JP2014176389A - 骨髄または臍帯血から回収した幹細胞と前駆細胞の組成物、それらを用意するためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

【課題】幹細胞を高率で且つ赤血球を低率で選択的に回収できる、システム及び方法の提供。
【解決手段】大部分の生存ＣＤ３４＋細胞と元のサンプル内に存在するよりも実質的に減じられた赤血球を含む、細胞分離を補助する生体異物添加剤なしの骨髄又は臍帯血から回収された幹細胞及び前駆細胞の組成物を含む幹細胞組成物。この組成物を用意する為のシステムは、バッグセット１００と処理装置を含み、光センサ、マイクロコントローラ、サーボモータ、加速度計、ロードセル、及び電池を利用する。システム及び方法は、各細胞を各層に階層化し、次いで幹細胞を幹細胞バッグ１０６内に分離及び移動する為に遠心分離を利用する。処理装置のマイクロコントローラは、装置の加速度計、ロードセル及び光センサからの入力を受信し、バッグセット内の絞り弁１３８の開閉を指示し、出来るだけ多くの幹細胞と出来るだけ少ない赤血球の移動を行う幹細胞組成物の濃縮製造方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、概略的には、人の骨髄または臍帯血から特定の細胞集団を回収するための方法および装置に関するものである。特に、本発明は、幹細胞回収の効率を改善するために一般的に使用される生体異物添加剤ないし添加物を用いることなしに、骨髄または臍帯血中に存在する、幹細胞および前駆細胞の高効率での回収および分離、および過剰の赤血球、好中球、血小板、および血漿を取り除くためのシステムおよび方法を含んでいる。このシステムは、無菌ないし殺菌した機能的に閉じられたバッグセット（一組のバッグ）、および、細胞集団をそれらの大きさおよび密度ないし濃度に基づいて分離し、次いで、これら幹細胞および前駆細胞を所定の最終体積で幹細胞バッグに移送する、遠心力場で動作するように設計され、マイクロプロセッサにより制御された、電気的・機械的および光学的な装置を含んでいる。本発明はまた、人の骨髄または臍帯血から用意ないし作成した幹細胞と前駆細胞の組成ないし組成物を含んでおり、これらは即時利用に供されるか、あるいは後で使用するために貯蔵される。

（関連出願の相互参照）
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０の規定により、本願は、２００２年４月８日に出願された同時係属の米国特許出願第１０／１１８，２９１号を優先権主張し且つその一部係属出願であり、この米国特許出願の全ての開示は参照されて本明細書中に組み込まれる。３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０の規定により、本願はまた、２００７年３月２８日に出願された同時係属の米国特許出願第１１／６６４，２１２号を優先権主張し且つその一部係属出願であり、この米国特許出願は、米国を指定国とし且つＰＣＴ第２１（２）条に基づいて国際公開番号ＷＯ ２００６／０３８９９３ Ａ２として２００６年４月１３日に英語で公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９２８８号を優先権とし、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３７１に基づく国内段階出願であり、およびこの米国特許出願は一方では２００４年９月３０日に出願され２００７年５月１日に米国特許第７，２１１，１９１号として発行された米国特許出願第１０／９５７，０９５号において優先権主張されたものであり、これらの全ての開示は参照されて本明細書中にそのまま組み込まれる。

本明細書および特許請求の範囲のために、次の定義が使用される。
「自家使用」とは、人の細胞または組織をこれら細胞や組織が回収された個体に戻すための内移植、移植、注入または移動を意味する。
「晶質」とは、食塩水、乳酸リンゲル液、あるいは５％ブドウ糖液のような、電解質の置換または血管内容量を増大するために使用される等張塩および／またはブドウ糖溶液（等張の塩および／またはブドウ糖の溶液）を意味する。
「造血幹細胞」は、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（Leukocytes）、白血球（ＷＢＣ）、および血小板を含む多種の血球を生じさせる多能性幹細胞である。
「白血球」は、造血系の細胞であり、主に単球、リンパ球、および好中球を含み、細胞表面抗原ＣＤ４５（ＣＤ４５＋細胞）を発現ないし呈する。
「リンパ球」は、リンパ系の細胞（リンパ球系細胞）であり、Ｓｙｓｍｅｘ（シスメックス）ＸＥ−２１００で測定され、成熟リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）およびリンパ芽球のような未熟ないし成熟中のリンパ球を含む。
「最低限の処理がされた骨髄または臍帯血」とは、幹細胞および前駆細胞のための（例えばヘパリンあるいはシトラート（クエン酸塩）で抗凝固つまり抗血液凝固処理された骨髄や臍帯血であって、化学物質の追加物がなく（水、晶質、あるいは減菌剤（消毒剤）、保存剤、保管剤を除く）、関連する生物学的な性質を変容されていないものを意味する。
「単球」は、骨髄系の細胞であり、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ−２１００で測定され、成熟単球、および単芽球のような熟成中の単球を含む。
「単核細胞（単核球）」（ＭＮＣ）は、造血系の細胞であり、単球やリンパ球を含む。
「好中球」は、骨髄形の細胞であり、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ−２１００で測定され、多形核球、および桿状核、後骨髄球、骨髄球、骨髄芽球などの熟成中の好中球を含む。
「血小板」は、巨核球系の細胞であり、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ−２１００で測定され、成熟した血小板を含む。
「前駆細胞」は、幹細胞の直接的な子孫であり、一連の細胞分裂により直接的な細胞系統を生じさせる。
「赤血球」は、赤血球の系統の細胞であり、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ−２１００で測定され、成熟ＲＢＣを含むが有核赤血球は含まない。
「幹細胞」は、多機能性細胞であり、３つの一般的性質である（１）長期間にわたってそれ自体で分裂および複製できること、（２）未分化であること、（３）種々の分化ないし特殊化された細胞型を生じさせることが可能であること、を有している。幹細胞の細胞表面の抗原マーカーはＣＤ３４であり、細胞内酵素のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アルデヒド脱水素酵素）の高濃度のものである。
「ストークスの法則」は、重力加速度の間における粘稠液（粘性液体）中での粒子の沈殿ないし沈降速度を表した、数式（Ｖ_ｇ＝ｄ^２（Ｐ１−Ｐ２）／１８μ×Ｇ）であり、Ｖ_ｇ＝沈殿速度、ｄ＝粒径（粒子の直径）、Ｐ１＝粒子の密度（濃度）、Ｐ２＝液体の濃度ないし密度、Ｇ＝重力加速度、およびμ＝液体の粘度ないし粘性である。
「Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ−２１００」は、日本国、神戸のシスメックス株式会社により製造された自動式の血液・細胞分析装置で、フローサイトメトリーにより造血細胞を識別および定量化するものであり、半導体レーザビームを放射し、３つの光学信号である前方散乱光、側方散乱光、および側方蛍光強度を検知する。
「総有核細胞」（ＴＮＣ）は、ＷＢＣと有核ＲＢＣである。
「生体異物添加剤」と「生体異物剤」は、添加がない場合には生じない細胞分離プロセス性能特性の変化を起こす目的で、採取された骨髄または臍帯血に意図的に加えられた人体の天然要素ではない化学物質を意味する。
生体異物添加剤の例としては、
１．沈殿（沈降）剤（例えば、ヒドロキシエチルスターチ（ヒドキシエチルデンプン）、デキストラン、あるいはゼラチン）
２．密度勾配担体（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標））、および
３．細胞表面の巨大分子細胞のための親和性分子（例えば、モノクローナル抗体、常磁性粒子に結合するモノクローナル抗体）

現在まで、幹細胞の大きな臨床ないし医療的な可能性にも拘わらず、幹細胞治療の人体への使用に対するＦＤＡの認可はされていない。幹細胞治療の臨床効果や安全性を実証すると共に監督官庁（規制当局）の認可を得るための主要な障害は、骨髄や臍帯血から幹細胞を分離するために使用される既存の装置や方法が次の重大な欠点を１つ以上有することに因る。即ち、これら装置や方法は、解放系（解放型システム）であって微生物汚染の危険性があること、これらは時間および労働集約的であること（時間や労働の投入率が高い）、これらは好ましくなく且つ高価な生体異物剤の添加が必要であること、幹細胞の回収の割合が非常に低く平均して４０から７５％であること、およびこれらは組織や細胞の再生に利用される臍帯血や骨髄の量に適合しないこと。

心筋梗塞、虚血、糖尿病および皮膚傷のような重要且つ高頻度のヒト疾患を治療するために幹細胞を広い規模で使用をする前に、次の３つの重大な障害を克服する必要がある。
１．臨床試験（治験）により幹細胞治療の効率性および安全性を実証すること、
２．国の保健機関による監督官庁、特に米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）、細胞、組織および遺伝子治療局（ＯＣＴＧＴ）の認可を得なければならないこと、および
３．過剰の血漿、赤血球、および顆粒球を取り除くための生体異物添加剤の使用によらない、最低限の処理がされた骨髄または臍帯血から生存幹細胞および前駆細胞を迅速且つ容易に回収するための実用的な方法を開発する必要があること。

造血幹細胞に加えて、骨髄および臍帯血は組織再生や創傷治癒に潜在的な治療評価ある他のタイプの幹細胞および前駆細胞を含んでいることが現在では知られている。以前は骨髄間質細胞と称されたヒト間葉幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、および結合組織を生じさせることができ、ＡＬＤＨ Ｂｒ＋である。造血幹細胞に由来する原始細胞である骨髄に存在する内皮前駆細胞は、血流に入って血管損傷の場所に行って損傷を修復する助け、新しい血管を生じさせることができるものであり、ＣＤ３４＋である。

幹細胞は、ＣＤ３４＋およびアルデヒド デヒドロゲナーゼ ブライトセル（ＡＬＤＨ Ｂｒ＋）を含む、種々の細胞表面のマーカーにより識別ないし同定される。ＣＤ３４＋は、ＣＤ３４で識別される抗原を表し、この特定の抗原に特異性のある発光団共役抗体を使用して検知することができる幹細胞である。他の研究者は、成体幹細胞を、それらの表す高レベルな酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）に基づいて識別している。１つの会社である、Ａｌｄａｇｅｎ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）では、強い緑の蛍光を発生することで高レベルのＡＬＤＨを呈する細胞を検知する物体ないし基質を利用した技術を開発した。これらの所謂ＡＬＤＨブライトセル（ＡＬＤＨ Ｂｒ＋）は、フローサイトメトリーを利用して検知できる。ＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞は、神経細胞および内皮細胞を含む、種々の重要な細胞株を生じることができる異なる前駆細胞を含んでいる。

幹細胞の生存性は、トリパンブルーあるいは７−アミノ−アクチノマイシン Ｄ（７−ＡＡＤ）のような生体染色色素の除外を含む、いくつかの方法によって実証できる。幹細胞の生存性は、市販のキットを使用して骨髄または臍帯血中の幹細胞の代理としての白血球（ＣＤ４５＋細胞）の生存性を測定することで通常は査定ないし決定される。

大量の骨髄または臍帯血は、特に多数の赤血球が存在するために扱いにくい（骨髄中の各ＣＤ３４＋細胞に対して約２５，０００個の赤血球が、また臍帯血中の各ＣＤ３４＋細胞に対して約１８０，０００個の赤血球が存在する）。これらの過剰の赤血球が幹細胞と前駆細胞を利用することを困難とする。これは、これらの存在により組織再生を必要とする傷の場所における幹細胞と前駆細胞の濃度が極度に希釈され、およびこれらが、生体外での細胞増殖の培養、遺伝子治療、あるいは細胞集団の親和性精製を含む、幹細胞に対する他の処理を妨げることに因る。さらに、このような大量の赤血球の存在により、同種移植におけるＡＢＯ不適合性のような他の安全性の問題が引き起こる。いくつかのケースでは、体積ないし容量が低減した幹細胞濃縮物から好中球を最小限に抑えることが、これらの細胞が炎症反応を起こす可能性があること、および幹細胞の生存性あるいは柔軟性に悪影響を与えたり、その機能性を変える可能性がある生物学的に活性のある酵素およびサイトカインがその細胞質中の存在することを考慮して、同様に好ましい。

