KR102198943B1 - 뇌신경계 질환의 치료 또는 진단을 위한 표적 단백질로서 pcnt - Google Patents

뇌신경계 질환의 치료 또는 진단을 위한 표적 단백질로서 pcnt Download PDF

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Abstract

PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물, PCNT 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물 또는 키트, PCNT 단백질을 이용하여 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법, 및 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 포함하는 조성물을 사용하면, 뇌신경계 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, PCNT 단백질은 조기에 뇌신경계 질환을 진단하고 뇌신경계 질환 치료제를 개발하기 위한 표적으로 활용할 수 있다.

Description

뇌신경계 질환의 치료 또는 진단을 위한 표적 단백질로서 PCNT {PCNT as a target protein for treatment or diagnosis of brain-nervous system disease}
PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물, PCNT 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물 또는 키트, PCNT 단백질을 이용하여 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법, 및 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
뇌신경계는 뇌, 척수, 뇌신경, 척수신경, 자율신경계 등으로 구성된 신체 조절 시스템을 의미한다. 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 외상성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌진탕, 뇌타박상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 중풍, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증 등 다양하다. 뇌손상이란 내적 또는 외적인 여러 이유로 뇌의 신경조직에 이상이 생겨 행동 또는 기능상에 이상이 오는 상태를 의미한다. 뇌손상은 개방성 두부 손상, 폐쇄성 두부 손상, 감속손상, 독성 물질의 노출, 산소 부족, 종양, 감염, 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환에 의해 발생할 수 있다.
뇌성마비는 하나의 질병이 아니라 비슷한 임상적 특징을 가진 증후군을 집합적으로 일컫는 용어로 미성숙한 뇌에 대한 비진행성 병변 혹은 손상으로 생기는 운동과 자세의 장애를 보이는 임상증후군을 말한다. 뇌성마비란 발달 과정중인 뇌에 대한 손상으로 인하여 근육 조절 능력이나, 보행 미 자세유지 등에 문제를 일으키는 질환으로 뇌 손상은 출생 전후나, 출생 도중에 주로 발생하지만 임신 중 어느 때나 발생 가능하고 심지어 소아기 때도 생길 수 있다.
뇌의 손상은 비진행성이지만 시간이 지나면서 신경운동 장애의 양상과 근골격계의 장애가 변화하므로 주기적인 진찰을 통해 변화된 임상 양상에 가장 적합한 재활 치료를 제공해야만 한다. 그 밖에 다른 치료 방법들이 있지만 이를 통한 획기적이고 근본적인 치료 방법은 없는 실정이다.
뇌성마비의 치료로 뇌 가소성의 가능성을 자극함으로써 잠재적 효과를 나타낼 수 있다고 보고되고 있으며, 이것은 뇌손상 환자에서 긍정적인 효과를 나타낸다. 뇌 가소성의 가능성을 자극하기 위한 방법으로 세포 치료의 방법이 있다.
특허문헌 1은 희돌기교전구세포의 중추신경계 질환의 세포 치료제로서의 용도에 관한 것으로서, Olig2 유전자 인코딩 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 줄기세포인 희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환 치료용 조성물을 개시하고 있다.
한편, 중간엽줄기세포를 포함한 줄기세포를 직접 이식하게 되면 생체 내에서 분화와 생존에 실패할 수 있으며, 정량적인 투여가 어렵다는 문제점이 있어 세포 치료제로의 사용이 어렵다. 이에 따라 생체 내에서 거부 반응이 없고, 운동 및 인지 발달에 치료효과가 있는 세포 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
한국 등록특허공보 제14093336호
이에, 본 발명자들은 뇌신경계 질환의 세포 치료제로서 제대혈을 연구하던 중 뇌신경계 질환의 치료 또는 진단을 위한 표적 단백질로서 PCNT 단백질을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료의 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료에서 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 인 비트로에서, PCNT 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포에서 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 증가되게 하는 시험 물질을 뇌신경계 질환 치료제 후보물질로 선택하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 PCNT 단백질 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
용어, "페리센트린 (Pericentrin: PCNT)"은 칼모둘린(calmodulin)과 결합되는 단백질로서, 중심체(centrosome)에서 발현되어 중심소체와 함께 중심체를 이루는 단백질을 의미한다. PCNT 단백질은 세포 분열시 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Liu Q et al., Aug 2010, Cell Research. 20 (8): 948-62.), 이 단백질의 이상으로 인한 정신에 관련된 질환들이 보고된 바 있다(Unal S et al., Feb 2014, Pediatric Blood & Cancer. 61 (2): 302-5.). 상기 PCNT 단백질은 제대혈에서 정상인의 혈장 대비 높은 발현 수준을 보였으며, 뇌성마비 환자에서 정상인의 혈장 대비 낮은 발현 수준을 보임을 확인하였다. 또한, PCNT 단백질은 제대혈 세포 치료를 시술받은 뇌성마비 환자에서 시술받기 전 대비 높은 발현 수준을 보임을 확인하였다. 이와 같은 결과는 PCNT 단백질이 뇌성마비와 같은 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 진단 마커로 사용될 수 있다는 점을 시사할 뿐만 아니라, PCNT 단백질이 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하는 데 관여한다는 점을 시사한다. 따라서, PCNT 단백질의 발현율이 높은 제대혈 또는 제대혈 유래 세포는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 PCNT 단백질은 제대혈 또는 제대혈 유래 세포로부터 분비되는 것일 수 있다. 또한, 상기 PCNT 단백질은 포유동물에서 유래된 것일 수 있고, 예를 들어 인간, 원숭이 또는 설치류로부터 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 PCNT는 서열번호 1의 아미노산 서열(GenBank Accession No. XP_005261181)로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 정상에 비해 PCNT의 발현이 감소된 뇌신경계 질환일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌신경계를 구성하는 뇌, 척수, 뇌신경, 척수신경, 자율신경계 등 중 일부 또는 전부에 이상이나 장애가 발생한 질환을 모두 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌손상 질환일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 신경손상 질환일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 외상성 뇌손상(Traumatic Brain Injury), 허혈성 뇌손상, 뇌진탕(Concussion), 뇌타박상(Brain Contusion), 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 중풍, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비일 수 있다.
용어, "뇌성마비(cerebral palsy)"란 미성숙한 뇌에 출생 시 또는 출생 후 여러 원인인자에 의해 비진행성 병변이나 손상이 발생하여 임상적으로 운동과 자세의 장애를 보이게 되는 질환을 의미할 수 있다.
용어, "제대혈(cord blood)"은 태반이나 탯줄 내의 혈액을 의미한다. 제대혈은 혈액 성분인 백혈구, 적혈구, 혈소판 등을 만드는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)와 연골, 뼈, 지방, 근육, 신경 등을 만드는 다양한 줄기세포를 다량 함유하고 있다. 용어, "줄기세포(stem cell)"란 원시단계의 세포로 어떤 기관으로도 전환할 수 있는 미분화 세포이며, 그 종류는 배아줄기세포(embryonic stem cell) 및 성체줄기세포(adult stem cell)를 포함할 수 있다. 제대혈 유래 줄기세포는 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell: MSC) 등의 성체줄기세포일 수 있다. 제대혈은 출산 후 탯줄로부터 분리하여 얻을 수 있다. 상기 제대혈은 적혈구 및 혈장을 제거한 백혈구 농축액을 사용할 수 있다. 상기 제대혈의 백혈구 농축액은 조혈모세포, 단핵구, 호중구, B-림프구, T-림프구, CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC), 혈소판, 림프절, 편도선, 골수 기질적 세포(Bone marrow stromal cell), 골수 중간엽 줄기세포(Bone marrow mesenchymal stem cell) 등 다양한 제대혈 유래 세포를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제대혈은 자가(autologous) 제대혈 또는 동종이계(allogeneic) 제대혈일 수 있다. 상기 동종이계 제대혈은 형제, 부모 등 가족의 제대혈을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 조혈모세포일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 PCNT를 발현 또는 분비하는 세포일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 단핵구, B-림프구, CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포, 혈소판, 및 림프절로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 말초혈액 단핵구 세포일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 PCNT를 발현 또는 분비하거나 발현 또는 분비가 증가하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 에리트로포이에틴 (Erythropoietin: EPO)을 더 포함할 수 있다. 상기 에리트로포이에틴은 골수에서의 적혈구의 생산을 조절하는 호르몬일 수 있다. 에리트로포이에틴을 제대혈 또는 제대혈 유래 세포와 복합 투여할 경우, 제대혈의 치료 효과가 증진되어 환자의 운동기능 및 인지기능이 보다 더 향상될 수 있다.
