KR20240014038A - 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 단백질 및 이를포함하는 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드는 뇌졸중 동물모델, 뇌성마비 동물모델, 치매 모델, 파킨슨병 모델 및 자폐 모델에서 우수한 치료 효과를 갖는 바, 재생이 어려운 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
뇌신경계는 뇌, 척수, 뇌신경, 척수신경, 자율신경계 등으로 구성된 신체 조절 시스템을 의미한다. 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 외상성 뇌손상, 저산소성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 자폐, 조현병, 지적 장애, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증 등 다양하다. 뇌손상이란 내적 또는 외적인 여러 이유로 뇌의 신경조직에 이상이 생겨 행동 또는 기능상에 이상이 오는 상태를 의미한다. 뇌손상은 개방성 두부 손상, 폐쇄성 두부 손상, 감속손상, 독성 물질의 노출, 산소 부족, 종양, 감염, 또는 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환에 의해 발생할 수 있다.
뇌졸중은 허혈이나 출혈에 의하여 유발되며 암 및 심장병과 더불어 사망률이 높은 질병이다. 뇌졸중 같은 뇌신경계 질환의 경우, 뇌의 손상은 시간이 지나면서 신경운동 장애 및 근골격계 장애에 따른 주기적 진찰과 재활치료가 제공되어야만 하는 한계가 있다.
뇌성마비는 하나의 질병이 아니라 비슷한 임상적 특징을 가진 증후군을 집합적으로 일컫는 용어로 미성숙한 뇌에 대한 비진행성 병변 혹은 손상으로 생기는 운동과 자세의 장애를 보이는 임상증후군을 말한다. 뇌성마비란 발달 과정중인 뇌에 대한 손상으로 인하여 근육 조절 능력이나, 보행 시 자세유지 등에 문제를 일으키는 질환으로 뇌 손상은 출생 전후나, 출생 도중에 주로 발생하지만 임신중 어느때나 발생 가능하고 심지어 소아기때도 생길 수 있다.
뇌의 손상은 비진행성이지만 시간이 지나면서 신경운동 장애의 양상과 근골격계의 장애가 변화하므로 주기적인 진찰을 통해 변화된 임상 양상에 가장 적합한 재활 치료를 제공해야 한다. 그 밖에 다른 치료 방법들이 있지만 이를 통한 획기적이고 근본적인 치료 방법은 없는 실정이다.
퇴행성 뇌신경계 질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상과, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적 원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이다. 대표적인 질환으로는 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파킨슨 질환(Parkinson's disease) 및 기억장해 등이 있다. 퇴행성 뇌신경계 질환은 급격히 혹은 천천히 진행되는 괴사(necrosis)나 아폽토시스(apoptosis)에 의한 신경세포의 사멸이 나타난다. 따라서 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방, 조절 및 치료법 개발을 위해서는 신경세포의 사멸기전에 대한 이해가 필요하다.
현재 노산이 증가하면서 뇌성마비 환아와 같은 뇌신경계 질환의 위험이 증가하고 있으며, 현대 사회가 급속히 고령화됨에 따라 알츠하이머 질환 등의 퇴행성 뇌신경계 질환도 급증하고 있는 실태이다.
뇌졸중이나 치매 등과 같은 뇌신경계 질환은 공통적으로 뇌세포 또는 신경세포가 사멸하게 되는데, 그 결과 비가역적인 신경기능 장애를 가져온다. 현재 세계적으로 여러 종류의 화합물, 줄기세포 등을 이용한 치료를 동물 모델에서 시도하고 있으나, 임상시험에 적용되기엔 많은 문제가 수반되는 상황이다. 따라서, 이러한 뇌신경계 질환을 근본적으로 치료할 수 있는 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 것인 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 단백질 및 상기 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 단백질 및 상기 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 뇌 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1은 Human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform X5; 서열번호 3)의 3,229 amino acids 가운데 아미노산 번호 255-399 (145 amino acids)의 서열을 나타낸다.
상기 Human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform X5)는 기존에 알려진 PCNT와 아미노산 서열의 차이가 있는 다른 단백질로서, 공지되지 않았으며, 검색되지 않는 단백질이다. 구체적으로, 기존 PCNT 단백질 서열과 비교하여 PCNT-isoform X5는 기존 PCNT 단백질 서열과 비교하여 1288 내지 1298 및 2732 내지 2810 서열이 새로운 서열로 추가된 새로운 단백질이다. 기존에 알려진 PCNT는 세포질 내에 존재하며 세포 분열 시 핵내에서 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, PCNT-isoform X5는 혈장 내에서 발견된 단백질로서 차이가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 Human pericentrin (PCNT), 및 Human pericentrin-isoform X5의 3,229 amino acids과는 다른 새로운 물질로 볼 수 있다. 그 이유는 PCNT 또는 PCNT-isoform X5 단백질 전체의 크기 중 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 P145 (MK145)는 약 4.5% 양에 해당하므로, 단백질 구조가 각기 다르고, 그에 따라 같은 역할을 한다고 볼 수 없기 때문이다. 따라서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 PCNT 또는 PCNT-isoform X5 서열 중 일부와 일치하는 아미노산 서열로 이루어졌으나 새롭게 발견되어 정의된 물질이다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 "P145 (MK145)"로 정의한다.