指定期間の遠心分離後における細胞の移動速度および最終的な配置は、その大きさおよび密度（濃度）の関数であり、またその動きはストークスの法則により規定される。幹細胞はＲＢＣより密度が低く、また血小板より密度が高く、ＷＢＣに近似した濃度を有している。よって、幹細胞を密度と大きさにより回収する従来の方法では、遠心分離により細胞手段を階層化することを含んでおり、次いで、遠心分離器から取り外した後に、脊髄や臍帯血の残留物から幹細胞を獲得する試みがされている。

骨髄や臍帯血からＷＢＣや幹細胞を隔離する１つの手動の方法は、骨髄あるいは臍帯血を全て遠心分離チューブ内に挿入し、室温で１５００−２０００ｘｇで１０−１５分間だけスピン（高速回転）することである。これにより骨髄や臍帯血は、上部の血漿層、下部の赤血球（ＲＢＣ）、およびＲＢＣと血漿との間の界面にあるＷＢＣと幹細胞と前駆細胞の薄層に分離される。階層化（層化）が完了した後は、ＲＢＣから約１ｍｍ下側までの血漿（上層）を、使い捨て式のプラスチック製の転移用ピペット（注入器）を使用して吸引する。血漿を取り除く際は、ＲＢＣ中への幹細胞および前駆細胞の損失がないように、あるいは幹細胞にＲＢＣが混入しないように監視しながら、同様なピペット吸引技術により取り除かれるＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層を乱さないように細心の注意を払う必要がある。試験管内でのこの手動の手法の欠点は、解放系であり骨髄ユニットの微生物汚染の危険性があること、時間および労働集約的であること、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞層の赤血球混入の量が非常に変化し易いこと、および幹細胞のロス(損失）が甚大且つ変化し易いこと。この方法における主要な関心事項である微生物汚染は、幹細胞の培養にマイナスの影響を与えたり、あるいは幹細胞の受容者(移植者）の体に感染症が伝播するリスクがあるので回避することが重要である。

臍帯血や脊髄からＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞集団を回収するための他の方法は、Compomat G4装置（ドイツ、フリードベルクのFresenius Kabi AG）およびCOBE 2991血球プロセッサ（コロラド州、レークウッド、COBE研究所）のように、細胞処理（細胞調整、細胞培養）装置を利用している。このタイプの処理の一例は、Tsubakiなどによる「Concentration of Progenitor Cells Collected from Bone Marrow Fluid Using a Continuous Flow Cell Separator System」Apheresis and Dialysis 5 (1), 46-48, 2001により提示されている。幹細胞のために採取される骨髄あるいは臍帯血の量は、目的とする臨床用途に依存する。組織再生における細胞ベースの治療のためには、典型的には、５０−１５０ｍＬの骨髄または臍帯血が収集される。これら血液バンクの機器は正しく機能するためにはより大量の骨髄または臍帯血（２００ｍＬ以上）を必要とし、また組織再生の医療用途では収集されるのが低量であると（２００ｍＬより少ない）と全く不適合となる。さらに、これらの機械化された処理の細胞生産物の最終的な体積（５０−１００ｍＬ）は、医療用途に対して適した幹細胞および前駆細胞の濃度を提供する、好ましい最終体積である３−２０ｍＬよりも実質的に大きい。これらの機器は血液や骨髄を１つの容器から他の容器に移動するためにポンプを必要とし、またこれらポンプは細胞に物理的（機械的）な損傷をもたらす可能性がある。

骨髄や臍帯血の体積ないし容積縮小(減容）や浄化ないし精製のための他の方法は、Ficoll(登録商標）やPercoll(登録商標）のような勾配担体を利用しており、これは、骨髄や臍帯血と結合ないし化合し、また遠心分離の間にそれ自体が細胞集団の間に介入ないし割り込み、幹細胞の回収を試みる間における細胞集団の混合を減らす。Ficoll(登録商標）は、中性の高度に分岐した高質量の親水性多糖類である。Ficoll(登録商標）(例えば、密度が１．０７７）は、血液や骨髄をその構成成分（赤血球、白血球など）に分離するために使用できる。Ficoll(登録商標）は、通常はチューブの底部に配置され、次いで生理食塩水で希釈された骨髄や臍帯血がFicoll(登録商標）の上部にゆっくりと重ねられる。遠心分離された後は、チューブの底部のFicoll(登録商標）がより重いＲＢＣ（密度１．０９−１．１０）に置き換わり、続く各層が縦列で現れる。上から下に、（１）血漿および血小板、（２）単核細胞（ＭＮＣ）（密度１．０６−１．０７）、（３）Ficoll(登録商標）、および（４）赤血球と好中球（密度１．０８−１．０９）が底部にペレット状に現れる。この分離により、ＭＮＣがＲＢＣと混り合う可能性が少ない状態で、ＭＮＣを採取できる。ＭＮＣ層中では赤血球の捕集（赤血球と好中球）が多少ある。

骨髄や臍帯血をFicoll(登録商標）で処理することの大きな欠点は、骨髄や臍帯血にFicoll(登録商標）を加える工程で解放系であることであり、微生物（細菌）が骨髄や臍帯血中に直接入り、これにより微生物汚染の危険性が増大することである。この危険性を低減するために、この工程を生物学的安全キャビネットを使用して行う必要があり、このキャビネットは常に使用可能ではないし、高価な実験装置（研究用機器）であり、許容可能な性能を常に維持し且つ監視しなければならない。さらに、Ficoll(登録商標）は生体異物であり、細胞が人体に安全に投与される前に洗浄により取り除く必要がある。この洗浄工程は時間や労力がかかり、また微生物汚染や細胞の損失の可能性が増大する。幹細胞の回収は低く、また非常に変動しやすく、２０から７０％の範囲である。Percoll(登録商標）は、ポリビニルピロリドンをコーティングしたコロイド状シリカであり、Ficoll(登録商標）に類似した他の密度勾配担体であって、同様な欠点を有する。

ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）沈殿剤を使用して骨髄白血球を隔離する技術が、A. Montuoro などによる「A technique for isolation of bone marrow cells using, hydroxyethyl starch (HES) sedimentation agent,」 Haematologica 76 Suppl 1:7-9, 1991により発表されている。ＨＥＳは、臨床的には血漿増量剤（血漿増補液）として使用されており、またその分子量およびその置換の程度により特徴付けされる。典型的には、骨髄または臍帯血の体積に対してＨＥＳを最終濃度０．５から２重量％で添加することで赤血球の凝集が起こり、このためそれらの沈殿速度がストークスの法則に基づいて変化する。しかしながら、ＨＥＳは生体異物であり、静脈内投与された際には患者によっては有害事象が不随する。さらに、ＨＥＳの使用は細胞処理にコストや複雑さが追加される。デキストラン重合体調合液やゼラチン溶液が同様な目的で使用されているが、ＨＥＳと同じ欠点を有している。

最後に、幹細胞と前駆細胞は、フローサイトメトリー細胞選別（Beckton Dickinson あるいはCoulter）を含む免疫学的方法を使用すること、およびMiltenyi CliniMacsあるいはBaxter Isolexシステムのような抗体被覆された常磁性粒子細胞選別により、骨髄あるいは臍帯血から分離できることは公知である。ＣＤ３４のような幹細胞抗原と特異性がある抗体は、この分離技術の一部に採用されている。これらの方法は、高価な生体異物剤、装置および使い捨て式の処理セットを必要とし、また実行に時間がかかるという欠点がある。最終生成物が赤血球あるいは白血球の混入が殆どない幹細胞のより純粋な集合である一方、このレベルの純度は発生費用が著しくかかり、意図した細胞治療効果を達成するためには必要ないものである。さらに、骨髄や臍帯血への抗体やビーズの添加により、系統コミットされた経路（lineage committed pathway）への不可逆的な幹細胞の分化といった、意図しない有害な生物学的影響をこれら試薬が引き起こすため、生成物が処理の間に「最低限の処理がされた」ものではなくなる。

Minguellなどの「Preparative separation of nucleated cells from human bone marrow」Experentia 35:548-549, 1978による研究では、デキストラン、デキストランとFicoll(登録商標）、およびFicoll(登録商標）と軟膜法による処理の結果における体積低減、細胞回収および細胞の生存性が比較されている。この論文では、骨髄について、いくつかの工程が細胞の生存性の損失を起こしており、また全てがリンパ系細胞（単球、リンパ球あるいはＭＮＣ）の細胞回収率が６８％以下と比較的低いという点で、理想的な用意ないし準備工程として欠如していることを例証している。観察された赤血球（ＲＢＣ）／有核細胞の比を２．７：１にするためには、軟膜法と称される沈殿の補助なしでの遠心分離において、最初に存在したこれらの細胞のリンパ系細胞の回収の範囲（低くて変動し易い）が、３６から６８％の範囲である必要がある。

幹細胞を高率で且つＲＢＣを非常に低率で選択的に回収できる、骨髄または臍帯血から幹細胞の組成物を用意するためのシステムおよび方法であって、迅速に行えて労働集約型でないと共に一貫した方法で行うことができ、手術室内で使用でき、無菌の機能的に閉じたシステム内で実行でき、生体異物添加剤を必要とせず、骨髄または臍帯血のサンプルの最初の量ないし体積を低減でき、様々な量ないし体積の骨髄を処理することができ、および最終生成物の量ないし体積を前もってユーザが選択できるようなものを提供する必要性がある。さらに、元のサンプルから高率の幹細胞を含み、またこれら幹細胞を生存状態に維持でき、元のサンプルから非常の低率のＲＢＣを含み、いずれの生体異物添加剤を含まず、およびユーザにより選択できる最終体積を有する、幹細胞組成ないし組成物に対する必要性がある。

本発明によれば、人の骨髄または臍帯血を由来とする幹細胞の組成物およびこの組成物を用意するためのシステムおよび方法が提供される。この開示された発明は、次の１０の特性ないし属性を単一のシステム内に統合している。
１． 幹細胞を高率で回収する。
２． 余分ないし過剰の血漿、ＲＢＣ、血小板、好中球を取り除くことで、骨髄または臍帯血のサンプルの元の体積ないし量を減じる。
３． 幹細胞の回収を行うために生体異物添加剤を必要としない一方、生成物ないし製品の安全性プロフィールを高め、細胞洗浄の必要性をなくし、コストを最小限とする。
４． 幹細胞を生存状態で維持する。
５． 迅速に完了できる（９０分未満）。
６． 幹細胞の分離ステップおよび獲得ステップが自動的に行われるので労働集約型ではない。
７． 一貫した方法で行われ、必要とするオペレータの訓練および専門知識が最小限で良い。
８． 自己（自家）使用のために手術室の内部ないし隣接させて使用でき、あるいは同種使用のために細胞処理研究所の内部ないし隣接させて使用できる。
９． 生成物の微生物汚染の危険性を減らすために無菌の、機能的に閉じたシステム内で幹細胞または前駆細胞を分離および隔離できる。
１０． 組織再生のために使用されるあらゆる種類の骨髄および臍帯血を処理することができる。