용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포, 세포 성분의 적어도 일부, 또는 세포 유래 분비 성분을 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 상기 담체 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예를 들면, 식염수 및 멸균수), 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 링거액, 완충제, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 덱스트란, 알부민, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당업자에게 알려진 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 용매 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있고, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 수성 용매는 생리식염수 또는 PBS를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여 형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상적으로 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 제대혈 유래 세포를 유핵세포수 1 x 107/kg 이상, 구체적으로 2 x 107/kg 이상, 3 x 107/kg 이상, 또는 3 x 107/kg 내지 10 x 107/kg, 예를 들어 3 x 107/kg 내지 5 x 107/kg로 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물의 투여량(유효량)은 1일 약 0.01 내지 200 ml, 구체적으로 약 0.01 내지 150 ml, 약 0.01 내지 100 ml, 약 0.1 내지 150 ml, 약 0.1 내지 100 ml, 약 1 내지 100 ml, 약 1 내지 50 ml, 약 5 내지 50 ml, 또는 약 10 내지 40 ml, 예를 들어 15 내지 30 ml일 수 있다. 필요한 경우, 상기 제대혈은 적절히 농축하여 투여함으로써 전체 투여량을 감소시킬 수도 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 국소 (경피 포함), 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
다른 양상은 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다.
PCNT 단백질 및 뇌신경계 질환은 상술한 바와 같다.
일 실시예에서, PCNT 단백질은 뇌성마비 환자에서 정상인의 혈장 대비 낮은 발현 수준을 보임을 확인하였다. 따라서, PCNT 단백질의 발현이나 활성 수준을 측정하여 정상인 유래 샘플과 비교하는 것에 의해 뇌성마비와 같은 뇌신경계 질환의 발병 또는 진행 여부를 진단할 수 있다. 그러므로, PCNT 단백질은 뇌신경계 질환, 예를 들어 뇌성마비의 진단 마커일 수 있다.
용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "뇌신경계 질환의 진단"이란 뇌신경계 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병의 위험을 예측하는 것을 의미할 수 있다.
용어, "진단 마커(diagnosis marker)"는 상기 뇌신경계 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 진단할 수 있는 물질을 의미할 수 있다.
상기 단백질을 측정하는 제제는 상기 PCNT 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 PCNT 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
공지된 아미노산 서열을 갖는 PCNT 단백질로부터 이에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 것은 통상의 기술자가 공지된 방법을 이용하여 용이하게 수행할 수 있다. PCNT 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 재조합 항체를 포함할 수 있고, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태 외에도, 적어도 항원 결합 기능을 보유하는 기능성 단편인 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함할 수 있다.
또한, 통상의 기술자는 공지된 PCNT 유전자의 서열로부터 특정 영역을 특이적으로 증폭하거나 인식하는 프라이머 또는 프로브를 설계할 수 있다.
용어, "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈(polymerase) 또는 역전사 효소(reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, PCNT 유전자의 뉴클레오티드 서열 부위의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 뇌신경계 질환을 진단할 수 있다.
용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, PCNT 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 뇌신경계 질환을 진단할 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트(phospharamidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분을 더 포함할 수 있다. 분석 방법이 RT-PCR인 경우, 상기 키트는 PCNT 단백질에 특이적인 프라이머 세트 외에, 필요한 용기, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTP), PCR용 DNA 폴리머라아제 및 역전사 효소 등을 더 포함할 수 있다. 또한, 분석 방법이 ELISA인 경우, 결합된 항체 검출용 시약, 예를 들면, 2차 항체, 발색단, 효소 및 그 기질을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료의 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료에서 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법을 제공한다.
PCNT 단백질 및 뇌신경계 질환은 상술한 바와 같다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 시료의 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
용어, "개체"란 뇌신경계 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병 위험도를 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 뇌신경계 질환이 발병할 수 있는 동물이라면 그 종류를 한정하지 않으나, 구체적으로 포유동물일 수 있고, 예를 들어 인간(Homo sapiens)일 수 있다.
상기 시료는 개체의 체외로 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 시료는 혈장일 수 있다.
상기 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량을 측정하는 단계는 PCNT 유전자의 mRNA 또는 PCNT 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다.
상기 PCNT 단백질의 발현량, 즉 mRNA 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던블랏팅(Northern blotting), DNA칩 등의 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 PCNT 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, ELISA, 질량분석기, 방사선 면역분석법, 면역침전법 등의 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법은 시료에서 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료에서 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 시료에서의 PCNT 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료의 수준보다 더 낮으면 상기 시료는 뇌신경계 질환이 발병하거나 또는 진행될 확률이 높은 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 상기 측정된 발현량 또는 활성 수준이 상기 대조군 시료에서 측정된 발현량 또는 활성 수준보다 낮은 경우 뇌신경계 질환이 있는 것으로 판단하는 것을 포함할 수 있다.
다른 양상은 인 비트로에서, PCNT 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포에서 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 증가되게 하는 시험 물질을 뇌신경계 질환 치료제 후보물질로 선택하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
PCNT 단백질 및 뇌신경계 질환은 상술한 바와 같다.
PCNT 단백질은 제대혈 세포 치료를 시술받은 뇌성마비 환자에서 시술받기 전 대비 높은 발현 수준을 보임을 확인하였고, 이에 의한 뇌성마비의 호전 효과를 확인하였다. 따라서, PCNT 단백질의 발현이나 활성을 특이적으로 증가시키는 물질은 뇌성마비와 같은 뇌신경계 질환의 치료 효과를 발휘할 수 있다. 이와 같은 효과는 PCNT 단백질 또는 그 유전자가 뇌성마비와 같은 뇌신경계 질환 치료의 표적이라는 것을 나타낸다.
상기 방법은 인 비트로(in vitro)에서, PCNT 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 PCNT 단백질을 발현하는 세포는, 예를 들어 혈액 세포, 뇌 세포 등일 수 있으나, 그 종류를 제한하지 않는다.
상기 시험 물질과의 접촉은 시험 물질의 형질감염, 형질전환 또는 주입에 의해 수행될 수 있다.
상기 시험 물질과의 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어질 수 있다.
상기 방법은 세포에서 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 측정은 PCNT 단백질 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 또는 PCNT 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 특이적으로 인식하는 프라이머 또는 프로브에 의해 수행될 수 있다.
상기 발현량의 측정은 PCNT 유전자의 mRNA 또는 PCNT 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다.
상기 mRNA의 양은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RPA), 노던블랏팅, 또는 DNA칩에 의해 측정할 수 있으나, 그 종류를 제한하지 않는다.
상기 단백질의 양은 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, ELISA, 또는 질량분석기 방사선 면역분석법, 또는 면역침전법에 의해 측정할 수 있으나, 그 종류를 제한하지 않는다.
상기 방법은 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 증가되게 하는 시험 물질을 뇌신경계 질환 치료제 후보물질로 선택하는 단계를 포함한다.
시험 물질의 처리 후에 PCNT 단백질의 발현 또는 활성 수준이 더 증가된 경우, 상기 시험 물질을 PCNT 단백질의 발현이나 활성을 증가시켜 뇌신경계 질환의 치료를 위해 사용될 수 있는 물질로 선별될 수 있다.
상기 대조군은 상기 시험 물질과 접촉시키는 단계를 제외하고는 동일한 조건에 있는 세포이다.