다른 양상은 상기 단백질에 세포 투과 펩타이드가 추가적으로 융합된 것인 단백질을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질은 단백질의 세포 투과성을 높이기 위해 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPP)는 세포막을 투과할 수 있는 모든 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 막전달 서열(membrane-translocation sequence; MTS) 또는 이의 단편(상기 막전달 서열 중 연속하는 5개 이상의 아미노산 포함), 거대분자 세포내 전달 도메인(Macromolecule Intracellular Transduction Domain; MTD), TAT 펩타이드, 소수성 펩타이드 및 염기성 펩타이드를 포함하는 세포 투과성 융합 펩타이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 막전달 서열은, 예컨대, AAVALLPAVLLALLAP(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 이의 단편은 상기 아미노산 서열 중 연속하는 7 내지 16개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 단편, 예컨대, AAVALLP(서열번호 5) 또는 AVLLALLAP(서열번호 6)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소수성 펩타이드와 염기성 펩타이드의 융합 펩타이드는, 소수성 아미노산을 전체 아미노산 개수 기준으로 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상, 예컨대, 60 내지 100%, 70 내지 100%, 80 내지 100% 또는 90 내지 100%의 비율로 포함하는 5 내지 100개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 또는 6 내지 30개의 아미노산을 포함하는 소수성 펩타이드; 및 1 내지 6개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 단위체, 또는 상기 펩타이드 단위체가 2 내지 6개 반복된 반복체를 포함하고, 염기성 아미노산으로 이루어진, 염기성 펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질은 발현 및/또는 정제를 위한 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 및/또는 정제를 위해 서열번호 1의 N말단, C말단, 또는 양 말단에 1 내지 30개의 아미노산을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 발현 및/또는 정제를 위해 서열이 추가된 단백질은 서열번호 7의 아미노산서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 정제를 위한 서열은 His-tag 서열일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1의 N말단에 서열번호 3의 254번째 아미노산부터 N말단 방향으로 1 내지 30개의 아미노산 또는 상기 서열번호 1의 C말단에 서열번호 3의 400번째 아미노산부터 C말단 방향으로 1 내지 30개의 아미노산이 부가된 것인 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 3은 Human pericentrin-isoform X5 (PCNT- isoform X5)의 아미노산 서열을 나타낸다.
상기 단백질에 부가되는 아미노산은 상기 단백질의 N말단 또는 C말단의 한 쪽에만 부가될 수 있으며, 양 쪽 모두에 부가될 수 있다.
상기 단백질의 N말단 또는 C말단에 부가되는 아미노산은 적어도 1개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개 또는 30개일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)", "펩타이드(peptide)" 및 "단백질"은 상호 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec): 셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.
본 발명의 펩타이드, 즉 서열번호 1로 표시되는 펩타이드는 이의 기능적 동등물을 포함한다. 기능적 동등물이란, 본 발명의 펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(또는, 동일성)을 갖는 펩타이드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로, 본 발명의 폴리펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 여기서, 용어 "실질적으로"는 특정 성질의 전체 또는 거의 동일한 정도의 성질을 나타내는 상태를 의미한다.
본원에서 "상동성(homology) 또는 동일성(identity)"은, 펩타이드 분자와 같은 중합체 분자간의 전체적인 관련성(relatedness)을 의미한다. 예를 들면, 2개 폴리펩타이드 서열간의 상동성/동일성(%)의 계산은, 최적의 비교를 위해 2개의 서열을 배열하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 비교 목적으로 배열된 서열의 길이는, 기준 서열(reference sequence)의 길이의 적어도 30% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다. 그리고 나서, 상응하는 아미노산 부위의 아미노산을 서로 비교한다. 제1 서열의 부위에 위치한 아미노산이 제2 서열의 상응하는 부위의 아미노산과 동일한 경우, 2개의 서열은 당해 부위에서는 동일성을 가지는 것이다. 2개 서열의 동일성(%)은, 2개 서열간의 최적 배열(optimal alignment)을 위해 도입해야 하는 갭(gap)의 숫자와 길이를 고려한, 2개 서열에서 공통되는 아미노산을 가지는 부위의 숫자의 함수이다. 2개 서열간의 비교 및 동일성(%)의 결정은 수학적인 알고리즘을 통해 수행할 수 있다. 예를 들면, ClustalW (Thompson 외, 1994)를 사용하여 다음의 파라미터를 사용하여 서열 동일성 수치를 측정할 수 있다: 쌍 배열 파라미터 - 방법: 정확성(accurate), 매트릭스: PAM, 갭 개방 페널티(Gap open penalty): 10.00, 갭 연장 페널티(Gap extension penalty): 0.10; 다중 배열 파라미터 - 매트릭스: PAM, 갭 개방 페널티(Gap open penalty): 10.00, delay 동일성 (%): 30, 엔드 갭 페널티 부여(penalize end gaps): on, 갭 분리 거리(Gap separation distance): 0, 네가티브 매트릭스: no, 갭 연장 페널 티: 0.20, 잔기-특정 갭 페널티(residue-specific gap penalties): on, 친수성 갭 페널티: on, 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정 잔기에서의 서열 동일성은 단순히 유도체화된 동일한 잔기를 포함한다.
본원에서 용어 "실질적으로"는 특정 성질의 전체 또는 거의 동일한 정도의 성질을 나타내는 상태를 의미한다. 본원에서 용어 "실질적으로 동일한"은, 아미노산 또는 핵산 서열간의 비교와 관련하여 사용되고 있다. 본원 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는, 상응하는 부위에 동일한 잔기를 가지는 경우에 2개의 서열은 "실질적으로 동일한" 것으로 이해될 것이다. 당업계에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 다양한 종류의 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있는 데, 예를 들면 핵산 서열 비교를 위해서는 BLASTN을, 아미노산 서열 비교를 위해서는 BLASTP, 갭(gapped) BLAST, PSI-BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 상기한 컴퓨터 프로그램의 예는 아래 문헌에 기재되어 있다: Altschul 외, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul 외, Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis 외, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener 외, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. 동일한 서열을 검색하는 것 이외에, 상기한 컴퓨터 프로그램에서는 통상적으로 서열 동일성의 정도(degree of identity)를 제공해 준다. 2개의 서열에 있어서, 일정 길이의 잔기에 걸쳐 상응하는 부위의 잔기(residue) 중 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 91% 이상, 적어도 92% 이상, 적어도 93% 이상, 적어도 94% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 96% 이상, 적어도 97% 이상, 적어도 98% 이상, 적어도 99% 이상이 동일한 경우에 "실질적으로 동일한" 서열인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 상기한 "일정 길이의 잔기"는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 또는 그 이상의 잔기일 수 있다.
