WO2018021778A1 - Lrg1 당단백질을 포함하는 융합 단백질을 함유하는 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Lrg1 당단백질을 포함하는 융합 단백질을 함유하는 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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류지간
김호민
윤국남
강지인
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인하대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein comprising LRG1 glycoprotein and a composition and method for preventing or treating erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease comprising the same as an active ingredient.
  • Erectile dysfunction is a type of male sexual dysfunction, a phenomenon in which male sexual activity is not possible because the male genitals are not erection or erection persists.
  • the causes of erectile dysfunction are largely divided into psychogenic causes and organic causes.
  • Psychogenic erectile dysfunction is due to excessive secretion of noradrenaline due to excessive effects of sympathetic nerve due to psychological and psychological effects, increased penile cavernous smooth muscle tension, and suppression of neurotransmitter secretion.
  • Matrix erectile dysfunction is classified into neurogenic, vascular and endocrine dysfunction depending on the cause.
  • the vascular and neurogenic erectile dysfunction is due to hyperlipidemia, diabetes, hypertension, smoking, systemic cardiovascular disease, spinal cord injury, penile nerve damage, damage to the corpus cavernosum and vascular endothelial cells, penile nerve cells and nitric oxide It is a disorder caused by poor secretion of loose substances such as nitric oxide (NO).
  • NO nitric oxide
  • PDE-5 phosphodiesterase-5) inhibitors, including iOS (component name sildenafil)
  • Such oral drugs are known to have an effect of treating erectile dysfunction by increasing the concentration of cGMP by inhibiting PDE-5, which is specifically distributed in the corpus cavernosum, thereby increasing the blood flow in the corpus cavernosum.
  • PDE-5 inhibitors such as Viagra
  • Viagra have been reported to have several side effects, including headache, hot flashes, indigestion, and heart failure, as well as to regulate transient protein expression and related factors at the molecular level. It is not a fundamental cure.
  • Ischemia refers to a reduced state of blood flow to body organs, tissues or sites, ultimately leading to irreversible damage, ie necrosis of cells and tissues.
  • the heart, kidneys, and brain are the most sensitive body organs for lack of blood flow.
  • ischemic cascades are triggered, causing brain tissue to develop. Permanent damage.
  • Ischemia can be caused by a variety of causes, including, for example, abnormal fast beating of the heart, hypotension, vascular compression from outside the blood vessels (eg, vascular pressure from cancer outside the blood vessel), thrombus, embolism, transient Ischemic symptoms may be caused by a transient ischemic attack, a transient heart attack, cerebral vascular injury due to an accident, cerebral hemorrhage, cerebral infarction, arteriovenous malformation, or peripheral arterial obstruction.
  • causes including, for example, abnormal fast beating of the heart, hypotension, vascular compression from outside the blood vessels (eg, vascular pressure from cancer outside the blood vessel), thrombus, embolism, transient Ischemic symptoms may be caused by a transient ischemic attack, a transient heart attack, cerebral vascular injury due to an accident, cerebral hemorrhage, cerebral infarction, arteriovenous malformation, or peripheral arterial obstruction.
  • Ischemic disease is a disease exhibiting such ischemic symptoms, and may include cerebral ischemia, cardiac ischemia, retinal ischemia, critical limb ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure, and cardiomyopathy depending on the body organs involved.
  • cardiac ischemia that occurs when there is insufficient blood flow to the heart muscle can cause chest pain
  • cardiac failure such as angina
  • cerebral ischemia caused by insufficient blood flow to the brain can cause acute ischemic stroke or May cause vascular dementia due to chronic cerebral ischemia.
  • Ischemia of the large intestine or small intestine can lead to ischemic colitis or mesenteric ischemia, and spotty skin discoloration can occur when the blood supply to the skin is reduced.
  • neuropathy is a disease caused by structural or functional abnormalities of the nervous system.
  • the nervous system is divided into the central nervous system, which is distributed in the brain and the spinal cord and is involved in the regulation of its function, and the peripheral nervous system, which is distributed in almost every organ in the body except the brain and the spinal cord.
  • Peripheral nervous system is classified into the motor nervous system, sensory nervous system, autonomic nervous system.
  • neurites In the brain and spinal cord, neurites (neurites) extend to the body, arms and legs, which is called peripheral nerves.
  • Peripheral nerves convey the senses felt in the hands, feet, and auditory organs to the central nervous system (brain and spinal cord), and transmit central nervous command to the muscles.
  • Peripheral nerves are damaged by various causes, commonly referred to as peripheral neuropathy. When only one peripheral nerve is damaged, it is called mono neuropathy, and when several peripheral nerves are damaged to a similar extent, multiple neuropathy is called multiple neuropathy.
  • neuropathy There are many causes of neuropathy, which can be broadly divided into metabolic diseases (diabetes, renal failure, hypothyroidism), drugs (anticancer drugs, tuberculosis drugs), toxic poisoning (lead, organic solvent), nutritional deficiency (vitamin deficiency, alcoholism) , Connective tissue diseases (rheumatic arthritis, systemic lupus erythematosus), inflammatory diseases (Guillain-Barré syndrome), hereditary neuropathy. It is also associated with cancer.
  • LRG1 is a serum glycoprotein having eight leucine-rich repeats (LRRs).
  • LRRs leucine-rich repeats
  • LRG1 is known to be involved in various intracellular actions such as signaling and cell adhesion. Unlike other LRR family proteins that have many different functions in cells, little is known about the function of the LRG1 glycoprotein, and only its expression has been reported during various inflammatory diseases and the differentiation of granulocytes. Recently, LRG1 glycoproteins have been reported to induce angiogenesis through proliferation and migration of vascular endothelial cells in mouse retinal vessels (X Wang et al., Nature, 499 (7458)). , pp306-311, 2013). However, there is no known relationship between LRG1 glycoprotein and penile erection and its prevention or treatment of erectile dysfunction.
  • the present inventors have conducted research to develop a new protein drug, and as a result, the LRG1-Fc fusion protein fused with LRG1 glycoprotein and Fc domain induces regeneration of penile cortical endothelium and nerve cells, thereby increasing penile erection, Confirming the effect of blood vessels and nerve regeneration, and completed the present invention.