１つの観点において、本発明は、処理用のバッグセットおよび処理装置を含むシステムである。バッグセットは、無菌で好ましくは使い捨て式であり、処理バッグ、ＲＢＣ濃縮バッグ、幹細胞バッグ、絞り弁、および絞り弁から各バッグに接続されたラインを含んでいる。骨髄または臍帯血が処理バッグ内に移されると、バッグセットは、遠心分離器のバケット内に嵌め込まれる処理装置内に配置される。処理装置はバッグセットと相互作用し、単一の遠心分離運転の間にＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層を骨髄または臍帯血から幹細胞バッグ内に移す。処理装置は光センサ、マイクロコントローラ、サーボモータ、１つ以上の加速度計、ロードセル、および電池を含んでいる。マイクロコントローラは、光センサ、加速度計、およびロードセルからの入力を受領ないし受信し、および分析ないし解析すると共に、絞り弁の開および閉をするためにサーボモータに指令する。正確ないし精密なバルブ運動により、遠心分離の間において異なる細胞層は密度（濃度）および大きさにより階層化され、異なるバッグ内に移動する。

他の観点から、本発明はまた、骨髄または臍帯血から幹細胞を分離および濃縮するための方法を含んでいる。この方法は次のステップを含んでいる。骨髄または臍帯血は処理バッグ内に移される。こうして装填されたバッグセットは、処理装置内に配置される。バッグセットは処理装置内で、処理バッグ内の骨髄または臍帯血の各細胞がそれらの密度（濃度）および大きさに基づいて階層化されるのに十分なｇ力および時間で遠心分離される。バッグセットは処理バッグ内で、ＲＢＣの大部分が処理バッグからＲＢＣ濃縮バッグ内に分離されるより低いｇ力で遠心分離される。随意的ないし選択的に、バッグセットは処理装置内で、処理バッグ内の各細胞が細胞密度および大きさに基づいて再階層化するのに十分なｇ力および時間だけ遠心分離される。バッグセットは処理装置内で遠心分離される一方で、絞り弁は迅速に開と閉を連続的に多数回つまり何度も繰り返して行い、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層を移動することなしに、ＲＢＣの残りの部分をＲＢＣ濃縮バッグ内に分離する。バッグセットが遠心分離されている間、処理装置は空の幹細胞バッグの重量をゼロに風袋する。バッグセットを処理装置内で遠心分離しながら、絞り弁を迅速に開と閉を多数回連続して（開閉を繰り返し）、残りのＲＢＣの少量、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層、およびいくらかの血漿を処理バッグから幹細胞バッグ内に分離および移動する。

他の観点において、本発明は、本発明の方法の実施例により用意した、骨髄または臍帯血に由来する幹細胞および前駆細胞の組成物を含む。骨髄からの幹細胞および前駆細胞の組成物は、ＲＢＣの約５００に対して約１の割合のＣＤ３４＋細胞、および臍帯血からの、ＲＢＣの５，０００に対して１の割合のＣＤ３４＋細胞を有している。

本発明の幹細胞組成は、従来は達成できない赤血球対幹細胞の割合を達成するために生体異物添加剤を必要とすることなしに、機能的に閉じたバッグセット内で迅速に用意される幹細胞および前駆細胞の組成に対する現在は満たされていない臨床的な必要性に対応することができる。骨髄組成は、ＲＢＣの約９８％を減らし且つ生体異物添加剤を含むことなく、高い割合でＣＤ３４＋細胞（約９７％）およびＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞（約９２％）を回収できる点において、有用である。臍帯血組成は、ＲＢＣの約９８％を減らし且つ生体異物添加剤を含むことなく、高い割合でＣＤ３４＋細胞（約９５％）を回収できる点において有用である。

本発明のバッグセットの実施例の２次元的な配置を示した説明図。 図１のバッグセットの斜視図。 （Ａ）は図１のバッグセットの絞り弁の１つの流体路を示した図式的な説明図、（Ｂ）は図３（Ａ）に示した絞り弁の第２の流体路を示した図式的な説明図、（Ｃ）は図３（Ａ）に示した絞り弁の第３の流体路を示した図式的な説明図。 （Ａ）は図３（Ａ）から図３（Ｃ）の実施例とは異なる絞り弁の１つの流体路を示した図示的な説明図、（Ｂ）は図４（Ａ）に示した絞り弁の第２の流体路を示した図式的な説明図。 本発明の処理装置の実施例の斜視図。 図５の処理装置の斜視図。 図５の処理装置の斜視図。 図５の処理装置の斜視図。 図５の処理装置の側面図。 構成要素が示された、本発明の処理装置のベースプレートの実施例の斜視図。 図５の処理装置の分解図。 図５の処理装置内に配置される図１のバッグセットｆの斜視図。 図１２のバッグセットおよび処理装置の斜視図。 図１２のバッグセットおよび処理装置の斜視図。 図１２のバッグセットおよび処理装置の斜視図。 遠心分離バケット内の図１２のバッグセットおよび処理装置の斜視図。 図１６の遠心分離バケットと遠心分離器を装着した状態を示した一部分解した説明図。 図５の処理装置のマイクロコントローラの入力および出力を示したブロック図。 階層化ステップの後の細胞層を示した図１の処理バッグを示した一部断面の側面図。 本方法の遠心分離ステップの間における時間を関数とする光透過率の変化を示したグラフ。

（骨髄または臍帯血から幹細胞および前駆細胞を回収するためのシステム）
このシステムは、バッグセット１００と処理装置２００を含んでいる。
図１および図２にバッグセット１００の実施例を示した。バッグセット１００は、有効に閉じられており、また好ましくは使い捨て式のものである。バッグセット１００は、ラインや配管などにより絞り弁に連結ないし接続された３つ以上のバッグを含んでおり、入力ライン、クランプ、フィルタ、およびサンプリングサイト（サンプリングを行う場所）を備えている。バッグセット１００は好ましくは３つのバッグ、つまり処理バッグ１０２、赤血球（ＲＢＣ）濃縮バッグ１０４、および幹細胞バッグ１０６を含んでいる。

処理バッグ１０２はエチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）から作られるが、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）あるいは他のプラスチックから作ることもできる。ＲＢＣ濃縮バッグはＰＶＣあるいは他のプラスチックで作られる。幹細胞バッグ１０６は、ＥＶＡから作られるが、他のプラスチックも使用できる。これらバッグ１０２や１０６はブロー成形で作ることができる。ＲＢＣ濃縮バッグはＲＦ溶接（誘電加熱溶接、電磁波溶着）されたものであるが、ブロー成形したものでも良い。

処理バッグ１０２は、上縁部１０８、曲線側部１１０、直線側部１１２、テーパー状底部（先細り形状の底部）１１３、および底出口部１１４を含む，非対称形状の三次元的なバッグである。上縁部１０８は入口１１５と２つの穴１１６を含む。あるいは、処理バッグ１０２を、その両側部が底出口部１１４にテーパー状に対称的に向かう対称的な形状にすることもできる。処理バッグ１０２の全体の体積は約２４０ｍＬであるが、使用の際には、通常は約５０−１５０ｍＬの骨髄または臍帯血で満たされる。処理バッグ１０２には、入口１１５に接続される入力ライン１１８を通して供給される。入口ライン１１８は雌型ルアー１２０を含み、これによりバッグセット１００が、処理バッグ１０２内に移動されるべき骨髄や臍帯血を含む注射器に接続される。雌型ルアー１２０は、キャップ１２６により被覆されたスパイク１２４に接続された雄側ルアー１２２に接続されており、これによりバッグセット１００は、処理バッグ１０２内に移動される骨髄や臍帯血を含む採取バッグに接続される。入力ライン１１８は凝血塊および骨片のフィルタ１２８（約２００−３００μメッシュ）を含んでいる。ラインまたは配管のクランプ１３０は、凝血塊および骨片のフィルタ１２８と雌ルアー１２０との間に配置されている。選択的に、入力ライン１１８はサンプリングサイト１３２、サンプリングピロー（サンプリング容器）１３４、およびサンプリングサイト１３６を含めても良く、これらは全て凝固塊および骨片のフィルタ１２８の下側に位置している。サンプリングサイト１３２と１３６は無針（ニードル無し）の雌ルアーと無呼吸型のルアーキャップをそれぞれ含んでいる。底出口部１１４は出力物を処理バッグ１０２から絞り弁１３８に案内する。

ＲＢＣ濃縮バッグ１０４は、平らなバッグで良く、上端部１０５、底縁部１０７、および２つの側縁部１０９を有しており、また、必要な場合には処理の最後においてＲＢＣのアリコート（全体の中から取り出した一部分）を取り除くために使用される、バタフライ型（折り畳み式）のスパイクポート１４０を含んでいる。底縁部１０７は一方の角に入口１１１を含んでいる。ＲＢＣ濃縮バッグ１０４の体積ないし容量は１００ｍＬであるが、使用の際には、通常は約３０−８０ｍＬが満たされる。ＲＢＣ濃縮バッグ１０４は入口１１１において、絞り弁１３８のコネクタ１３９の１つで絞り弁１３８に接続された、供給ライン１４２に接続される。

幹細胞バッグ１０６は、正方形の三次元的なバッグである。幹細胞バッグ１０６は、上端部１１７、底端部１１９、大区画部１４４、および小区画部１４６を含んでおり、区画部１４４と１４６は２つのチャネル（流路）１４８により接続されている。上端部１１７は入口１２１と、プロセスの終わりに幹細胞を取り除くために使用される２つのスパイクポート１５０を含んでいる。幹細胞バッグ１０６の体積ないし容量は約３０ｍＬであるが、使用の際には通常は約２５ｍＬが満たされ、このうち約２０ｍＬが大区画部１４４にまた約５ｍＬが小区画部１４６に入る。幹細胞バッグ１０６は入口１２１において、Ｆコネクタ１５４を介して供給ライン１５６に接続された幹細胞バッグ入口ライン１５２に接続される。供給ライン１５６は、絞り弁１３８のコネクタ１３９の１つで絞り弁１３８に接続される。Ｆコネクタ１５４は、供給ライン１５６と幹細胞バッグ入力ライン１５２を分岐ライン１５８に接続する。分岐ライン１５８はサンプリングライン１６２および抗凍結剤供給ライン１６４にＴコネクタ１６０を介して接続される。サンプリングライン１６２は、ラインクランプ１６４とサンプリングサイト１６６を含み、サンプリングピロー１６８で終端する。抗凍結剤供給ライン１６４はサンプリングサイト１７０とラインクランプ１７２を含み、無菌（殺菌）フィルタ１７４（好ましくは約０．２μメッシュ）で終端する。サンプリングサイト１６６と１７０はそれぞれ無針の雌型ルアーおよび無呼吸型のルアーキャップを含んでいる。

ライン１１８，１４２，１５６，および１６２は、ＰＶＣ、ＥＶＡあるいは他の材料で作られた配管である。ライン１５２と１５８はＥＶＡで作られた配管である。抗凍結剤供給ライン１６４は、外側がＰＶＣで内側がＥＶＡにより作られた同時押し出し成形された配管である。抗凍結剤に接触するプラスチック材料は、抗凍結剤中に浸出した場合には、幹細胞バッグ１０６内に入り最終生成物を汚染するので、耐凍結剤と接触するラインにおいては、ＥＶＡのような抗凍結剤中に浸出する可塑剤を含まない材料を使用することが好適である。