본원에서 상기 용어 "상응하는"은 소정의 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 위치(position)/정체(identity)를 결정하는 데에 종종 사용된다. 통상의 기술자라면, 폴리펩타이드 내의 잔기는 기준 펩타이드(reference-related polypeptide)에 기초한 원형 숫자 시스템(canonical numbering system)을 사용하여 종종 지정된다. 따라서, 예를 들어 제190번째 위치의 잔기에 "상응하는" 아미노산은 특정 아미노산 쇄에서 반드시 제190번째 위치에 있을 필요는 없으며, 통상의 기술자라면 "상응하는" 아미노산을 확인하는 방법에 대해서 쉽게 이해할 수 있다.
상기 "기능적 동등물"은 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과로 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한, 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한, 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 단백질의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 이와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 단백질 또는 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장 서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디폴트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디폴트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250 (표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명의 폴리펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 작제한다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 예를 들면, 인간 PCNT 또는 PCNT-isoform X5 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 주형으로 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 염기서열을 합성할 수도 있다. 작제된 폴리뉴클레오타이드 서열은 이 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 폴리뉴클레오타이드 염기 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 단백질을 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다.
상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드 또는 단백질"'이라 함은 본 발명에 따른 단백질 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 단백질 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 해당분야에 공지된 기술로 화학적으로 합성할 수 있다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 즉, 본 발명의 폴리펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다 (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). 바람직한 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase synthesis)을 이용하는 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 규명된 아미노산 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스(aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press, 1980).
유전공학적 방법에 의해 제조된 단백질 또는 화학적으로 합성된 단백질은 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 2는 P145를 코딩(암호화)하는 DNA 서열을 나타낸다.
본 명세서에서 "폴리뉴클레오타이드", "핵산"은 단일-가닥 또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오타이드의 공지된 아날로그도 포함된다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 것이면 제한 없이 사용될 수 있으며, DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 천연에서 분리되거나 당업계에 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
다른 양상은 상기 폴리뉴틀레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 발현벡터로서, 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 전달하는데 사용되는 모든 수단으로 바람직한 벡터는 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터이다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 유전자는 바이러스 벡터를 사용하여 또는 직접적인 DNA 도입을 통해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 도입시킨다. 표적 조직내에서의 발현은 돌연변이 벡터를 바이러스 벡터 또는 수용체 리간드 등을 이용하여 특정 세포에 대해 표적화하거나 또는 조직 특이적 프로모터를 사용하거나, 또는 그 두 방법 모두를 사용하여 실시할 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T.J.,Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).
또한, 본 발명에서 "코돈 최적화"는 암호화(코딩)된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다.
다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포는 줄기세포, 전구세포, 미생물, 식물세포 또는 동물세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 줄기세포는 구체적으로 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS), 중간엽줄기세포 또는 역분화줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 줄기세포에서 분화된 줄기세포, 예컨대 배아줄기세포 유래의 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포 유래의 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포 유래의 신경줄기세포 등을 모두 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 세포는 자가(autologous) 또는 타가, 또는 동종이계(allogenic) 또는 이종(Xenogenic) 세포일 수 있다.
형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자 수준에서 이해될 수 있는 범위 내에서 숙주세포에 따라 적합한 사용가능한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 단백질은 형질전환 세포를 적절한 배지에서 배양하거나, 또는 상기 형질전환 세포를 임의의 동물에 도입한 후 생체내에서 배양함으로써 용이하게 발현 및 대량 생산할 수 있다.
일 구체예는, 상기 단백질 및 상기 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공한다.
상기 세포 배양용 조성물은 상기 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 배양된 세포는 상기 단백질 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 세포내로 도입되거나 또는 세포외에서 작용하여 세포의 기능이 강화될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 단백질 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물의 용도를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌신경계를 구성하는 뇌, 척수, 뇌신경, 척수신경, 자율신경계 등 중 일부 또는 전부에 이상이나 장애가 발생한 질환을 모두 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 저산소성 뇌손상, 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 정신질환 및 퇴행성 뇌질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 정신질환은 자폐 스펙트럼, 조현병, 지적장애 및 다운증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸중(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취 (Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 용어, "예방"은 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 뇌신경계 질환을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 뇌신경계 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드는, 뇌신경계 질환 치료 또는 예방 효과가 있는 한 제한되지 않는다.
일 구체예에 있어서, 유효성분이 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드인 경우, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 일 구현예로, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 단백질또는 폴리뉴클레오타이드는 0 초과 10 μM 이하 농도일 수 있고, 예를 들어 0.9 μM 내지 4.5μM, 1.8 μM 내지 3.6 μM 농도로 포함될 수 있다. 다른 구현예로, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드는 0 초과 500 nM 이하 농도일 수 있고, 예를 들어 0 초과 100 nM, 0 초과 50 nM, 0 초과 40 nM 농도로 포함될 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않고, 투여 대상에 따라 효과적인 용량을 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식이 경구 투여 방식인지 또는 비경구 투여 방식인지에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
상기 정제 또는 캡슐 등과 같은 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스(Saccharose), 솔비 (Sorbitol), 만니톨(Mannitol), 전분, 아밀로펙틴(Amylopectin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 젤라틴(Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 칼슘(calcium stearate), 스테아릴 푸마르 산 나트륨(sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스(polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있다. 나아가 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1회 투여하거나 또는 수 회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일 양상에 따른 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드는 뇌졸중 동물모델, 뇌성마비 동물모델, 치매 모델, 파킨슨병 모델 및 자폐 모델에서 뇌졸중, 뇌성마비, 치매, 파킨슨 병 및 자폐 스펙트럼에 대하여 우수한 치료 효과를 갖는 바, 재생이 어려운 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 pET28a-P145(MK145) plasmid DNA를 대장균에 형질전환한 후 단백질 발현 및 정제를 통해 얻은 P145(MK145) 재조합 단백질의 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 P145를 ES-MSC에 형질주입하여 P145(MK145)의 발현양을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 뇌졸중 모델인 MCAO에 ES-MSC와 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 4는 뇌졸중 동물모델에 ES-MSC와 ES-MSC+P145(MK145)를 투여한 그룹에 대한 1일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차의 mNSS test 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 줄기세포 투여일인 7일차에서 28일차간의 행동 능력이 개선된 점수를 나타낸 것이다.