  • LRG1-Fc fusion protein in which an LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) glycoprotein and an Fc domain are fused.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease comprising LRG1 glycoprotein or LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention provides a LRG1-Fc fusion protein fused with the LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) glycoprotein and the Fc domain.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention also provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention also provides a cell transformed with the vector.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating erectile dysfunction comprising the LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention also provides a food composition for preventing or improving erectile dysfunction comprising the LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention also provides a quasi-drug composition for preventing or improving erectile dysfunction comprising the LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic diseases comprising the LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention also provides a food composition for the prevention or improvement of ischemic diseases comprising the LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of LRG1 glycoprotein or peripheral neurological disease comprising the LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention also provides a food composition for the prevention or improvement of peripheral neurological diseases comprising the LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating erectile dysfunction comprising administering an LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein to a subject in need thereof.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating ischemic disease, comprising administering an LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein to a subject in need thereof.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating peripheral neuropathy, comprising administering LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein to a subject in need thereof.
  • LRG1 glycoprotein or LRG1-Fc fusion protein increases the level of endothelial and neuronal specific proteins to induce regeneration of the corpus cavernosum and endothelial cells and neurons and increase penile erectile dysfunction. Having a bar, it can be usefully used for the prevention or treatment of erectile dysfunction.
  • the LRG1 glycoprotein or LRG1-Fc fusion protein according to the present invention has vascular and neuronal regeneration effects, and thus may be usefully used for the prevention or treatment of ischemic diseases or peripheral neurological diseases.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of confirming the isolated LRG1-Fc fusion protein via SDS-PAGE after expression of the recombinant vector in insect cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of confirming the isolated LRG1-Fc fusion protein through SDS-PAGE after the recombinant vector is expressed in mammalian cells.
  • Figure 3 is a schematic diagram of the LRG1-Fc fusion protein linking the human-derived LRG1 glycoprotein with the Fc domain of human IgG1 with a linker (signal peptides (1-28)-human LRG1 (29-340)-linker (AAA) (341) 343) -Fc domain (344-570, human IgG1)).
  • linker signal peptides (1-28)-human LRG1 (29-340)-linker (AAA) (341) 343) -Fc domain (344-570, human IgG1)
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the LRG1-Fc fusion protein linking the mouse-derived LRG1 glycoprotein with the Fc domain of human IgG1 with a linker (signal peptide (1-28) -mouse LRG1 (29-338) -linker (AAA) (339). 341) -Fc domain (342-568, human IgG1)).
  • Figure 5 is a diagram showing the results of corpus cavernosum pressure (erection force) measurement according to the penile nerve stimulation by the administration of human LRG1-Fc fusion protein in diabetic erectile dysfunction mouse model.
  • Figure 6 is a diagram showing the results of measurement of the corpus cavernosum pressure (erectile power) according to penile nerve stimulation by the administration of human LRG1-Fc fusion protein in penile nerve injury erectile dysfunction mouse model.
  • PECAM-1 Platelet / Endothelial Cell Adhesion Molucule-
  • BrdU 5-bromo-2-deoxyuridine
  • nNOS 8 is a confocal microscope analysis of the expression level of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) by administration of human LRG1-Fc fusion protein in the dorsal nerve of diabetic erectile dysfunction mouse model penis tissue. It is also.
  • nNOS neuronal nitric oxide synthase
  • nNOS neuronal nitric oxide synthase
  • Figure 10 is a diagram showing the results of Western blot analysis of the expression of various neuronal regeneration specific proteins and their receptors by administration of human LRG1-Fc fusion protein in the corpus cavernosum of diabetic erectile dysfunction mouse model penis tissue.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of microscopic observation of the degree of tube formation according to the treatment of human LRG1-Fc fusion protein in HUVECs and mouse cavernous endothelial cells (MCECs) induced ischemia with hyperglycemia.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of microscopic observation of the degree of microangiogenesis according to the treatment of human LRG1-Fc fusion protein in the aortic ring (aortic ring) induced ischemia with hyperglycemia.
  • FIG. 13 shows a model of peripheral neuropathy by culturing a major pelvic ganglion (MPG) in a normal mouse under hyperglycemic conditions, and then a neuron specific fiber, which is a neuron-specific protein following human LRG1-Fc fusion protein treatment. ) And beta-III tubulin expression level analysis results by confocal microscopy.
  • MPG major pelvic ganglion
  • FIG. 14 shows a model of peripheral neuropathy by culturing the dorsal root ganglion (DRG) of a normal mouse in hyperglycemic conditions, followed by the beta-III tubulin, a neuron-specific protein following human LRG1-Fc fusion protein treatment. It is a figure which shows the result of having analyzed the expression degree by confocal microscope.
  • DRG dorsal root ganglion
  • the present invention provides an LRG1-Fc fusion protein in which an LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) glycoprotein and an Fc domain are fused.
  • LRG1 Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1
  • LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) refers to a serum glycoprotein having eight leucine-rich repeats (LRRs), which are derived from various mammals such as humans and mice. Including, but not limited to, all LRG1 glycoproteins.
  • the LRG1 glycoprotein according to the present invention preferably consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, for example derived from human or mouse, and includes a functional equivalent of the protein.
  • the term "functional equivalent” means at least 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 as a result of the addition, substitution or deletion of the amino acid. More preferably, it refers to a protein having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • LRG1 glycoproteins of the present invention include not only proteins having their native amino acid sequences, but also amino acid sequence variants thereof within the scope of the present invention.
  • the variant of LRG1 glycoprotein refers to a protein in which the natural amino acid sequence of the LRG1 glycoprotein and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art.
  • the LRG1 glycoprotein or variant thereof can be extracted from nature or synthesized (Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156, 1963) or by genetic recombination methods based on DNA sequences (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2nd edition, 1989).
  • the LRG1 glycoprotein of the present invention may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5, and variants that can function functionally with the nucleotides are included within the scope of the present invention.
  • the term "functionally equivalent” means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more than the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5 as a result of the addition, substitution, or deletion of the base.