일 양상에 따른 PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 포함하는 조성물을 사용하면, 뇌신경계 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, PCNT 단백질은 조기에 뇌신경계 질환을 진단하고 뇌신경계 질환 치료제를 개발하기 위한 표적으로 활용할 수 있다.
도 1은 제대혈 시술 전(Pre)과 시술 10일 후(Post+10 days)의 혈장 내 단백질의 변화를 확인하기 위한 2차원 겔전기영동 결과이다: (A) 실험 1 즉, 4번, 9번 및 10번 환아의 샘플을 분석한 결과이고; 그리고 (B) 실험 2 즉, 6번, 7번 및 8번 환아의 샘플을 분석한 결과이다.
도 2는 13명의 뇌성마비 환아들의 혈장에 대해 제대혈 시술 전(Pre)과 후(Post)의 PCNT의 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 3은 도 2에 나타난 모든 환아들의 결과를 합산하여 제대혈 시술 전과 후의 PCNT 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 뇌성마비 유발 쥐 모델에서 제대혈 단핵구(UCB) 투여 후 PCNT의 발현량을 각각 4번 반복하여 확인한 결과를 나타낸 도이다. 비교군으로 EPO를 투여한 모델을 사용하였다.
도 5는 뇌성마비를 유발하지 않은 샴(Sham) 모델에 제대혈을 투여하지 않았을 때를 기준으로 하여 도 4의 PCNT 발현 변화량을 %로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 제대혈(UCB) 혈장, 정상인 혈장, 뇌성마비 환아 혈장 샘플에서 PCNT의 발현량을 확인한 결과이다: (A) PCNT 발현량을 나타낸 그림; (B) 제대혈 1번 샘플을 기준으로 한 PCNT의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프.
도 7은 제대혈 내에 존재하는 성분인 혈청(Serum), 혈장(Plasma), 단핵구(Monocyte), 호중구(Neutrophil), B-림프구(B-lymphocyte), T-림프구(Lymphocyte), CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell), 혈소판(Platelet), 림프절(Lymph node), 편도선(Tonsil), 골수 기질적 세포(Bone marrow stromal cell), 및 골수 중간엽 줄기세포(Bone marrow mesenchymal stem cell) 각각의 PCNT 발현량(Log10, ppm)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(GMFCS_pre) 및 시술 후(GMFCS_post)의 GMFCS 평가 결과(GMFCS total (%))를 나타낸 그래프이다.
도 9는 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(BSID_Motor_pre) 및 시술 후(BSID_Motor_post)의 베일리 영아 발달검사 행동발달 영역 평가 결과(BSID II motor)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(BSID_Mental_pre) 및 시술 후(BSID_Mental_post)의 베일리 영아 발달검사 정신발달 영역 평가 결과(BSID II mental)를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 제대혈 시술 후 발현 수준이 변화된 단백질 스크리닝
제대혈 세포 치료를 받은 뇌성마비 환아의 시술 전과 후의 혈액을 채취하여 혈장 내 존재하는 특정 단백질의 변화를 관찰하였다. 제대혈 세포 치료에서, 제대혈은 적혈구와 혈장을 제거하고 백혈구 농축액을 만들어 냉동 보관된 것을 사용하였다. 냉동 보관된 백혈구 농축액은 시술 전에 37℃ 워터 배스(water bath)에서 해동 후, 이를 10% 덱스트란(dextran)-40 (100g 덱스트란-40/1ℓ 물) 및 5% 알부민 (50g 알부민/1ℓ 물)을 동량으로 희석한 용액으로 세척하였다. 세척을 마친 백혈구 농축액은 10% 덱스트란-40 및 5% 알부민을 동량으로 희석한 혼합액 10 ml에 최소 총 유핵세포수가 3 x 107/kg이 되도록 현탁한 후, 정맥 내 주사로 15 ml 내지 30 ml 사이의 투여량을 투여하였다.
1-1. 스크리닝에 사용할 혈장 샘플의 준비
표 1은 혈장 내 단백질을 스크리닝하기 위해 선별된 뇌성마비 환아들의 진단명 및 제대혈 시술 여부를 나타낸 표이다. 표 1에 나타난 뇌성마비 환아들의 혈액 1~3cc 정도를 EDTA-튜브에 채취하여 2000rpm의 속도로 원심분리를 수행하였다. 이때 혈액의 층이 맨 아래쪽에 적혈구, 가운데 층에 단핵구, 맨 윗층에 혈장으로 나누어지게 되며, 이렇게 나누어진 혈액에서 혈장만을 분리하여 -80℃ 초저온 냉동고에 냉동 보관하였다.
No. 성별 나이
(개월) 		동종이계 제대혈 치료 자가 제대혈 치료 시클로스포린
(cyclosporin) 		진단
1 남성 123 O 발달 지연(Delayed milestone)
2 남성 42 O 미토콘드리아 근병증, NEC
3 남성 20 O O 뇌성마비
4 남성 137 O O 뇌성마비
5 여성 70 O O 발달 지연(Delayed milestone)
6 남성 13 O 뇌성마비
7 여성 42 O O 뇌성마비
8 여성 20 O O 뇌성마비
9 여성 81 O O 뇌성마비
10 여성 141 O O 발달 지연(Delayed milestone)
1-2. 제대혈 세포 치료 전후 혈장 내 단백질의 스크리닝
상기 실시예 1-1에서 분리한 혈장 내에 존재하고 있는 특정 단백질의 변화를 확인하기 위하여 2차원 겔전기영동(2-Dimensional gel Electrophoresis: 2DE) 기법을 사용하였다. 준비한 샘플에 대한 2DE 기법, 이미지 분석 및 정성 분석은 연세대학교 내 연세프로테옴연구원을 통해 진행하였다.
표 1의 10명의 뇌성마비 환아 중 제대혈 시술을 받은 후 호전을 보인 6명 즉, 4번, 6번, 7번, 8번, 9번 및 10번 환아를 선별하여 실험을 진행하였다.
표 2는 제대혈 시술을 받은 후 호전을 보인 6명의 환아의 혈장 내 단백질의 스크리닝을 위한 실험 샘플에 대한 정보이다. 실험 1에서는 제대혈 치료 전 혈장으로 4번, 9번 및 10번 환아의 혈장을 섞은 혼합물을 사용하였고, 제대혈 치료 10일 후 혈장으로 4번 환아의 혈장을 샘플로 사용하여 분석하였다. 실험 2에서는 제대혈 치료 전 혈장으로 6번, 7번 및 8번 환아의 혈장을 섞은 혼합물을 사용하였고, 제대혈 치료 10일 후 혈장으로 6번 환아의 혈장을 샘플로 사용하여 분석하였다.
실험 1 실험 2
샘플 제대혈 치료 전 제대혈 치료 10일 후 제대혈 치료 전 제대혈 치료 10일 후
4번, 9번 및 10번 환아의 혈장 혼합물 4번 환아의 혈장 6번, 7번 및 8번 환아의 혈장 혼합물 6번 환아의 혈장
도 1은 제대혈 시술 전(Pre)과 시술 10일 후(Post+10 days)의 혈장 내 단백질의 변화를 확인하기 위한 2차원 겔전기영동 결과이다: (A) 실험 1, 즉, 4번, 9번 및 10번 환아의 샘플을 분석한 결과이고; 그리고 (B) 실험 2, 즉, 6번, 7번 및 8번 환아의 샘플을 분석한 결과이다. 가로축은 pH, 세로축은 단백질 크기를 나타낸다. 초록색 점들은 제대혈 시술 후 증가한 단백질, 빨간색 점들은 제대혈 시술 후 감소한 단백질을 나타내었다.
표 3은 2DE 결과에 따라 각각의 단백질을 정성분석 한 결과, 제대혈 시술 후 호전을 보인 환아들의 혈장 내에서 3배 이상 증가하는 것으로 보이는 단백질을 나타낸 것이다. 알파-2-매크로글로불린 이소폼의 경우 2개의 점에서 나타나는 것으로 보아 일반적으로 혈장 내에 존재하는 단백질로 실험 진행 시 샘플에서 완벽하게 걸러지지 않은 것으로 보인다. 626점의 결과로 나온 단백질은 피브리노겐에 결합하는 단편(fragment)으로 보여지며, 이것 또한 혈장 내 피브리노겐의 제거가 이루어 지지 않아 나타난 결과로 보여진다. 따라서, 페리센트린(Pericentrin: PCNT)이 제대혈 시술 후 혈장 내에서 증가하는 특정 단백질임을 확인하였다.