絞り弁１３８は栓でもある。一つの実施形態では、絞り弁１３８は３方向栓であり、３つのバッグ、つまり処理バッグ１０２、ＲＢＣ濃縮バッグ１０４、および幹細胞バッグ１０６に接続することができる、３つのコネクタ１３９を有している。他の形式の絞り弁あるいは栓、例えば４つのコネクタを有する４方向栓も同様に使用できる。絞り弁１３８は、３つのコネクタ１３９を有する外側部１４１と内側部１４３とを含んでいる。外側部１４１はポリカーボネートで作られる。内側部１４３は一体的に成形され、ポリエチレンから作られたハンドル１４５とバレル（円筒部）１４７を含んでいる。バレル１４７は絞り弁１３８を通る流体流れが許容されない位置として定義される閉じた位置（閉位置）、および絞り弁１３８を通る流体流れが許容される位置として定義される２つの開いた位置（開位置）含む、いくつかの位置の間を移動する。２つの開位置は、絞り弁１３８を通って処理バッグ１０２からＲＢＣ濃縮バッグ１０４への流体流れが許容される１つの位置と、絞り弁１３８を通って処理バッグ１０２から幹細胞バッグ１０６への流体流れが許容される１つの位置とを含んでいる。１つの実施形態では、図３（Ａ）から図３（Ｃ）に示したように、絞り弁１３８のバレル１４７は、３つの可能性のある流体経路、即ち図３（Ａ）に示されたような処理バッグ１０２からＲＢＣ濃縮バッグ１０４への所望の経路、図３（Ｂ）に示されたような処理バッグ１０２から幹細胞バッグ１０６への所望の経路、および絞り弁１３８がその２つの所望の位置の間を移動する際に生じる図３（Ｃ）に示されたようなＲＢＣ濃縮バッグ１０４と幹細胞バッグ１０６との間の意図しない一時的な経路に沿った流体流れを許容する、３つの開口（開口位置）を含むように構成される。このような一時的な流体流れは、ＲＢＣのいくらかのものが追加で幹細胞バッグ１０６内に流れ込んで得られた幹細胞組成の純度が低減する可能性があるので好ましくない。この問題に対処するため、他の実施形態では、代案として、図４（Ａ）から図４（Ｂ）に示したように、絞り弁１３８のバレル１４７を２つの開口（開口位置）だけを含むように構成し、２つの可能性のある流体経路のみ、即ち図４（Ａ）に示されたような処理バッグ１０２からＲＢＣ濃縮バッグ１０４への所望の経路、図４（Ｂ）に示されたような処理バッグ１０２から幹細胞バッグ１０６への所望の経路に沿って流体流れを許容する構成される。この構成は、ＲＢＣ濃縮バッグ１０４と幹細胞バッグ１０６との間の一時的な流体流れの可能性を排除できる。絞り弁１３８は、遠心分離の間に生じる高圧に耐えられる構造のものであり、例えば、約５００ｐｓｉまでの定格を満たすものである。供給ライン１６４は絞り弁１３８からＲＢＣ濃縮バッグ１０４まで通じている。供給ライン１６４は絞り弁１３８からＦコネクタ１５４まで通じており、このコネクタは幹細胞バッグ入力ライン１５２を経て幹細胞バッグ１０６に通じている。ライン１４２、１５２、および１５６はそれぞれ熱シール（ヒートシール）され、バッグセット１００から分離されている。

骨髄または臍帯血から別の成分を分離する必要がある場合には、バッグセット１００に別のバッグを含めれば良い。別のバッグが含まれた場合、絞り弁１３８は、各バッグに対応した追加のコネクタを有し、またバッグセットは絞り弁を各バッグに接続するための別の供給ラインを含む。例えば、処理バッグ１０２内でＲＢＣの最後の部分をＲＢＣ濃縮バッグ１０４内に移動されたＲＢＣから分離したい場合には、４つのバッグセットが使用される。４番目のバッグは別の供給ラインにより絞り弁１３８に接続される。その場合、絞り弁１３８は４つのコネクタを有する四方向栓となり、また処理バッグ１０２から他の４つのバッグのそれぞれへの流体流れを許容するバレルを含んでいる。

図５から１５は処理装置２００の実施形態を示したものである。処理装置２００は略円筒形状であり、上部２０２、底部２０４、前部２０６、後部２０８、側部２１０、および側部２１２を有している。前部２０６は前部ドア２１４および前壁２１６と２１７を含んでいる。処理装置２００は本体２１８、幹細胞バッグ室２２０、底板２２２、支持ブラケット２２４、および処理バッグハンガー２２６を有する。本体２１８と幹細胞バッグ室２２０は好ましくはウレタン成形されたものであるが、他の熱可塑性材料も使用できる。底板２２２は好ましくはステンレススチールから作られる。支持ブラケット２２４は好ましくはアルミニウムから作られる。処理バッグハンガー２２６は好ましくはステンレススチールから作られる。処理装置２００は、断面が円形または楕円形であり最小容量が１Ｌである遠心分離バケット（バケツ）の内側に収まる寸法のものである。図１６に、遠心分離バケット２２８の内側に、バッグセット１００を含む、処理装置２００を示した。図１７は、５つの他の遠心分離バケットが所定位置に既に配置された遠心分離器の内側に遠心分離バケット２２８を装填する方法を示した。

処理装置２００の本体２１８は、処理バッグ１０２を受容する寸法で細長い楕円形状である主室２３０を含んでいる。主室２３０は上部が開口しており、ヒンジ２３２により処理装置２００の前部２０６に取り付けられた前部ドア２１４を開くことでアクセス（利用）できる。主室２３０は、処理バッグ１０２に適合し且つこれを支持するための側壁２３４と２３６および後壁２３８を有しており、処理バッグ１０２のテーパ状底部１１３を受容する寸法のチャネル（溝部）２４０に向かってテーパ状つまり先細り形状となっている。側壁２３４と２３６は、中央部では緩やかに且つテーパ状底部１１３ではよりしっかりと処理バッグ１０２を載置する。遠心分離の高圧の間において処理バッグ１０２およびその内容物を支持してバッグの内容物の乱れを最小限にするために、処理バッグ１０２のテーパ状底部１１３付近での許容誤差をより少なくすることが好ましい。前部ドア２１４はその内面に主室２３０の側壁２３４と２３６およびチャネル２４０に対応した連続面を提供する窪んだ内側凹部２４２を含んでおり、前部ドア２１４が閉じた状態では処理バッグ１０２に適合し且つこれを支持する。

凹部２４４は前壁２１６と２１７の下側で処理装置２００の前部２０６上に配置されており、絞り弁１３８のコネクタ１３９を支持する形状である。弁アクチュエータカフ（弁アクチュエータの折返部）２４６は凹部２４４の内側に設けられ、絞り弁１３８のハンドル１４５を受容する寸法および形状である。弁アクチュエータカフ２４６はネジ２５０によりサーボモータ２４８の軸に取り付けられる。対応する凹部２５２が、前部ドア２１４の内側に絞り弁１３８の突出部およびコネクタを受容する寸法および形状で設けられている。

１つ以上の光センサ２５４は、主室２３０の前壁２１７を介して集合されており、それらの開口は側壁２３６に設けられ、反対側の側壁２３４には同数のＬＥＤ２５６が配置されている。ＬＥＤ２５６は赤色ＬＥＤ光を含むものであるが、他の形式のＬＥＤを使用しても良い。１つの光センサ２５４と一つのＬＥＤ２５６は好ましくはチャネル２４０の約２ｃｍ上部に配置されており、光センサ２５４およびＬＥＤ２５６のレベルと絞り弁１３８のレベルの間にある処理バッグ１０２の体積ないし量は約２ｍＬとなるが、他の距離や対応する体積ないし量を使用しても良い。別の（追加の）光センサとＬＥＤを含ませる必要がある場合は、これらは分離すべきＲＢＣの所望の体積ないし量に応じて、光センサ２５４とＬＥＤ２５６の上側または下側に配置される。

処理装置２００の側部２１２にはノッチ２５８、格納用空洞部２６０、チャネル（溝部）２６２、ＲＢＣ濃縮バッグ用凹部２６４、支持棚２６６、およびフック２６８を含んでいる。ノッチ２５８はＲＢＣ濃縮バッグ１０４のスパイクポート１４０を受容する寸法および形状である。ＲＢＣ濃縮バッグ用凹部２６４は、ノッチ２５８から支持棚２６６に下がっており、ＲＢＣ濃縮バッグ１０４を受容する寸法および形状である。格納用空洞部２６０はノッチ２５８の下側に位置し、またＲＢＣ濃縮バッグ用凹部２６４の背後でこれとつながっている。チャネル２６２はＲＢＣ濃縮バッグ用凹部２６４の内側縁に沿って延在し、前部ドア２１４、上部２０２および後部２０８に隣接している。支持棚２６６は水平な棚で、ＲＢＣ濃縮バッグ用凹部２６４の床面を形成している。

幹細胞バッグ室２２０は、水平な中空の正方形の区画であり、前部ドア２１４のヒンジ２３２の下側に位置する大型の側部２７０を有している。幹細胞バッグ室２６８は、底板２３２の下側に位置し、ロードセル２７２に取り付けられている。幹細胞バッグ室２２０は、下方に開口するヒンジ付きドア２７４を介してアクセスされ、このドアは幹細胞バッグ室２２０の内側に位置するその上端のラッチ２７６を介して所定の位置に嵌め込まれる。ヒンジ付きドア２７４はその内側に、幹細胞バッグ１０６のスパイクポート１５０および入口１２１を収容する寸法と形状である凹部２７８を含む。ヒンジ付きドア２７４はその外側に、幹細胞バッグ入口ライン１５２を収容する大きさのスロット２８０とチャネル２８２を含む。

底部チャネル２８４は、底板２２２の上部で平行に延在しており、ヒンジ２３２の下側の前部２０６から側部２１０と後部２０８を横断して側部２１２に戻っている。底部チャネル２８４はライン１４２を収納する大きさと形状である。

処理装置２００は、側部２１０において上部２０２の上部に延在する処理バッグハンガー２２６を含んでいる。処理バッグハンガー２２６は、処理バッグ１０２上の穴１１６と係合し、処理バッグ１０２を処理装置２００の内側の所定位置に保持するためのタブ２２７を有している。ＬＥＤ窓２２９は側部２１０において上部２０２上に配置されている。

支持ブラケット２２４は、ネジ２２５により底板２２２に取り付けられると共に処理装置２００の側部２１０と２１２に平行に向けられたＵ形状のブラケットである。

図１０に示したように、底板２２２には好ましくは次の構成要素、即ちプリント基板２８６、サーボモータ２４８、ロードセル２７２、およびインタフェース用プリント基板２８８が取り付けられている。プリント基板２８６はプログラム可能な読み取り専用メモリ付きのマイクロコントローラ２９０を含んでいる。マイクロコントローラ２９０は遠心分離の間の熱発生による温度補償を要する。ロードセル２７２は温度補償された歪みゲージロードセルである。サーボモータ２４８は減速ギア式のモータである。プリント基板２８６には１つ以上の加速度計２９２が載置されており、２つ以上の加速度計２９２を使用する場合には、１つは他の上に載置される。好ましくは、加速度計２９２は、約０−２００×ｇを測定する低いｇの加速度計２９１と、約１０００−１７００×ｇを測定する高いｇの加速度計２９３を含む。プリント基板２８６は、ＬＥＤ窓２２９から見ることができるステータスＬＥＤ２９４を含む。１つ以上のステータスＬＥＤ２９４は電池２９６の充電状態や処理中で現在行われてるステップ、並びのその他の情報を表示する。インタフェース用プリント基板２８８は外部の充電器に接続するため、およびパーソナルコンピュータと通信接続を行うために設けられる。底板２２２はネジ２９８により本体２１８に取り付けられる。

図１８は、マイクロコントローラ２９０の入力および出力を示したブロック図である。光センサ２５４、電池電圧３０２、ロードセル２７２、および加速度計２９１と２９３はアナログ信号を発生し、この信号はデジタル信号に変換されてマイクロコントローラ２９０に受信される。マイクロコントローラ２９０は、予め定めた時間間隔でこれらの入力を記録し、記憶し、および分析する。マイクロコントローラはサーボモータ２４８、光センタ２５４用のＬＥＤ２５６、およびステータスＬＥＤ２９４を制御する。絞り弁１３８を含むバッグセット１００が処理装置２００内に正しく設置された場合、サーボモータ２４８はその駆動軸を介して弁アクチュエータカフ２４６に接続され、マイクロコントローラ２９０からの信号に応答して、サーボモータ２４８は、バッグセット１００の各バッグへの流体流れを開いたり閉じたりするために、絞り弁１３８を異なる位置に移動する。

