WO2024019603A1 - 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents
뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to proteins for preventing or treating brain nervous system diseases and pharmaceutical compositions containing the same.
- the cranial nervous system refers to the body control system consisting of the brain, spinal cord, cranial nerves, spinal nerves, and autonomic nervous system.
- Neurological diseases include cerebral palsy, traumatic brain injury, hypoxic brain injury, ischemic brain injury, stroke, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, autism, schizophrenia, intellectual disability, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, dementia, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, and Peak (Pick disease), Creutzfeld-Jakob disease, amyotrophic axial sclerosis, primary axonal sclerosis, degenerative ataxia, multiple sclerosis, nervous system dysfunction, memory loss, epilepsy, encephalitis, prion disease, neuropathy, etc.
- Brain damage refers to a condition in which abnormalities in behavior or function occur due to abnormalities in the nervous tissue of the brain due to various internal or external reasons. Brain damage can be caused by open head injury, closed head injury, deceleration injury, exposure to toxic substances, oxygen deprivation, tumor, infection, or cerebrovascular disease such as stroke.
- Stroke is caused by ischemia or hemorrhage and is a disease with a high mortality rate along with cancer and heart disease.
- brain diseases such as stroke
- brain damage has limitations as periodic examinations and rehabilitation treatment must be provided according to neuromotor and musculoskeletal disorders over time.
- Cerebral palsy is not a single disease, but a collective term for syndromes with similar clinical characteristics. It refers to a clinical syndrome that shows movement and posture disorders caused by non-progressive lesions or damage to the immature brain. Cerebral palsy is a disease that causes problems with muscle control or maintaining posture when walking due to damage to the brain during development. Brain damage mainly occurs before, during, or after birth, but can occur at any time during pregnancy and even during childhood. You can.
- Degenerative brain nervous system disease is a disease in which degenerative changes occur in nerve cells of the central nervous system, causing various symptoms such as impairment of motor and sensory functions and inhibition of higher-order causal functions such as memory, learning, and computational reasoning.
- Representative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and memory impairment.
- Degenerative brain and nervous system diseases result in the death of nerve cells due to necrosis or apoptosis that progresses rapidly or slowly. Therefore, in order to prevent, control, and develop treatments for degenerative brain and nervous system diseases, an understanding of the death mechanisms of nerve cells is necessary.
- brain and nervous system diseases such as cerebral palsy
- degenerative brain and nervous system diseases such as Alzheimer's disease are also rapidly increasing.
- Neurological diseases such as stroke and dementia commonly result in the death of brain cells or nerve cells, resulting in irreversible neurological dysfunction.
- treatments using various types of compounds, stem cells, etc. are being attempted in animal models around the world, but many problems are involved in applying them to clinical trials. Therefore, there is a need to develop a therapeutic agent that can fundamentally treat these brain and nervous system diseases.
- One aspect is to provide a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
- Another aspect is providing a polynucleotide encoding the protein.
- Another aspect is to provide a recombinant vector containing the polynucleotide.
- Another aspect is providing cells that have been transformed with the vector.
- Another aspect is to provide a composition for cell culture containing any one selected from the group consisting of the protein and the polynucleotide.
- Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating brain and nervous system diseases, comprising as an active ingredient any one selected from the group consisting of the protein and the polynucleotide.
- Another aspect is to provide a method for preventing or treating a brain nervous system disease comprising administering the protein, the polynucleotide, or the composition to an individual in need thereof.
- Another aspect is to provide a use of the protein, the polynucleotide or the composition for use in the preparation of a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases of the brain nervous system.
- Another aspect provides a use of the protein, the polynucleotide or the composition for use in the prevention or treatment of a brain nervous system disease.
- One aspect provides a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
- SEQ ID NO: 1 represents the sequence of amino acids 255-399 (145 amino acids) among the 3,229 amino acids of Human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform X5; SEQ ID NO: 3).
- PCNT-isoform X5 The Human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform Specifically, compared to the existing PCNT protein sequence, PCNT-isoform X5 is a new protein with new sequences 1288 to 1298 and 2732 to 2810 compared to the existing PCNT protein sequence. Previously known PCNT exists in the cytoplasm and is known to play a role in the nucleus during cell division, but PCNT-isoform X5 is different as it is a protein found in plasma.
- the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be viewed as a new substance different from human pericentrin (PCNT) and the 3,229 amino acids of human pericentrin-isoform X5.
- PCNT human pericentrin
- MK145 protein P145
- the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention consists of an amino acid sequence that matches part of the PCNT or PCNT-isoform X5 sequence, but is a newly discovered and defined substance.
- the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is defined as “P145 (MK145)”.
- Another aspect provides a protein in which a cell-penetrating peptide is additionally fused to the above protein.
- the protein may further include a cell-penetrating peptide to increase cell permeability of the protein.
- the cell penetrating peptides may be any peptide that can penetrate the cell membrane, for example, a membrane-translocation sequence (MTS) or a fragment thereof (five consecutive sequences of the membrane-translocation sequence). It may be one or more types selected from the group consisting of (including the above amino acids), macromolecule intracellular transduction domain (MTD), TAT peptide, cell-penetrating fusion peptide including hydrophobic peptide and basic peptide, etc.
- MTS membrane-translocation sequence
- TAT peptide cell-penetrating fusion peptide including hydrophobic peptide and basic peptide, etc.
- the membrane transfer sequence may have, for example, an amino acid sequence of AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 4), and a fragment thereof may be a peptide fragment consisting of 7 to 16 consecutive amino acids in the amino acid sequence, such as AAVALLP (SEQ ID NO: 5). Alternatively, it may have the amino acid sequence of AVLLALLAP (SEQ ID NO: 6), but is not limited thereto.
- the fusion peptide of the hydrophobic peptide and the basic peptide contains hydrophobic amino acids of 60% or more, 70% or more, 80% or more or 90% or more, for example, 60 to 100%, 70 to 100%, 80 to 100%, based on the total number of amino acids. % or 90 to 100% hydrophobic peptide containing 5 to 100, 5 to 50, 5 to 40, or 6 to 30 amino acids; and a peptide unit containing 1 to 6 amino acids, or a basic peptide in which the peptide unit contains 2 to 6 repeated repeats and is made of basic amino acids.
- the protein may additionally include sequences for expression and/or purification.
- sequences for expression and/or purification 1 to 30 amino acids may be additionally included at the N-terminus, C-terminus, or both ends of SEQ ID NO: 1, but are not limited thereto.
- the protein to which the sequence has been added for expression and/or purification may include, but is not limited to, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
- the sequence for purification may be a His-tag sequence, but is not limited thereto.
- Another aspect includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and 1 to 30 amino acids from the 254th amino acid of SEQ ID NO: 3 at the N-terminus of SEQ ID NO: 1 to the N-terminus, or SEQ ID NO: 3 at the C-terminus of SEQ ID NO: 1. It provides a protein in which 1 to 30 amino acids are added from the 400th amino acid to the C terminus.
- SEQ ID NO: 3 represents the amino acid sequence of Human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform X5).
- the amino acid added to the protein may be added to either the N-terminus or the C-terminus of the protein, or to both.
- the number of amino acids added to the N-terminus or C-terminus of the protein may be at least 1, at least 5, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, or 30.
- polypeptide As used herein, the terms “polypeptide,” “peptide,” and “protein” are used interchangeably and refer to a polymer of amino acid residues, e.g., as commonly found in proteins in their native state.
- the single letter (triple letter) of amino acids refers to the following amino acids according to standard abbreviation conventions in the field of biochemistry: A (Ala): alanine; C(Cys): Cysteine; D(Asp): Aspartic acid; E(Glu): glutamic acid; F(Phe): Phenylalanine; G(Gly): glycine; H(His): histidine; I(IIe): Isoleucine; K(Lys): Lysine; L(Leu): leucine; M(Met): methionine; N(Asn): Asparagine; O(Ply): pyrrolysine; P(Pro): Proline; Q(Gln): Glutamine; R(Arg): arginine; S(Ser): Serine; T(Thr): threonine; U(Sec): Selenocysteine, V(Val): Va
- the peptide of the present invention that is, the peptide represented by SEQ ID NO: 1, includes functional equivalents thereof.
- Functional equivalent refers to a peptide having at least 70% or more sequence homology (or identity) with the amino acid sequence of the peptide of the present invention, preferably 80% or more, more preferably 90% or more.
- sequence homology includes a polypeptide having a , and refers to a peptide that exhibits substantially the same physiological activity as the polypeptide of the present invention.
- substantially means the state of exhibiting all or approximately the same degree of a particular property.
- homology or identity refers to the overall relatedness between polymer molecules, such as peptide molecules.
- calculation of % homology/identity between two polypeptide sequences can be performed by aligning the two sequences for optimal comparison.
- the length of the sequences arranged for comparison purposes is at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, or at least 80% of the length of the reference sequence. % or more, at least 90% or more, or substantially 100%. Then, the amino acids in the corresponding amino acid region are compared to each other. If an amino acid located at a region in the first sequence is identical to an amino acid at a corresponding region in the second sequence, the two sequences are identical at that region.
- the identity (%) of two sequences is a function of the number of regions with common amino acids in the two sequences, taking into account the number and length of gaps that must be introduced for optimal alignment between the two sequences. am. Comparison between two sequences and determination of identity (%) can be performed through a mathematical algorithm. For example, ClustalW (Thompson et al., 1994) can be used to estimate sequence identity values using the following parameters: Pair alignment parameters - method: accurate, matrix: PAM, gap open penalty.
- the term “substantially” means the state of exhibiting all or approximately the same degree of a particular property.
- the term “substantially identical” is used herein in reference to comparisons between amino acid or nucleic acid sequences. Those skilled in the art will understand that two sequences are “substantially identical” if they have identical residues in corresponding regions.
- amino acid or nucleic acid sequences can be compared using various types of algorithms, such as BLASTN for nucleic acid sequence comparison, BLASTP, gapped BLAST, for amino acid sequence comparison.
- Computer programs such as PSI-BLAST can be used. Examples of such computer programs are described in Altschul et al., Basic local alignment search tool, J. Mol.
- At least 70% of the residues of the corresponding region over a certain length of residues preferably at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92 Sequences are considered “substantially identical” if they are at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical.
- the "residues of a certain length" described above are at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, It may be 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 or more residues.
- corresponding is often used herein to determine the position/identity of an amino acid residue in a given polypeptide.