단백질 수준 점 No. 단백질명 (gray p>0.05) 점수 * gi No. 분자량(Mw)
증가 62 알파-2-매크로글로불린 이소폼 X1 72 gi|578822814 168914
84 페리센트린 이소폼 X2 102 gi|530419252 368506
92 알파-2-매크로글로불린 이소폼 X1 168 gi|578822814 168914
626 3.4 옹스트롬 해상도에서 인간 C3c와 결합된 포도상구균 보체억제제 G의 잘려진 형태의 구조, 체인 E 106 gi|358009626 23690
* 점수는 -10*Log(P)이고, 여기에서 P는 관찰된 매치가 랜덤 이벤트인 확률이다. 단백질 점수가 72 이상인 경우 유의성이 있다 (p<0.05).
실시예 2: 제대혈 시술을 받은 뇌성마비 환아에서 PCNT의 발현 확인
2-1. 뇌성마비 환아들의 혈장 샘플 준비
표 4는 임상 뇌성마비 환아들의 명단, 시술한 제대혈의 종류 및 에리트로포이에틴(Erythropoietin: EPO)의 주입 여부에 대한 정보를 나타낸 표이다. 동종이계 제대혈은 형제나 가족의 제대혈을 사용하였다. 표 4에 나타낸 총 13명의 뇌성마비 환아들의 혈액을 분리하여 혈장만을 채취하였다. 채취한 혈장은 PBS (Phosphate-buffered saline)로 5:1로 희석하여 브래드포드법 (Bradford assay)으로 정량하였다. 정량한 단백질은 30μg을 샘플 버퍼에 섞어 7분 동안 끓인 뒤 스핀 다운(spin down)하여 준비하였다.
No. 성별 진단명 자가 제대혈 치료
(Auto UCB) 		동종이계 제대혈 치료
(Allo UCB) 		에리트로포이에틴 (EPO) 주입
1 여성 뇌성마비 - O -
2 남성 뇌성마비 - O -
3 여성 뇌성마비 - O -
4 남성 뇌성마비 - O -
5 남성 뇌성마비 - O -
6 여성 뇌성마비 - O O
7 여성 뇌성마비 - O O
8 남성 뇌성마비 O - O
9 남성 뇌성마비 O - O
10 남성 뇌성마비 O - O
11 남성 뇌성마비 O - O
12 남성 뇌성마비 O - O
13 남성 뇌성마비 O - O
2-2. 제대혈 시술 후 PCNT 단백질의 발현 확인
제대혈 시술 후 PCNT 단백질의 발현을 웨스턴 블랏(Western blot) 기법으로 확인하였다.
먼저, 상기 실시예 2-1에서 준비한 혈장 샘플을 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 제대혈 시술 전과 후의 순서대로 분주하여 내려주었다. 겔에 내려진 단백질을 니트로셀룰로스(nitrocellulose: NC) 멤브레인으로 옮겨 PCNT 항체와 16시간 이상 반응시킨 후, 제대혈 시술 전과 후의 PCNT 발현량을 밴드로 확인하였다.
도 2는 13명의 뇌성마비 환아들의 혈장에 대해 제대혈 시술 전(Pre)과 후(Post)의 PCNT의 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 각 샘플들의 시술 전과 후의 날짜 차이가 있지만, 제대혈의 종류에 차이 없이 전반적으로 제대혈 시술 후 PCNT의 양이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다.
도 3은 도 2에 나타난 모든 환아들의 결과를 합산하여 제대혈 시술 전과 후의 PCNT 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 제대혈 시술 후 3일 또는 10일이 지났을 때 PCNT의 발현량이 증가하는 것을 확인하였으며, 결과에 유의성이 있었다.
따라서, 뇌성마비 환아에게 제대혈 시술을 하였을 때, PCNT의 발현량이 크게 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 뇌신경계 질환 동물 모델에서 PCNT의 변화 확인
3-1. 뇌성마비 유발 쥐 모델의 제작
생후 7일차 되는 ICR 쥐를 이용하여 뇌성마비 유발 쥐 모델인 저효소 허혈(Hypoxic ischemia: HI) 모델을 제작하였다. 생후 7일차 되는 ICR 쥐의 우측 총경동맥을 5-0 블루 나이론(blue nylon)을 이용하여 묶은 후 O2 8%, N2 92%로 유지되는 밀폐된 특수 용기에 넣고 37℃로 유지시킨 뒤 1시간 동안 저산소-뇌허혈을 유도하였다. HI 모델을 제작한 후 6일 뒤 뇌 조직의 손상 정도를 눈으로 확인하여 50% 이상 손상된 모델은 제외시켰다.
3-2. 뇌성마비 유발 쥐 모델에 제대혈의 투여
제대혈은 차병원 제대혈은행 아이코드(icord)에서 기증된 연구용 제대혈을 사용하였다. 연구용 제대혈은 2200rpm에서 원심분리하여 적혈구, 단핵구층, 혈장으로 분리한 뒤 혈장은 따로 보관하고 피콜(Ficoll, Pharmacia Corp., USA)을 이용하여 단핵구층만을 분리하였다. 구체적으로, 피콜 위에 혈장을 제외한 적혈구와 단핵구층을 PBS로 희석하여 올린 뒤, 2200rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 피콜의 원리에 의해 피콜보다 무거운 적혈구는 밑으로 가라앉고 피콜 바로 위쪽에 단핵구층이 분리되게 된다. 분리 된 단핵구층만을 따로 옮긴 뒤 4 X 105 cells/10g 농도를 100μl 살린(saline)에 풀어주었다. 준비한 제대혈 단핵구는 뇌성마비 유발 쥐 모델을 제작한 뒤 7일차 되는 모델에 무작위로 복강 투여하였다.
3-3. 뇌 조직 내에서의 PCNT 발현 변화 확인
제대혈 단핵구를 투여하고 일주일이 지난 뇌성마비 유발 쥐 모델을 혈액을 제거하여 죽인 뒤 뇌조직을 적출하였다. 적출한 뇌조직을 용해 버퍼(Lysis buffer)를 사용하여 파쇄한 뒤 원심분리하여 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질 30μg에 대하여 웨스턴 블랏(Western blot) 기법으로 PCNT의 변화한 발현량을 확인하였다.
도 4는 뇌성마비 유발 쥐 모델에서 제대혈 단핵구(UCB) 투여 후 PCNT의 발현량을 각각 4번 반복하여 확인한 결과를 나타낸 도이다. 비교군으로 EPO를 투여한 모델을 사용하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 제대혈 투여를 받은 뇌성마비 유발 쥐 모델에서 PCNT의 발현량이 증가하는 것을 확인하였고, 비교군으로 EPO를 투여한 모델과 비교하였을 때에도 제대혈에 의한 PCNT의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 뇌성마비를 유발하지 않은 샴(Sham) 모델에 제대혈을 투여하지 않았을 때를 기준으로 하여 도 4의 PCNT 발현 변화량을 %로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 제대혈을 투여하지 않은 정상 쥐인 샴 모델과 비교하였을 때에도 뇌성마비 유발 쥐 모델에 제대혈을 투여하였을 때 PCNT의 발현량이 훨씬 많았다.
실시예 4: 제대혈, 정상인 및 뇌성마비 환아의 혈장 내에 존재하는 PCNT 양의 차이 검증
4-1. 제대혈, 정상인 혈액 및 뇌성마비 환아 혈액 내에서의 혈장 분리
제대혈은 아이코드(icord)에서 기증받은 연구용 제대혈을 원심분리하여 혈장만을 분리하여 -80℃ 초저온 냉동고에 냉동하여 보관하였다. 정상인의 혈액은 2~30대 여성과 남성의 혈액 3cc를 원심분리하여 혈장만을 분리하였고, 뇌성마비 환아의 혈액은 입원 중인 뇌성마비 환아의 제대혈 시술 전 혈액을 원심분리하여 혈장만을 분리하였으며, 두 혈장은 냉동 보관하였다. 표 5는 제대혈 내에 함유하고 있는 PCNT의 발현을 확인하기 위하여, 비교군으로 선정한 정상인과 뇌성마비 환아의 정보를 나타낸 표이다.