電池２９６は、処理装置２００の側部２１０において上部２０２上の電池用空洞３００内に配置される。電池２９６は充電式のニッケル水素電池であり、全部で約３．８−４ボルトである３つのセルを含んでおり、この電圧は５ボルトの定電圧を提供するために調整される。電池２９６はマイクロコントローラ２９０、光センサ２５４、加速度計２９１および２９３、ロードセル２７２、光センサＬＥＤ２５６、ステータスＬＥＤ２９４、サーボモータ２４８、およびパーソナルコンピュータとの通信を含む処理装置２００内の全ての電気回路に電力供給する。

処理ユニット２００は、充電器を含む別のドッキングステーション（接続用架台）内に配置され、またパーソナルコンピュータに接続される。インタフェース用プリント基板２８８を介してドッキングステーションを経て、マイクロコントローラ２９０からのデータはパーソナルコンピュータに転送され、またパーソナルコンピュータからのコマンド（命令）が受信される。

図１２から１５に示したように、バッグセット１００は次のように処理装置２００内に挿入される。幹細胞バッグ１０６は、最初に底端部１１９を嵌め込み、また小区画部１４６が大型の側部２７０内に折り重なって配置されるように、幹細胞バッグ室２２０内に配置される。入口１２１とスパイクポート１５０は、ヒンジ付きドア２７４の凹部２７８の内側に配置される。幹細胞バッグ入力ライン１５２はヒンジ付きドア２７４のスロット２８０内に配置される。ヒンジ付きドア２７４は次いで閉じられ、またラッチ２７６により留められる。幹細胞バッグ入力ライン１５２がチャネル２８２内に配置される。絞り弁１３８のハンドル１４５が弁アクチュエータカフ２４６内に配置される。処理ユニット１０２は、前部ドア２１４が処理バッグ１０２の直線側部１１２を上から閉じるように、主室２３０内に向けられる。Ｆコネクタ１５４がＲＢＣ濃縮バッグ用凹部２６４の内側に配置される。ラインクランプ１６５が閉じられ、サンプリングライン１６２に沿ってチャネル２６２の内側に配置される。抗凍結剤供給ライン１６５、ラインクランプ１７２（閉じられている）、およびサンプリングサイト１７０が格納用空洞部２６０内に配置され、格納用空洞部２６０の右側壁容器内に無菌フィルタ１７４が配置される。サンプリングサイト１６６はフック２６８において固定される。サンプリングピロー１６８はＲＢＣ濃縮バッグ用凹部２６４の右側のフィルタ容器の直ぐ下の凹部内に収容される。次いで、供給ライン１４２が底部チャネル２８４内に配置され、またＲＢＣ濃縮バッグ１０４がＲＢＣ濃縮バッグ用凹部２６４内に配置される。入力ライン１１８およびサンプリングサイト１３６は下側に折り込まれ、側部２１０の処理バッグハンガー２２６に向けられる。処理バッグ１０２の穴１１６はハンガー２２６のタブ２２７に取り付けられる。前部ドア２１４が閉じられる。支持棚２６６上の底縁部１０７と共に、スパイクポート１４０がノッチ２５８内に嵌められ、ＲＢＣ濃縮バッグ１０４が格納用空洞２６０上に嵌められる。分岐ライン１５８は格納用空洞２６０の左側に沿って垂直に配置される。

（骨髄または臍帯血から幹細胞および前駆細胞組成を回収する方法）
この方法は、骨髄または臍帯血を細胞密度および大きさ（寸法）により階層化および分離する、遠心分離を含んでいる。処理される骨髄または臍帯血は、ＣＤ３４＋およびＡＬＤＨ Ｂｒ＋幹細胞マーカーの存在により示されるように、血漿、ＲＢＣ、ＷＢＣ、および幹細胞を含んでいる。得られた幹細胞生成物は、幹細胞と前駆細胞の組成物であり、また少しのＷＢＣと、著しく減じられたＲＢＣおよび血漿を含んでいる。この方法は、上記したシステムを使用して、無菌の機能的に閉じられた様々な体積ないし量の骨髄または臍帯血を処理すると共にユーザにより事前に選択される体積ないし量の最終生成物を産出することができるシステム内で実施される。この方法は、過剰ないし余分なＲＢＣと血漿、および臨床的に好ましい場合は好中球と血小板を取り除くことで骨髄の体積を著しく減じ、これにより、最終的な幹細胞組成内における幹細胞を濃縮する。この方法では生体異物添加剤は必要とせず、骨髄または臍帯血から高率で幹細胞および前駆細胞を回収する。

本明細書中で使用したように、「ｇ力」の用語は、相対遠心力を指し、特定のｇ力に対する全ての言及は処理装置２００内の光センサ２５４の位置において決定される。ここで、本明細書において言及される具体的ないし特定のｇ力および時間期間は、本発明の１つの実施形態で例示されたものであり、これら言及された以外のｇ力と時間期間も同様に有用であり、本方法の他の実施形態において包含される。

１．骨髄または臍帯血が処理バッグ内に移動される。
骨髄または臍帯血は、バッグ、注射器、あるいは他の容器のような採取（収集）容器内に採取され、へパリンやＣＰＤのような抗凝固剤つまり抗血液凝固剤と共に保存され、および処理バッグ１０２内に移動される。この移動は、スパイク１２４を採取バッグ内に挿入し、雌型ルアーを注射器に取り付け、あるいは無菌接続装置を使用して採取バッグの配管を処理バッグに無菌結合することで行われる。ラインクランプ１３０が開かれる。骨髄あるいは臍帯血は次いで、採取容器から処理バッグ１０２に重力流れで入力ライン１１８を介して移動する。骨髄または臍帯血は、凝血塊および骨片のフィルタ１２８を通過し、処理バッグ１０２に到達する前にこのフィルタにより凝血塊（血栓、脂肪球、骨片など）が骨髄または臍帯血から取り除かれる。骨髄または臍帯血が移動した後は、入力ライン１１８が上記のサンプリングサイト１３２において熱シールされ、採取容器、凝固塊および骨片フィルタ１２８およびライン１１８の残りが取り除かれる。

約２５−２００ｍＬ、好ましくは約５０−１７０ｍＬの体積の骨髄または臍帯血が処理バッグ１０２内に入れられる。採取された骨髄または臍帯血の最初の体積が約１００ｍＬであり、骨髄または臍帯血のヘマトクリット値が約３０％である場合、ＲＢＣの体積は約３０ｍＬであり、ＷＢＣと幹細胞および前駆細胞の体積は約１ｍＬであり、残りは血漿である。

意外ではあるが、上記したように、この方法を実施して骨髄または臍帯血から幹細胞および前駆細胞を回収するためには、沈殿剤や他の生体異物添加剤は必要としない。ＨＥＳのような沈殿剤が必要な場合は、処理バッグ１０２内の骨髄に適宜加えられる。

必要ならば上記のサンプリングサイト１３２における熱シールの後に、処理される骨髄または臍帯血のサンプルが処理バッグ１０２から採取される。サンプリングピロー１３４はこのピロー内にサンプルを取り出すために圧迫され圧迫解除される。次いで入力ライン１１８は上記のサンプリングサイト１３６において熱シールされ、またサンプリングピロー１３４はサンプリングサイト１３２と共に取り除かれる。サンプリングピロー１３４内の骨髄または臍帯血は次いで、細胞計数、細胞活性、微生物汚染、およびＨＬＡ分析などの別の分析のためにサンプリングサイト１３２を介してアクセスされる。

処理バッグ１０２からサンプルが取り出されない場合には、入力ライン１１８は上記のサンプリングサイト１３６において熱シールされ、サンプリングサイト１３６の上部の全ての構成要素が取り除かれる。

２．装填されたバッグセットは処理装置内に配置される。
各バッグ、各ラインおよび絞り弁を含む、バッグセット１００が上記のように処理装置２００内に配置される。
図１６および１７に示されるように、冷却する構成とすることもできる処理装置２００はバッグセット１００と共に、遠心分離器の遠心分離バケット２２８内に配置される。遠心分離器は、他の処理装置２００あるいは適当な釣り合い重りによりバランスがとられる。

３．バッグセットは処理装置内で十分なｇ力および骨髄あるいは臍帯血の各細胞が処理バッグ内で、それらの密度および大きさに基づいて各層に階層化されるのに十分な経過時間で遠心分離される。

処理装置２００内のバッグセット１００は、予め設定されたｇ力、および処理バッグ１０２内の骨髄または臍帯血の細胞集合が細胞密度および大きさで各層に階層化されるのに十分な予め設定された時間だけ遠心分離される。例えば、遠心分離は、約１４００×ｇで約２０分から４０分の間だけ行われる。この階層化ステップの間において、絞り弁１３８はその閉じた位置にあり、このため、絞り弁１３８を通る流体流れはない。遠心分離の間に加速度計２９３はｇ力を測定ないし計測する。

遠心分離は好ましくは各細胞が３つの層に階層化されるまで継続される。図１９を参照すれば、この図にこの階層化ステップが完了した後の処理バッグ１０２が示されている。下側の最も密度の高い層４００は主にＲＢＣであり、密度が中間の中央の層４０２はＷＢＣ／幹細胞と前駆細胞、および少しの血小板であり、密度が最も薄い層４０４は主に血漿であり少しの血小板がある。幹細胞および前駆細胞と一緒に存在する血小板の割合は遠心分離の期間の増加と共に増大する。１４００ｇ力と２０−４０の遠心分離時間とすれば幹細胞の７０％超がＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層に移行するのに十分であるが、この層内に幹細胞の少なくとも約８０％から９０％を移行させることが好ましい。

４．処理バッグからＲＢＣ濃縮バッグ内にＲＢＣの大部分を分離させて移動させるために小さいｇ力でバッグセット１００は処理装置内で遠心分離される。
前のステップにおいて処理バッグ１０２内で各細胞が階層化した後、処理バッグ１０２からＲＢＣ濃縮バッグ１０４内にＲＢＣの大部分を分離させ移動させるのに十分な時間だけ予め定められた小さいｇ力で、バッグセット１００は処理装置２００内で遠心分離される。このｇ力は、ＲＢＣ層が制御下で細胞損傷の危険性を最小限にした状態で処理バッグ１０２から絞り弁１３８を通り、供給ライン１４２を通ってＲＢＣ濃縮バッグ１０４内に流れるため、上記のステップ３で使用されたｇ力よりも小さい。例えば、遠心分離は約８０×ｇで約１０分間だけ行われる。この遠心分離ステップは、先のステップのｇ力を予め設定したより低いｇ力に自動的に減じることで先の階層化ステップの遠心分離と連続的に行われるか、あるいは先の遠心分離ステップが完了し停止した後に開始して行われる。

加速度計２９１は遠心分離の間においてｇ力を計測ないし測定する。予め設定されたｇ力が安定化した加速度計２９１からの入力をマイクロコントローラ２９０が受信すると直ちに、例えば約３０秒の間、マイクロコントローラ２９０はサーボモータ２４８に指令を出して弁アクチュエータカフ２４６が、処理バッグ１０２から供給ライン１４２を通りＲＢＣ濃縮バッグ１０４までの流体経路が形成される位置まで絞り弁１３８が開くようにする。絞り弁１３８が開いている間は、濃縮された（押し詰められた）ＲＢＣからなる処理バッグ１０２内の下側の層の多くはＲＢＣ濃縮バッグ内に流れる。