- residues within a polypeptide are often designated using a canonical numbering system based on a reference-related polypeptide. Therefore, for example, the amino acid "corresponding to" the residue at position 190 does not necessarily have to be at position 190 in a particular amino acid chain, and a person skilled in the art will readily understand how to identify the "corresponding" amino acid. You can.
- the “functional equivalent” may be produced as a result of addition, substitution, or deletion of part of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention.
- the substitution of amino acids is preferably a conservative substitution.
- conservative substitutions of naturally occurring amino acids are as follows: aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), and acidic amino acids (Asp). , Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn) and sulfur-containing amino acids (Cys, Met).
- the functional equivalents also include variants in which some amino acids are deleted in the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention.
- the deletion or substitution of the amino acid is preferably located in a region that is not directly related to the physiological activity of the polypeptide of the present invention. Additionally, the amino acid deletion is preferably located in a region that is not directly involved in the physiological activity of the polypeptide of the present invention. In addition, variants in which several amino acids are added to both ends of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention or within the sequence are also included. In addition, the scope of functional equivalents of the present invention also includes protein or polypeptide derivatives in which part of the chemical structure of the protein is modified while maintaining the basic skeleton and physiological activity of the protein according to the present invention. For example, this includes structural changes to change the stability, storage, volatility, or solubility of the protein of the present invention.
- Sequence homology and homology herein are defined as the percentage of amino acid residues of the candidate sequence relative to the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention after aligning the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention with the candidate sequence and introducing a gap. do. When necessary, conservative substitutions are not considered as part of sequence identity to obtain maximum percent sequence identity. Additionally, any N-terminal, C-terminal or internal extension, deletion or insertion of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention is not to be interpreted as a sequence affecting sequence identity or homology. Additionally, the sequence identity can be determined by common standard methods used to compare similar portions of the amino acid sequences of two proteins or polypeptides.
- BLAST or similar computer programs align two proteins or polypeptides such that each amino acid is optimally matched (either along the full length of one or both sequences or along a predicted portion of one or both sequences).
- the program provides a default opening penalty and a default gap penalty and can be used in conjunction with a computer program called PAM250 (standard scoring matrix; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978) provides a scoring matrix.
- percent homogeneity can be calculated as follows: Multiply the total number of identical matches by 100 and then the sum of the length of the longer sequence in the matched span and the number of gaps introduced into the longer sequence to align the two sequences. Share.
- the polypeptide of the present invention can be constructed by genetic engineering methods.
- a polynucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention is constructed according to a conventional method.
- the polynucleotide sequence can be constructed, for example, by PCR amplification using a polynucleotide encoding the human PCNT or PCNT-isoform X5 gene as a template using appropriate primers.
- the DNA sequence may be synthesized by standard methods known in the art, for example, using an automatic DNA synthesizer (sold by Biosearch or Applied Biosystems).
- the constructed polynucleotide sequence is operatively linked to the polynucleotide and contains one or more expression control sequences (e.g.
- telomere sequence that regulates the expression of the polynucleotide base sequence. It is inserted into the vector containing it, and the host cell is transformed with the recombinant expression vector formed therefrom. The resulting transformant is cultured under appropriate media and conditions to express the DNA sequence, and a substantially pure protein encoded by the DNA sequence is recovered from the culture. The recovery can be performed using methods known in the art (eg, chromatography).
- substantially pure polypeptide or protein means that it substantially does not contain any other protein derived from the protein host cell according to the present invention.
- genetic engineering methods for protein synthesis of the present invention refer to the following literature: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; and Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
- polypeptide of the present invention can be chemically synthesized using techniques known in the art (Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). That is, the polypeptide of the present invention can be manufactured using conventional stepwise liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, F-MOC or T-BOC chemical methods (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al. ., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). A preferred preparation method is to use solid phase synthesis.
- the polypeptide of the present invention can be synthesized by a conventional solid-phase method through a condensation reaction between protected amino acids, starting from the C-terminus and proceeding sequentially according to the identified amino acid sequence. After the condensation reaction, the carrier to which the protecting group and the C-terminal amino acid are linked can be removed by a known method such as acid decomposition or aminolysis.
- a known method such as acid decomposition or aminolysis.
- Proteins manufactured by genetic engineering methods or chemically synthesized proteins include, for example, extraction methods, recrystallization methods, various chromatography methods (gel filtration, ion exchange, precipitation, adsorption, reversed phase), electrophoresis, countercurrent partitioning methods, etc. It can be separated and purified by methods known in the industry.
- Another aspect provides a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
- the polynucleotide may be a polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
- SEQ ID NO: 2 represents the DNA sequence encoding P145.
- polynucleotide and “nucleic acid” refer to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in single-stranded or double-stranded form. Unless otherwise limited, known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides are also included.
- the polynucleotide can be used without limitation as long as it encodes the polypeptide of the present invention, and includes all DNA, cDNA, and RNA sequences.
- the polynucleotide may be isolated from nature or produced by genetic engineering methods known in the art.
- Another aspect provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.
- vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable control sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
- Vectors can be plasmids, phage particles, or simply potential genomic inserts. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vector, “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
- a typical plasmid vector that can be used for this purpose includes (a) an origin of replication that allows efficient replication to contain hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) a replication origin that allows host cells transformed with the plasmid vector to be selected. It has a structure that includes (c) an antibiotic resistance gene and (c) a restriction enzyme cut site into which a foreign DNA fragment can be inserted. Even if an appropriate restriction enzyme cut site does not exist, the vector and foreign DNA can be easily ligated using a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to a conventional method.
- Vectors of the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, viral vectors, etc.
- a suitable vector is an expression vector, which may include expression control elements such as a promoter, operator, start codon, stop codon, polyadenylation signal, and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose.
- the vector of the present invention is any means used to deliver the nucleic acid encoding the peptide of the present invention to a host cell, and preferred vectors are viral vectors such as retrovirus, herpes virus, adenovirus, and adeno-related virus.
- the gene encoding the peptide of the present invention is introduced in vivo, in vitro, or in vitro using a viral vector or through direct DNA introduction.
- Expression in the target tissue can be performed by targeting the mutant vector to specific cells using a viral vector or receptor ligand, using a tissue-specific promoter, or both methods.
- “codon optimization” means changing the codon of a polynucleotide encoding a protein to be preferentially used in a specific organism so that the encoded protein is expressed more efficiently in the organism.
- the genetic code is degenerate in the sense that most amino acids are represented by several codons, called “synonymous” or “synonymous” codons, codon usage by a particular organism is not random and is biased toward particular codon triplets. This codon usage bias may be higher with respect to certain genes, genes of common function or ancestral origin, highly expressed proteins versus low copy number proteins, and collective protein coding regions of the organism's genome.
- Another aspect provides cells transformed with the vector.
- the cells of the present invention may be stem cells, progenitor cells, microorganisms, plant cells, or animal cells, but are not limited thereto.
- the stem cells may specifically be embryonic stem cells, adult stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS), mesenchymal stem cells, or pluripotent stem cells, but are not limited thereto. It may include all stem cells differentiated from cells, such as mesenchymal stem cells derived from embryonic stem cells, mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells, and neural stem cells derived from induced pluripotent stem cells. Additionally, the cells may be autologous or allogeneic, or allogenic or xenogenic.
- Transformation can be performed using any known method for introducing a nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and can be performed by selecting an appropriate available technique depending on the host cell within the range understood by those skilled in the art. These methods include electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO4) precipitation, calcium chloride (CaCl2) precipitation, agitation using silicon carbide fibers, agrobacteria-mediated transformation, PEG, dextran sulfate, and lipopec. It includes, but is not limited to, vitamins and the like.
- the protein of the present invention can be easily expressed and mass-produced by culturing transformed cells in an appropriate medium, or by introducing the transformed cells into any animal and culturing them in vivo.
- One embodiment provides a composition for cell culture containing any one selected from the group consisting of the protein and the polynucleotide.
- composition for cell culture may include the cells.
- Cells cultured in the composition of the present invention may have their function enhanced by the proteins and polynucleotides introduced into the cells or acting extracellularly, but are not limited thereto.
- the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cranial nervous system diseases, comprising the protein or polynucleotide as an active ingredient.
- the present invention also provides a method for preventing or treating a brain nervous system disease comprising administering the protein, polynucleotide or composition to an individual in need thereof.
- the present invention also provides the use of the protein, polynucleotide or composition for the manufacture of a medicine for preventing or treating diseases of the brain nervous system.
- the present invention also provides the use of the protein, polynucleotide or composition for preventing or treating diseases of the brain nervous system.
- the cranial nervous system disease may include all diseases in which abnormalities or disorders occur in some or all of the brain, spinal cord, cranial nerves, spinal nerves, and autonomic nervous system that constitute the cranial nervous system.
- the brain nervous system disease may be one or more selected from the group consisting of ischemic stroke, hemorrhagic stroke, hypoxic brain injury, traumatic brain injury, cerebral palsy, mental illness, and degenerative brain disease.
- the mental illness may be one or more selected from the group consisting of autism spectrum disorder, schizophrenia, intellectual disability, and Down syndrome.
- the degenerative brain disease includes dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, mild cognitive impairment, cerebral amyloid angiopathy, amyloid stroke, systemic amyloid disease, Dutch amyloidosis, Niemann-Pick disease, senile dementia, amyotrophic lateral sclerosis, Spinocerebellar Atrophy, Tourette's Syndrome, Friedrich's Ataxia Ataxia), Machado-Joseph's disease, Lewy Body Dementia, Dystonia, Progressive Supranuclear Palsy, and Frontotemporal Dementia. It may be one or more selected from the group, but is not limited thereto.
- prevention in the present invention refers to all actions that inhibit or delay a brain nervous system disease by administering the composition of the present invention to an individual.
- treatment refers to any action that improves symptoms of a cranial nervous system disease or is beneficial by administering the composition of the present invention to an individual.
- the protein or polynucleotide contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not limited as long as it has an effect in treating or preventing brain nervous system diseases.
- the active ingredient when the active ingredient is a protein or polynucleotide, it may be included in an amount of 0.0001 to 99.9% by weight, more specifically 0.01 to 80% by weight, based on the total weight of the final composition.
- the protein or polynucleotide contained in the pharmaceutical composition of the present invention may be contained at a concentration of more than 0 and 10 ⁇ M or less, for example, 0.9 ⁇ M to 4.5 ⁇ M, 1.8 ⁇ M to 3.6 ⁇ M.