성별 나이
정상인 1 여성 28세
정상인 2 남성 31세
뇌성마비 환아 1 남성 2세
뇌성마비 환아 2 남성 3세
4-2. 제대혈, 정상인 혈장 및 뇌성마비 환아 혈장 내에 포함된 PCNT 발현량 확인
상기 실시예 4-1에서 보관하였던 혈장을 얼음 위에서 천천히 녹인 뒤, PBS로 5:1로 희석하였다. 희석된 샘플을 브래드포드(BradFord) 시약을 이용하여 정량하여 30μg에 대해 웨스턴 블랏(Western blot) 기법 실험을 진행하였다.
도 6은 제대혈(UCB) 혈장, 정상인 혈장, 뇌성마비 환아 혈장 샘플에서 PCNT의 발현량을 확인한 결과이다: (A) PCNT 발현량을 나타낸 그림; (B) 제대혈 1번 샘플을 기준으로 한 PCNT의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프.
도 6에 나타낸 바와 같이, 뇌성마비 환아의 혈장에는 PCNT의 발현량이 현저하게 적게 나타났으며, 그 다음으로 정상인이었고, PCNT를 가장 많이 포함하고 있는 것이 제대혈로 나타났다. 혈장 내 기준이 되는 단백질이 없으므로 폰소(Ponceau)로 염색한 밴드를 기준으로 잡고 PCNT의 발현량을 %로 환산하였을 때에도, 제대혈 내에 PCNT가 가장 많이 발현되고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: PCNT를 발현하는 제대혈 내 세포 종류의 확인
제대혈은 탯줄의 조직에 있는 혈액으로, 조혈줄기세포(조혈모세포)가 다량 함유되어 있다. 조혈모세포는 혈액의 주요 구성성분으로 골수에서 생성되는 단핵구, 대식세포, 혈소판 세포들과 T-세포, B-세포, NK 세포 등의 림프계 세포로 분화할 수 있는 잠재적인 세포이다. 따라서, 제대혈 내에 존재하는 세포 중 어떠한 세포가 PCNT를 발현하는지 그 종류를 확인하였다. PCNT를 발현하는 세포에 대한 정보는 GeneCards 웹사이트 (http://www.genecards.org/)에서 확인하였다.
도 7은 제대혈 내에 존재하는 성분인 혈청(Serum), 혈장(Plasma), 단핵구(Monocyte), 호중구(Neutrophil), B-림프구(B-lymphocyte), T-림프구(Lymphocyte), CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC), 혈소판(Platelet), 림프절(Lymph node), 편도선(Tonsil), 골수 기질적 세포(Bone marrow stromal cell), 및 골수 중간엽 줄기세포(Bone marrow mesenchymal stem cell) 각각의 PCNT 발현량(Log10, ppm)을 나타낸 그래프이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 제대혈 내에 존재하는 세포 중 단핵구, B-림프구, CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포, 혈소판, 및 림프절에서 PCNT가 분비되었으며, 이 중 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)가 가장 많은 PCNT 발현을 나타냄을 확인하였다.
실시예 6: 제대혈의 뇌신경계 질환 치료 효과 확인
제대혈 시술이 실제로 뇌신경계 환자의 뇌신경계 질환을 치료하는 효과가 있는지 확인하기 위하여, 뇌성마비 환아에게 자가 제대혈 시술을 진행하였다.
제대혈 세포 치료에서, 제대혈은 적혈구와 혈장을 제거하고 백혈구 농축액을 만들어 냉동 보관된 것을 사용하였다. 냉동 보관된 백혈구 농축액은 시술 전에 37℃ 워터 배스(water bath)에서 해동 후, 이를 10% 덱스트란(dextran)-40 (100g 덱스트란-40/1ℓ 물) 및 5% 알부민 (50g 알부민/1ℓ 물)을 동량으로 희석한 용액으로 세척하였다. 세척을 마친 백혈구 농축액은 10% 덱스트란-40 및 5% 알부민을 동량으로 희석한 혼합액 10 ml에 최소 총 유핵세포수가 3 x 107/kg이 되도록 현탁한 후, 정맥 내 주사로 15 ml 내지 30 ml 사이의 투여량을 투여하였다.
표 6은 제대혈의 치료 효과를 확인하기 위해 선별된 13명의 뇌성마비 환아들의 성별, 진단명 및 제대혈 치료 후의 기능 평가 결과를 나타낸 표이다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 13명의 뇌성마비 환자에게서 제대혈 시술 후 전반적인 기능의 향상이 나타남을 확인하였다.
No. 성별 진단명 자가 제대혈 치료 (Auto UCB) 후 기능 평가
1 여 뇌성마비 시술 후 양측 하지 근 긴장도 저하 및 손 뻗기 가능해짐.
2 남 뇌성마비 시술 후 목의 정중선 유지 가능해지고 전반적 경직 감소 관찰 됨.
3 여 뇌성마비 시술 후 목의 실조성 움직임 감소 하였고, 몸통 근력 향상되어 엎으린 자세에서 양손 사용 관찰됨.
4 남 뇌성마비 시술 후 전신의 실조성 움직임 감소 보였고, 상지의 선택적 움직임 호전 보임.
5 남 뇌성마비 시술 후 실조성 움직임 감소 하였고, 약간의 도움 주면 뒤집기 가능 해짐.
6 여 뇌성마비 시술 전 선자세 유지 어려운 수준이었으나, 시술 후 퇴원 시 붙잡고 서기 동작 가능해짐.
7 여 뇌성마비 시술 전보다 보행 시 균형도와 자세 호전 되었고, 보행 거리 증가 하였음.
8 남 뇌성마비 시술 이후 사물에 대한 관심도 증가 및 퍼즐 쌓기 하는 것 관찰됨.
9 남 뇌성마비 시술 후 약간의 도움 주면 뒤집기 가능해 지고, 양팔 지지한 상태로 10초간 앉은 자세 유지 가능해짐.
10 남 뇌성마비 시술 후 바 잡고 서서 유지 가능해 지고 양손 잡고 걷기 호전됨.
11 남 뇌성마비 시술 후 보조기 착용한 상태에서 양손 잡고 걷기 가능 해짐.
12 남 뇌성마비 시술 후 계단 오르기 시술 전 보다 호전 양상 보임.
13 남 뇌성마비 시술 후 몸통 균형 호전되어 앉은 자세 유지시간 길어 졌음.
또한, 제대혈 시술 2~4개월 후에 5번, 11번, 및 13번 환자에 대해 대동작기능분류시스템(The Gross Motor Function Classification System: GMFCS), 베일리 영아 발달검사 행동발달 영역(Bayley Scales of Infant Development (BSID) II motor) 및 베일리 영아 발달검사 정신발달 영역(BSID II mental)에 따른 평가를 수행하였다.
도 8은 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(GMFCS_pre) 및 시술 후(GMFCS_post)의 GMFCS 평가 결과(GMFCS total (%))를 나타낸 그래프이다.
도 9는 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(BSID_Motor_pre) 및 시술 후(BSID_Motor_post)의 베일리 영아 발달검사 행동발달 영역 평가 결과(BSID II motor)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(BSID_Mental_pre) 및 시술 후(BSID_Mental_post)의 베일리 영아 발달검사 정신발달 영역 평가 결과(BSID II mental)를 나타낸 그래프이다.
도 8 내지 10에 나타낸 바와 같이, 제대혈 시술 전후 뇌성마비 환아에 대해 GMFCS, BSID II motor 및 BSID II mental 검사를 수행한 결과, 제대혈 시술 후 호전 양상이 관찰되었다.