絞り弁１３８が開くと同時に、マイクロコントローラ２９０は、処理バッグ１０２内の骨髄または臍帯血を通るＬＥＤ２５６からの光の透過率をＬＥＤ２５６による流体流れとして読み取るように光センサ２５４に指令を出す。マイクロコントローラ２９０は、光センサ２５４からの時間を関数とする入力として受信する光透過率を連続的に記録および分析する。図２０は、各細胞層がＬＥＤ２５６および光センサ２５４を通過する際の、遠心分離の間の時間を関数とする相対的な光透過率を示したものであり、絞り弁１３８が開いた後のステップ４から開始し、ステップ８を通って継続しており、随意的なステップ５は除外してある。この線は略Ｓ形状の曲線であり光透過率が僅かであるかゼロであり線は略水平である領域Ａ、光透過率の量が著しく増加し線の傾きが急勾配である領域Ｂ、および光透過率が高い大きさで線が略水平である領域Ｃを有している。

このステップの間において、ＲＢＣ層は光センサ２５４を通過して流れる。ＲＢＣ層は細胞の濃度が高いため、光センサ２５４への光の透過を妨害する。よって、このステップの間は、図２０の領域Ａで示したように、光センサ２５４はＬＥＤ２５６から殆ど光りを検知しないか全く検知しない。

ＲＢＣ層が光りセンサ２５４を流れ過ぎた後は、ＲＢＣ層とＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層との間の界面が光センサ２５４のそばを流れる。この層はＲＢＣ層よりも細胞の濃度が小さいため、光センサ２５４はＬＥＤ２５６からのより多くの光を検知する。ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の組成の層の通過の開始を意味する、予め定められた光透過率の量に到達したことをマイクロコントローラ２９０が光センサ２５４から伝達されると、マイクロコントローラ２９０は、弁アクチュエータカフ２４６により絞り弁１３８を閉じさせるようにサーボモータ２４８に指令し、これにより、絞り弁１３８を通る流体流れが止まる。これは図２０において点Ｄにより示される。よって、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層の最下層部分が光センサ２５６に到達し始めると直ちに絞り弁１３８は閉じられる。

この分離ステップの後、処理バッグ１０２内には約２ｍＬの濃縮されたＲＢＣが残っており、ＲＢＣの体積の大部分はＲＢＣ濃縮バッグ１０４内に移動している。例えば、ヘマトクリット値が３０％である採取された骨髄の元の１００ｍＬの体積は、約２８％の体積のＲＢＣ（約９３％）はＲＢＣ濃縮バッグ１０４内にあり、約２ｍＬ（７％）の体積のＲＢＣは処理バッグ１０２内に残っている。

５．バッグセットは処理装置内で処理バッグ内の細胞が細胞の密度と大きさに基づいて階層化されるのに十分なｇ力と経過時間で随意的に遠心分離される。
これは随意的ないし任意的なステップである。このステップが実行されない場合、本方法は次のステップに進む。

前の分離ステップおよび細胞溶液が絞り弁１３８を通って取り除かれる際に発生するコリオリの力の結果、ＲＢＣ層の残りの部分、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層の全部、およびプラズマ層の全部を含む処理バッグ１０２内の各細胞層は、それらの境界がやや明確でなくなりそれらの界面でより混ざった状態となる。この随意的なステップでは、処理装置２００内のバッグセット１００は、残りの細胞が細胞密度および大きさにより、より明確な各層に階層化するのに十分となるような予め定められたｇ力および時間で遠心分離される。例えば、この遠心分離は約１４００×ｇで約５から１５分の間だけ行われる。この遠心分離ステップは、遠心分離を自動的にｇ力が増大するようにプログラムすることで前の分離ステップの遠心分離と連続的でも良く、あるいは前の遠心分離ステップが完了し停止した後に開始して行うようにしても良い。

この遠心分離ステップの間において、絞り弁１３８は閉じた位置にされ、これにより絞り弁１３８を通る流体流れが阻止される。遠心分離は好ましくは、各細胞が３つの層、つまり下側の残りのＲＢＣ層、中間のＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層、および上側の血漿相に再階層化され且つ各層間の界面での混合が低減されるまで継続される。遠心分離の力および時間は、幹細胞の７０％超がＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層に配置される結果を得るものであれば十分であるが、幹細胞の少なくとも約８０％から９０％がこの層内に配置される結果が得られるものであればより好ましい。

６．バッグセットが処理装置内で遠心分離される間に絞り弁は連続して多数回の開と閉を速く繰り返すことで、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層の移動なしに、残りのＲＢＣの大部分を処理バッグからＲＢＣ濃縮バッグ内により正確に移動させる。
前の随意的な再階層化ステップの後、あるいはこの再階層化ステップが行われない場合には先の分離ステップの後に、処理装置２００内のバッグセット１００はこのステップおよびステップ７と８を完了するのに十分な予め定められたｇ力および予め定められた時間間隔で遠心分離される。例えば、この遠心分離は、ステップ４で使用されたのと同じｇ力である約８０×ｇで、約５から１５分の間だけ行われる。

このステップでは、処理バッグ１０２内の残りのＲＢＣの殆どの部分がＲＢＣ濃縮バッグ１０４内に正しく移動される。低いｇ力の目的は、細胞損傷の危険性を最小限となる制御された方法でＲＢＣが処理バッグ１０２からＲＢＣ濃縮バッグ１０４内に流れるようにするためである。この遠心分離ステップは、前のステップが再階層化である場合には遠心分離を自動的にｇ力が減じるようにプログラムすることで前のステップと連続的とすることができ、あるいは前のステップが分離であれば同じｇ力で遠心分離を継続させれば良いし、あるいは前の遠心分離ステップが完了して停止した後に開始および実行しても良い。

加速度計２９１は遠心分離の間におけるｇ力を計測する。マイクロコントローラ２９０が予め定められたｇ力が安定化したことを加速度計２９１からの入力を受信したら直ちに、例えば約３０秒間、マイクロコントローラ２９０はサーボモータ２４８に指令を出して弁アクチュエータカフ２４６が絞り弁１３８を開く位置にさせ処理バッグ１０２から供給ライン１４２を介してＲＢＣ濃縮バッグ１０４への流体経路を生成させ、次いで閉じさせ、この開および閉を予め定められたサイクル数で予め定められた期間で予め定められた間隔で連続的に多数回繰り返すことで、処理バッグ１０２からＲＢＣ濃縮バッグ１０４に対して繰り返され、血漿層が光センサ２５４のレベルに達するのに十分な不連続な時間の量で繰り返される。例えば、絞り弁１３８は約０．１から０．２秒の期間だけ開におよび約１０秒間だけ閉に設定され、このサイクルが約１０から約３０回繰り返されるが、他の期間、間隔、および繰り返しの組合せでも良い。絞り弁１３８が開いたり閉じたりする際に、処理バッグ１０２内のＲＢＣの残りの部分はＲＢＣ濃縮バッグ１０４内に流れる。この正確な赤血球の取り除きステップにより、前ステップの後に処理バッグ１０２内に残っていたＲＢＣ量の２ｍＬのうちの約１から１．５ｍＬが処理バッグ１０２からＲＢＣ濃縮バッグ１０４に流れ、処理バッグ１０２内に残るＲＢＣの量がさらに減じられる。これは、絞り弁１３８を素早く開いたり閉じたりする度に僅かな量のＲＢＣが移動することによるものであり、ＲＢＣは幹細胞および前駆細胞と混ざることがなく、またコリオリの力により幹細胞および前駆細胞は移動された赤血球中に吸い込まれることがない。この手法により、必要に応じて、残りのＲＢＣの多くの部分をＲＢＣ濃縮バッグ１０４内に移動できる。

この最後の細かい計量動作は、処理バッグ１０２内の各細胞層がＬＥＤ２５６のそばを流れる際における、ＬＥＤ２５６からの光の透過率の光センサ２５４における測定値を受領したマイクロコントローラ２９０により指示されたものである。マイクロコントローラ２９０は光透過率を時間を関数として連続して記録および分析し、前の値を現在の値と比較する。このステップの間、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層は光センサ２５４を通過して流れる。この層はそのＲＢＣ層との界面では細胞密度がより高く、またその血漿相との界面ではその細胞密度がより小さいことから、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層が光センサ２５４を通過して血漿相との界面が近づくと光透過率が徐々に増加する。よって、このステップの間、光センサ２５４はＬＥＤ２５６からの光の透過率における一様な増大を検知する。これは図２０の領域Ｂでの線の傾きにより示される。

ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層が光センサ２５４を通過した後は、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層と血漿相との間の界面が光センサ２５４のそばを流れるようになる。血漿相はＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層よりも細胞が少ないので、ＬＥＤ２５６から光センサ２５４により検知される光が多くなる。マイクロコントローラ２９０は、光センサ２５４が予め定められた変化率の値を検知したことに基づいて、光透過率の変化の割合（変化速度）が予め定められた減少であることを光センサ２５４からの入力を受信したならば、サーボモータ２４８にバルブアクチュエータカフ２４６が絞り弁１３８を閉じるように指令を出し、これにより絞り弁１３８を通るＲＢＣの移動は終了する。これは図２０の点Ｅにより示され、領域Ｂの線の急勾配の傾きから領域Ｃにおける略水平な線への移行部であり、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の組成の層が光センサ２５４の下側を通過し、血漿相が光センサ２５４を通過し始める時点である。よって、血漿相の最下部が光センサ２５４に到達し始めると直ぐに絞り弁１３８は閉じられる。

この分離ステップの後、処理バッグ１０２内には約０．５から１．０ｍＬの量のＲＢＣが残り、他の１から１．５ｍＬの量のＲＢＣはＲＢＣ濃縮バッグ１０４内に移動する。

７．バッグセットが遠心分離されている間に処理装置は空の幹細胞バッグをゼロに風袋する（空の幹細胞バッグの自重をゼロにする）。
前のステップにおいて絞り弁１３８が閉じられた後は、遠心分離はステップ６で設定されたｇ力と時間で継続される。加速度計２９１が設定されたｇ力を確認すると、この時点でロードセル２７２とマイクロコントローラ２９０は協力して、空の幹細胞バッグ１０６の重さをゼロに風袋する。

８．バッグセットが処理装置内で遠心分離される間に絞り弁は連続して多数回の開と閉を速く繰り返すことで、残りのＲＢＣの僅かな量、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層、および少量の血漿を処理バッグから幹細胞バッグ内に分離および移動する。
処理バッグ１０２内でのバッグセット１００の遠心分離は、ステップ６において設定されたｇ力および時間で継続される。マイクロコントローラ２９０は、空の幹細胞バッグ１０６の重さがゼロに風袋されたことをロードセル２７２からの入力として受信したならばサーボモータ２４８に次の指示を行う。即ち、弁アクチュエータカフ２４６が絞り弁１３８を開いて処理バッグ１０２から供給ライン１５６と幹細胞バッグ入力ライン１５２を通り幹細胞バッグ１０６への流体経路が生成される位置にすると共に、次いで閉じるようにし、この開と閉を予め定められたサイクル数で予め定められた間隔で予め定められた期間だけ連続的に繰り返され、幹細胞バッグがその予め定められた重さに到達するまで充填されるのに十分な個別の時間の量だけ、処理バッグ１０２から幹細胞バッグ１０６へのアクセスが繰り返される。例えば、絞り弁１３８は約０．１から０．２秒の期間だけ開き、約１０秒の間だけ閉じ、このサイクルを多数回繰り返すように設定される。絞り弁１３８が開いたり閉じたりする際に、処理バッグ１０２内の血漿のいくらかは幹細胞バッグ１０６内に流れ込む。このステップにおいて小さいｇ力とした目的は、大きなｇ力では発生する細胞損傷の危険性を最小限にする制御された方法で、これらの細胞を処理バッグ１０２から幹細胞バッグ１０６内に導くことである。