  • having 95% or more of sequence homology it means a nucleotide sequence capable of encoding a protein having a substantially homogeneous physiological activity with a protein encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5.
  • SEQ ID NO: 4 or 5 a nucleotide sequence capable of encoding a protein having a substantially homogeneous physiological activity with a protein encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5.
  • variants that can function functionally the same as the nucleic acid molecule encoding the LRG1 glycoprotein The concept is to include.
  • Fc domain refers to the Fc domain of Ig (immunoglobulin).
  • the Fc domain of Ig means heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3), except for heavy and light chain variable regions, heavy chain constant region 1 (CH1) and light chain constant region (CL1) of Ig.
  • the heavy chain constant region may include a hinge portion.
  • the Fc domain of Ig has a substantially equivalent or improved effect as the natural type, except for the heavy and light chain variable regions of Ig, only some or all heavy chain constant region 1 (CH1) and / or light chain constant region 1 (CL1) It may be an extended Fc region including a.
  • the Fc domain of Ig may have various sites such as a site capable of forming a disulfide bond, a few amino acids at the N-terminus of a native Fc, or a methionine residue at the N-terminus of a native Fc.
  • sites such as a site capable of forming a disulfide bond, a few amino acids at the N-terminus of a native Fc, or a methionine residue at the N-terminus of a native Fc.
  • Ig includes IgA, IgD, IgE, IgG or IgM, preferably IgG.
  • the IgG may be derived from humans or mammals such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, preferably humans.
  • the IgG comprises IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, preferably IgG1.
  • the Fc domain of human IgG1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the Fc domain of the human IgG1 may be encoded by a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, and a variant capable of functioning equivalent to the nucleotide is included within the scope of the present invention.
  • the fusion protein of the present invention may be in the form of a linker in which the LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) glycoprotein and the Fc domain are linked.
  • LRG1 Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1
  • linker basically refers to two different fusion partners (e.g., biological polymers, etc.) by hydrogen bonding, electrostatic interaction, van der Waals force, disulfide bond, salt bridge, hydrophobicity. It refers to a linker that can be linked using interaction, covalent bonds, etc., preferably a peptide linker.
  • the peptide linker is a peptide having any amino acid sequence, a small amino acid having no functional group is suitable, preferably a peptide linker consisting of one or more amino acids selected from the group consisting of alanine, glycine and combinations thereof. have.
  • the peptide linker does not interfere with the binding ability of the LRG1 glycoprotein and the Fc domain, and may be composed of a number of amino acids that can give flexibility to maintain proper culture, for example, may consist of 1 to several tens of amino acids. And, it may be preferably composed of 1 to 10 amino acids, but is not limited thereto.
  • the LRG1-Fc fusion protein according to the present invention may consist of, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8, and includes functional equivalents of the protein.
  • the Fc domain according to the present invention binds to neonatal Fc-receptor (FcRN) on the surface of vascular endothelial cells, and binds to FcRN at low pH and separates at neutral pH. Due to these characteristics, the fusion protein including the Fc domain is endocytosis into vascular endothelial cells, and is exotized again to be discharged into the blood, thereby increasing the half-life of the fusion protein in the blood. In addition, the fusion protein containing the Fc domain has the effect of improving the water solubility and safety by fusion with the Fc domain, and also in terms of drug production can be easily purified and separated to reduce the production cost bar, LRG1 glycoprotein It has advantages over using bay.
  • FcRN neonatal Fc-receptor
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the LRG1-Fc fusion protein.
  • polynucleotide is included within the scope of the present invention without limitation as long as it encodes the LRG1-Fc fusion protein of the present invention through a transcription and translation process.
  • the polynucleotide of the present invention may further comprise a sequence encoding a signal peptide for secretion of the expressed protein.
  • the signal peptide sequence is preferably cleaved off after expression and purification of the protein.
  • the LRG1-Fc fusion protein according to the present invention may be composed of, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 10, and a variant capable of functionally equivalent function with the polynucleotide is included in the scope of the present invention. .
  • the present invention also provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector, wherein the expression vector is a recombinant vector capable of expressing a protein of interest in a host cell of interest, and a gene construct comprising an essential regulatory element operatively linked to express a gene insert. it means.
  • the expression vector includes expression control elements such as initiation codon, termination codon, promoter, operator, etc.
  • the initiation codon and termination codon are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and when the gene construct is administered, Must be functional and must be in coding sequence and in frame.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector may further comprise a protein tag that can be removed using an endopeptidase, to facilitate detection of the fusion protein.
  • the term “tag” refers to a molecule that exhibits quantifiable activity or properties, and refers to a polypeptide fluorescent material such as a chemical fluorescent material such as fluorescein, fluorescent protein (GFP) or related protein. May be a fluorescent molecule, including; It may be an epitope tag such as a Myc tag, a flag tag, a histidine tag, a leucine tag, an IgG tag, a straptavidin tag, or the like. In particular, when an epitope tag is used, a peptide tag preferably consisting of 6 or more amino acid residues, more preferably 8 to 50 amino acid residues, may be used.
  • Vectors that can be used in the present invention are plasmids often used in the art (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, etc.), E. coli derived plasmids (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), Bacillus subtilis derived plasmids (pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, YCp50, etc.), phage DNA (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.), animal virus vectors (retrovirus, adenovirus (adenovirus) ), Vaccinia virus, etc.), insect virus vectors (baculovirus, etc.) can be produced.
  • E. coli derived plasmids pYG601BR322, pBR325, p
  • the vector system of the present invention may be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), This document is incorporated herein by reference.
  • the present invention also provides a cell transformed with the vector.
  • the transformation may be performed by a variety of methods, as long as it can produce the fusion protein of the present invention, without being particularly limited thereto, CaCl 2 precipitation, CaCl 2 precipitation using a reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide) Hanahan method, electroporation, calcium phosphate precipitation method, plasma fusion method, agitation method using silicon carbide fibers, agrobacterial mediated transformation method, transformation method using PEG, dextran sulfate, Lipofectamine and dry / inhibited mediated transformation methods and the like can be used.