- the protein or polynucleotide included in the pharmaceutical composition of the present invention may be included at a concentration of more than 0 and 500 nM or less, for example, more than 0 and 100 nM, more than 0 and 50 nM, and more than 0 and 40 nM. there is. However, it is not limited thereto, and an effective dose can be appropriately selected depending on the administration target.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include appropriate carriers, excipients, or diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
- pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not irritate living organisms and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
- the type of carrier that can be used in the present invention is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art and pharmaceutically acceptable can be used.
- Non-limiting examples of the carrier include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, etc. These may be used individually or in combination of two or more types.
- compositions of the present invention can be prepared in various dosage forms depending on whether the desired administration method is oral or parenteral administration.
- Non-limiting examples of dosage forms for oral administration include troches, lozenges, tablets, aqueous suspensions, oily suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, soft capsules, syrups or elixirs. I can hear it.
- a dosage form for oral administration such as tablets or capsules, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin, etc. binder; Excipients such as dicalcium phosphate; disintegrants such as corn starch or sweet potato starch; It may include lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, or polyethylene glycol wax. Furthermore, in the case of a capsule formulation, in addition to the above-mentioned substances, it may additionally contain a liquid carrier such as fatty oil.
- Formulations for parenteral administration include, for example, injectable forms such as subcutaneous injection, intravenous injection, or intramuscular injection; Suppository injection method; Alternatively, it can be formulated as a spray, such as an aerosol that allows inhalation through the respiratory tract, but is not limited to this.
- the composition of the present invention can be mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, and then formulated for unit administration in ampoules or vials.
- a propellant, etc. may be mixed with additives to disperse the water-dispersed concentrate or wet powder.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount, and the term "pharmaceutically effective amount" in the present invention refers to treating or preventing a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or prevention. It means a sufficient amount, and the effective dose level is determined by the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, gender, the patient's sensitivity to the drug, the administration time, administration route, and excretion rate of the composition of the present invention used. It may be determined depending on factors including the duration of treatment, drugs used in combination or concurrently with the composition of the present invention used, and other factors well known in the medical field.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, the amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects can be administered.
- the frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered once or several times.
- the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
- Proteins or polynucleotides according to one aspect have excellent therapeutic effects on stroke, cerebral palsy, dementia, Parkinson's disease and autism spectrum disorder in stroke animal models, cerebral palsy animal models, dementia models, Parkinson's disease models and autism models. It has the effect of being useful in the prevention or treatment of this difficult brain and nervous system disease.
- Figure 1 shows the results of staining with Coomassie brilliant blue for the P145(MK145) recombinant protein obtained through protein expression and purification after transforming pET28a-P145(MK145) plasmid DNA into E. coli.
- Figure 2 shows the results of transfecting P145 into ES-MSC and confirming the expression level of P145 (MK145) through RT-PCR.
- Figure 3 is a diagram showing the treatment schedule of ES-MSC and P145 (MK145) in MCAO, a stroke model.
- Figure 4 shows the mNSS test results on days 1, 3, 7, 14, 21, and 28 for the group administered ES-MSC and ES-MSC+P145 (MK145) to a stroke animal model.
- Figure 5 shows the score of improved behavioral ability from day 7 to day 28 of stem cell administration.
- Figure 6 shows the modified Neurological Severity Score (mNSS) test results on days 1, 3, 7, 14, 21, and 28 for groups administered P145 (MK145) protein at different concentrations to an ischemic stroke animal model. will be.
- mNSS Neurological Severity Score
- Figures 7 and 8 show the results of confirming the neuronal marker (NeuN) by immunostaining using brain tissue from an ischemic stroke animal model administered P145 (MK145) at 100 ⁇ g/kg.
- Figures 9 to 12 show the results of confirming inflammatory markers and apoptosis markers by Western blotting using brain tissue of a stroke animal model administered P145 (MK145) at 10 ⁇ g/kg.
- Figure 13 is a diagram showing the treatment schedule of P145 (MK145) in a hemorrhagic stroke model (Intracerebral hemorrhage, ICH).
- Figure 14 shows the mNSS test results on days 1, 3, 7, 14, 21, and 28 for groups administered P145 (MK145) at different concentrations to ICH.
- Figures 15 to 17 show the improved scores in behavioral ability from day 1 to day 14, 21, and 28 of P145 (MK145) administration in ICH.
- Figures 18 to 22 show the results of confirming inflammatory markers by RT-PCR using brain tissue from an animal model of cerebral hemorrhage administered P145 (MK145).
- Figure 23 is a diagram showing the treatment schedule of P145 (MK145) for neonatal hypoxic-ischemic brain injury (HI), a cerebral palsy model.
- Figure 24 shows the results of mNSS and cylinder test behavioral evaluation scores 35 days after treatment of P145 (MK145) in a cerebral palsy model.
- Figures 25 and 26 show the results of confirming inflammatory markers and oxidative stress (reactive oxygen stress, ROS) markers by RT-PCR using brain tissue of a cerebral palsy model administered P145 (MK145).
- ROS reactive oxygen stress
- FIG. 27 is a diagram showing the treatment schedule of P145 (MK145) in amyloid beta-injected animals, which are dementia induction models.
- Figure 28 shows a graph of Y-Maze and NORT test behavioral evaluation scores after treatment of P145 (MK145) in a dementia model.
- Figures 29 and 30 show images and score graphs of nest-building behavior after treatment of P145 (MK145) in a gene expression dementia model.
- Figures 31 and 32 show graphs of staining images and numbers of amyloid plaques after treatment with P145 (MK145) in a gene expression dementia model.
- Figure 33 shows a score graph of Forced swimming and Tail suspension test behavioral evaluations after treatment with P145 (MK145) in an animal model causing Parkinson's disease.
- Figures 34 and 35 show the results of confirmation of dopamine-related genes and proteins by ELISA and RT-PCR after treatment with P145 (MK145) in a Parkinson's animal model.
- Figure 36 is a diagram showing the treatment schedule of P145 (MK145) in an autism animal model.
- Figure 37 shows a graph of social function test scores after treatment of P145 (MK145) in an autism animal model.
- Figures 38 and 39 show images and graphs of scores of the behavioral evaluation of the abnormal marble covering test after treatment of P145 (MK145) in an autism animal model.
- a and/or B means A or B, or A and B.
- the P145 (MK145) protein (SEQ ID NO: 1) used in the present invention was produced by recombinant protein expression and purification using the pET-28a expression vector. Using human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform Each downstream primer was produced (Cosmogenetech, Korea) and polymerase chain reaction (PCR) was performed. The sequences of each primer used are as follows.
- Down primer 5'-AATATA GGATCC TTACTCCAGTTCGGACTCATG-3' (underlined restriction enzyme Bam HI recognition sequence) (SEQ ID NO: 9).
- the DNA fragment obtained through PCR was cut with restriction enzymes Nhe I and Bam HI and introduced into the pET28a plasmid vector (Novagen, Germany) obtained by treatment with the same restriction enzymes to produce pET28a-P145 recombinant DNA.
- the constructed pET28a-P145 clone was transduced into E. coli strain BL21(DE3) and cultured in LB broth medium for a certain period of time to express the recombinant protein. Then, isopropyl- ⁇ -D-thio-galactoside (IPTG) was added and incubated at 30°C. was cultured for an additional 4 hours. The cultured E. coli was recovered by centrifugation, disrupted with an ultrasonicator, and the P145 protein was isolated using Ni-NTA affinity column chromatography.
- IPTG isopropyl- ⁇ -D-thio-galactoside
- the purified protein was confirmed by staining with Coomassie brilliant blue.
- the results of staining the P145 recombinant protein with Coomassie Brilliant Blue are shown in Figure 1.
- the prepared pET28a-P145 recombinant DNA was transfected into embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells (ES-MSC) using lipofectamine. 24 hours after transfection, cells were harvested and expression level was confirmed by RT-PCR. The results are shown in Figure 2. Compared to control cells, it was confirmed that P145 protein was overexpressed.
- This model is permanent if the middle cerebral artery is occluded by inserting a monofilament thread for suture through the internal carotid artery (ICA) to block blood flow to the middle carotid artery (MCA) and the thread is maintained. If the thread is removed to cause reperfusion, it becomes a transient occlusion surgery.
- ICA internal carotid artery
- MCA middle carotid artery
- SD rats Male Sprague-Dawley (SD) rats (200 to 250 g), 6 to 8 weeks old, were maintained at 21 degrees Celsius with 12 hours of light and dark and provided with food and water.
- MCAO transient middle cerebral artery occlusion
- SD rats were anesthetized by inhalation using 3% isoflurane, and then 1.5% isoflurane was maintained during surgery using a respiratory anesthesia machine.
- An incision was made in the midline of the neck, and the right common carotid artery (CCA), external carotid artery (ECA), and internal carotid artery (ICA) were exposed to avoid damaging the vagus nerve.
- CCA common carotid artery
- ECA external carotid artery
- ICA internal carotid artery
- the manufactured 4-0 nylon filament was inserted (1.5 to 1.8 mm) from the external carotid artery through the right internal carotid artery to the middle cerebral artery through a small hole to occlude it.
- the skin of the incised neck was closed, and 90 minutes later, the middle cerebral artery was reperfused with the inserted filament.
- the temperature was maintained at 37°C using a rectal thermometer.
- ES-MSC used p12 (passage12) that had been subcultured 12 times, and each cell was frozen at 5 ⁇ 106 cells per vial. When used, 3 ⁇ 106 cells per rat were dissolved in 1ml of physiological saline and injected into the tail vein. It was administered by injection. ES-MSC+P145 were harvested 24 hours after transfection of P145, dissolved in physiological saline, and injected through tail vein. The control group was injected with the same amount of physiological saline.
- Neurological deficit scale modified neurological severity scores (mNSS): An analysis method that gives a total score of 14 points. When normal behavior is shown, the score is 0, and as the neurological deficit becomes more severe, the total score approaches 14 points. Limb tension (total 3 points), gait (total 3 points), balance maintenance (total 6 points), and sensory function (total 2 points) were comprehensively evaluated and added up. The evaluation results are shown in Figures 4 and 5.
- the mNSS score at 28 days after surgery was 5.88 in the ES-MSC+P145 group, which was lower than 6.25 in the ES-MSC group, showing the best treatment effect for stroke.
- the difference in behavioral ability scores between the 7th and 28th days after surgery was 4.13 in the ES-MSC+P145 group, which was larger than the 2.63 in the ES-MSC group, showing excellent treatment effect for stroke.