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145 150 155 160 Glu Leu Arg Glu Met Leu Asn Ser Arg Arg Ala Gln Glu Leu Ala Leu 165 170 175 Leu Gln Ser Arg Gln Gln His Glu Leu Glu Leu Leu Arg Glu Gln His 180 185 190 Ala Arg Glu Lys Glu Glu Val Val Leu Arg Cys Gly Gln Glu Ala Ala 195 200 205 Glu Leu Lys Glu Lys Leu Gln Ser Glu Met Glu Lys Asn Ala Gln Ile 210 215 220 Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp Trp Glu Ser Glu Lys Asp Leu Cys Leu 225 230 235 240 Glu Asn Leu Arg Lys Glu Leu Ser Ala Lys His Gln Ser Glu Met Glu 245 250 255 Asp Leu Gln Asn Gln Phe Gln Lys Glu Leu Ala Glu Gln Arg Ala Glu 260 265 270 Leu Glu Lys Ile Phe Gln Asp Lys Asn Gln Ala Glu Arg Ala Leu Arg 275 280 285 Asn Leu Glu Ser His His Gln Ala Ala Ile Glu Lys Leu Arg Glu Asp 290 295 300 Leu Gln Ser Glu His Gly Arg Cys Leu Glu Asp Leu Glu Phe Lys Phe 305 310 315 320 Lys Glu Ser Glu Lys Glu Lys Gln Leu Glu Leu Glu Asn Leu Gln Ala 325 330 335 Ser Tyr Glu Asp Leu Lys Ala Gln Ser Gln Glu Glu Ile Arg Arg Leu 340 345 350 Trp Ser Gln Leu Asp Ser Ala Arg Thr Ser Arg Gln Glu Leu Ser Glu 355 360 365 Leu His Glu Gln Leu Leu Ala Arg Thr Ser Arg Val Glu Asp Leu Glu 370 375 380 Gln Leu Lys Gln Arg Glu Lys Thr Gln His Glu Ser Glu Leu Glu Gln 385 390 395 400 Leu Arg Ile Tyr Phe Glu Lys Lys Leu Arg Asp Ala Glu Lys Thr Tyr 405 410 415 Gln Glu Asp Leu Thr Leu Leu Gln Gln Arg Leu Gln Gly Ala Arg Glu 420 425 430 Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Glu Val Gly Leu Ser Cys Val Gly Leu 435 440 445 Glu Glu Lys Pro Glu Lys Gly Arg Lys Asp His Val Asp Glu Leu Glu 450 455 460 Pro Glu Arg His Lys Glu Ser Leu Pro Arg Phe Gln Ala Glu Leu Glu 465 470 475 480 Glu Ser His Arg His Gln Leu Glu Ala Leu Glu Ser Pro Leu Cys Ile 485 490 495 Gln His Glu Gly His Val Ser Asp Arg Cys Cys Val Glu Thr Ser Ala 500 505 510 Leu Gly His Glu Trp Arg Leu Glu Pro Ser Glu Gly His Ser Gln Glu 515 520 525 Leu Pro Trp Val His Leu Gln Gly Val Gln Asp Gly Asp Leu Glu Ala 530 535 540 Asp Thr Glu Arg Ala Ala Arg Val Leu Gly Leu Glu Thr Glu His Lys 545 550 555 560 Val Gln Leu Ser Leu Leu Gln Thr Glu Leu Lys Glu Glu Ile Glu Leu 565 570 575 Leu Lys Ile Glu Asn Arg Asn Leu Tyr Gly Lys Leu Gln His Glu Thr 580 585 590 Arg Leu Lys Asp Asp Leu Glu Lys Val Lys His Asn Leu Ile Glu Asp 595 600 605 His Gln Lys Glu Leu Asn Asn Ala Lys Gln Lys Thr Glu Leu Met Lys 610 615 620 Gln Glu Phe Gln Arg Lys Glu Thr Asp Trp Lys Val Met Lys Glu Glu 625 630 635 640 Leu Gln Arg Glu Ala Glu Glu Lys Leu Thr Leu Met Leu Leu Glu Leu 645 650 655 Arg Glu Lys Ala Glu Ser Glu Lys Gln Thr Ile Ile Asn Lys Phe Glu 660 665 670 Leu Arg Glu Ala Glu Met Arg Gln Leu Gln Asp Gln Gln Ala Ala Gln 675 680 685 Ile Leu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Gln Gln Gly Arg Leu Gln 690 695 700 Gln Leu Glu Gln Asp Leu Thr Ser Asp Asp Ala Leu His Cys Ser Gln 705 710 715 720 Cys Gly Arg Glu Pro Pro Thr Ala Gln Asp Gly Glu Leu Ala Ala Leu 725 730 735 His Val Lys Glu Asp Cys Ala Leu Gln Leu Met Leu Ala Arg Ser Arg 740 745 750 Phe Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Thr Glu Lys Phe Ser Ala Glu Gln 755 760 765 Asp Ala Phe Leu Gln Glu Ala Gln Glu Gln His Ala Arg Glu Leu Gln 770 775 780 Leu Leu Gln Glu Arg His Gln Gln Gln Leu Leu Ser Val Thr Ala Glu 785 790 795 800 Leu Glu Ala Arg His Gln Ala Ala Leu Gly Glu Leu Thr Ala Ser Leu 805 810 815 Glu Ser Lys Gln Gly Ala Leu Leu Ala Ala Arg Val Ala Glu Leu Gln 820 825 830 Thr Lys His Ala Ala Asp Leu Gly Ala Leu Glu Thr Arg His Leu Ser 835 840 845 Ser Leu Asp Ser Leu Glu Ser Cys Tyr Leu Ser Glu Phe Gln Thr Ile 850 855 860 Arg Glu Glu His Arg Gln Ala Leu Glu Leu Leu Arg Ala Asp Phe Glu 865 870 875 880 Glu Gln Leu Trp Lys Lys Asp Ser Leu His Gln Thr Ile Leu Thr Gln 885 890 895 Glu Leu Glu Lys Leu Lys Arg Lys His Glu Gly Glu Leu Gln Ser Val 900 905 910 Arg Asp His Leu Arg Thr Glu Val Ser Thr Glu Leu Ala Gly Thr Val 915 920 925 Ala His Glu Leu Gln Gly Val His Gln Gly Glu Phe Gly Ser Glu Lys 930 935 940 Lys Thr Ala Leu His Glu Lys Glu Glu Thr Leu Arg Leu Gln Ser Ala 945 950 955 960 Gln Ala Gln Pro Phe His Gln Glu Glu Lys Glu Ser Leu Ser Leu Gln 965 970 975 Leu Gln Lys Lys Asn His Gln Val Gln Gln Leu Lys Asp Gln Val Leu 980 985 990 Ser Leu Ser His Glu Ile Glu Glu Cys Arg Ser Glu Leu Glu Val Leu 995 1000 1005 Gln Gln Arg Arg Glu Arg Glu Asn Arg Glu Gly Ala Asn Leu Leu Ser 1010 1015 1020 Met Leu Lys Ala Asp Val Asn Leu Ser His Ser Glu Arg Gly Ala Leu 1025 1030 1035 1040 Gln Asp Ala Leu Arg Arg Leu Leu Gly Leu Phe Gly Glu Thr Leu Arg 1045 1050 1055 Ala Ala Val Thr Leu Arg Ser Arg Ile Gly Glu Arg Val Gly Leu Cys 1060 1065 1070 Leu Asp Asp Ala Gly Ala Gly Leu Ala Leu Ser Thr Ala Pro Ala Leu 1075 1080 1085 Glu Glu Thr Trp Ser Asp Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Arg Thr Leu 1090 1095 1100 Ser Glu Cys Ala Glu Met Ser Ser Val Ala Glu Ile Ser Ser His Met 1105 1110 1115 1120 Arg Glu Ser Phe Leu Met Ser Pro Glu Ser Val Arg Glu Cys Glu Gln 1125 1130 1135 Pro Ile Arg Arg Val Phe Gln Ser Leu Ser Leu Ala Val Asp Gly Leu 1140 1145 1150 Met Glu Met Ala Leu Asp Ser Ser Arg Gln Leu Glu Glu Ala Arg Gln 1155 1160 1165 Ile His