  • CaCl 2 precipitation CaCl 2 precipitation using a reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide) Hanahan method
  • electroporation calcium phosphate precipitation method
  • plasma fusion method agitation method using silicon carbide fibers
  • agrobacterial mediated transformation method transformation method using PEG, dextran sulfate, Lipofectamine and dry / inhibited mediated transformation methods
  • the cell is not particularly limited as long as it can produce the fusion protein of the present invention, but is not limited thereto, bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Yeast cells, such as Saccharomyces cerevisiae and ski-irradiated caromyces pombe; Fungal cells such as Pchia pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; Animal cells such as CHO, COS, NSO, 293, bow melanoma cells; Or plant cells.
  • bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium
  • Yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae and ski-irradiated caromyces pombe
  • Fungal cells such as Pchia pastoris
  • Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells
  • Animal cells such as CHO, COS, NSO, 293, bow melanom
  • LRG1 glycoprotein or LRG1-Fc fusion protein according to the present invention increases the level of endothelial and neuronal specific proteins to induce regeneration of the corpus cavernosum and endothelial cells and neurons and increase penile erectile dysfunction.
  • the LRG1 glycoprotein or LRG1-Fc fusion protein according to the present invention has vascular and neuronal regeneration effects. Therefore, the LRG1 glycoprotein or LRG1-Fc fusion protein of the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating erectile dysfunction comprising LRG1 glycoprotein as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of ischemic diseases comprising the LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating peripheral neurological diseases comprising the LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein.
  • the composition comprises a pharmaceutical composition, quasi-drug composition or food composition.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating erectile dysfunction comprising administering an LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein to a subject in need thereof.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating ischemic disease, comprising administering an LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein to a subject in need thereof.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating peripheral neuropathy, comprising administering LRG1 glycoprotein or the LRG1-Fc fusion protein to a subject in need thereof.
  • the term “prophylaxis” is used to block the symptoms of erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease, or to prevent erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral using a composition comprising the LRG1 glycoprotein or LRG1-Fc fusion protein of the present invention. Any action that inhibits or delays the symptoms of neurological disease.
  • treatment refers to any action that improves or benefits the symptoms of erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease using a composition comprising the LRG1 glycoprotein or LRG1-Fc fusion protein of the present invention.
  • the term "erectile dysfunction” means a state in which there is not enough erection or maintenance for sexual life, and generally defined as erectile dysfunction when such a state lasts for 3 months or more.
  • the erectile dysfunction can be largely divided into psychogenic erectile dysfunction due to psychological factors and organic erectile dysfunction due to physical disorders, LRG1 glycoprotein or LRG1-Fc fusion protein of the present invention ultimately improve the function of the penis Both psychogenic and organic erectile dysfunction can be treated.
  • the organic erectile dysfunction may be due to diseases such as diabetes, penile tissue damage, coronary artery disease, nephropathy, neuropathy, hypertension, arteriosclerosis or hyperlipidemia, but is not limited to the above examples and may affect erection. If the disease is present, it is included without limitation.
  • the term "cavernous body” is an erectile tissue that forms the subject of the mammal's penis or clitoris, and is surrounded by a thick, durable connective tissue membrane containing elastic fibers, and the membrane enters the inside to make a small room on the sponge. It is coming true. Inside the penis of the male there are two penile cavernous bodies on the left and one under the urethral cavernous body, and in women there is a clitoris cavernous body and urethral cavernous body having a structure similar to the penile cavernous body. When the cavernous body is filled with venous blood, the penis will be erect.
  • the corpus cavernosum smooth muscle and the blood vessels of the penis are normally contracted by the adrenergic sympathetic nerves, and after the erection response by relaxation, they are returned to the contracted state by the stimulation of the adrenergic sympathetic nervous system.
  • the erectile tissue maintains its normal contraction state, but during sexual arousal, the erectile tissue is relaxed by the signals from the brain center, stimulation of the nervous system, various neurotransmitters and hormones in the body and erectile tissue, erection starts, and erection Is maintained. After the completion of the erection reaction, the erectile tissue is kept in a contracted state again.
  • ischemic disease refers to a disease that indicates a decreased state of blood flow to body organs, tissues, or sites, and according to the related organs or causes, myocardial infarction, cerebral infarction, ischemic acute renal failure, and ischemic acute liver failure. , Diabetic foot ulcers, diabetic nephropathy, ischemic colitis, myocardial hypertrophy, ischemic disease or organ tissue damage due to surgical side effects, and the like. Ischemic diseases due to the surgical side effects include, but are not limited to, ischemic heart failure, ischemic renal failure, ischemic liver failure or ischemic stroke.
  • the organ tissue damage includes long-term surgery or transplantation with reperfusion after ischemia, due to traumatic amputation of the limb.
  • the organs include, but are not limited to, kidney, liver, pancreas, lung or heart.
  • peripheral neuropathy refers to a disease caused by damage or death of peripheral nerves, including, but not limited to, peripheral nerve damage, diabetic neuropathy (diabetic peripheral neuropathy), and the like. Do not.
  • the diabetic neuropathy is a diabetic complication caused by metabolic abnormalities or disorders of nutritional vessels of neurons accompanied by hyperglycemia, symmetrical peripheral polyneuropathy, diabetic muscular atrophy, unipolar neuropathy, autonomic neuropathy Symptoms such as painless myocardial ischemia and movement disorder.
  • composition of the present invention when formulated into a pharmaceutical composition for the purpose of preventing or treating erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease, it may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of the pharmaceutical composition.
  • Suitable formulations known in the art are preferably those disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, recently, Mack Publishing Company, Easton PA.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose , Microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, It is prepared by mixing gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be used.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the term "administration" means providing a subject with any composition of the invention in any suitable manner.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. Administration of the composition may be administered once a day, may be divided several times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, or cerebrovascular injections. However, upon oral administration, since the protein is digested, it is desirable to formulate oral compositions to coat or protect the active agent from degradation in the stomach.
  • the composition of the present invention may preferably be administered in the form of an injection.
  • composition of the present invention may further contain at least one known effective ingredient having a prophylactic or therapeutic effect of erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease together with LRG1 glycoprotein.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers for the prevention and treatment of erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease.