この分離ステップの間において、ロードセル２７２は幹細胞バッグ１０６の重さないし重量を計測し、マイクロコントローラ２９０はロードセル２７２からのこの入力を受領する。ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層の望ましい重さは予め設定されており、これは約３グラムから約３０グラムに設定される。例えば、幹細胞バッグ１０６内の最終的な幹細胞生成物の所望の量が１０ｍＬであれば、１０グラムの重さが使用される。マイクロコントローラ２９０は、幹細胞バッグ１０６が予め設定された重さに到達したというロードセル２７２からの入力を受信したならば、サーボモータ２４８に、弁アクチュエータカフ２４６が絞り弁１３８を閉じて絞り弁１３８を通る流体流れが止まるように指示する。

絞り弁１３８が閉じた後は、遠心分離は、同じｇ力でステップ６において設定された予め定められた時間に達するまで継続される。

９．遠心分離が終了すると、バッグセットは処理装置から取り外される。
予め定められた遠心分離期間が終わると、遠心分離は停止し、処理装置２００は遠心分離器から取り外される。全てのバッグ、絞り弁１３８、および各ラインを含む、バッグセット１００は、処理ユニット２００から取り出される。

幹細胞バッグ１０６は、残りのＲＢＣ、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞、いくらかの血漿を含む。幹細胞バッグ１０６の内容物を本明細書では「幹細胞組成（組成物）」あるいは「幹細胞の組成（組成物）」と称する。ＲＢＣ濃縮バッグ１０４はＲＢＣを含む。処理バッグ１０２は、幹細胞バッグ１０６に含まれない血漿の残りを含む。

必要に応じて、ＲＢＣ濃縮バッグ１０４および幹細胞バッグ１０６からのサンプルが取り出される。サンプリングライン１６２、サンプリングピロー１６８、サンプリングサイト１６６、およびラインクランプ１６４は幹細胞バッグ１０６をサンプリングするために使用される。

幹細胞組成が直ちに使用される場合、例えば自己（自家）使用の場合には、幹細胞バッグ１０６は次いでSebraシーラー（アリゾナ州、トゥーソンのSebra Corp.）を使用してバッグセット１００の残りのものから分離される。

幹細胞組成が冷凍される場合は、ＤＭＳＯ溶液のような抗凍結剤溶液が、無菌フィルタ１７４および抗凍結剤供給ライン１６５を介して幹細胞バッグ１０６に加えられる。

幹細胞の原料として骨髄および臍帯血を使用する方法の実施例
公認ないし認定を受けたベンダー（売り主、業者）から、人の血漿が５ユニットと、臍帯血が６ユニットだけ１から３日以内に収集ないし採取された。以下の表は、本発明の方法により処理された骨髄および臍帯血から得られたデータを示したものである。骨髄はヘパリンにより、また臍帯血はＣＰＤによりそれぞれ抗凝固処理された。処理装置を含む寸法の卓上型の遠心分離器は遠心力場を提供する。この実験では沈殿補助のための生体外異物添加剤は使用していない。以下の表１には、骨髄および臍帯血の実験のために利用される本発明の各ステップの要約が示されている。

骨髄および臍帯血のサンプルが処理前に取り出され、また最終生成物（幹細胞組成）のサンプルが処理後に取り出された。ＲＢＣ、ＷＢＣ、血小板、好中球、リンパ球、単球の細胞計数が、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ−２１００を使用して行われた。処理前および処理後のサンプルについて、市販のStem-Countキット（細胞計数キット）（フロリダ州、マイアミのBeckman Coulter, Inc.）を使用し製造者の取扱説明書に従って、ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ４５＋細胞（全ての白血球および殆どのＣＤ３４＋細胞について発現される抗原）の計数が行われた。このキットは、フローサイトメトリーにより、ＣＤ３４＋および二元ＣＤ４５＋の同時同定および計数、ＣＤ３４＋の細胞密度率、および生物サンプルにおける絶対細胞数を行うことができる。ＣＤ４５＋細胞の生存性は、生体染色７−ＡＡＤの色素除外に基づいて決定される。細胞集団の計測は、適切に構成されたBeckman Coulter FC-500フローサイトメトリー（フロリダ州、マイアミのBeckman Coulter, Inc.）上で、適切な制御および分析を行うフローサイトメトリーにより得られる。ＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞の同定および計数は、骨髄ユニット１，２および３からのサンプルについて処理の前後で、市販のAldecount kit (ノースカロライナ州、ダラムのAldagen)とBeckman Coulter FC-500フロー血球計数機を使用して、取扱説明書に従って行った。キットに設けられた試薬は、幹細胞を明るい蛍光緑に染色した。これらの細胞はAldagen明細胞（ＡＬＤＨ Ｂｒ＋）であると示された。

Ａ．骨髄データ
表２は、処理前の５つの試験における骨髄の体積および細胞計数を示したものである。各ユニットにおけるＲＢＣ、血小板、ＴＮＣ、好中球、リンパ球、単球、ＭＮＣ、ＣＤ３４＋細胞、およびＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞の全数が示されている。ＮＤの項目はデータが「未定である」ことを意味する。

表３は、表２において参照される５つのユニットから５つの試験で得られた幹細胞組成に対する体積およびセル計数を示している。各ユニットにおけるＲＢＣ、血小板、ＴＮＣ、好中球、リンパ球、単球、ＭＮＣ、ＣＤ３４＋細胞、およびＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞の全数が示されている。

表４は、表２および３に示された５つの実験の結果に基づく、各細胞タイプの回収率を示している。回収率は、幹細胞組成（表３）内の細胞計数を、骨髄処理サンプル（表２）における対応する値で割ると共に、この商（quotient）を１００倍することで計算される。例えば、実験１において、ＲＢＣの回収率は、「６，７００×１０^６」を「３２９，０００×１０^６」で割り、その商を１００倍することで計算され、回収率２．０％（表４）が得られる。減少率は１００％から回収率を引くことで簡単に計算される。例えば、実験１において、赤血球の減少率は１００％−２．０％＝９８％となる。

表４のデータは、意外なことにＲＢＣ（２．１％回収）の減少を平均で９７．９％で達成する一方、ＣＤ３４＋細胞およびＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞（それぞれ平均回収率が９８．９％、９２．０％）により測定される幹細胞が９０％超で回収できることを例証している。さらに意外なことには、表４は幹細胞の９０％超が回収される一方、好中球は平均で５９％だけの回収がされる。このような骨髄の選択的な分離のレベルは生体異物である沈殿剤の使用を必要として見込めるものである。

表５と６は、表２と３のデータに基づく、処理前の骨髄や幹細胞組成中のＲＢＣの有核細胞型に対する割合を示したものである。これら細胞の互いに対する割合は、自然界で見つけることができず、あるいは他のいずれかの細胞処理システムにより作ることができない、独特な珍しい幹細胞組成である。非常に少数のＲＢＣを備えた幹細胞組成を作成することは、幹細胞治療にとって重要な進歩であり、幹細胞輸血における過剰な赤血球に関連する悪影響がなく、免疫親和性あるいはフローサイトメトリー法でのさらなる純化プロセスに貢献する細胞生成物のための、安全な細胞生成物を作ることができる。特に、表５と６のデータは、処理前の骨髄は、ＲＢＣのＣＤ３４＋に対する平均的な割合が最初は２５，６４２：１であり処理後は、幹細胞組成におけるこの割合は５３９：１である。このようにＲＢＣの幹細胞組成に対する割合を劇的に減じることは、ＣＤ３４＋細胞を失うことなくＲＢＣを選択的に除くための本方法の成功を反映している。赤血球のＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞に対する割合でも同様な低減が観察される。

これらの細胞集団の単一性はそれらに含まれる生存細胞に固有のものである。表７は、市販のキット（カリフォルニア州、フラートンの Beckman CoulterのStem-Kit）を使用して計測した、骨髄中のＣＤ４５＋の細胞生存性（生存率）の結果の分析を含んでいる。処理後におけるＣＤ４５＋細胞の生存性の大きな変化はなく、これは本プロセスの生体適合性を例証している。

Ｂ．臍帯血データ
表８は、処理前の６つの臍帯血ユニットの体積および細胞計数を示した。各ユニットにおけるＲＢＣ、血小板、ＴＮＣ、好中球、リンパ球、単球、ＭＮＣ、およびＣＤ３４＋細胞の全数が示されている。

表９は、表８において参照した臍帯血の対応するユニットからの６つの実験で得られた幹細胞組成に対する体積および細胞計数を示している。処理後の各ユニットにおけるＲＢＣ、血小板、ＴＮＣ、好中球、リンパ球、単球、ＭＮＣ、およびＣＤ３４＋細胞の全数が示されている。

表１０は、表８および９で提示された６つの実験の結果に基づく、各細胞型の回収率を示したものである。回収率は、幹細胞組成（表９）における細胞計数を臍帯血の処理前のサンプル（表８）における対応する値で割り、この商を１００倍したものである。

表１０のデータは、ＲＢＣ（２．０％回収）の平均減少について９８．０％を達成することが可能である一方、ＣＤ３４＋マーカーにより測定される幹細胞を平均９５％で回収できることが例証されている。さらに、表１０は、好中球が平均５５％だけの回収であるのに対して幹細胞は平均で９５％の回収ができたことが例証している。骨髄については、このレベルの選択的な細胞分離を達成するために生体異物剤による沈殿作用を使用することが必要であると予測される。

以下の表１１および１２は、表８および９のデータに基づいて、処理前の臍帯血中および臍帯血の幹細胞組成中におけるＲＢＣの種々の他の細胞型に対する割合を示したものである。これらの細胞の互いに対する割合は、生体異物添加剤の存在なしでは自然界でも見出せず、あるいは他のいずれの細胞処理システムにより生成できない、特異な幹細胞組成を規定している。これら幹細胞組成の単一性は、赤血球の著しい減少および生体異物添加剤の添加がないことと共に、幹細胞が生存していることが必要である。原料の骨髄または臍帯血中に生存する幹細胞と前駆細胞の殆どを含むと共にＲＢＣのＣＤ３４＋細胞に対する割合が非常に小さい幹細胞組成を利用できることは、幹細胞治療にとって重要な進歩であり、幹細胞輸血における過剰な赤血球に関連する悪影響がない、安全な細胞生成物を作ることができる。

ＲＢＣのＣＤ３４＋に対する平均的な割合は、最初は２０１，８３４：１であり、処理後は５，００７：１に低減する。ＲＢＣの幹細胞に対する割合のこの劇的な低減は、ＣＤ３４＋細胞を大きく損失することなしに選択的にＲＢＣを削減できるという本方法の成功を反映している。

これらの細胞集団の単一性はそれらに含まれる生存細胞に固有のものである。
表１３は、Stem-Kitを使用して計測した、臍帯血中のＣＤ４５＋の細胞生存性（生存率）の結果の分析を含んでいる。ＣＤ４５＋細胞の生存性における大きな変化はなく、処理後の臍帯血生成品における幹細胞の生存性の維持を例証しており、代理として認められるものである。

幹細胞組成
上記した本発明の方法は、幹細胞、血漿、ＲＢＣ、および赤血球を含む骨髄または臍帯血から派生し、生体異物添加剤のない幹細胞の組成物を生じる。血漿に由来する幹細胞組成は、ＣＤ３４＋細胞またはＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞により測定されるように、各ＴＮＣに対してＲＢＣが約５、各好中球に対してＲＢＣが約１０、各ＭＮＣに対してＲＢＣが約１８、および各幹細胞に対してＲＢＣが約４００から５００の割合を有している（表６）。臍帯血に由来する幹細胞組成は、ＣＤ３４＋細胞により測定されるように、各ＴＮＣに対してＲＢＣが約１１、各好中球に対してＲＢＣが約２４、各ＭＮＣに対してＲＢＣが約２３、および各幹細胞に対してＲＢＣが約５，０００の割合を有している（表１２）。