- the newly produced P145 (MK145) protein was diluted with physiological saline at different concentrations: 1 ⁇ g/kg, 10 ⁇ g/kg, and 100 ⁇ g/kg.
- Each ischemic stroke animal model rat was injected intraperitoneally with P145 protein for 5 days starting from the 2nd day after inducing the stroke model.
- the control group was injected with the same amount of physiological saline.
- P145 (MK145) protein was administered to an ischemic stroke animal model at different concentrations, and then an mNSS test was performed. The evaluation results are shown in Figure 6.
- Ischemic stroke animal model (control group and 100 ⁇ g/kg P145 (MK145) protein administration group) was used to identify NeuN, a neural differentiation marker, by immunostaining using samples of rat brain tissue cut to a thickness of 20uM. The results are shown in Figures 7 and 8.
- the expression levels of TNF-a protein, NLRP3 protein, Bax protein, Bcl-2 protein, ATF6 protein, and GRP78 protein were decreased compared to the control group.
- the newly produced P145 (MK145) protein was diluted with physiological saline at different concentrations: 1 ⁇ g/kg, 10 ⁇ g/kg, and 100 ⁇ g/kg.
- physiological saline at different concentrations: 1 ⁇ g/kg, 10 ⁇ g/kg, and 100 ⁇ g/kg.
- Hemorrhagic stroke animal model Each rat was injected with P145 protein intraperitoneally for 5 days starting from day 1 after inducing the hemorrhagic stroke model.
- the control group was injected with the same amount of physiological saline.
- P145 (MK145) protein was administered at different concentrations to the hemorrhagic stroke animal model as described above, and then an mNSS test was performed. The evaluation results are shown in Figures 14 and 15 to 17.
- RT-PCR was performed using brain tissue from normal rats and hemorrhagic stroke animal model rats (control group and P145 (MK145) protein administration group). The results are shown in Figures 18 to 22.
- mRNA expression levels of NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1 ⁇ , and IL-18 increase, leading to increased inflammation, but in the group administered P145 (MK145), the expression levels were lower than those in the control group. decreased more.
- An animal model of cerebral palsy was created using an ICR mouse that was 7 days old.
- CCA right common carotid artery
- the treatment schedule in the cerebral palsy model is shown in Figure 23.
- Neurological deficit scale modified neurological severity scores (mNSS): An analysis method that gives a total score of 14 points. When normal behavior is shown, the score is 0, and as the neurological deficit becomes more severe, the total score approaches 14 points. Limb tension (total 3 points), gait (total 3 points), balance maintenance (total 6 points), and sensory function (total 2 points) were comprehensively evaluated and added up.
- Cylinder test A method of measuring exploration ability based on spatial sense and motor function. After placing an experimental animal in a glass cylinder with a diameter of 15 cm and a height of 40 cm, the number of times the animal stands up and touches the wall with its front paws is measured. A total of 20 observations were observed. In the analysis, the number of times the impaired left front foot touched the wall was calculated as a percentage out of a total of 20 times. The evaluation results are shown in Figure 24.
- the mNSS score was found to be significantly reduced in the group administered P145, indicating a therapeutic effect on cerebral palsy.
- the frequency of use of the impaired forepaw was found to increase in the group administered P145 (MK145), indicating a therapeutic effect for cerebral palsy.
- RT-PCR was performed using brain tissue from sham rats and cerebral palsy stroke animal model rats (control group and P145 (MK145) protein administration group). The results are shown in Figures 25 and 26.
- mice Male B6 mice weighing about 23 to 25 g at 6 weeks of age were used. Five mice were housed in each cage, maintained at 21°C with 12 hours of light and dark, and food and water were provided.
- Amyloid beta 1-42 a substance that causes memory deficits, was dissolved in 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) saline solution, cultured at 37°C for 1 week, and prepared at a concentration of 10 ⁇ M.
- DMSO dimethyl sulfoxide
- the experimental animals were anesthetized by inhalation using 3% isoflurane, and then 1.5% isoflurane was maintained during the surgery using a breathing anesthesia device.
- the head of the experimental animal was fixed and 5 ⁇ l of amyloid beta 1-42 was injected from bregma to -0.9mm posteriorly, 1.7mm laterally, and 2.2mm deep using a 10 ⁇ l Hamilton microsyringe with a 26-gauge needle. was injected for 10 minutes.
- MK145 purified and extracted P145 (MK145) protein was dissolved in 100 ⁇ l of physiological saline and administered intraperitoneally (IP) and intravenously (IV).
- the treatment schedule in the amyloid beta injection animal model is shown in Figure 27.
- the Y maze and NORT cognitive ability evaluation were trained, and after scoring them, behavioral evaluation was performed.
- lesion models were selected and experiments were conducted. Treatment was administered 7 days after the procedure, and whether cognitive function improved was measured on the 7th and 14th days after treatment.
- Y-maze test The device extends into three arms, shaped like the letter Y. Each arm is 35 cm long, 15 cm high, and 5 cm wide, and is positioned at the same angle. The movement of the experimental animal is expressed as cross-counting, which is defined as crossing once when passing through three passages sequentially (spontaneous alteration). Each experimental animal started from one maze and went to the other maze, and the number of times it successfully crossed correctly was scored and expressed as a percentage. After being allowed to move freely for 2 minutes, measurements were taken for 5 minutes.
- Novel object recognition test A cognitive experimental technique that stimulates the curiosity of rodents. During the existing adaptation training period, memories of two identical objects are instilled, and as soon as the measurement begins, different objects and objects of different colors are introduced. Memory is measured by inducing instinctive curiosity through substitution. They were allowed to move freely with a familiar object (familiar) for 2 minutes, then changed to a new object (novel), and then measured for 5 minutes. The time spent on the new object was divided by the sum of the time spent on each object and expressed as a percentage. The results are shown in Figure 28.
- mice Male B6 mice weighing about 23 to 25 g at 10 weeks of age were used. Five mice were housed in each cage, maintained at 21°C with 12 hours of light and dark, and food and water were provided.
- a Parkinson's model was induced by dissolving 25 mg/kg of MTPT in 0.9% NaCl and administering it intraperitoneally for 7 days.
- Neurobehavioral evaluation was performed after administration of P145 (MK145) in an animal model of Parkinson's disease.
- the results of neurobehavioral evaluation of normal rats and Parkinson's animal model rats (control group and P145 (MK145) protein administration group) are shown in Figure 33.
- Parkinson's disease As a result, the expression of dopamine type 1 receptors and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), which are known to be highly related to neurological function in Parkinson's disease, decreased due to Parkinson's induction. In the group administered P145 (MK145), expression was improved compared to the control group. This shows that P145 (MK145) can be used as a treatment for Parkinson's disease.
- BDNF brain-derived neurotrophic factor
- the treatment schedule in the autism model is shown in Figure 36.
- the social response when meeting unfamiliar peers decreased due to the induction of autism, but the group administered P145 (MK145) protein showed an improved socialization response compared to the control group, through which P145 (MK145) protein was administered. It can be seen that it can be used as a treatment for autism.
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Abstract
본 발명은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드는 뇌졸중 동물모델, 뇌성마비 동물모델, 치매 모델, 파킨슨병 모델 및 자폐 모델에서 우수한 치료 효과를 갖는 바, 재생이 어려운 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
뇌신경계는 뇌, 척수, 뇌신경, 척수신경, 자율신경계 등으로 구성된 신체 조절 시스템을 의미한다. 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 외상성 뇌손상, 저산소성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 자폐, 조현병, 지적 장애, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증 등 다양하다. 뇌손상이란 내적 또는 외적인 여러 이유로 뇌의 신경조직에 이상이 생겨 행동 또는 기능상에 이상이 오는 상태를 의미한다. 뇌손상은 개방성 두부 손상, 폐쇄성 두부 손상, 감속손상, 독성 물질의 노출, 산소 부족, 종양, 감염, 또는 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환에 의해 발생할 수 있다.
뇌졸중은 허혈이나 출혈에 의하여 유발되며 암 및 심장병과 더불어 사망률이 높은 질병이다. 뇌졸중 같은 뇌신경계 질환의 경우, 뇌의 손상은 시간이 지나면서 신경운동 장애 및 근골격계 장애에 따른 주기적 진찰과 재활치료가 제공되어야만 하는 한계가 있다.
뇌성마비는 하나의 질병이 아니라 비슷한 임상적 특징을 가진 증후군을 집합적으로 일컫는 용어로 미성숙한 뇌에 대한 비진행성 병변 혹은 손상으로 생기는 운동과 자세의 장애를 보이는 임상증후군을 말한다. 뇌성마비란 발달 과정중인 뇌에 대한 손상으로 인하여 근육 조절 능력이나, 보행 시 자세유지 등에 문제를 일으키는 질환으로 뇌 손상은 출생 전후나, 출생 도중에 주로 발생하지만 임신중 어느때나 발생 가능하고 심지어 소아기때도 생길 수 있다.
뇌의 손상은 비진행성이지만 시간이 지나면서 신경운동 장애의 양상과 근골격계의 장애가 변화하므로 주기적인 진찰을 통해 변화된 임상 양상에 가장 적합한 재활 치료를 제공해야 한다. 그 밖에 다른 치료 방법들이 있지만 이를 통한 획기적이고 근본적인 치료 방법은 없는 실정이다.
퇴행성 뇌신경계 질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상과, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적 원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이다. 대표적인 질환으로는 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파킨슨 질환(Parkinson's disease) 및 기억장해 등이 있다. 퇴행성 뇌신경계 질환은 급격히 혹은 천천히 진행되는 괴사(necrosis)나 아폽토시스(apoptosis)에 의한 신경세포의 사멸이 나타난다. 따라서 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방, 조절 및 치료법 개발을 위해서는 신경세포의 사멸기전에 대한 이해가 필요하다.
현재 노산이 증가하면서 뇌성마비 환아와 같은 뇌신경계 질환의 위험이 증가하고 있으며, 현대 사회가 급속히 고령화됨에 따라 알츠하이머 질환 등의 퇴행성 뇌신경계 질환도 급증하고 있는 실태이다.
뇌졸중이나 치매 등과 같은 뇌신경계 질환은 공통적으로 뇌세포 또는 신경세포가 사멸하게 되는데, 그 결과 비가역적인 신경기능 장애를 가져온다. 현재 세계적으로 여러 종류의 화합물, 줄기세포 등을 이용한 치료를 동물 모델에서 시도하고 있으나, 임상시험에 적용되기엔 많은 문제가 수반되는 상황이다. 따라서, 이러한 뇌신경계 질환을 근본적으로 치료할 수 있는 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 것인 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 단백질 및 상기 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 단백질 및 상기 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 뇌 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1은 Human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform X5; 서열번호 3)의 3,229 amino acids 가운데 아미노산 번호 255-399 (145 amino acids)의 서열을 나타낸다.