  • composition of the present invention may be added to the quasi-drug composition for the purpose of preventing or ameliorating erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease.
  • the active ingredient may be added as it is or used together with other quasi-drug components, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be suitably determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • composition of the present invention may be added to a dietary supplement for the purpose of preventing or improving erectile dysfunction, ischemic disease or peripheral neurological disease.
  • the term "health functional food” refers to a food having a bioregulatory function, such as prevention and improvement of disease, biological defense, immunity, recovery from illness, and aging inhibition, and should be harmless to the human body when taken in the long term.
  • the dietary supplement may include food acceptable food additives, and may further include appropriate carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of dietary supplements.
  • the active ingredient When the composition of the present invention is used as a food additive, the active ingredient may be added as it is or used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present invention is added in an amount of up to 15% by weight, preferably up to 10% by weight relative to the raw material.
  • the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acids and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonated beverages And a carbonation agent used in the.
  • the proportion of such additives is not critical but is usually selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • LRG1 glycoprotein was synthesized and purified based on amino acid sequence information of known human-derived LRG1 glycoprotein or mouse-derived LRG1 glycoprotein.
  • the amino acid sequence of the human-derived LRG1 glycoprotein used in the experiment is represented by SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence of the mouse-derived LRG1 glycoprotein is represented by SEQ ID NO: 2.
  • the sequence of the original signal peptide of the LRG1 glycoprotein is MSSWSRQRPKSPGGIQPHVSRTLFLLLLLAASAWG (SEQ ID NO: 13), and to facilitate expression, MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGS (SEQ ID NO: 11), which is a signal peptide of the expression vector, is attached to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 above. Used.
  • the Fc domain binds to neonatal Fc-receptor (FcRN) on the surface of vascular endothelial cells, which binds to FcRN at low pH and separates at neutral pH. Due to these characteristics, the fusion protein including the Fc domain is endocytosis into vascular endothelial cells, and is exotized again to be discharged into the blood, thereby increasing the half-life of the fusion protein in the blood. In addition, the fusion protein containing the Fc domain has the effect of improving the water solubility and safety by fusion with the Fc domain, and also in terms of drug production can be easily purified and separated to reduce the production cost bar, LRG1 glycoprotein It has advantages over using bay.
  • FcRN neonatal Fc-receptor
  • a gene comprising a signal peptide, an LRG1 glycoprotein, and an Fc domain of human IgG1 was inserted into the pVL1391 vector.
  • the Fc domain of the LRG1 glycoprotein and human IgG1 was linked by a linker (AAA).
  • AAA As a signal peptide, MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGS (SEQ ID NO: 11), which is a signal peptide of an expression vector, was used.
  • Baculovirus for the production of the fusion protein of the LRG1-Fc domain was prepared using recombinant vectors and SF9 cells in which the recombinant gene encoding the fusion protein was inserted.
  • the recombinant baculovirus was infected with Hi5 cells for protein expression.
  • the fusion protein of the LRG1-Fc domain expressed in Hi5 cells was secreted into the medium, which was isolated and purified. More specifically, culture medium of Hi5 cells containing the fusion protein of the LRG1-Fc domain was loaded onto Protein A resin.
  • the fusion protein of the LRG1-Fc domain bound to the resin was eluted with 0.1M glycine buffer (pH 2.7).
  • the elution fraction containing the fusion protein of the LRG1-Fc domain was neutralized with 1M Tris buffer (pH8.0) (final Tris pH8.0 buffer concentration was 100 mM).
  • the fusion protein of the purified LRG1-Fc domain was concentrated and buffer exchange was performed with PBS using a desalting column. Finally, a fusion protein of LRG1-Fc domain at a concentration of 2 mg / ml was used for later experiments. After elution of the fusion protein of the LRG1-Fc domain bound to the resin, it was confirmed by SDS-PAGE. This is shown in FIG.
  • a gene comprising a signal peptide, an LRG1 glycoprotein, and an Fc domain of human IgG1 was inserted into the pcDNA3.1 vector.
  • the Fc domain of the LRG1 glycoprotein and human IgG1 was linked by a linker (AAA).
  • AAA As a signal peptide, MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGS (SEQ ID NO: 11), which is a signal peptide of an expression vector, was used.
  • the recombinant vector into which the recombinant gene encoding the fusion protein was inserted was transfected into Expi293F cells.
  • the fusion protein of the LRG1-Fc domain expressed in Expi293F cells was secreted into the medium, which was isolated and purified. More specifically, culture medium of Expi293F cells containing the fusion protein of the LRG1-Fc domain was loaded on Protein A resin. The fusion protein of the LRG1-Fc domain bound to the resin was eluted with 0.1M glycine buffer (pH 2.7). The elution fraction containing the fusion protein of the LRG1-Fc domain was neutralized with 1M Tris buffer (pH9.0) (final Tris pH9.0 buffer concentration was 100 mM).
  • the fusion protein of the purified isolated LRG1-Fc domain was buffer exchanged into PBS via dialysis, finally concentrated to a concentration of 2.8 mg / ml and used for subsequent experiments.
  • the fusion protein of the eluted LRG1-Fc domain was confirmed by SDS-PAGE. This is shown in FIG. 2.
  • a fusion protein comprising a human-derived LRG1 glycoprotein (SEQ ID NO: 1) and an Fc domain (SEQ ID NO: 3) of human IgG1, and a mouse-derived LRG1 glycoprotein (SEQ ID NO: 2) and a fusion protein comprising the Fc domain (SEQ ID NO: 3) of human IgG1 were prepared, respectively, and their amino acid sequence analysis was performed.
  • the fusion protein linking the human-derived LRG1 glycoprotein with the linker and the Fc domain of human IgG1 is shown by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the fusion protein linking the mouse-derived LRG1 glycoprotein with the Fc domain and linker of the human IgG1 is SEQ ID NO: It is represented by the amino acid sequence of 8.
  • the sequence does not include a signal peptide consisting of 28 amino acids (MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGS, SEQ ID NO: 11), which is located in front of the N-terminus of the LRG1 glycoprotein.
  • Schematic diagrams of the fusion proteins are shown in FIGS. 3 and 4.
