JP7244423B2 - 脳神経系疾患の治療または診断のための標的タンパク質としてのpcnt - Google Patents
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Description
本発明はまた、以下に関する。
[項目1]
ペリセントリン(PCNT)を発現または分泌する臍帯血または臍帯血由来細胞を有効成分として含む、中枢神経系疾患を予防または治療するための薬学的組成物。
[項目2]
前記PCNTは、配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とする項目1に記載の薬学的組成物。
[項目3]
正常個体に比べ、PCNT発現レベルが低減された中枢神経系疾患を予防または治療するためのものであることを特徴とする項目1に記載の薬学的組成物。
[項目4]
前記中枢神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳損傷、脳震蕩、脳打撲傷、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症からなる群から選択されたものであることを特徴とする項目1に記載の薬学的組成物。
[項目5]
前記臍帯血は、自家臍帯血または同種異系臍帯血であることを特徴とする項目1に記載の薬学的組成物。
[項目6]
前記臍帯血由来細胞は、造血幹細胞であることを特徴とする項目1に記載の薬学的組成物。
[項目7]
前記臍帯血由来細胞は、単核球、B-リンパ球、CD4 T細胞、CD8 T細胞、NK細胞、末梢血液単核球細胞、血小板及びリンパ節からなる群から選択されたものであることを特徴とする項目1に記載の薬学的組成物。
[項目8]
エリスロポエチン(EPO)をさらに含むものであることを特徴とする項目1に記載の薬学的組成物。
[項目9]
ペリセントリン(PCNT)タンパク質またはその遺伝子のmRNAのレベルを測定する薬剤を含む、中枢神経系疾患を診断するための組成物。
[項目10]
前記タンパク質を測定する薬剤は、前記PCNTタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体であるか、あるいは前記遺伝子のmRNAレベルを測定する薬剤は、前記PCNTタンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合するプライマーまたはプローブを含むものであることを特徴とする項目9に記載の組成物。
[項目11]
前記中枢神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳損傷、脳震蕩、脳打撲傷、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症からなる群から選択されたものであることを特徴とする項目9に記載の組成物。
[項目12]
ペリセントリン(PCNT)タンパク質またはその遺伝子のmRNAのレベルを測定する薬剤を含む、中枢神経系疾患を診断するためのキット。
[項目13]
個体から分離された試料のペリセントリン(PCNT)タンパク質またはその遺伝子の発現量または活性レベルを測定する段階と、
前記測定された発現量または活性レベルを、正常個体から分離された対照試料で測定されたPCNTタンパク質の発現量または活性レベルと比較する段階と、を含む、中枢神経系疾患診断に必要な情報を分析する方法。
[項目14]
前記試料は、血漿であることであることを特徴とする項目13に記載の方法。
[項目15]
前記測定された発現量または活性レベルが、前記対照試料で測定された発現量または活性レベルより低い場合、中枢神経系疾患があると判断することをさらに含むことを特徴とする項目13に記載の方法。
[項目16]
前記中枢神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳損傷、脳震蕩、脳打撲傷、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症からなる群から選択されたことであることを特徴とする項目13に記載の方法。
[項目17]
インビトロで、ペリセントリン(PCNT)タンパク質を発現する細胞と試験物質とを接触させる段階と、
前記細胞において、PCNTタンパク質の発現量または活性を測定する段階と、
前記測定されたPCNTタンパク質の発現量または活性を、対照群で測定された発現量または活性と比較した結果として、PCNTタンパク質の発現量または活性を増大させる試験物質を、中枢神経系疾患の治療剤候補物質として選択する段階と、を含む中枢神経系疾患治療剤の候補物質をスクリーニングする方法。
[項目18]
前記細胞と試験物質との接触は、前記細胞の成長を維持することができる培地においてなされることを特徴とする項目17に記載の方法。
[項目19]
前記発現量の測定は、PCNT遺伝子のmRNAまたはPCNTタンパク質の量を測定することによってなされることを特徴とする項目17に記載の方法。
[項目20]
前記中枢神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳損傷、脳震蕩、脳打撲傷、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病気、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症からなる群から選択されたことであることを特徴とする項目17に記載の方法。
臍帯血細胞治療を受けた脳性マヒ患児の施術前後の血液を採取し、血漿内に存在する特定タンパク質の変化を観察した。該臍帯血細胞治療において、臍帯血は、赤血球と血漿とを除去し、白血球濃縮液を作り、冷凍保管されたものを使用した。冷凍保管された白血球濃縮液は、施術前、37℃ウォーターバス(water bath)で解凍した後、それを、10%デキストラン(dextran)40(100gデキストラン40/1l水)及び5%アルブミン(50gアルブミン/1l水)を同量で希釈した溶液で洗浄した。洗浄を終えた白血球濃縮液は、10%デキストラン40及び5%アルブミンを同量で希釈した混合液10mlに、最小総有核細胞数が、3x107/kgになるように懸濁した後、静脈内注射で、15mlから30mlの投与量を投与した。
