步优选地，所述的全血为人外周血EDTA抗凝全血。最优选地，所述的人外周血EDTA抗凝全血在采集后于15～30℃保存且保存时间在4小时以下。
本发明提供了血液中中性粒细胞的分离方法，在离心前依次加入中性粒细胞分离液、淋巴细胞分离液及全血，通过一次离心即可快速获得纯度为80％左右的中性粒细胞，而且可以实现一次离心同时分离中性粒细胞和红细胞。该方法是发明人经过对多种分离方法的实践及比较后探索出的一种新方法，具有很好的实用价值。
附图说明
图1为采用Percoll或Ficoll单种分离液对外周血进行梯度离心获取中性粒细胞的示意图；
图2为按照实施例1分离中性粒细胞的示意图；
图3为实施例1、对比例1、对比例2所得中性粒细胞的纯度对比图；
图4为实施例1、对比例1、对比例2的操作示意图。
具体实施方式
本发明提供了血液中中性粒细胞的分离方法，包括如下步骤：将中性粒细胞分离液、淋巴细胞分离液、全血依次加入离心管，使淋巴细胞分离液位于中性粒细胞分离液上方，全血位于淋巴细胞分离液上方，然后离心，即可分离得到中性粒细胞。
本发明的发明人基于对血液中各种细胞成分的分离探索经验，结合淋巴细胞分离液及中性粒细胞分离液的物理特性，将二者联合使用，在不增加耗时的情况下明显提高了中性粒细胞分离的纯度，所得细胞也可以顺利用于后续细胞试验。国内外尚未见有类似分离方法的报道。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
主要实验器材：人外周静脉全血(采集后于室温保存，且在采集后4小时内进行试验)、人中性粒细胞分离液(PolymorphPrep,AXIS-SHIELD)、人淋巴细胞分离液(HumanLymphocyte Separation Medium,DAKEWE)、葡聚糖T-500(Dextran T-500,Solarbio)、PBS液、红细胞裂解液、离心管、离心机、流式仪。
实施例1采用本发明方法从血液中分离中性粒细胞
将37℃预热5分钟的中性粒细胞分离液、淋巴细胞分离液依次缓慢加入离心管，尽量保持两者分界面不被破坏。共使用0.5ml淋巴细胞分离液+4.5ml中性粒细胞分离液，淋巴细胞分离液位于中性粒细胞分离液上方。然后在最上层缓慢加入5ml人外周EDTA抗凝全血，保持分界面清晰。然后常温离心500g、35min、升降速均为9，离心后可见分界清晰的单核细胞层和中性粒细胞层，如图2所示。
实施例2采用本发明方法从血液中分离中性粒细胞
将37℃预热5分钟的中性粒细胞分离液、淋巴细胞分离液依次缓慢加入离心管，尽量保持两者分界面不被破坏。共使用1ml淋巴细胞分离液+4ml中性粒细胞分离液，淋巴细胞分离液位于中性粒细胞分离液上方。然后在最上层缓慢加入5ml人外周EDTA抗凝全血，保持分界面清晰。然后常温离心500g、35min、升降速均为9，离心后可见分界清晰的单核细胞层和中性粒细胞层，如图2所示。
对比例1淋巴细胞分离液+葡聚糖沉降法
人外周EDTA抗凝全血与PBS液按1：1稀释，离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，然后在其上方加入4ml稀释后的血液，室温离心800g、30min、升速3降速3，全程耗时约40min。离心后丢弃上清(血浆、单核细胞层、分离液)，红细胞层沉淀使用PBS重悬，室温离心2000rpm、15min。离心后丢弃上清，加入PBS至体积为4.5ml，加入0.5ml 6％葡聚糖溶液，葡聚糖终浓度为0.6％，重悬后室温静置30-40min。然后吸出上层液室温离心1500rpm、5min，沉淀加入2-3ml红细胞裂解液室温裂解15min，然后室温离心1500rpm、5min。沉淀使用PBS清洗两次后流式检测中性粒细胞比例。
该方法步骤十分繁琐，总耗时太长(约100-120min)，沉降效果欠稳定，获得的中性粒细胞较少。此外，葡聚糖不易溶于水、配制耗时，葡聚糖溶液粘稠、不适合灭菌使用，故经该方法分离所得中性粒细胞不适合后续细胞试验。
对比例2单用中性粒细胞分离液法
50ml离心管中装入20ml预热的中性粒细胞分离液，其上方缓慢加入20ml室温人外周EDTA抗凝全血，保持液面分界清晰(另外也尝试了不同加液体积，如2ml：2ml)。室温离心500g、35min，升降速均为9。离心后于离心管中部可见两层白膜层，吸取第二层白膜层即中性粒细胞层，使用等体积PBS清洗细胞，离心300g、10min。沉淀加入红细胞裂解液3ml，室温裂解10min，然后室温离心300g、5min，沉淀细胞使用PBS清洗一次后用于流式检测中性粒细胞比例。
该方法加液方便，步骤简洁，总耗时明显缩短(约65-75min)，但离心后两白膜层细胞之间距离较近、分界欠清晰，在吸弃第一层细胞时常常污染第二层或吸掉部分第二层细胞。虽耗时较葡聚糖沉降法明显缩短，但最终收获的中性粒细胞数量偏低。
实施例1、对比例1、对比例2的操作示意图见图4，所得中性粒细胞的纯度对比见图3。可见，实施例与普通分离方法(淋巴细胞分离液后葡聚糖沉降、单用中性粒细胞分离液)相比，耗时较短，分离效果稳定，可一次获得较多纯度更高的中性粒细胞(如图4)；且该方法细胞分界清晰、吸取不同细胞层时不易互相污染。结果已通过流式细胞检测及统计学分析得以验证(Kruskal-Wallis检验，Prism 9，GraphPad)，中性粒细胞分离纯度在实施例(N＝8)中为67.79％-80.24％、对比例1(N＝8)中为34.47％-43.23％、对比例2(N＝8)中为9.26％-58.41％(如图3，*差异有统计学意义：**P＜0.01，***P＜0.001)。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims (10)

1.血液中中性粒细胞的分离方法，其特征是：包括如下步骤：将中性粒细胞分离液、淋巴细胞分离液、全血依次加入离心管，使淋巴细胞分离液位于中性粒细胞分离液上方，全血位于淋巴细胞分离液上方，然后离心，即可分离得到中性粒细胞；所述中性粒细胞分离液为购自AXIS-SHIELD 公司的PolymorphPrep；淋巴细胞分离液为购自DAKEWE公司的 HumanLymphocyte Separation Medium。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征是：淋巴细胞分离液占分离液总体积的10%~20%。
3.如权利要求1所述的分离方法，其特征是：全血：分离液总体积的体积比为（0.8~1.2）：（0.8~1.2）。
4.如权利要求3所述的分离方法，其特征是：全血：分离液总体积的体积比为1：1。
5.如权利要求1所述的分离方法，其特征是：所述离心的条件为：于15~30°C离心400~600g，30~50min，升降速为8~9。
6.如权利要求5所述的分离方法，其特征是：所述离心的条件为：于15~30°C离心500g，35min，升降速为9。
7.如权利要求1所述的分离方法，其特征是：所述的全血为外周血全血。
8.如权利要求7所述的分离方法，其特征是：所述的全血为人外周血全血。
9.如权利要求8所述的分离方法，其特征是：所述的全血为人外周血EDTA抗凝全血。
10.如权利要求9所述的分离方法，其特征是：所述的人外周血EDTA抗凝全血在采集后于15~30°C保存且保存时间在4小时以下。
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