Ser Arg Phe Glu Lys Glu Phe Ser Phe Lys Asn Glu Glu Thr 1170 1175 1180 Ala Gln Val Val Arg Lys His Gln Glu Leu Leu Glu Cys Leu Lys Glu 1185 1190 1195 1200 Glu Ser Ala Ala Lys Ala Glu Leu Ala Leu Glu Leu His Lys Thr Gln 1205 1210 1215 Gly Thr Leu Glu Gly Phe Lys Val Glu Thr Ala Asp Leu Lys Glu Val 1220 1225 1230 Leu Ala Gly Lys Glu Asp Ser Glu His Arg Leu Val Leu Glu Leu Glu 1235 1240 1245 Ser Leu Arg Arg Gln Leu Gln Gln Ala Ala Gln Glu Gln Ala Ala Leu 1250 1255 1260 Arg Glu Glu Cys Thr Arg Leu Trp Ser Arg Gly Glu Ala Thr Ala Thr 1265 1270 1275 1280 Asp Ala Glu Ala Arg Glu Ala Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala His Lys 1285 1290 1295 Asp Ser Ala Leu Arg Lys Glu Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Gln Ser 1300 1305 1310 Glu Thr Arg Lys Gln Ala Glu Lys Asp Arg Ser Ala Leu Leu Ser Gln 1315 1320 1325 Met Lys Ile Leu Glu Ser Glu Leu Glu Glu Gln Leu Ser Gln His Arg 1330 1335 1340 Gly Cys Ala Lys Gln Ala Glu Ala Val Thr Ala Leu Glu Gln Gln Val 1345 1350 1355 1360 Ala Ser Leu Asp Lys His Leu Arg Asn Gln Arg Gln Phe Met Asp Glu 1365 1370 1375 Gln Ala Ala Glu Arg Glu His Glu Arg Glu Glu Phe Gln Gln Glu Ile 1380 1385 1390 Gln Arg Leu Glu Gly Gln Leu Arg Gln Ala Ala Lys Pro Gln Pro Trp 1395 1400 1405 Gly Pro Arg Asp Ser Gln Gln Ala Pro Leu Asp Gly Glu Val Glu Leu 1410 1415 1420 Leu Gln Gln Lys Leu Arg Glu Lys Leu Asp Glu Phe Asn Glu Leu Ala 1425 1430 1435 1440 Ile Gln Lys Glu Ser Ala Asp Arg Gln Val Leu Met Gln Glu Glu Glu 1445 1450 1455 Ile Lys Arg Leu Glu Glu Met Asn Ile Asn Ile Arg Lys Lys Val Ala 1460 1465 1470 Gln Leu Gln Glu Glu Val Glu Lys Gln Lys Asn Ile Val Lys Gly Leu 1475 1480 1485 Glu Gln Asp Lys Glu Val Leu Lys Lys Gln Gln Met Ser Ser Leu Leu 1490 1495 1500 Leu Ala Ser Thr Leu Gln Ser Thr Leu Asp Ala Gly Arg Cys Pro Glu 1505 1510 1515 1520 Pro Pro Ser Gly Ser Pro Pro Glu Gly Pro Glu Ile Gln Leu Glu Val 1525 1530 1535 Thr Gln Arg Ala Leu Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val Leu Asp Leu Lys 1540 1545 1550 Glu Gln Leu Glu Lys Met Lys Gly Asp Leu Glu Ser Lys Asn Glu Glu 1555 1560 1565 Ile Leu His Leu Asn Leu Lys Leu Asp Met Gln Asn Ser Gln Thr Ala 1570 1575 1580 Val Ser Leu Arg Glu Leu Glu Glu Glu Asn Thr Ser Leu Lys Val Ile 1585 1590 1595 1600 Tyr Thr Arg Ser Ser Glu Ile Glu Glu Leu Lys Ala Thr Ile Glu Asn 1605 1610 1615 Leu Gln Glu Asn Gln Lys Arg Leu Gln Lys Glu Lys Ala Glu Glu Ile 1620 1625 1630 Glu Gln Leu His Glu Val Ile Glu Lys Leu Gln His Glu Leu Ser Leu 1635 1640 1645 Met Gly Pro Val Val His Glu Val Ser Asp Ser Gln Ala Gly Ser Leu 1650 1655 1660 Gln Ser Glu Leu Leu Cys Ser Gln Ala Gly Gly Pro Arg Gly Gln Ala 1665 1670 1675 1680 Leu Gln Gly Glu Leu Glu Ala Ala Leu Glu Ala Lys Glu Ala Leu Ser 1685 1690 1695 Arg Leu Leu Ala Asp Gln Glu Arg Arg His Ser Gln Ala Leu Glu Ala 1700 1705 1710 Leu Gln Gln Arg Leu Gln Gly Ala Glu Glu Ala Ala Glu Leu Gln Leu 1715 1720 1725 Ala Glu Leu Glu Arg Asn Val Ala Leu Arg Glu Ala Glu Val Glu Asp 1730 1735 1740 Met Ala Ser Arg Ile Gln Glu Phe Glu Ala Ala Leu Lys Ala Lys Glu 1745 1750 1755 1760 Ala Thr Ile Ala Glu Arg Asn Leu Glu Ile Asp Ala Leu Asn Gln Arg 1765 1770 1775 Lys Ala Ala His Ser Ala Glu Leu Glu Ala Val Leu Leu Ala Leu Ala 1780 1785 1790 Arg Ile Arg Arg Ala Leu Glu Gln Gln Pro Leu Ala Ala Gly Ala Ala 1795 1800 1805 Pro Pro Glu Leu Gln Trp Leu Arg Ala Gln Cys Ala Arg Leu Ser Arg 1810 1815 1820 Gln Leu Gln Val Leu His Gln Arg Phe Leu Arg Cys Gln Val Glu Leu 1825 1830 1835 1840 Asp Arg Arg Gln Ala Arg Arg Ala Thr Ala His Thr Arg Val Pro Gly 1845 1850 1855 Ala His Pro Gln Pro Arg Met Asp Gly Gly Ala Lys Ala Gln Val Thr 1860 1865 1870 Gly Asp Val Glu Ala Ser His Asp Ala Ala Leu Glu Pro Val Val Pro 1875 1880 1885 Asp Pro Gln Gly Asp Leu Gln Pro Val Leu Val Thr Leu Lys Asp Ala 1890 1895 1900 Pro Leu Cys Lys Gln Glu Gly Val Met Ser Val Leu Thr Val Cys Gln 1905 1910 1915 1920 Arg Gln Leu Gln Ser Glu Leu Leu Leu Val Lys Asn Glu Met Arg Leu 1925 1930 1935 Ser Leu Glu Asp Gly Gly Lys Gly Lys Glu Lys Val Leu Glu Asp Cys 1940 1945 1950 Gln Leu Pro Lys Val Asp Leu Val Ala Gln Val Lys Gln Leu Gln Glu 1955 1960 1965 Lys Leu Asn Arg Leu Leu Tyr Ser Met Thr Phe Gln Asn Val Asp Ala 1970 1975 1980 Ala Asp Thr Lys Ser Leu Trp Pro Met Ala Ser Ala His Leu Leu Glu 1985 1990 1995 2000 Ser Ser Trp Ser Asp Asp Ser Cys Asp Gly Glu Glu Pro Asp Ile Ser 2005 2010 2015 Pro His Ile Asp Thr Cys Asp Ala Asn Thr Ala Thr Gly Gly Val Thr 2020 2025 2030 Asp Val Ile Lys Asn Gln Ala Ile Asp Ala Cys Asp Ala Asn Thr Thr 2035 2040 2045 Pro Gly Gly Val Thr Asp Val Ile Lys Asn Trp Asp Ser Leu Ile Pro 2050 2055 2060 Asp Glu Met Pro Asp Ser Pro Ile Gln Glu Lys Ser Glu Cys Gln Asp 2065 2070 2075 2080 Met Ser Leu Ser Ser Pro Thr Ser Val Leu Gly Gly Ser Arg His Gln 2085 2090 2095 Ser His Thr Ala Glu Ala Gly Pro Arg Lys Ser Pro Val Gly Met Leu 2100 2105 2110 Asp Leu Ser Ser Trp Ser Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Trp Thr 2115 2120 2125 Leu Glu Pro Trp Pro Ser Leu Pro Val Thr Pro His Ser Gly Ala Leu 2130 2135 2140 Ser Leu Cys Ser Ala Asp Thr Ser Leu Gly Asp Arg Ala Asp Thr Ser 2145 2150 2155 2160 Leu Pro Gln