상기 Human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform X5)는 기존에 알려진 PCNT와 아미노산 서열의 차이가 있는 다른 단백질로서, 공지되지 않았으며, 검색되지 않는 단백질이다. 구체적으로, 기존 PCNT 단백질 서열과 비교하여 PCNT-isoform X5는 기존 PCNT 단백질 서열과 비교하여 1288 내지 1298 및 2732 내지 2810 서열이 새로운 서열로 추가된 새로운 단백질이다. 기존에 알려진 PCNT는 세포질 내에 존재하며 세포 분열 시 핵내에서 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, PCNT-isoform X5는 혈장 내에서 발견된 단백질로서 차이가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 Human pericentrin (PCNT), 및 Human pericentrin-isoform X5의 3,229 amino acids과는 다른 새로운 물질로 볼 수 있다. 그 이유는 PCNT 또는 PCNT-isoform X5 단백질 전체의 크기 중 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 P145 (MK145)는 약 4.5% 양에 해당하므로, 단백질 구조가 각기 다르고, 그에 따라 같은 역할을 한다고 볼 수 없기 때문이다. 따라서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 PCNT 또는 PCNT-isoform X5 서열 중 일부와 일치하는 아미노산 서열로 이루어졌으나 새롭게 발견되어 정의된 물질이다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 "P145 (MK145)"로 정의한다.
다른 양상은 상기 단백질에 세포 투과 펩타이드가 추가적으로 융합된 것인 단백질을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질은 단백질의 세포 투과성을 높이기 위해 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPP)는 세포막을 투과할 수 있는 모든 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 막전달 서열(membrane-translocation sequence; MTS) 또는 이의 단편(상기 막전달 서열 중 연속하는 5개 이상의 아미노산 포함), 거대분자 세포내 전달 도메인(Macromolecule Intracellular Transduction Domain; MTD), TAT 펩타이드, 소수성 펩타이드 및 염기성 펩타이드를 포함하는 세포 투과성 융합 펩타이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 막전달 서열은, 예컨대, AAVALLPAVLLALLAP(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 이의 단편은 상기 아미노산 서열 중 연속하는 7 내지 16개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 단편, 예컨대, AAVALLP(서열번호 5) 또는 AVLLALLAP(서열번호 6)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소수성 펩타이드와 염기성 펩타이드의 융합 펩타이드는, 소수성 아미노산을 전체 아미노산 개수 기준으로 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상, 예컨대, 60 내지 100%, 70 내지 100%, 80 내지 100% 또는 90 내지 100%의 비율로 포함하는 5 내지 100개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 또는 6 내지 30개의 아미노산을 포함하는 소수성 펩타이드; 및 1 내지 6개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 단위체, 또는 상기 펩타이드 단위체가 2 내지 6개 반복된 반복체를 포함하고, 염기성 아미노산으로 이루어진, 염기성 펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질은 발현 및/또는 정제를 위한 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 및/또는 정제를 위해 서열번호 1의 N말단, C말단, 또는 양 말단에 1 내지 30개의 아미노산을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 발현 및/또는 정제를 위해 서열이 추가된 단백질은 서열번호 7의 아미노산서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 정제를 위한 서열은 His-tag 서열일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1의 N말단에 서열번호 3의 254번째 아미노산부터 N말단 방향으로 1 내지 30개의 아미노산 또는 상기 서열번호 1의 C말단에 서열번호 3의 400번째 아미노산부터 C말단 방향으로 1 내지 30개의 아미노산이 부가된 것인 단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 3은 Human pericentrin-isoform X5 (PCNT- isoform X5)의 아미노산 서열을 나타낸다.
상기 단백질에 부가되는 아미노산은 상기 단백질의 N말단 또는 C말단의 한 쪽에만 부가될 수 있으며, 양 쪽 모두에 부가될 수 있다.
상기 단백질의 N말단 또는 C말단에 부가되는 아미노산은 적어도 1개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개 또는 30개일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)", "펩타이드(peptide)" 및 "단백질"은 상호 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec): 셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.
본 발명의 펩타이드, 즉 서열번호 1로 표시되는 펩타이드는 이의 기능적 동등물을 포함한다. 기능적 동등물이란, 본 발명의 펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(또는, 동일성)을 갖는 펩타이드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로, 본 발명의 폴리펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 여기서, 용어 "실질적으로"는 특정 성질의 전체 또는 거의 동일한 정도의 성질을 나타내는 상태를 의미한다.
본원에서 "상동성(homology) 또는 동일성(identity)"은, 펩타이드 분자와 같은 중합체 분자간의 전체적인 관련성(relatedness)을 의미한다. 예를 들면, 2개 폴리펩타이드 서열간의 상동성/동일성(%)의 계산은, 최적의 비교를 위해 2개의 서열을 배열하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 비교 목적으로 배열된 서열의 길이는, 기준 서열(reference sequence)의 길이의 적어도 30% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다. 그리고 나서, 상응하는 아미노산 부위의 아미노산을 서로 비교한다. 제1 서열의 부위에 위치한 아미노산이 제2 서열의 상응하는 부위의 아미노산과 동일한 경우, 2개의 서열은 당해 부위에서는 동일성을 가지는 것이다. 2개 서열의 동일성(%)은, 2개 서열간의 최적 배열(optimal alignment)을 위해 도입해야 하는 갭(gap)의 숫자와 길이를 고려한, 2개 서열에서 공통되는 아미노산을 가지는 부위의 숫자의 함수이다. 2개 서열간의 비교 및 동일성(%)의 결정은 수학적인 알고리즘을 통해 수행할 수 있다. 예를 들면, ClustalW (Thompson 외, 1994)를 사용하여 다음의 파라미터를 사용하여 서열 동일성 수치를 측정할 수 있다: 쌍 배열 파라미터 - 방법: 정확성(accurate), 매트릭스: PAM, 갭 개방 페널티(Gap open penalty): 10.00, 갭 연장 페널티(Gap extension penalty): 0.10; 다중 배열 파라미터 - 매트릭스: PAM, 갭 개방 페널티(Gap open penalty): 10.00, delay 동일성 (%): 30, 엔드 갭 페널티 부여(penalize end gaps): on, 갭 분리 거리(Gap separation distance): 0, 네가티브 매트릭스: no, 갭 연장 페널 티: 0.20, 잔기-특정 갭 페널티(residue-specific gap penalties): on, 친수성 갭 페널티: on, 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정 잔기에서의 서열 동일성은 단순히 유도체화된 동일한 잔기를 포함한다.
본원에서 용어 "실질적으로"는 특정 성질의 전체 또는 거의 동일한 정도의 성질을 나타내는 상태를 의미한다. 본원에서 용어 "실질적으로 동일한"은, 아미노산 또는 핵산 서열간의 비교와 관련하여 사용되고 있다. 본원 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는, 상응하는 부위에 동일한 잔기를 가지는 경우에 2개의 서열은 "실질적으로 동일한" 것으로 이해될 것이다. 당업계에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 다양한 종류의 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있는 데, 예를 들면 핵산 서열 비교를 위해서는 BLASTN을, 아미노산 서열 비교를 위해서는 BLASTP, 갭(gapped) BLAST, PSI-BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 상기한 컴퓨터 프로그램의 예는 아래 문헌에 기재되어 있다: Altschul 외, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul 외, Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis 외, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener 외, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. 동일한 서열을 검색하는 것 이외에, 상기한 컴퓨터 프로그램에서는 통상적으로 서열 동일성의 정도(degree of identity)를 제공해 준다. 2개의 서열에 있어서, 일정 길이의 잔기에 걸쳐 상응하는 부위의 잔기(residue) 중 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 91% 이상, 적어도 92% 이상, 적어도 93% 이상, 적어도 94% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 96% 이상, 적어도 97% 이상, 적어도 98% 이상, 적어도 99% 이상이 동일한 경우에 "실질적으로 동일한" 서열인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 상기한 "일정 길이의 잔기"는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 또는 그 이상의 잔기일 수 있다.
본원에서 상기 용어 "상응하는"은 소정의 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 위치(position)/정체(identity)를 결정하는 데에 종종 사용된다. 통상의 기술자라면, 폴리펩타이드 내의 잔기는 기준 펩타이드(reference-related polypeptide)에 기초한 원형 숫자 시스템(canonical numbering system)을 사용하여 종종 지정된다. 따라서, 예를 들어 제190번째 위치의 잔기에 "상응하는" 아미노산은 특정 아미노산 쇄에서 반드시 제190번째 위치에 있을 필요는 없으며, 통상의 기술자라면 "상응하는" 아미노산을 확인하는 방법에 대해서 쉽게 이해할 수 있다.
상기 "기능적 동등물"은 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과로 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한, 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한, 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 단백질의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 이와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 단백질 또는 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장 서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디폴트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디폴트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250 (표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명의 폴리펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 작제한다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 예를 들면, 인간 PCNT 또는 PCNT-isoform X5 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 주형으로 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 염기서열을 합성할 수도 있다. 작제된 폴리뉴클레오타이드 서열은 이 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 폴리뉴클레오타이드 염기 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 단백질을 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다.
상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드 또는 단백질"'이라 함은 본 발명에 따른 단백질 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 단백질 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 해당분야에 공지된 기술로 화학적으로 합성할 수 있다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 즉, 본 발명의 폴리펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다 (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). 바람직한 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase synthesis)을 이용하는 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 규명된 아미노산 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스(aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press, 1980).
유전공학적 방법에 의해 제조된 단백질 또는 화학적으로 합성된 단백질은 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 2는 P145를 코딩(암호화)하는 DNA 서열을 나타낸다.
본 명세서에서 "폴리뉴클레오타이드", "핵산"은 단일-가닥 또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오타이드의 공지된 아날로그도 포함된다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 것이면 제한 없이 사용될 수 있으며, DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 천연에서 분리되거나 당업계에 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
다른 양상은 상기 폴리뉴틀레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 발현벡터로서, 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 전달하는데 사용되는 모든 수단으로 바람직한 벡터는 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터이다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 유전자는 바이러스 벡터를 사용하여 또는 직접적인 DNA 도입을 통해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 도입시킨다. 표적 조직내에서의 발현은 돌연변이 벡터를 바이러스 벡터 또는 수용체 리간드 등을 이용하여 특정 세포에 대해 표적화하거나 또는 조직 특이적 프로모터를 사용하거나, 또는 그 두 방법 모두를 사용하여 실시할 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T.J.,Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).