도 6은 허혈성 뇌졸중 동물모델에 P145(MK145) 단백질을 농도별로 투여한 그룹에 대한 1일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차의 modified Neurological Severity Score (mNSS) 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 8은 P145(MK145)를 100μg/kg으로 투여한 허혈성 뇌졸중 동물모델의 뇌조직을 이용하여 면역염색으로 신경세포 마커(NeuN)를 확인한 결과이다.
도 9 내지 12는 P145(MK145)를 10μg/kg으로 투여한 뇌졸중 동물모델의 뇌조직을 이용하여 웨스턴 블럿팅으로 염증마커 및 세포사멸 마커를 확인한 결과이다.
도 13은 출혈성 뇌졸중 모델(Intracerebral hemorrhage, ICH)에 P145 (MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 14는 ICH에 P145(MK145)를 농도별로 투여한 그룹에 대한 1일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차의 mNSS test 결과를 나타낸 것이다.
도 15 내지 17은 ICH에 P145(MK145) 투여일인 1일차에서 14, 21, 28일차간의 행동 능력이 개선된 점수를 나타낸 것이다.
도 18 내지 22는 P145(MK145)를 투여한 뇌출혈 동물모델의 뇌조직을 이용하여 RT-PCR로 염증마커를 확인한 결과이다.
도 23은 뇌성마비 모델인 영아기 저산소-허혈성 뇌손상(neonatal hypoxic-ischemic brain injury, HI)에 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 24는 뇌성마비 모델에서 P145(MK145)의 치료 35일 후의 mNSS와 cylinder test 행동평가 점수의 결과를 나타낸 것이다.
도 25 및 26은 P145(MK145)를 투여한 뇌성마비 모델의 뇌조직을 이용하여 RT-PCR로 염증마커 및 산화적 스트레스(reactive oxygen stress, ROS) 마커를 확인한 결과이다.
도 27은 치매 유발 모델인 아밀로이드 베타 주입동물에 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 28은 치매 모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 Y-Maze와 NORT test 행동평가 점수의 그래프를 나타낸 것이다.
도 29 및 30은 유전자발현 치매 모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 둥지만들기 행동의 이미지와 점수 그래프를 나타낸 것이다.
도 31 및 32는 유전자발현 치매 모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 아밀로이트 플라크를 염색한 이미지와 개수에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
도 33은 파킨슨병 유발 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 Forced swimming과 Tail suspension test 행동평가의 점수 그래프를 나타낸 것이다.
도 34 및 35는 파킨슨 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 ELISA 및 RT-PCR로 도파민 관련 유전자 및 단백질의 확인한 결과이다.
도 36은 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 37은 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후 사회적 기능 행동평가(sociality test) 점수의 그래프를 나타낸 것이다.
도 38 및 39는 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후 구슬을 덮는 이상행동 marble burying test 행동평가의 이미지와 점수의 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 P145를 ES-MSC에 형질주입하여 P145(MK145)의 발현양을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 뇌졸중 모델인 MCAO에 ES-MSC와 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 4는 뇌졸중 동물모델에 ES-MSC와 ES-MSC+P145(MK145)를 투여한 그룹에 대한 1일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차의 mNSS test 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 줄기세포 투여일인 7일차에서 28일차간의 행동 능력이 개선된 점수를 나타낸 것이다.
도 6은 허혈성 뇌졸중 동물모델에 P145(MK145) 단백질을 농도별로 투여한 그룹에 대한 1일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차의 modified Neurological Severity Score (mNSS) 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 8은 P145(MK145)를 100μg/kg으로 투여한 허혈성 뇌졸중 동물모델의 뇌조직을 이용하여 면역염색으로 신경세포 마커(NeuN)를 확인한 결과이다.
도 9 내지 12는 P145(MK145)를 10μg/kg으로 투여한 뇌졸중 동물모델의 뇌조직을 이용하여 웨스턴 블럿팅으로 염증마커 및 세포사멸 마커를 확인한 결과이다.
도 13은 출혈성 뇌졸중 모델(Intracerebral hemorrhage, ICH)에 P145 (MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 14는 ICH에 P145(MK145)를 농도별로 투여한 그룹에 대한 1일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차의 mNSS test 결과를 나타낸 것이다.
도 15 내지 17은 ICH에 P145(MK145) 투여일인 1일차에서 14, 21, 28일차간의 행동 능력이 개선된 점수를 나타낸 것이다.
도 18 내지 22는 P145(MK145)를 투여한 뇌출혈 동물모델의 뇌조직을 이용하여 RT-PCR로 염증마커를 확인한 결과이다.
도 23은 뇌성마비 모델인 영아기 저산소-허혈성 뇌손상(neonatal hypoxic-ischemic brain injury, HI)에 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 24는 뇌성마비 모델에서 P145(MK145)의 치료 35일 후의 mNSS와 cylinder test 행동평가 점수의 결과를 나타낸 것이다.
도 25 및 26은 P145(MK145)를 투여한 뇌성마비 모델의 뇌조직을 이용하여 RT-PCR로 염증마커 및 산화적 스트레스(reactive oxygen stress, ROS) 마커를 확인한 결과이다.
도 27은 치매 유발 모델인 아밀로이드 베타 주입동물에 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 28은 치매 모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 Y-Maze와 NORT test 행동평가 점수의 그래프를 나타낸 것이다.
도 29 및 30은 유전자발현 치매 모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 둥지만들기 행동의 이미지와 점수 그래프를 나타낸 것이다.
도 31 및 32는 유전자발현 치매 모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 아밀로이트 플라크를 염색한 이미지와 개수에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
도 33은 파킨슨병 유발 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 Forced swimming과 Tail suspension test 행동평가의 점수 그래프를 나타낸 것이다.
도 34 및 35는 파킨슨 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 ELISA 및 RT-PCR로 도파민 관련 유전자 및 단백질의 확인한 결과이다.
도 36은 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 37은 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후 사회적 기능 행동평가(sociality test) 점수의 그래프를 나타낸 것이다.
도 38 및 39는 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후 구슬을 덮는 이상행동 marble burying test 행동평가의 이미지와 점수의 그래프를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.