血漿に由来する幹細胞組成は、約７９％から約１００％のＣＤ３４＋細胞、および約７４％から約１００％のＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞が回収されており、一方、ＲＢＣの約９７％から約９９％が減じられている。臍帯血に由来する幹細胞組成は、約７７％超で約１００％までのＣＤ３４＋細胞が回収されており、一方、ＲＢＣの約９６％から約９９％が減じられている。

上記の各結果は、骨髄または臍帯血内の幹細胞が、分離およびＲＢＣを処理バッグからＲＢＣ濃縮バッグ内に移動するプロセスを通して、ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞層内でその比較的高い位置（赤血球層よりも血漿相に近い）を維持でき、また好中球はＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞層内で比較的低い位置（赤血球層により近い）を維持するという、予想外の成果を実証している。処理バッグから流出するＲＢＣは、コリオリの効果およびＲＢＣが絞り弁に向かって下方に流れる際の層流によって、幹細胞、好中球、および赤血球と共に他の細胞型と著しく混合を生じることが予想されていた。このような混合により、好中球の低率の回収に対して幹細胞の高率の回収、およびＲＢＣの高効率の低減に対して幹細胞の高率の回収が期待された。

以上、本発明を実施例に基づいて説明した。当業者は他の実施例、および特許請求の範囲の範囲内の本発明の種々の実施例を想定できる。

１００ バックセット
１０２ 処理バッグ
１０４ ＲＢＣ濃縮バッグ
１０６ 幹細胞バック
１３８ 絞り弁
２００ 処理装置
２１８ 本体
２２０ 幹細胞バッグ室
２２８ 遠心分離バケット
２３０ 主室
２４８ サーボモータ
２５４ 光センサ
２７２ ロードセル
２８６ プリント基板
２８８ インタフェース用プリント基板
２９０ マイクロコントローラ
２９６ 電池

Claims (21)

1. 抗凝固処理された骨髄から用意された幹細胞組成物であり、
   血漿、
   ＲＢＣ、
   ＷＢＣ、および
   生存幹細胞を有してなり、
   前記組成物が生体異物添加剤を含んでおらず、
   前記幹細胞がＣＤ３４＋細胞を含んでおり、および
   前記組成物中での前記ＲＢＣの前記ＣＤ３４＋に対する割合が約２０００対１より小さい、幹細胞組成物。
2. 抗凝固処理された骨髄から用意された幹細胞組成物であり、
   血漿、
   ＲＢＣ、
   ＷＢＣ、および
   生存幹細胞を有してなり、
   前記組成物が生体異物添加剤を含んでおらず、
   前記幹細胞がＡＬＤＨ Ｂｒ＋細胞を含んでおり、および
   前記組成物中での前記ＲＢＣの前記ＡＬＤＨ Ｂｒ＋に対する割合が約２０００対１より小さい、幹細胞組成物。
3. 抗凝固処理された臍帯血から用意された幹細胞組成物であり、
   血漿、
   ＲＢＣ、
   ＷＢＣ、および
   生存幹細胞を有してなり、
   前記組成物が生体異物添加剤を含んでおらず、
   前記幹細胞がＣＤ３４＋細胞を含んでおり、および
   前記組成物中での前記ＲＢＣの前記ＣＤ３４＋に対する割合が約１５，０００対１より小さい、幹細胞組成物。
4. 抗凝固処理された骨髄から用意された幹細胞組成物であり、
   血漿、
   ＲＢＣ、
   ＷＢＣ、および
   生存幹細胞を有してなり、
   前記組成物が、血漿と、ＲＢＣと、ＷＢＣと、生存ＣＤ３４＋細胞を含む幹細胞とを有してなる採取され抗凝固処理された骨髄から用意されたものであり、
   前記組成物が、前記採取された骨髄のＣＤ３４＋細胞を少なくとも約８０％および前記採取された骨髄のＲＢＣを約１０％以下だけ含み、および
   前記組成物が生体異物添加剤を含んでいない、幹細胞組成物。
5. 前記組成物の体積が、前記採取された骨髄の体積の約２５％以下である、請求項４記載の組成物。
6. 前記組成物の体積が予め選択される、請求項５記載の組成物。
7. 前記採取された骨髄の前記生存ＣＤ３４＋細胞の９０％超が前記組成物中に生存している、請求項４記載の組成物。
8. 抗凝固処理された臍帯血から用意された幹細胞組成物であり、
   血漿、
   ＲＢＣ、
   ＷＢＣ、および
   生存幹細胞を有してなり、
   前記組成物が、血漿と、ＲＢＣと、ＷＢＣと、生存ＣＤ３４＋細胞を含む幹細胞とを有してなる採取され抗凝固処理された臍帯血から用意されたものであり、
   前記組成物が、前記採取された臍帯血のＣＤ３４＋細胞を少なくとも約８０％および前記採取された臍帯血のＲＢＣを約１０％以下だけ含み、および
   前記組成物が生体異物添加剤を含んでいない、幹細胞組成物。
9. 前記組成物の体積が、前記採取された臍帯血の体積の約２５％以下である、請求項８記載の組成物。
10. 前記組成物の体積が予め選択される、請求項９記載の組成物。
11. 前記採取された臍帯血の前記生存ＣＤ３４＋細胞の９０％超が前記組成物中に生存している、請求項４記載の組成物。
12. 骨髄から用意された幹細胞組成物であり、
    血漿、
    ＲＢＣ、
    ＷＢＣ、および
    生存幹細胞を有してなり、
    前記幹細胞がＣＤ３４＋細胞を含んでおり、
    ＲＢＣのＣＤ３４＋細胞に対する割合が約５００対１であり、
    前記組成物が生体異物添加剤を含んでおらず、および
    前記組成物が、周囲環境から機能的に閉じた容器内で用意される、組成物。
13. 臍帯血から用意された幹細胞組成物であり、
    血漿、
    ＲＢＣ、
    ＷＢＣ、および
    生存幹細胞を有してなり、
    前記幹細胞がＣＤ３４＋細胞を含んでおり、
    ＲＢＣのＣＤ３４＋細胞に対する割合が約５０００対１であり、
    前記組成物が生体異物添加剤を含んでおらず、および
    前記組成物が、周囲環境から機能的に閉じた容器内で用意される、組成物。
14. 骨髄または臍帯血から幹細胞組成物を用意するための方法であって、
    （ａ） 処理バッグ内に採取した骨髄または臍帯血を配置するステップを有してなり、前記処理バッグはバッグセットの一部であり、前記バッグセットは赤血球濃縮バッグ、幹細胞バッグ、および絞り弁をさらに含んでおり、前記絞り弁は前記処理バッグ、前記赤血球濃縮バッグ、および前記幹細胞バッグに接続されており、
    （ｂ） 前記バッグセットを処理装置に設置するステップを有してなり、前記処理装置はマイクロコントローラ、サーボモータ、光学センサ、ＬＥＤ、ロードセル、および加速度計を含み、前記サーボモータは前記バッグセットが前記処理装置に収納されたときに動作するように前記絞り弁に接続されており、
    （ｃ） 前記バッグセットを収納した前記処理バッグを、ｇ力で、前記処理バッグ内の前記骨髄または前記臍帯血の細胞が赤血球の層、白血球（ＷＢＣ）／幹細胞および前駆細胞の層、および血漿の層に階層化するのに十分な時間だけ遠心分離するステップを有してなり、前記絞り弁は閉じられており、
    （ｄ） 前記遠心分離するステップで使用されたｇ力よりも低いｇ力で、前記赤血球の大部分が前記処理バッグから前記赤血球濃縮バッグに分離されるのに十分な時間だけ、前記バッグセットを収納した前記処理装置を遠心分離するステップを有してなり、前記絞り弁は前記処理バッグから前記赤血球濃縮バッグに開いており、
    （ｅ） 前記光学センサが前記ＬＥＤから予め設定した体積の光透過率を検知したことに応答して、前記絞り弁を閉じるステップを有してなり、
    （ｆ） 前記バッグセットを収納した前記処理装置を、ｇ力で、前記赤血球のより多くのものが前記処理バッグから前記赤血球濃縮バッグに分離されるのに十分な時間だけ、遠心分離するステップを有してなり、前記絞り弁は開と閉を多数回繰り返し、
    （ｇ） 前記光学センサが予め設定した割合の光透過率の変化を検知したことに応答して、前記絞り弁を閉じるステップを有してなり、
    （ｈ） 前記ロードセルからのデータを使用して、前記幹細胞バッグを風袋するステップを有してなり、前記風袋は前記ロードセルからのデータを使用して行われ、
    （ｉ） 前記バッグセットを収納した前記処理装置を、ｇ力で、前記赤血球の残りのもの、前記ＷＢＣ／幹細胞および前駆細胞の層、および前記プラズマの一部が前記処理バッグから前記幹細胞バッグに分離されるのに十分な時間だけ遠心分離するステップを有してなり、前記絞り弁は開と閉を多数回繰り返し、
    （ｊ） 前記ロードセルが前記幹細胞バッグの予め設定した重量を測定したことに応答して、前記絞り弁を閉じるステップを有してなり、
    （ｋ） 前記バッグセットを前記処理装置から取り外すステップを有してなり、および
    （ｌ） 前記幹細胞組成物を含む前記幹細胞バッグを前記バッグセットから取り外すステップを有してなる、方法。
15. ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、前記バッグセットを収納した前記処理装置を、ｇ力で、前記処理バッグ内の前記骨髄または臍帯血の細胞が前記処理バッグ内に赤血球の層、白血球（ＷＢＣ）／幹細胞および前駆細胞の層、および血漿の層に再び階層化するのに十分な時間だけ遠心分離するステップをさらに有してなり、前記絞り弁は閉じている、請求項１４記載の方法。
16. 予め前記幹細胞組成物の体積を選択するステップをさらに有してなる、請求項１４記載の方法。
17. 前記選択された体積が、前記幹細胞バッグ内の前記幹細胞組成物の体積を選択することで決定される、請求項１６記載の方法。
18. 前記選択された骨髄の体積が約４０ｍＬから約２４０ｍＬである、請求項１４記載の方法。
19. 骨髄やまたは臍帯血から幹細胞生成物を用意するためのシステムであって、
    （ａ） 採取した骨髄または臍帯血を保持するための処理バッグ、赤血球濃縮バッグ、幹細胞バッグ、および絞り弁を含むバッグセットを有してなり、前記絞り弁が前記処理バッグ、前記赤血球濃縮バッグ、および前記幹細胞バッグに接続されており、
    （ｂ） 内部に前記バッグセットが納められると共に、マイクロコントローラ、サーボモータ、光学センサ、ＬＥＤ、ロードセル、および加速度計を含む処理装置を有してなり、前記サーボモータは前記バッグセットが前記処理装置内に収納されたときに動作するように前記絞り弁に接続されており、および
    （ｃ） 前記バッグセットと前記処理装置が、ｇ力で、前記採取された骨髄または臍帯血から幹細胞生成物を分離し濃縮するために十分な時間だけの遠心分離に耐えることができるものである、システム。
20. 前記マイクロコントローラは、前記加速度計、前記光センサ、および前記ロードセルからの入力を受領および分析すると共に、前記各入力に応答して前記絞り弁を開または閉にする、請求項１９記載のシステム。
21. 前記光センサが、前記処理装置内で前記光センサのレベルと前記絞り弁のレベルの間の前記処理バッグ内の体積が約２ｍＬであるように配置されている、請求項１９記載のシステム。

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