또한, 본 발명에서 "코돈 최적화"는 암호화(코딩)된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다.
다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포는 줄기세포, 전구세포, 미생물, 식물세포 또는 동물세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 줄기세포는 구체적으로 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS), 중간엽줄기세포 또는 역분화줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 줄기세포에서 분화된 줄기세포, 예컨대 배아줄기세포 유래의 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포 유래의 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포 유래의 신경줄기세포 등을 모두 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 세포는 자가(autologous) 또는 타가, 또는 동종이계(allogenic) 또는 이종(Xenogenic) 세포일 수 있다.
형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자 수준에서 이해될 수 있는 범위 내에서 숙주세포에 따라 적합한 사용가능한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 단백질은 형질전환 세포를 적절한 배지에서 배양하거나, 또는 상기 형질전환 세포를 임의의 동물에 도입한 후 생체내에서 배양함으로써 용이하게 발현 및 대량 생산할 수 있다.
일 구체예는, 상기 단백질 및 상기 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공한다.
상기 세포 배양용 조성물은 상기 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 배양된 세포는 상기 단백질 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 세포내로 도입되거나 또는 세포외에서 작용하여 세포의 기능이 강화될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 단백질 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 조성물의 용도를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌신경계를 구성하는 뇌, 척수, 뇌신경, 척수신경, 자율신경계 등 중 일부 또는 전부에 이상이나 장애가 발생한 질환을 모두 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 저산소성 뇌손상, 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 정신질환 및 퇴행성 뇌질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 정신질환은 자폐 스펙트럼, 조현병, 지적장애 및 다운증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸중(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취 (Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 용어, "예방"은 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 뇌신경계 질환을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 뇌신경계 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드는, 뇌신경계 질환 치료 또는 예방 효과가 있는 한 제한되지 않는다.
일 구체예에 있어서, 유효성분이 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드인 경우, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 일 구현예로, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 단백질또는 폴리뉴클레오타이드는 0 초과 10 μM 이하 농도일 수 있고, 예를 들어 0.9 μM 내지 4.5μM, 1.8 μM 내지 3.6 μM 농도로 포함될 수 있다. 다른 구현예로, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드는 0 초과 500 nM 이하 농도일 수 있고, 예를 들어 0 초과 100 nM, 0 초과 50 nM, 0 초과 40 nM 농도로 포함될 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않고, 투여 대상에 따라 효과적인 용량을 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식이 경구 투여 방식인지 또는 비경구 투여 방식인지에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
상기 정제 또는 캡슐 등과 같은 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스(Saccharose), 솔비 (Sorbitol), 만니톨(Mannitol), 전분, 아밀로펙틴(Amylopectin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 젤라틴(Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 칼슘(calcium stearate), 스테아릴 푸마르 산 나트륨(sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스(polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있다. 나아가 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1회 투여하거나 또는 수 회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일 양상에 따른 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드는 뇌졸중 동물모델, 뇌성마비 동물모델, 치매 모델, 파킨슨병 모델 및 자폐 모델에서 뇌졸중, 뇌성마비, 치매, 파킨슨 병 및 자폐 스펙트럼에 대하여 우수한 치료 효과를 갖는 바, 재생이 어려운 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 pET28a-P145(MK145) plasmid DNA를 대장균에 형질전환한 후 단백질 발현 및 정제를 통해 얻은 P145(MK145) 재조합 단백질의 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 P145를 ES-MSC에 형질주입하여 P145(MK145)의 발현양을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 뇌졸중 모델인 MCAO에 ES-MSC와 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 4는 뇌졸중 동물모델에 ES-MSC와 ES-MSC+P145(MK145)를 투여한 그룹에 대한 1일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차의 mNSS test 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 줄기세포 투여일인 7일차에서 28일차간의 행동 능력이 개선된 점수를 나타낸 것이다.
도 6은 허혈성 뇌졸중 동물모델에 P145(MK145) 단백질을 농도별로 투여한 그룹에 대한 1일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차의 modified Neurological Severity Score (mNSS) 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 8은 P145(MK145)를 100μg/kg으로 투여한 허혈성 뇌졸중 동물모델의 뇌조직을 이용하여 면역염색으로 신경세포 마커(NeuN)를 확인한 결과이다.
도 9 내지 12는 P145(MK145)를 10μg/kg으로 투여한 뇌졸중 동물모델의 뇌조직을 이용하여 웨스턴 블럿팅으로 염증마커 및 세포사멸 마커를 확인한 결과이다.
도 13은 출혈성 뇌졸중 모델(Intracerebral hemorrhage, ICH)에 P145 (MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 14는 ICH에 P145(MK145)를 농도별로 투여한 그룹에 대한 1일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차의 mNSS test 결과를 나타낸 것이다.
도 15 내지 17은 ICH에 P145(MK145) 투여일인 1일차에서 14, 21, 28일차간의 행동 능력이 개선된 점수를 나타낸 것이다.
도 18 내지 22는 P145(MK145)를 투여한 뇌출혈 동물모델의 뇌조직을 이용하여 RT-PCR로 염증마커를 확인한 결과이다.
도 23은 뇌성마비 모델인 영아기 저산소-허혈성 뇌손상(neonatal hypoxic-ischemic brain injury, HI)에 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 24는 뇌성마비 모델에서 P145(MK145)의 치료 35일 후의 mNSS와 cylinder test 행동평가 점수의 결과를 나타낸 것이다.
도 25 및 26은 P145(MK145)를 투여한 뇌성마비 모델의 뇌조직을 이용하여 RT-PCR로 염증마커 및 산화적 스트레스(reactive oxygen stress, ROS) 마커를 확인한 결과이다.
도 27은 치매 유발 모델인 아밀로이드 베타 주입동물에 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 28은 치매 모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 Y-Maze와 NORT test 행동평가 점수의 그래프를 나타낸 것이다.
도 29 및 30은 유전자발현 치매 모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 둥지만들기 행동의 이미지와 점수 그래프를 나타낸 것이다.
도 31 및 32는 유전자발현 치매 모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 아밀로이트 플라크를 염색한 이미지와 개수에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
도 33은 파킨슨병 유발 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 Forced swimming과 Tail suspension test 행동평가의 점수 그래프를 나타낸 것이다.
도 34 및 35는 파킨슨 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후의 ELISA 및 RT-PCR로 도파민 관련 유전자 및 단백질의 확인한 결과이다.
도 36은 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 37은 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후 사회적 기능 행동평가(sociality test) 점수의 그래프를 나타낸 것이다.
도 38 및 39는 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료 후 구슬을 덮는 이상행동 marble burying test 행동평가의 이미지와 점수의 그래프를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.
실시예 1. P145
(MK145)
유전자 클로닝
본 발명에서 사용한 P145(MK145) 단백질(서열번호 1)의 제조는 pET-28a 발현 벡터를 이용하여 재조합 단백질 발현 및 정제에 의해 이루어졌다. Human pericentrin-isoform X5 (PCNT-isoform X5, 서열번호 3)를 주형으로 하여 PCNT-isoform X5 단백질 전체 서열 가운데 아미노산 255-399(145개 아미노산)에 해당하는 DNA 서열(서열번호 2)에 대한 upstream 및 downstream 프라이머를 각각 제작(코스모진텍, 대한민국)하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. 사용한 각각의 프라이머 서열은 다음과 같다.
Up primer : 5'-CGCCTAGCTAGCATGGAGGATTTACAAAAC-3' (밑줄은 제한효소 NheI 인식 서열)(서열번호 8).
Down primer : 5'-AATATAGGATCCTTACTCCAGTTCGGACTCATG-3' (밑줄은 제한효소 BamHI 인식 서열)(서열번호 9).
PCR을 통해 얻은 DNA 단편을 제한효소 NheI과 BamHI으로 자르고, 동일한 제한효소로 처리하여 얻은 pET28a plasmid vector(Novagen, Germany)에 도입하여 pET28a-P145 재조합 DNA를 제작하였다.
실시예 2. P145(MK145) 단백질 발현 및 정제
제작된 pET28a-P145 클론을 대장균주 BL21(DE3)에 형질도입시켜 재조합 단백질 발현을 위해 대장균을 LB broth 배지에 일정한 시간 배양한 후 isopropyl-β-D-thio-galactoside(IPTG)를 첨가하여 30℃에서 4시간 추가 배양하였다. 배양된 대장균을 원심분리로 회수하여 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 Ni-NTA 친화 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography) 방법으로 P145 단백질을 분리하였다.
정제된 단백질은 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하여 확인하였다. P145 재조합 단백질의 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색한 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 3. 줄기세포에 P145의 과발현을 위한 형질주입
제작된 pET28a-P145 재조합 DNA는 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)에 lipofectamine을 이용하여 형질주입하였다. 형질주입 24시간 후에 세포를 harvest 하여 RT-PCR로 발현정도를 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. Control 세포와 비교하여 P145단백질이 과발현된 것을 확인하였다.
실시예 4. 뇌졸중 동물모델에서 P145의 치료적 효능평가
4.1. 허혈성 뇌졸중 동물 모델의 확립
중대뇌동맥을 내경동맥(internal carotid artery; ICA)을 통해 봉합용 모노필라멘트 실을 삽입하여 폐쇄함으로써 중대뇌동맥(middle carotid artery; MCA)으로 가는 혈류를 막는 방법으로 실을 유지시키면 영구적인(permanent) 모델이 되고, 실을 제거하여 재관류(reperfusion)를 일으키면 일시적인(transient) 폐쇄술이 된다.
생후 6~8주의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 래트 (200 ~ 250g)는 12시간 명-암으로 21도의 조건으로 유지하였으며 먹이 및 식수를 제공하였다.