  • mice Group 3-Induction of diabetes mellitus with streptozotocin [mouse 8 weeks after intraperitoneal administration at 50 mg / kg concentration] + mice treated with PBS (phosphate-buffered solution) [20 ⁇ L] to the corpus cavernosum;
  • PBS phosphate-buffered solution
  • mice Group 4-Induction of diabetes with streptozotocin [mouse 8 weeks after intraperitoneal administration for 5 consecutive days at a concentration of 50 mg / kg] + a fusion protein of the human LRG1-Fc domain obtained in Example 2 to the corpus cavernosum twice Injection [day ⁇ 3, 0; 5 ⁇ g / 20 ⁇ L] mice.
  • PBS phosphate-buffered solution
  • mice Group 3-Penile nerve injury mouse + penile corpus cavernosum twice injection of the fusion protein of the human LRG1-Fc domain obtained in Example 2 [day -3, 0; 5 ⁇ g / 20 ⁇ L] mice.
  • a fusion protein of human LRG1-Fc domain was injected into the corpus cavernosum of the erectile dysfunction animal model, and the nerves of the corpus cavernosum were stimulated and erection was measured. More specifically, in order to measure the erectile force, the left epidermis was opened in the lower abdomen of each mouse, and the penile cavernous nerve (the penis nerve) located on the posterior and posterior side of the prostate was well prepared. For electrical stimulation of the penis nerve, a platinum electrode was placed in the penis nerve, and then electrically stimulated for about 1 minute at a strength of 5 volts and 12 hertz. When electrical stimulation is applied, the penis will have an erection.
  • ICP Intracavernous Pressure in the longitudinal axis in FIGS. 5A and 6A refers to the pressure inside the penis (intracavernosal cavernosal pressure) during an erection, and is generally an indicator of erectile power.
  • the horizontal axis in FIGS. 5A and 6A represents the time after the electrical stimulation, and the electrical stimulation period of 1 minute is indicated by a black bar on the horizontal axis.
  • FIGS. 5B and 6B show the maximum ICP divided by the mean systolic blood pressure (MSBP), and FIGS. 5C and 6C show the area of the total ICP curve (area under the curve). Divided by the mean systolic blood pressure (MSBP), which is used to measure erection since blood pressure itself can affect the cavernosal pressure.
  • MSBP mean systolic blood pressure
  • the group administered with the fusion protein of the human LRG1-Fc domain showed a higher erection improvement effect than the non-treated diabetic group (NT) and PBS administration group (PBS), the normal control (Control It was confirmed that erection was restored up to about 90% of the). In particular, it was confirmed that two variables related to penile erection, that is, the peak corpus cavernosum pressure and the area of the penile pressure curve showed a significant synergistic effect after administration of LRG1 glycoprotein.
  • the penis consists of the cavernous tissue responsible for the functioning of the penis and the small blood vessels that supply it.
  • pathological conditions such as diabetes, hyperlipidemia, and nerve damage, lesions occur in the corpus cavernosum tissue including blood vessels and nerves, and abnormal tissue structures cause erectile dysfunction.
  • PECAM-1 Platelet-endothelial adhesion molecule-1
  • nNOS neuronal nitric oxide synthase
  • a tissue section was prepared by cutting the tissue into a 7 ⁇ m thickness in a freezing section. Next, the prepared tissue sections were placed on slides and fixed for about 5 minutes in 4% paraformaldehyde for expression analysis of PECAM-1, BrdU and nNOS. Fixed penile tissue sections were washed three times with wash buffer (2% FBS + 0.1% Sodium Azide in PBS) and then blocked with nonspecific protein blocking buffer (5% BSA in PBS) for 1 hour.
  • wash buffer 2% FBS + 0.1% Sodium Azide in PBS
  • nonspecific protein blocking buffer 5% BSA in PBS
  • the number of vascular endothelial cells in the corpus cavernosum tissue of the non-treated diabetic group (DM) or PBS-administered group (DM + PBS) was significantly reduced compared to normal mice (Control), but the human LRG1-Fc domain.
  • the expression of PECAM-1, a vascular endothelial cell-specific protein was increased compared to the control group (DM or DM + PBS).
  • nNOS neuronal nitric oxide synthase
  • nerve growth factor NGF
  • TrkA protein a receptor for neurotrophin-3
  • BDNF brain-derived neutrophic factor
  • the penile cavernous tissue isolated from each mouse was thoroughly washed with PBS, lysed and lysed with a cytolysis buffer (RIPA buffer) containing a protease inhibitor cocktail, and then dissolved at 13,000 at 4 ° C. Centrifugation was performed for 15 minutes at rpm to recover only the supernatant. Bovine serum albumin (BSA) was used to measure the protein concentration in the lysate. The extracted proteins were electrophoresed using SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), and then the proteins in the gel were transferred to a nitrocellulose membrane and 5% skim milk. Blocking.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • TrkA a receptor for nerve growth factor (NGF), neurotrophin-3 (NT-3), brain-derived neutrophic factor (BDNF), and nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NT-3 neurotrophin-3
  • BDNF brain-derived neutrophic factor
  • the reaction was carried out at 4 ° C. for 16 hours with the primary antibody against. After washing again with washing buffer three times to remove the remaining antibody, the reaction with a secondary antibody (HRP-labeled anti-mouse or HRP-labeled anti-rabbit antibody, 1: 200) for 3 hours at room temperature I was. After the reaction, the cells were washed again three times with washing buffer to remove the remaining antibody, followed by color development. ⁇ -actin was used as a housekeeping protein for quantifying protein expression. The results are shown in FIG.
  • TrkA a receptor for neuronal growth factor, neurotrophin-3, brain-derived neurotrophic factor, and neuronal growth factor
  • DM + PBS the corpus cavernosum tissue of the PBS-administered group
  • LRG1 glycoprotein induces the regeneration of neurons reduced by diabetes or penile injury, thereby showing an erection recovery effect.
  • endothelial cells that migrate and proliferate during angiogenesis continue to divide and grow into hollow tube shapes, differentiate into final blood vessels, and blood enters to complete blood vessel formation.