실시예 1. P145
(MK145)
유전자 클로닝
본 발명에서 사용한 P145(MK145) 단백질(서열번호 1)의 제조는 pET-28a 발현 벡터를 이용하여 재조합 단백질 발현 및 정제에 의해 이루어졌다. Human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform X5, 서열번호 3)를 주형으로 하여 PCNT-isoform X5 단백질 전체 서열 가운데 아미노산 255-399(145개 아미노산)에 해당하는 DNA 서열(서열번호 2)에 대한 upstream 및 downstream 프라이머를 각각 제작(코스모진텍, 대한민국)하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. 사용한 각각의 프라이머 서열은 다음과 같다.
Up primer : 5'-CGCCTAGCTAGCATGGAGGATTTACAAAAC-3' (밑줄은 제한효소 NheI 인식 서열)(서열번호 8).
Down primer : 5'-AATATAGGATCCTTACTCCAGTTCGGACTCATG-3' (밑줄은 제한효소 BamHI 인식 서열)(서열번호 9).
PCR을 통해 얻은 DNA 단편을 제한효소 NheI과 BamHI으로 자르고, 동일한 제한효소로 처리하여 얻은 pET28a plasmid vector(Novagen, Germany)에 도입하여 pET28a-P145 재조합 DNA를 제작하였다.
실시예 2. P145(MK145) 단백질 발현 및 정제
제작된 pET28a-P145 클론을 대장균주 BL21(DE3)에 형질도입시켜 재조합 단백질 발현을 위해 대장균을 LB broth 배지에 일정한 시간 배양한 후 isopropyl-β-D-thio-galactoside(IPTG)를 첨가하여 30℃에서 4시간 추가 배양하였다. 배양된 대장균을 원심분리로 회수하여 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 Ni-NTA 친화 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography) 방법으로 P145 단백질을 분리하였다.
정제된 단백질은 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하여 확인하였다. P145 재조합 단백질의 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색한 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 3. 줄기세포에 P145의 과발현을 위한 형질주입
제작된 pET28a-P145 재조합 DNA는 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)에 lipofectamine을 이용하여 형질주입하였다. 형질주입 24시간 후에 세포를 harvest 하여 RT-PCR로 발현정도를 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. Control 세포와 비교하여 P145단백질이 과발현된 것을 확인하였다.
실시예 4. 뇌졸중 동물모델에서 P145의 치료적 효능평가
4.1. 허혈성 뇌졸중 동물 모델의 확립
중대뇌동맥을 내경동맥(internal carotid artery; ICA)을 통해 봉합용 모노필라멘트 실을 삽입하여 폐쇄함으로써 중대뇌동맥(middle carotid artery; MCA)으로 가는 혈류를 막는 방법으로 실을 유지시키면 영구적인(permanent) 모델이 되고, 실을 제거하여 재관류(reperfusion)를 일으키면 일시적인(transient) 폐쇄술이 된다.
생후 6~8주의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 래트 (200 ~ 250g)는 12시간 명-암으로 21도의 조건으로 유지하였으며 먹이 및 식수를 제공하였다.
뇌졸중 동물 모델로는 MCA 폐쇄 후 재관류를 일으킨 일시적 중대뇌동맥 폐색 (Middle cerebral artery occlusion; MCAO) 모델을 제작하였다. SD 래트를 3% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입 마취시킨 후 호흡 마취 기기를 이용하여 1.5% 이소플루란을 수술 동안 유지시켰다. 목 부위의 정중선을 절개하고 오른쪽 총경동맥(common carotid artery; CCA), 외경동맥(external carotid artery; ECA) 그리고 내경동맥(internal carotid artery; ICA)을 미주신경이 손상되지 않도록 노출시켰다. 먼저 총경동맥과 외경동맥을 블랙실크 봉합사로 묶고 외경동맥의 혈관 벽을 쪽가위를 이용하여 작은 구멍을 만들었다. 제작한 4-0 나일론 필라멘트를 작은 구멍을 낸 외경동맥으로부터 오른쪽 내경동맥을 통하여 중대뇌동맥까지 (1.5~1.8mm) 삽입하여 막았다. 절개한 목의 피부를 닫고 90분 후에 중대뇌동맥을 삽입된 필라멘트를 제거시켜 혈액을 재관류시켰다. 수술을 시행하는 동안 직장온도계를 통해 37℃를 유지하도록 했다.
4.2. 허혈성 뇌졸중 동물 모델에 각 ES-MSC 및 ES-MSC+P145 투여
ES-MSC는 계대배양을 12번 수행한 p12(passage12)를 사용하였으며, 각 세포는 한 개 바이알당 5Х106개 세포로 얼렸으며 사용 시 래트 한 마리당 3Х106개 세포를 생리식염수 1ml에 녹여 꼬리 정맥주사로 주입하였다. ES-MSC+P145는 P145를 형질주입한 후 24시간 뒤에 harvest 하여 생리식염수에 녹여 꼬리 정맥주사로 주입하였다. 대조군은 동일한 양으로 생리식염수를 주입하였다.
치료제의 투여는 MCAO 모델 제작 후 7일차에 수행하였으며, 모든 동물 모델의 실험은 블라인드로 수행하였다.
4.3. 허혈성 뇌졸중 동물 모델의 행동 평가 분석
뇌졸중 모델에서의 치료 스케줄을 도 3에 나타내었다.
행동 평가는 수술 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 그리고 28일 총 6번을 수행하였다.
신경학적 결손 척도(modified neurological severity scores; mNSS): 총 14점이 만점인 분석방법으로 정상적인 행동을 보일 때는 0점, 신경학적 결손이 심할수록 총점 14점에 가까워진다. 사지긴장도(총 3점), 보행(총 3점), 평형유지력(총 6점), 감각기능(총 2점)을 종합적으로 평가하여 합산하였다. 평가결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
그 결과, 수술 후 28일에 있어서 mNSS 점수가 ES-MSC+P145군에서 5.88로 ES-MSC군의 6.25 보다도 낮게 나타나, 뇌졸중에 대한 치료효과가 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, 수술 후 7일차와 28일차간의 행동 능력 점수 차이가 ES-MSC+P145군에서 4.13으로 ES-MSC군의 2.63 보다도 크게 나타나, 뇌졸중에 대한 치료효과가 우수한 것으로 나타났다.