表1は、血漿内タンパク質をスクリーニングするために選別された脳性マヒ患児の診断名及び臍帯血施術いかんを示した表である。表1に示された脳性マヒ患児の血液1~3ccほどをEDTAチューブに採取し、2,000rpmの速度で遠心分離を行った。このとき、血液の層が、最下側に、赤血球、中層に、単核球、最上層に、血漿と分けられ、そのように分けられた血液から血漿のみを分離し、-80℃超低温冷凍庫で冷凍保管した。
前記実施例1-1で分離した血漿内に存在している特定タンパク質の変化を確認するために、二次元ゲル電気泳動(2DE:2-dimensional gel electrophoresis)技法を使用した。準備したサンプルに対する2DE技法、イメージ分析及び定性分析は、延世大学校内延世プロテオーム研究院を介して進めた。
2-1.脳性マヒ患児の血漿サンプル準備
表4は、臨床脳性マヒ患児の名簿、施術した臍帯血の種類、及びエリスロポエチン(EPO:erythropoietin)の注入いかんに係わる情報を示した表である。同種異系臍帯血は、兄弟や家族の臍帯血を使用した。表4に示した総13名の脳性マヒ患児の血液を分離し、血漿のみを採取した。採取した血漿は、PBS(phosphate-buffered saline)で5:1に希釈し、ブラッドフォード法(Bradford assay)で定量した。定量したタンパク質は、30μgをサンプルバッファに混ぜ、7分間煮沸した後、スピンダウン(spin down)して準備した。
臍帯血施術後、PCNTタンパク質の発現をウェスタンブロット(Western blot)技法で確認した。
3-1.脳性マヒ誘発鼠モデルの作製
生後7日目になるICR鼠を利用し、脳性マヒ誘発鼠モデルである低酵素虚血(HI:hypoxic ischemia)モデルを作製した。生後7日目になるICR鼠の右側総頚動脈を、5-0ブルーナイロン(blue nylon)を利用して縛った後、O2 8%、N2 92%に維持される密閉された特殊容器に入れ、37℃に維持した後、1時間低酸素・脳虚血を誘導した。HIモデルを作製した後、6日後、脳組織の損傷程度を目で確認し、50%以上損傷されたモデルは除外した。
臍帯血は、車病院臍帯血銀行アイコード(icord)から寄贈された研究用臍帯血を使用した。該研究用臍帯血は、2,200rpmで遠心分離し、赤血球、単核球層、血漿に分離した後、血漿は別途に保管し、フィコール(Ficoll,Pharmacia Corp.,米国)を利用し、単核球層のみを分離した。具体的には、フィコール上に、血漿を除いた赤血球と単核球層とを、PBSに希釈して載せた後、2,200rpmで20分間遠心分離した。フィコールの原理により、フィコールより重い赤血球は、下に沈み、フィコール真上に単核球層が分離される。分離された単核球層のみを別途に移した後、4X105cells/10g濃度を100μlサリン(saline)に溶かした。準備した臍帯血単核球は、脳性マヒ誘発鼠モデルを作製した後、7日目になるモデルにランダムに腹腔投与した。
臍 帯血単核球を投与して一週間が経った脳性マヒ誘発鼠モデルに対し、血液を除去して死亡させた後、脳組織を摘出した。摘出した脳組織を、溶解バッファ(lysis buffer)を使用し、破砕した後、遠心分離し、タンパク質を分離した。分離したタンパク質30μgに対して、ウェスタンブロット(Western blot)技法で、PCNTの変化した発現量を確認した。
4-1.臍帯血、正常人血液及び脳性マヒ患児血液内での血漿分離
臍帯血は、アイコード(icord)から寄贈された研究用臍帯血を遠心分離し、血漿のみを分離し、-80℃超低温冷凍庫に冷凍して保管した。正常人の血液は、20~30代の女性と男性との血液3ccを遠心分離し、血漿のみを分離し、脳性マヒ患児の血液は、入院中の脳性マヒ患児の臍帯血施術前の血液を遠心分離し、血漿のみを分離し、2つの血漿は、冷凍保管した。表5は、臍帯血内に含まれているPCNT発現を確認するために、比較群として選定した正常人と脳性マヒ患児との情報を示した表である。
前記実施例4-1で保管した血漿を、氷上で徐々に融かした後、PBSで、5:1に希釈した。希釈されたサンプルを、ブラッドフォード(Bradford)試薬を利用して定量し、30μgに対してウェスタンブロット(Western blot)技法実験を進めた。
臍帯血は、臍帯の組織にある血液であり、造血幹細胞(造血幹細胞)が多量含有されている。該造血幹細胞は、血液の主要構成成分であり、骨髄で生成される単核球、大食細胞、血小板細胞と、T-細胞、B-細胞、NK細胞のようなリンパ系細胞とに分化することができる潜在的な細胞である。従って、臍帯血内に存在する細胞のうち、どの細胞がPCNTを発現するかということで、その種類を確認した。PCNTを発現する細胞に係わる情報は、GeneCardsウェブサイト(http://www.genecards.org/)から確認した。
臍帯血施術が、実際に脳神経系患者の脳神経系疾患を治療する効果があるか否かということを確認するために、脳性マヒ患児に自家臍帯血施術を進めた。
Claims (3)
- 臍帯血中の白血球を有効成分として含む、中枢神経系疾患を予防または治療するための薬学的組成物であって、前記臍帯血中の白血球は、ペリセントリン(PCNT)を発現または分泌し、前記中枢神経系疾患では、正常個体に比べ、PCNT発現レベルが低減されており、ならびに前記中枢神経系疾患は、脳性マヒであり、前記臍帯血は、自家臍帯血または同種異系臍帯血であることを特徴とする、前記薬学的組成物。
- 前記PCNTは、配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1に記載の薬学的組成物。
- エリスロポエチン(EPO)をさらに含むものであることを特徴とする請求項1に記載の薬学的組成物。
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