Thr Gln Gly Pro Gly Leu Leu Cys Ser Pro Gly Val Ser 2165 2170 2175 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Gln Trp Ala Glu Ser Pro Pro Ala Asp Asp 2180 2185 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Leu Gln Glu Lys Ser Leu Glu 2385 2390 2395 2400 His Leu Arg Leu Pro Asp Arg Ser Ser Leu Leu Ser Glu Ile Gln Ala 2405 2410 2415 Leu Arg Ala Gln Leu Arg Met Thr His Leu Gln Asn Gln Glu Lys Leu 2420 2425 2430 Gln His Leu Arg Thr Ala Leu Thr Ser Ala Glu Ala Arg Gly Ser Gln 2435 2440 2445 Gln Glu His Gln Leu Arg Arg Gln Val Glu Leu Leu Ala Tyr Lys Val 2450 2455 2460 Glu Gln Glu Lys Cys Ile Ala Gly Asp Leu Gln Lys Thr Leu Ser Glu 2465 2470 2475 2480 Glu Gln Glu Lys Ala Asn Ser Val Gln Lys Leu Leu Ala Ala Glu Gln 2485 2490 2495 Thr Val Val Arg Asp Leu Lys Ser Asp Leu Cys Glu Ser Arg Gln Lys 2500 2505 2510 Ser Glu Gln Leu Ser Arg Ser Leu Cys Glu Val Gln Gln Glu Val Leu 2515 2520 2525 Gln Leu Arg Ser Met Leu Ser Ser Lys Glu Asn Glu Leu Lys Ala Ala 2530 2535 2540 Leu Gln Glu Leu Glu Ser Glu Gln Gly Lys Gly Arg Ala Leu Gln Ser 2545 2550 2555 2560 Gln Leu Glu Glu Glu Gln Leu Arg His Leu Gln Arg Glu Ser Gln Ser 2565 2570 2575 Ala Lys Ala Leu Glu Glu Leu Arg Ala Ser Leu Glu Thr Gln Arg Ala 2580 2585 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Pro Ala Ala Ala Glu Gln Trp 2785 2790 2795 2800 Arg Lys Trp Gln Arg Asp Lys Glu Lys Leu Arg Glu Leu Glu Leu Gln 2805 2810 2815 Arg Gln Arg Asp Leu His Lys Ile Lys Gln Leu Gln Gln Thr Val Arg 2820 2825 2830 Asp Leu Glu Ser Lys Asp Glu Val Pro Gly Ser Arg Leu His Leu Gly 2835 2840 2845 Ser Ala Arg Arg Ala Ala Gly Ser Asp Ala Asp His Leu Arg Glu Gln 2850 2855 2860 Gln Arg Glu Leu Glu Ala Met Arg Gln Arg Leu Leu Ser Ala Ala Arg 2865 2870 2875 2880 Leu Leu Thr Ser Phe Thr Ser Gln Ala Val Asp Arg Thr Val Asn Asp 2885 2890 2895 Trp Thr Ser Ser Asn Glu Lys Ala Val Met Ser Leu Leu His Thr Leu 2900 2905 2910 Glu Glu Leu Lys Ser Asp Leu Ser Arg Pro Thr Ser Ser Gln Lys Lys 2915 2920 2925 Met Ala Ala Glu Leu Gln Phe Gln Phe Val Asp Val Leu Leu Lys Asp 2930 2935 2940 Asn Val Ser Leu Thr Lys Ala Leu Ser Thr Val Thr Gln Glu Lys Leu 2945 2950 2955 2960 Glu Leu Ser Arg Ala Val Ser Lys Leu Glu Lys Leu Leu Lys His His 2965 2970 2975 Leu Gln Lys Gly Cys Ser Pro Ser Arg Ser Glu Arg Ser Ala Trp Lys 2980 2985 2990 Pro Asp Glu Thr Ala Pro Gln Ser Ser Leu Arg Arg Pro Asp Pro Gly 2995 3000 3005 Arg Leu Pro Pro Ala Ala Ser Glu Glu Ala His Thr Ser Asn Val Lys 3010 3015 3020 Met Glu Lys Leu Tyr Leu His Tyr Leu Arg Ala Glu Ser Phe Arg Lys 3025 3030 3035 3040 Ala Leu Ile Tyr Gln Lys Lys Tyr Leu Leu Leu Leu Ile Gly Gly Phe 3045 3050 3055 Gln Asp Ser Glu Gln Glu Thr Leu Ser Met Ile Ala His Leu Gly Val 3060 3065 3070 Phe Pro Ser Lys Ala Glu Arg Lys Ile Thr Ser Arg Pro Phe Thr Arg 3075 3080 3085 Phe Arg Thr Ala Val Arg Val Val Ile Ala Ile Leu Arg Leu Arg Phe 3090 3095 3100 Leu Val Lys Lys Trp Gln Glu Val Asp Arg Lys Gly Ala Leu Ala Gln 3105 3110 3115 3120 Gly Lys Ala Pro Arg Pro Gly Pro Arg Ala Arg Gln Pro Gln Ser Pro 3125 3130 3135 Pro Arg Thr Arg Glu Ser Pro Pro Thr Arg Asp Val Pro Ser Gly His 3140 3145 3150 Thr Arg Asp Pro Ala Arg Gly Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ser Pro 3155 3160 3165 His Ser Gly Gly Arg Ala Thr Pro Ser Pro Asn Ser Arg Leu Glu Arg 3170 3175 3180 Ser Leu Thr Ala Ser Gln Asp Pro Glu His Ser Leu Thr Glu Tyr Ile 3185 3190 3195 3200 His His Leu Glu Val Ile Gln Gln Arg Leu Gly Gly Val Leu Pro Asp 3205 3210 3215 Ser Thr Ser Lys Lys Ser Cys His Pro Met Ile Lys Gln 3220 3225

Claims (12)

  1. 페리센트린(Pericentrin: PCNT) 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물로,
    상기 뇌신경계 질환은 정상에 비해 PCNT 발현이 감소된 뇌신경계 질환이고, 뇌성마비 또는 뇌졸중인, 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 PCNT 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체이거나, 또는 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 PCNT 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인 조성물.
  3. 삭제
  4. PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 키트로,
    상기 뇌신경계 질환은 정상에 비해 PCNT 발현이 감소된 뇌신경계 질환이고, 뇌성마비 또는 뇌졸중인, 키트.
  5. 개체로부터 분리된 시료의 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료에서 측정된 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌신경계 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로,
    상기 뇌신경계 질환은 정상에 비해 PCNT 발현이 감소된 뇌신경계 질환이고, 뇌성마비 또는 뇌졸중인, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 시료는 혈장인 것인 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 측정된 발현량 또는 활성 수준이 상기 대조군 시료에서 측정된 발현량 또는 활성 수준보다 낮은 경우 뇌신경계 질환이 있는 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  8. 삭제
  9. 인 비트로에서, PCNT 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계;
    상기 세포에서 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 증가되게 하는 시험 물질을 뇌신경계 질환 치료제 후보물질로 선택하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법으로,
    상기 뇌신경계 질환은 정상에 비해 PCNT 발현이 감소된 뇌신경계 질환이고, 뇌성마비 또는 뇌졸중인, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어지는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 발현량의 측정은 PCNT 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
  12. 삭제
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