이를 통해, P145를 과발현 시킨 경우, 단순히 MSC를 처리하는 것보다 뇌졸중에 우수한 치료효과가 있음을 알 수 있었다. 이는 P145가 뇌졸중의 치료제로서 사용될 수 있음을 의미한다.
4.4. 허혈성 뇌졸중 동물 모델에 P145(MK145)를 투여
새롭게 제작한 P145(MK145) 단백질은 1μg/kg, 10μg/kg, 100μg/kg로 농도별로 생리식염수로 희석하였다. 허혈성 뇌졸중 동물모델 래트 한 마리당 P145 단백질을 복강투여로, 뇌졸중 모델 유도 후 2일차부터 5일간 주입하였다. 대조군은 동일한 양으로 생리식염수를 주입하였다.
4.5. 허혈성 뇌졸중 동물 모델에 P145(MK145)를 투여에 따른 치료효능 확인
허혈성 뇌졸중 동물모델에 상기한 바와 같이 P145(MK145) 단백질을 농도별로 투여 후 mNSS test를 수행하였다. 평가결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록, 경과 일 수에 따른 mNSS 점수가 낮았다. 이를 통해, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록 dose-dependent 하게 신경회복이 발생함을 알 수 있다.
허혈성 뇌졸중 동물모델(대조군 및 100μg/kg P145(MK145) 단백질 투여군) 래트의 뇌조직을 20uM 두께로 자른 샘플을 이용하여 면역염색을 진행하여 신경분화 마커인 NeuN을 확인하였다. 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 단백질을 투여한 뇌조직에서 손상된 부위 근처에 신경세포 보호효과로 인하여 신경세포가 cortex와 striatum 부위에서 모두 증가한 것을 확인하였다. 이는, P145(MK145)가 뇌졸중의 치료제로서 사용될 수 있음을 의미한다.
정상 래트와 허혈성 뇌졸중 동물모델 래트(대조군 및 10μg/kg P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직을 활용하여 웨스턴 블럿팅을 하였다. 그 결과를 도 9 내지 12에 나타내었다.
P145(MK145) 투여한 군에서는, TNF-a protein, NLRP3 protein, Bax protein, Bcl-2 protein, ATF6 protein 및 GRP78 protein의 발현양이 대조군보다 감소하였다.
이를 통해, P145(MK145) 단백질 투여에 의한 뇌손상에 의하여 발생한 inflammasome 염증, 세포 사멸과 ER 스트레스의 치료효과를 알 수 있고, P145(MK145)가 뇌졸중의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
4.6. 출혈성 뇌졸중 동물 모델에 P145(MK145)를 투여
출혈성 뇌졸중 모델에서의 치료 스케줄을 도 13에 나타내었다.
새롭게 제작한 P145(MK145) 단백질은 1μg/kg, 10μg/kg, 100μg/kg로 농도별로 생리식염수로 희석하였다. 출혈성 뇌졸중 동물 모델 래트 한 마리당 P145 단백질을 복강투여로 출혈성 뇌졸중 모델 유도 후 1일차부터 5일간 주입하였다. 대조군은 동일한 양으로 생리식염수를 주입하였다.
4.7. 출혈성 뇌졸중 동물 모델에 P145(MK145)를 투여에 따른 치료효능 확인
출혈성 뇌졸중 동물모델에 상기한 바와 같이 P145(MK145) 단백질을 농도별로 투여 후 mNSS test를 수행하였다. 평가결과를 도 14 및 도 15 내지 17에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록, 경과 일 수에 따른 mNSS 점수가 낮았다. 또한, 경과 일이 증가할수록 개선점수(improved scores)는 높아졌으며, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록 개선 점수(improved scores)가 더 높았다. 이를 통해, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록 dose-dependent 하게 신경학적 회복이 더 잘 발생함을 알 수 있다.
정상 래트와 출혈성 뇌졸중 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직을 활용하여 RT-PCR을 수행하여 분석하였다. 그 결과를 도 18 내지 22에 나타내었다.
그 결과로, 뇌출혈에 따라, NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1β 및 IL-18의 mRNA 발현양이 증가하여 염증 발현이 증가하나, P145(MK145)를 투여한 군에서는 그 발현양이 대조군보다 감소하였다.
이를 통해, P145(MK145) 단백질 투여에 의한 뇌손상에 의하여 발생한 inflammasome 염증의 치료효과를 알 수 있고, P145(MK145)가 뇌졸중의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5. 뇌성마비 동물모델에서 P145의 치료적 효능평가
5.1. 뇌성마비 동물 모델의 확립
생후 7일차 되는 ICR mouse를 이용하여 뇌성마비 동물모델을 제작하였다.
생후 7일차 ICR mouse의 오른쪽 총경동맥(common carotid artery; CCA)를 5-0 blue nylon을 이용하여 묶은 뒤, O2 8%, N2 92%로 유지되는 밀폐된 특수 용기에 37℃로 유지시킨 뒤 1시간 동안 저산소-뇌허혈을 유도하였다.
모델 제작 후, 6일뒤에 뇌 조직의 손상 정도를 눈으로 확인하여 50%이상 손상된 모델은 제외시켰다.
5.2. 뇌성마비 동물 모델에 P145 단백질 투여
정제하여 추출한 P145 단백질 100ng을 복강투여로 100μl의 생리식염수에 녹여 투여하였다.
치료제의 투여는 뇌성마비 모델 제작 후 7일차에 수행하였으며, 모든 동물 모델의 실험은 블라인드로 수행하였다.
5.3. 뇌성마비 동물 모델의 행동 평가 분석
뇌성마비 모델에서의 치료 스케줄을 도 23에 나타내었다.
행동 평가는 수술 후 35일, 치료제 투여 후 28일 뒤에 1번 수행하였다.