뇌졸중 동물 모델로는 MCA 폐쇄 후 재관류를 일으킨 일시적 중대뇌동맥 폐색 (Middle cerebral artery occlusion; MCAO) 모델을 제작하였다. SD 래트를 3% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입 마취시킨 후 호흡 마취 기기를 이용하여 1.5% 이소플루란을 수술 동안 유지시켰다. 목 부위의 정중선을 절개하고 오른쪽 총경동맥(common carotid artery; CCA), 외경동맥(external carotid artery; ECA) 그리고 내경동맥(internal carotid artery; ICA)을 미주신경이 손상되지 않도록 노출시켰다. 먼저 총경동맥과 외경동맥을 블랙실크 봉합사로 묶고 외경동맥의 혈관 벽을 쪽가위를 이용하여 작은 구멍을 만들었다. 제작한 4-0 나일론 필라멘트를 작은 구멍을 낸 외경동맥으로부터 오른쪽 내경동맥을 통하여 중대뇌동맥까지 (1.5~1.8mm) 삽입하여 막았다. 절개한 목의 피부를 닫고 90분 후에 중대뇌동맥을 삽입된 필라멘트를 제거시켜 혈액을 재관류시켰다. 수술을 시행하는 동안 직장온도계를 통해 37℃를 유지하도록 했다.
4.2. 허혈성 뇌졸중 동물 모델에 각 ES-MSC 및 ES-MSC+P145 투여
ES-MSC는 계대배양을 12번 수행한 p12(passage12)를 사용하였으며, 각 세포는 한 개 바이알당 5Х106개 세포로 얼렸으며 사용 시 래트 한 마리당 3Х106개 세포를 생리식염수 1ml에 녹여 꼬리 정맥주사로 주입하였다. ES-MSC+P145는 P145를 형질주입한 후 24시간 뒤에 harvest 하여 생리식염수에 녹여 꼬리 정맥주사로 주입하였다. 대조군은 동일한 양으로 생리식염수를 주입하였다.
치료제의 투여는 MCAO 모델 제작 후 7일차에 수행하였으며, 모든 동물 모델의 실험은 블라인드로 수행하였다.
4.3. 허혈성 뇌졸중 동물 모델의 행동 평가 분석
뇌졸중 모델에서의 치료 스케줄을 도 3에 나타내었다.
행동 평가는 수술 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 그리고 28일 총 6번을 수행하였다.
신경학적 결손 척도(modified neurological severity scores; mNSS): 총 14점이 만점인 분석방법으로 정상적인 행동을 보일 때는 0점, 신경학적 결손이 심할수록 총점 14점에 가까워진다. 사지긴장도(총 3점), 보행(총 3점), 평형유지력(총 6점), 감각기능(총 2점)을 종합적으로 평가하여 합산하였다. 평가결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
그 결과, 수술 후 28일에 있어서 mNSS 점수가 ES-MSC+P145군에서 5.88로 ES-MSC군의 6.25 보다도 낮게 나타나, 뇌졸중에 대한 치료효과가 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, 수술 후 7일차와 28일차간의 행동 능력 점수 차이가 ES-MSC+P145군에서 4.13으로 ES-MSC군의 2.63 보다도 크게 나타나, 뇌졸중에 대한 치료효과가 우수한 것으로 나타났다.
이를 통해, P145를 과발현 시킨 경우, 단순히 MSC를 처리하는 것보다 뇌졸중에 우수한 치료효과가 있음을 알 수 있었다. 이는 P145가 뇌졸중의 치료제로서 사용될 수 있음을 의미한다.
4.4. 허혈성 뇌졸중 동물 모델에 P145(MK145)를 투여
새롭게 제작한 P145(MK145) 단백질은 1μg/kg, 10μg/kg, 100μg/kg로 농도별로 생리식염수로 희석하였다. 허혈성 뇌졸중 동물모델 래트 한 마리당 P145 단백질을 복강투여로, 뇌졸중 모델 유도 후 2일차부터 5일간 주입하였다. 대조군은 동일한 양으로 생리식염수를 주입하였다.
4.5. 허혈성 뇌졸중 동물 모델에 P145(MK145)를 투여에 따른 치료효능 확인
허혈성 뇌졸중 동물모델에 상기한 바와 같이 P145(MK145) 단백질을 농도별로 투여 후 mNSS test를 수행하였다. 평가결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록, 경과 일 수에 따른 mNSS 점수가 낮았다. 이를 통해, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록 dose-dependent 하게 신경회복이 발생함을 알 수 있다.
허혈성 뇌졸중 동물모델(대조군 및 100μg/kg P145(MK145) 단백질 투여군) 래트의 뇌조직을 20uM 두께로 자른 샘플을 이용하여 면역염색을 진행하여 신경분화 마커인 NeuN을 확인하였다. 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 단백질을 투여한 뇌조직에서 손상된 부위 근처에 신경세포 보호효과로 인하여 신경세포가 cortex와 striatum 부위에서 모두 증가한 것을 확인하였다. 이는, P145(MK145)가 뇌졸중의 치료제로서 사용될 수 있음을 의미한다.
정상 래트와 허혈성 뇌졸중 동물모델 래트(대조군 및 10μg/kg P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직을 활용하여 웨스턴 블럿팅을 하였다. 그 결과를 도 9 내지 12에 나타내었다.
P145(MK145) 투여한 군에서는, TNF-a protein, NLRP3 protein, Bax protein, Bcl-2 protein, ATF6 protein 및 GRP78 protein의 발현양이 대조군보다 감소하였다.
이를 통해, P145(MK145) 단백질 투여에 의한 뇌손상에 의하여 발생한 inflammasome 염증, 세포 사멸과 ER 스트레스의 치료효과를 알 수 있고, P145(MK145)가 뇌졸중의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
4.6. 출혈성 뇌졸중 동물 모델에 P145(MK145)를 투여
출혈성 뇌졸중 모델에서의 치료 스케줄을 도 13에 나타내었다.
새롭게 제작한 P145(MK145) 단백질은 1μg/kg, 10μg/kg, 100μg/kg로 농도별로 생리식염수로 희석하였다. 출혈성 뇌졸중 동물 모델 래트 한 마리당 P145 단백질을 복강투여로 출혈성 뇌졸중 모델 유도 후 1일차부터 5일간 주입하였다. 대조군은 동일한 양으로 생리식염수를 주입하였다.
4.7. 출혈성 뇌졸중 동물 모델에 P145(MK145)를 투여에 따른 치료효능 확인
출혈성 뇌졸중 동물모델에 상기한 바와 같이 P145(MK145) 단백질을 농도별로 투여 후 mNSS test를 수행하였다. 평가결과를 도 14 및 도 15 내지 17에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록, 경과 일 수에 따른 mNSS 점수가 낮았다. 또한, 경과 일이 증가할수록 개선점수(improved scores)는 높아졌으며, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록 개선 점수(improved scores)가 더 높았다. 이를 통해, P145(MK145) 단백질의 투여 용량이 많을수록 dose-dependent 하게 신경학적 회복이 더 잘 발생함을 알 수 있다.
정상 래트와 출혈성 뇌졸중 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직을 활용하여 RT-PCR을 수행하여 분석하였다. 그 결과를 도 18 내지 22에 나타내었다.
그 결과로, 뇌출혈에 따라, NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1β 및 IL-18의 mRNA 발현양이 증가하여 염증 발현이 증가하나, P145(MK145)를 투여한 군에서는 그 발현양이 대조군보다 감소하였다.
이를 통해, P145(MK145) 단백질 투여에 의한 뇌손상에 의하여 발생한 inflammasome 염증의 치료효과를 알 수 있고, P145(MK145)가 뇌졸중의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5. 뇌성마비 동물모델에서 P145의 치료적 효능평가
5.1. 뇌성마비 동물 모델의 확립
생후 7일차 되는 ICR mouse를 이용하여 뇌성마비 동물모델을 제작하였다.
생후 7일차 ICR mouse의 오른쪽 총경동맥(common carotid artery; CCA)를 5-0 blue nylon을 이용하여 묶은 뒤, O2 8%, N2 92%로 유지되는 밀폐된 특수 용기에 37℃로 유지시킨 뒤 1시간 동안 저산소-뇌허혈을 유도하였다.
모델 제작 후, 6일뒤에 뇌 조직의 손상 정도를 눈으로 확인하여 50%이상 손상된 모델은 제외시켰다.
5.2. 뇌성마비 동물 모델에 P145 단백질 투여
정제하여 추출한 P145 단백질 100ng을 복강투여로 100μl의 생리식염수에 녹여 투여하였다.
치료제의 투여는 뇌성마비 모델 제작 후 7일차에 수행하였으며, 모든 동물 모델의 실험은 블라인드로 수행하였다.
5.3. 뇌성마비 동물 모델의 행동 평가 분석
뇌성마비 모델에서의 치료 스케줄을 도 23에 나타내었다.
행동 평가는 수술 후 35일, 치료제 투여 후 28일 뒤에 1번 수행하였다.
신경학적 결손 척도(modified neurological severity scores; mNSS): 총 14점이 만점인 분석방법으로 정상적인 행동을 보일 때는 0점, 신경학적 결손이 심할수록 총점 14점에 가까워진다. 사지긴장도(총 3점), 보행(총 3점), 평형유지력(총 6점), 감각기능(총 2점)을 종합적으로 평가하여 합산하였다.
실린더 평가(cylinder test): 공간감각과 운동기능을 기반으로 한 탐색능력을 측정하는 방법으로 실험 동물을 지름 15cm, 높이 40cm 유리 실린더에 위치시킨 후, 실험 동물이 기립하여 앞발로 벽을 짚는 횟수를 총 20회 관찰하였다. 분석은 총 20회의 횟수 중 장애가 보이는 왼쪽 앞발이 벽을 짚은 횟수를 %로 계산하였다. 평가결과를 도 24에 나타내었다.
그 결과, 수술 후 35일에 있어서 mNSS 점수가 P145를 투여한 군에서 현저하게 감소하는 것으로 나타나, 뇌성마비에 대한 치료효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 실린더 평가에 있어서도, P145(MK145)를 투여한 군에 있어 장애가 보이는 앞발의 사용 빈도가 증가하는 것으로 나타나, 뇌성마비에 대한 치료효과가 있는 것으로 나타났다. 이를 통해 P145(MK145)가 뇌성마비의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
5.4. 뇌성마비 뇌졸중 동물 모델의 P145(MK145)의 치료기전 확인
샴 래트와 뇌성마비 뇌졸중 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 분석하였다. 그 결과를 도 25 및 26에 나타내었다.
그 결과로, 뇌손상에 따라, 염증마커인 NLRP3, ASC 및 Caspase-1의 와 ROS 마커인 NOX2 및 NOX4 의 mRNA 발현양이 증가하나, P145(MK145) 투여한 군에서는 그 발현양이 대조군보다 감소하였다.