  • LRG1 glycoprotein can be used for the treatment of erectile dysfunction as well as various other ischemic diseases.
  • experiments were performed using HUVECs and mouse cavernous endothelial cells (MCECs). Each cell was exposed for 48 hours at 5 mM normal glucose (similar to the normal range of blood glucose levels) and 30 mM high glucose (equivalent hyperglycemic levels) and fused protein (0.2 ⁇ g) of human LRG1-Fc domains. / Ml or 2 ⁇ g / ml) was treated with glucose for 48 hours simultaneously. The control group was treated with PBS simultaneously with glucose.
  • high glucose is one of the causes of ischemic diseases and is one of the known methods for producing ischemic disease models in vitro .
  • HUVEC and mouse penile corpus cavernosum (MCECs) exposed to high glucose showed significantly reduced tube formation compared to normal glucose treated group.
  • tube formation was markedly increased in HUVECs and mouse corpus cavernoid endothelial cells (MCECs) exposed to fusion proteins of high glucose and human LRG1-Fc domains.
  • LRG1 glycoprotein affects the differentiation of vascular endothelial cells or cavernous endothelial cells whose activity is inhibited due to diabetes, leading to vascular and cavernous formation.
  • An aortic segmental angiogenesis assay is a widely used method for evaluating the angiogenic capacity of candidates for treatment. Based on these results, objective evaluation of the candidate candidates for use in various ischemic diseases can be made. This is an important test method (Baker M et al, Nature Protocol, 7: 89, 2012).
  • Matrigel-coated tissue culture dishes were loaded with normal glucose, high glucose, and aortic sections exposed to high concentration glucose and fusion proteins of the human LRG1-Fc domain and for 3 or 6 days, respectively. After incubation in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, microangiogenesis was observed from the aortic section through a microscope. The results are shown in FIG.
  • the LRG1 glycoprotein has an excellent angiogenesis inducing effect, it can be used for the treatment of various ischemic diseases as well as erectile dysfunction treatment.
  • the penile nerves that control the penile erectile tissue are derived, which plays a major role in signaling associated with erection signals.
  • the dorsal root ganglion of the spinal cord is a central afferent nerve pathway, which is widely used to evaluate the neuronal regeneration or protection ability of therapeutic candidates. It is an important experimental method to objectively assess whether it can be used for neurological diseases (Jin GZ et al., Neuroscience Letter, 501: 10, 2011).
  • main pelvic ganglion and dorsal root ganglion were isolated from normal mice.
  • the extracted main pelvic ganglion and dorsal root ganglion were placed in a culture dish and covered with Matrigel to incubate for 15 minutes in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 to harden the Matrigel.
  • the Matrigel When the Matrigel is hardened, it is treated with normal glucose (5 mM glucose) or treated with fusion proteins (0.2 ⁇ g / mL) of the PBS and human LRG1-Fc domains under high glucose (30 mM glucose, high glucose), respectively. It was.
  • high glucose is one of the causes of peripheral neuropathy and is one of the known methods for preparing a peripheral neuropathy model in vitro .
  • LRG1 glycoprotein inhibits nerve damage and death induced by high glucose, and can be used for treatment of various peripheral neurological diseases as well as erectile dysfunction.
  • the fusion protein fused with the LRG1 glycoprotein and the Fc domain according to the present invention has excellent erectile dysfunction such as inducing regeneration of penile corpus cavernoid endothelial cells and neurons and increasing penile erectile ability by raising the level of endothelial and neuronal specific proteins. It has an improvement effect.
  • the fusion protein fused with LRG1 glycoprotein and Fc domain has a vascular and neuronal regeneration effect. Therefore, the fusion protein fused with the LRG1 glycoprotein and the Fc domain according to the present invention can be used for the prevention or treatment of erectile dysfunction, ischemic diseases and peripheral neurological diseases.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
  • Vitamin B6 0.5 mg
  • composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixture is a composition suitable for a relatively strong food in a preferred embodiment, but the formulation ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method.
  • the granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.

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Abstract

본 발명은 LRG1 당단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질은 내피세포 및 신경세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 해면체 내피세포 및 신경세포의 재생을 유도하고 음경 발기력을 증가시키는 등 우수한 발기부전 개선 효과를 가지고 있는바, 발기부전의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질은 혈관 및 신경 재생 효과를 가지고 있어, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

LRG1 당단백질을 포함하는 융합 단백질을 함유하는 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 LRG1 당단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
발기부전은 남성 성기능 장애의 일종으로서, 남성의 성기가 발기되지 않거나 발기 상태가 지속되지 않아 성행위를 할 수 없는 현상이다. 발기부전의 원인은 크게 심인성 원인과 기질성 원인으로 구별된다. 심인성 발기부전은 심리적, 정신적 영향에 의한 교감신경의 과다한 작용으로 인한 노르아드레날린(noradrenaline)의 과도한 분비, 음경해면체 평활근 긴장도 증가, 신경 전달물질의 분비 억제 등에 기인한다.
기질성 발기 부전은 그 원인에 따라, 신경인성, 혈관성 및 내분비성 발기부전으로 분류된다. 상기 혈관성 및 신경인성 발기부전은 고지질혈증, 당뇨, 고혈압, 흡연, 전신 심혈관질환, 척수손상, 음경신경손상 등으로 인해서 음경 해면체 및 혈관내피세포, 음경신경세포가 손상되어 이들 세포에서 일산화질소(nitric oxide: NO) 등의 이완성 물질의 분비가 원활하지 않아 생기는 장애이다.