신경학적 결손 척도(modified neurological severity scores; mNSS): 총 14점이 만점인 분석방법으로 정상적인 행동을 보일 때는 0점, 신경학적 결손이 심할수록 총점 14점에 가까워진다. 사지긴장도(총 3점), 보행(총 3점), 평형유지력(총 6점), 감각기능(총 2점)을 종합적으로 평가하여 합산하였다.
실린더 평가(cylinder test): 공간감각과 운동기능을 기반으로 한 탐색능력을 측정하는 방법으로 실험 동물을 지름 15cm, 높이 40cm 유리 실린더에 위치시킨 후, 실험 동물이 기립하여 앞발로 벽을 짚는 횟수를 총 20회 관찰하였다. 분석은 총 20회의 횟수 중 장애가 보이는 왼쪽 앞발이 벽을 짚은 횟수를 %로 계산하였다. 평가결과를 도 24에 나타내었다.
그 결과, 수술 후 35일에 있어서 mNSS 점수가 P145를 투여한 군에서 현저하게 감소하는 것으로 나타나, 뇌성마비에 대한 치료효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 실린더 평가에 있어서도, P145(MK145)를 투여한 군에 있어 장애가 보이는 앞발의 사용 빈도가 증가하는 것으로 나타나, 뇌성마비에 대한 치료효과가 있는 것으로 나타났다. 이를 통해 P145(MK145)가 뇌성마비의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
5.4. 뇌성마비 뇌졸중 동물 모델의 P145(MK145)의 치료기전 확인
샴 래트와 뇌성마비 뇌졸중 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 분석하였다. 그 결과를 도 25 및 26에 나타내었다.
그 결과로, 뇌손상에 따라, 염증마커인 NLRP3, ASC 및 Caspase-1의 와 ROS 마커인 NOX2 및 NOX4 의 mRNA 발현양이 증가하나, P145(MK145) 투여한 군에서는 그 발현양이 대조군보다 감소하였다.
이를 통해, P145(MK145) 단백질 투여에 의한 뇌손상에 의하여 발생한 염증 및 증가된 ROS의 치료효과를 알 수 있고, P145(MK145)가 뇌성마비의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6. 치매동물모델에서 P145(MK145)의 치료적 효능평가
6.1. 아밀로이드 베타 주입 동물 모델의 확립
생후 6주의 체중은 23~25g 정도 되는 수컷 B6 계 생쥐를 이용하였으며, 한 사육장에(cage) 5마리씩 사육하였으며 12시간 명-암으로 21℃의 조건으로 유지하였으며 먹이 및 식수를 제공하였다.
기억력결손을 일으키는 물질인 아밀로이드 베타1-42는 10% DMSO(dimethyl sulfoxide) 식염수에 녹인 후 37℃에서 1주 동안 배양하고 10μM 농도로 준비하였다.
실험 동물은 3% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입 마취 시킨 후 호흡 마취 기기를 이용하여 1.5% 이소플루란을 수술 동안 유지시켰다. 뇌정위수술틀 (stereotaxic)을 준비한 후 실험 동물의 머리를 고정시키고 bregma에서 후방 -0.9mm, 측면 1.7mm, 깊이 2.2mm로 아밀로이드베타1-42 5㎕를 26-gauge 바늘이 달려있는 10μl Hamilton microsyringe로 10분동안 주입하였다.
6.2. 아밀로이드 베타 주입 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여
정제하여 추출한 P145(MK145) 단백질 100ng을 복강(IP) 및 정맥(IV)투여로 100μl의 생리식염수에 녹여 투여하였다.
치료제의 투여는 치매 모델 제작 후 7일차에 수행하였으며, 모든 동물 모델의 실험은 블라인드로 수행하였다.
6.3. 아밀로이드 베타 주입 동물 모델의 행동 평가 분석
아밀로이드 베타 주입 동물 모델에서의 치료 스케줄을 도 27에 나타내었다.
시술 전 Y미로 와 NORT 인지능력 평가를 훈련시켰고 이를 점수화한 후에 행동평가를 진행하였으며 시술 후 7일째에 병변모델들을 선정하여 실험을 진행하였다. 시술 7일 후에 치료제를 처리하여 인지기능이 개선되는지를 치료 후 7일, 14일에 측정하였다.
Y자 미로 평가(Y-maze test): 장치는 3개의 통로(arm)으로 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며 각 가지의 길이는 35cm, 높이 15cm, 폭 5cm이고 동일한 각도로 위치시킨다. 실험 동물의 움직임을 교차 회수로 나타내는데 교차 회수는 연속적으로 3개의 통로를 순차적으로 통과하였을 때 한 번 교차한 것으로 정의된다 (spontaneous alteration). 각 실험 동물은 한 쪽 미로에서 시작하여 다른 미로로 가도록 하였으며 올바른 교차를 성공한 회수를 점수화하여 백분율로 표현 하였다. 2분간 자유롭게 움직이게 한 후 5분간 측정하였다.
새로운 물체 인식 테스트(novel object recognition test; NORT): 설치류의 호기심을 자극하는 인지 실험 기법으로 기존 적응 훈련기간동안 동일한 물체 두 가지에 대한 기억을 주입시키고 측정 시작과 동시에 다른 물체, 다른 색상의 물체로 치환해줌으로써 본능적인 호기심을 유도하여 기억력을 측정한다. 2분간 익숙한 물체(familiar)로 자유롭게 움직이도록 하고 새로운 물체(novel)로 바꿔준 후 5분간 측정하여 새로운 물체에 머문 시간을 각 물체의 머문 시간의 합으로 나누어 준 후 백분율로 표현하였다. 그 결과를 도 28에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 투여 후 7일 및 14일 째에 있어서, Y자 미로 평가 및 새로운 물체 인식 테스트 모두에서 P145를 복강 및 정맥으로 투여한 군은 투여하지 않은 군과 비교하여 현저하게 높은 수치를 기록하여, 치매에 대한 치료효과가 있는 것으로 나타났다. 이를 통해 P145(MK145)가 치매의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
6.4. APP/PS1 TG 치매 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여
12개월된 APP/PS1 TG 동물모델에 P145를 복강투여로 5일간 투여 후 둥지 만들기 행동 평가(Nest test)를 수행하였다. 정상 래트와 APP/PS1 TG 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 Nest test 평가결과를 도 29 및 30에 나타내었다.