이를 통해, P145(MK145) 단백질 투여에 의한 뇌손상에 의하여 발생한 염증 및 증가된 ROS의 치료효과를 알 수 있고, P145(MK145)가 뇌성마비의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6. 치매동물모델에서 P145(MK145)의 치료적 효능평가
6.1. 아밀로이드 베타 주입 동물 모델의 확립
생후 6주의 체중은 23~25g 정도 되는 수컷 B6 계 생쥐를 이용하였으며, 한 사육장에(cage) 5마리씩 사육하였으며 12시간 명-암으로 21℃의 조건으로 유지하였으며 먹이 및 식수를 제공하였다.
기억력결손을 일으키는 물질인 아밀로이드 베타1-42는 10% DMSO(dimethyl sulfoxide) 식염수에 녹인 후 37℃에서 1주 동안 배양하고 10μM 농도로 준비하였다.
실험 동물은 3% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입 마취 시킨 후 호흡 마취 기기를 이용하여 1.5% 이소플루란을 수술 동안 유지시켰다. 뇌정위수술틀 (stereotaxic)을 준비한 후 실험 동물의 머리를 고정시키고 bregma에서 후방 -0.9mm, 측면 1.7mm, 깊이 2.2mm로 아밀로이드베타1-42 5㎕를 26-gauge 바늘이 달려있는 10μl Hamilton microsyringe로 10분동안 주입하였다.
6.2. 아밀로이드 베타 주입 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여
정제하여 추출한 P145(MK145) 단백질 100ng을 복강(IP) 및 정맥(IV)투여로 100μl의 생리식염수에 녹여 투여하였다.
치료제의 투여는 치매 모델 제작 후 7일차에 수행하였으며, 모든 동물 모델의 실험은 블라인드로 수행하였다.
6.3. 아밀로이드 베타 주입 동물 모델의 행동 평가 분석
아밀로이드 베타 주입 동물 모델에서의 치료 스케줄을 도 27에 나타내었다.
시술 전 Y미로 와 NORT 인지능력 평가를 훈련시켰고 이를 점수화한 후에 행동평가를 진행하였으며 시술 후 7일째에 병변모델들을 선정하여 실험을 진행하였다. 시술 7일 후에 치료제를 처리하여 인지기능이 개선되는지를 치료 후 7일, 14일에 측정하였다.
Y자 미로 평가(Y-maze test): 장치는 3개의 통로(arm)으로 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며 각 가지의 길이는 35cm, 높이 15cm, 폭 5cm이고 동일한 각도로 위치시킨다. 실험 동물의 움직임을 교차 회수로 나타내는데 교차 회수는 연속적으로 3개의 통로를 순차적으로 통과하였을 때 한 번 교차한 것으로 정의된다 (spontaneous alteration). 각 실험 동물은 한 쪽 미로에서 시작하여 다른 미로로 가도록 하였으며 올바른 교차를 성공한 회수를 점수화하여 백분율로 표현 하였다. 2분간 자유롭게 움직이게 한 후 5분간 측정하였다.
새로운 물체 인식 테스트(novel object recognition test; NORT): 설치류의 호기심을 자극하는 인지 실험 기법으로 기존 적응 훈련기간동안 동일한 물체 두 가지에 대한 기억을 주입시키고 측정 시작과 동시에 다른 물체, 다른 색상의 물체로 치환해줌으로써 본능적인 호기심을 유도하여 기억력을 측정한다. 2분간 익숙한 물체(familiar)로 자유롭게 움직이도록 하고 새로운 물체(novel)로 바꿔준 후 5분간 측정하여 새로운 물체에 머문 시간을 각 물체의 머문 시간의 합으로 나누어 준 후 백분율로 표현하였다. 그 결과를 도 28에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 투여 후 7일 및 14일 째에 있어서, Y자 미로 평가 및 새로운 물체 인식 테스트 모두에서 P145를 복강 및 정맥으로 투여한 군은 투여하지 않은 군과 비교하여 현저하게 높은 수치를 기록하여, 치매에 대한 치료효과가 있는 것으로 나타났다. 이를 통해 P145(MK145)가 치매의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
6.4. APP/PS1 TG 치매 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여
12개월된 APP/PS1 TG 동물모델에 P145를 복강투여로 5일간 투여 후 둥지 만들기 행동 평가(Nest test)를 수행하였다. 정상 래트와 APP/PS1 TG 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 Nest test 평가결과를 도 29 및 30에 나타내었다.
그 결과로, 치매 유발에 따라 둥지 만들기 행동에 이상이 생기나, P145(MK145) 단백질을 투여한 군에서는, 대조군보다 개선된 둥지 만들기 행동과 점수가 나타났으며, 이를 통해, P145(MK145)가 치매의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
정상 래트와 APP/PS1 TG 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직을 이용하여 아밀로이드 베타 플라크를 염색한 후 분석하였다. 그 결과를 도 31 및 32에 나타내었다.
그 결과, P145 투여한 군에서 플라크의 숫자가 유의미하게 감소한 것을 확인하였다. 이를 통해, P145(MK145)가 치매의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7. 파킨슨 동물모델에서 P145(MK145)의 치료적 효능평가
7.1. MTPT 주입 동물 모델의 확립
생후 10주의 체중은 23~25g 정도 되는 수컷 B6 계 생쥐를 이용하였으며, 한 사육장에(cage) 5마리씩 사육하였으며 12시간 명-암으로 21℃의 조건으로 유지하였으며 먹이 및 식수를 제공하였다.
MTPT를 25mg/kg를 0.9% NaCl에 녹여 복강투여로 7일간 투여하여 파킨슨 모델을 유도하였다.
7.2. 파킨슨 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여
정제하여 추출한 P145 단백질 10μg/kg을 복강(IP)으로 총 5회 100μl의 생리식염수에 녹여 투여하였다.
치료제의 투여는 치매 모델 제작 후 7일차부터 수행하였으며, 모든 동물 모델의 실험은 블라인드로 수행하였다.
7.3. 파킨슨 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여에 따른 치료효능 확인
파킨슨 동물모델에서 P145(MK145) 투여 후 신경행동 평가를 수행하였다. 정상 래트와 파킨슨 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 신경행동 평가 결과를 도 33에 나타내었다.
그 결과로, 파킨슨 질환 유발에 따라 신경행동 이상이 생기나, P145(MK145) 단백질을 투여한 군에서는, 대조군보다 개선된 신경행동이 나타났으며, 이를 통해, P145(MK145)가 파킨슨 질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
정상 래트와 파킨슨 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 도파민 발현양을 ELISA를 통해 분석하였다. 그 결과를 도 34에 나타내었다.
그 결과, P145(MK145) 투여한 군에서, 도파민의 양이 대조군보다 증가하였으며, hippocampus에서의 도파민 양이 정상군 및 대조군 보다 유의미하게 증가한 것을 확인하였다. 이를 통해, P145(MK145)가 파킨슨 질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
정상 래트와 파킨슨 동물모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 뇌조직 내 도파민 관련 receptor의 발현양을 RT-PCR을 통해 분석하였다. 그 결과를 도 35에 나타내었다.
그 결과, 파킨슨 병 신경기능과 관계 높은 것으로 알려진 도파민 1형 수용체와 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)의 발현이 파킨슨 유발에 따라 저하되었다가. P145(MK145)를 투여한 군에서는 대조군보다 발현이 향상되었다. 이를 통해, P145(MK145)가 파킨슨 질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8. 자폐 동물모델에서 P145(MK145)의 치료적 효능평가
8.1. VPA 주입 자폐 동물 모델의 확립
임신 12일차 되는 어미 쥐에 피하로 VPA를 투여하여 생후 40일까지 사육하였으며, 12시간 명-암으로 21℃의 조건으로 유지하였으며 먹이 및 식수를 제공하였다.
8.2. 자폐 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여
정제하여 추출한 P145(MK145) 단백질 100μg/kg을 복강(IP)으로 생후 47일부터 총 5회 100μl의 생리식염수에 녹여 투여하였다.
8.3. 자폐 동물 모델에 P145(MK145) 단백질 투여에 따른 치료효능 확인
자폐 모델에서의 치료 스케줄은 도 36에 나타내었다.
자폐 모델의 행동평가는 P145(MK145) 투여 후 다음날부터 3일간 수행하였다.
정상 래트와 자폐 모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 낯선 또래를 만났을 때의 사회화 반응을 분석하였다. 그 결과를 도 37에 나타내었다.
그 결과로, 자폐 유발에 따라 낯선 또래를 만났을 때의 사회하 반응이 저하되었으나, P145(MK145) 단백질을 투여한 군에서는, 대조군보다 개선된 사회화 반응이 나타났으며, 이를 통해, P145(MK145)가 자폐의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
정상 래트와 자폐 모델 래트(대조군 및 P145(MK145) 단백질 투여군)의 자폐 증세로서 구슬을 파묻어 버리는 행동을 분석하였다. 그 결과를 도 38 및 39에 나타내었다.
그 결과로, 자폐 유발에 따라, 구슬을 파묻어 버리는 행동이 증가하였으나, P145(MK145) 단백질을 투여한 군에서는, 대조군보다 감소된 구슬을 파묻어 버리는 행동이 나타났으며, 이를 통해, P145(MK145)가 자폐의 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.
Claims (14)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
- 제1 항에 있어서,상기 단백질에 세포 투과 펩타이드가 추가적으로 융합된 것인 단백질.
- 제1 항에 있어서,서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1의 N말단에 서열번호 3의 254번째 아미노산부터 N말단 방향으로 1 내지 30개의 아미노산 또는 상기 서열번호 1의 C말단에 서열번호 3의 400번째 아미노산부터 C말단 방향으로 1 내지 30개의 아미노산이 부가된 것인 단백질.
- 제1 항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제4 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드.
- 제4 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제6 항의 벡터로 형질전환된 것인 세포.
- 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항의 단백질 및 제4 항 또는 제5 항의 폴리뉴클레오타이드 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 세포 배양용 조성물.
- 제8 항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 전구세포, 식물세포 및 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 세포 배양용 조성물.
- 제9 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS), 중간엽줄기세포 및 역분화줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 세포 배양용 조성물.
- 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항의 단백질 및 제4 항 또는 제5 항의 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제11 항에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 저산소성 뇌손상, 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 정신질환 및 퇴행성 뇌질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
- 제12 항에 있어서, 상기 정신질환은 자폐 스펙트럼, 조현병, 지적장애 및 다운증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
- 제12 항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸중(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
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DATABASE Protein 9 June 2008 (2008-06-09), ANONYMOUS : "PCNT protein, partial [Homo sapiens]", XP093131476, retrieved from NCBI Database accession no. AAH35913.1 * |
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