그 결과로, 치매 유발에 따라 둥지 만들기 행동에 이상이 생기나, P145(MK145) 단백질을 투여한 군에서는, 대조군보다 개선된 둥지 만들기 행동과 점수가 나타났으며, 이를 통해, P145(MK145)가 치매의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
정상 래트와 APP/PS1 TG 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직을 이용하여 아밀로이드 베타 플라크를 염색한 후 분석하였다. 그 결과를 도 31 및 32에 나타내었다.
그 결과, P145 투여한 군에서 플라크의 숫자가 유의미하게 감소한 것을 확인하였다. 이를 통해, P145(MK145)가 치매의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7. 파킨슨 동물모델에서 P145(MK145)의 치료적 효능평가
7.1. MTPT 주입 동물 모델의 확립
생후 10주의 체중은 23~25g 정도 되는 수컷 B6 계 생쥐를 이용하였으며, 한 사육장에(cage) 5마리씩 사육하였으며 12시간 명-암으로 21℃의 조건으로 유지하였으며 먹이 및 식수를 제공하였다.
MTPT를 25mg/kg를 0.9% NaCl에 녹여 복강투여로 7일간 투여하여 파킨슨 모델을 유도하였다.
7.2. 파킨슨 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여
정제하여 추출한 P145 단백질 10μg/kg을 복강(IP)으로 총 5회 100μl의 생리식염수에 녹여 투여하였다.
치료제의 투여는 치매 모델 제작 후 7일차부터 수행하였으며, 모든 동물 모델의 실험은 블라인드로 수행하였다.
7.3. 파킨슨 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여에 따른 치료효능 확인
파킨슨 동물모델에서 P145(MK145) 투여 후 신경행동 평가를 수행하였다. 정상 래트와 파킨슨 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 신경행동 평가 결과를 도 33에 나타내었다.
그 결과로, 파킨슨 질환 유발에 따라 신경행동 이상이 생기나, P145(MK145) 단백질을 투여한 군에서는, 대조군보다 개선된 신경행동이 나타났으며, 이를 통해, P145(MK145)가 파킨슨 질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
정상 래트와 파킨슨 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 도파민 발현양을 ELISA를 통해 분석하였다. 그 결과를 도 34에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 투여한 군에서, 도파민의 양이 대조군보다 증가하였으며, hippocampus에서의 도파민 양이 정상군 및 대조군 보다 유의미하게 증가한 것을 확인하였다. 이를 통해, P145(MK145)가 파킨슨 질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
정상 래트와 파킨슨 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직 내 도파민 관련 receptor의 발현양을 RT-PCR을 통해 분석하였다. 그 결과를 도 35에 나타내었다.
그 결과, 파킨슨 병 신경기능과 관계 높은 것으로 알려진 도파민 1형 수용체와 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)의 발현이 파킨슨 유발에 따라 저하되었다가. P145(MK145)를 투여한 군에서는 대조군보다 발현이 향상되었다. 이를 통해, P145(MK145)가 파킨슨 질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8. 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료적 효능평가
8.1. VPA 주입 자폐 동물 모델의 확립
임신 12일차 되는 어미 쥐에 피하로 VPA를 투여하여 생후 40일까지 사육하였으며, 12시간 명-암으로 21℃의 조건으로 유지하였으며 먹이 및 식수를 제공하였다.
8.2. 자폐 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여
정제하여 추출한 P145(MK145) 단백질 100μg/kg을 복강(IP)으로 생후 47일부터 총 5회 100μl의 생리식염수에 녹여 투여하였다.
8.3. 자폐 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여에 따른 치료효능 확인
자폐 모델에서의 치료 스케줄은 도 36에 나타내었다.
자폐 모델의 행동평가는 P145(MK145) 투여 후 다음날부터 3일간 수행하였다.
정상 래트와 자폐 모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 낯선 또래를 만났을 때의 사회화 반응을 분석하였다. 그 결과를 도 37에 나타내었다.
그 결과로, 자폐 유발에 따라 낯선 또래를 만났을 때의 사회하 반응이 저하되었으나, P145(MK145) 단백질을 투여한 군에서는, 대조군보다 개선된 사회화 반응이 나타났으며, 이를 통해, P145(MK145)가 자폐의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
정상 래트와 자폐 모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 자폐 증세로서 구슬을 파묻어 버리는 행동을 분석하였다. 그 결과를 도 38 및 39에 나타내었다.
그 결과로, 자폐 유발에 따라, 구슬을 파묻어 버리는 행동이 증가하였으나, P145(MK145) 단백질을 투여한 군에서는, 대조군보다 감소된 구슬을 파묻어 버리는 행동이 나타났으며, 이를 통해, P145(MK145)가 자폐의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
Claims (14)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
- 제1 항에 있어서,
상기 단백질에 세포 투과 펩타이드가 추가적으로 융합된 것인 단백질. - 제1 항에 있어서,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1의 N말단에 서열번호 3의 254번째 아미노산부터 N말단 방향으로 1 내지 30개의 아미노산 또는 상기 서열번호 1의 C말단에 서열번호 3의 400번째 아미노산부터 C말단 방향으로 1 내지 30개의 아미노산이 부가된 것인 단백질. - 제1 항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제4 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드.
- 제4 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제6 항의 벡터로 형질전환된 것인 세포.
- 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항의 단백질 및 제4 항 또는 제5 항의 폴리뉴클레오타이드 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 세포 배양용 조성물.
- 제8 항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 전구세포, 식물세포 및 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 세포 배양용 조성물.
- 제9 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS), 중간엽줄기세포 및 역분화줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 세포 배양용 조성물.
- 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항의 단백질 및 제4 항 또는 제5 항의 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제11 항에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 저산소성 뇌손상, 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 정신질환 및 퇴행성 뇌질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
- 제12 항에 있어서, 상기 정신질환은 자폐 스펙트럼, 조현병, 지적장애 및 다운증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
- 제12 항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸중(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
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Patent Citations (1)
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