최근 발기부전에 관한 연구는 기질성 원인에 더 비중을 두고 있고, 그의 치료로서 주로 비아그라(viagra, 성분명: 실데나필)를 포함한 경구용 PDE-5(phosphodiesterase-5) 저해제가 전세계적으로 사용되고 있다. 이러한 경구용 약물은 음경해면체에 특이적으로 분포하는 PDE-5의 저해에 의한 cGMP의 농도를 증가시킴으로써 음경해면체 내 혈류를 증대시켜 발기를 유도하여 발기부전의 치료효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 비아그라와 같은 PDE-5 저해제 계열의 약물들은 두통, 안면홍조, 소화불량, 및 심장마비 등 여러 가지 부작용을 가지고 있다고 보고되고 있을 뿐만 아니라, 분자적 수준에서 일시적인 단백질 발현 및 관련 인자들을 조절하는 것으로 근본적인 치료라 할 수 없다. 더욱이 당뇨 또는 음경신경손상에 의한 발기부전의 경우, 이와 같은 치료 효과가 잘 나타나지 않을 뿐만 아니라, 설령 효과가 있다 해도 그 효능이 장기간 지속되지 못한다는 단점이 있다. 따라서, 발기부전 음경 내의 비정상화된 해면체 구조를 근본적으로 치료하고, 그 효능도 장시간 지속되는 발기부전 치료제의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 허혈(Ischemia)이란 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈류 공급 감소 상태를 말하며, 궁극적으로 비가역적인 손상, 즉 세포 및 조직의 괴사로 이어지게 된다. 특히, 심장, 신장, 뇌는 혈류 공급 부족에 가장 민감한 신체 기관으로서, 예를 들어, 뇌졸중 또는 두부 손상 등에 의하여 뇌 조직 상에 허혈이 발생하면 허혈성 캐스캐이드라고 불리우는 일련의 과정들이 촉발되어 뇌 조직이 영구적으로 손상된다. 허혈은 여러 가지 원인에 의하여 야기될 수 있으며, 예를 들면, 심장의 비정상적인 빠른 박동, 저혈압, 혈관 외부로부터의 혈관 압박(예를 들어, 혈관 외부의 암에 의한 혈관 압박), 혈전, 색전증, 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 일과성 심장발작, 사고로 인한 뇌혈관 손상, 뇌일혈, 뇌경색, 동정맥 기형, 말초 동맥 폐색 질환 등에 의하여 허혈 증상이 나타날 수 있다.
허혈성 질환이란, 상기와 같은 허혈 증상을 나타내는 질환으로서, 관련되는 신체기관에 따라 뇌허혈, 심장허혈, 망막허혈, 심한사지허혈(critical limb ischemia), 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증 및 심근비대증 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 심장 근육에 혈류 공급이 불충분할 때 발생하는 심장 허혈은 협심증과 같은 가슴 통증, 심부전(cardiac failure)을 일으킬 수 있고, 뇌에 불충분한 혈류 공급으로 인하여 발생하는 뇌 허혈은 급성 허혈성 뇌졸중 또는 만성 뇌 허혈로 인한 혈관성 치매(vascular dementia)의 원인이 될 수 있다. 대장 또는 소장의 허혈은 허혈성 대장염 또는 장간막허혈을 야기할 수 있고, 피부로의 혈류 공급이 감소한 경우 반점성 피부 변색이 발생할 수 있다. 또한, 혈관이 부실함에 기인하여 신체 말단으로의 혈류공급이 불충분하여 사지절단술을 받아야만 하는 심한 사지 허혈(critical limb ischemia)을 야기할 수 있고, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 당뇨성 신경장애(diabetic neuropathy), 당뇨병성 혈관심장질환을 포함할 수 있다. 상기와 같은 허혈성 질환의 치료를 위하여 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈류 공급 감소 상태를 해소하기 위한 혈관생성(angiogenesis)을 이용하는 방법이 연구되어 왔다.
한편, 신경병증이란 신경계의 구조적 혹은 기능적 이상으로 발생되는 질환이다. 신경계는 뇌, 척수에 분포하여 그 기능의 조절에 관여하는 중추신경계와 뇌, 척수를 제외한 체내의 거의 모든 기관에 분포하여 그 기능의 조절에 관여하는 말초신경계로 나뉘어 진다. 말초신경계는 다시 운동신경계, 감각신경계, 자율신경계로 분류된다. 뇌와 척수에서 신경돌기(neurite)들이 뻗어 나와 몸통, 팔, 다리로 가게 되는데 이를 말초신경이라고 한다. 말초신경은 손, 발, 청각기관에서 느낀 감각을 중추신경(뇌와 척수)에 전하고, 중추신경의 명령을 근육에 전달하는 역할을 한다.
말초신경은 여러 가지 원인에 의해서 손상을 받게 되는데 이러한 경우를 통칭하여 말초 신경병증(peripheral neuropathy)이라고 한다. 하나의 말초신경만 손상을 받는 경우를 단신경병증(mono neuropathy)이라고 하고, 여러 말초신경이 비슷한 정도로 손상되는 경우를 다발성 신경병증(multiple neuropathy)이라고 한다. 신경병증의 원인은 여러 가지가 있는데 크게 나누어 보면 대사성 질환(당뇨병, 신부전증, 갑상선 기능저하증), 약물(항암제, 결핵약)이나 독성물질중독(납, 유기용매), 영양결핍(비타민 부족, 알코올중독), 결체조직질환(류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 낭창 등), 염증성 질환(길랑-바레 증후군), 유전성 신경병 등이 있다. 그 외에 암과도 연관되어 나타나기도 한다.
한편, LRG1은 8개의 류신 중복성 부위 (leucine-rich repeat; LRR)를 가지는 혈청 당단백질로, LRR 모티프를 가진 단백질의 경우, 신호전달 및 세포 부착 등 다양한 세포 내 작용에 관여함이 알려져 있다. 세포 내 여러 다양한 작용을 하는 다른 LRR 패밀리 단백질과는 달리, LRG1 당단백질에 대한 기능은 거의 알려진 바가 없고, 다양한 염증성 질환 및 과립구 (granulocyte)의 분화 과정 동안 그 발현이 증가됨이 보고되어 있을 뿐이다. 최근에는 마우스 망막혈관에서 LRG1 당단백질이 TGF를 매개로 하는 신호전달 경로에 작용하여 혈관 내피세포의 증식 및 이동을 통한 혈관생성을 유도함이 보고되었다 (X Wang et al., Nature, 499 (7458), pp306-311, 2013). 그러나 LRG1 당단백질과 음경발기의 관계 및 이의 발기부전 예방 또는 치료 효과에 대해서는 알려진 바 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 상태이다.
이에 본 발명자들은 새로운 단백질 의약품 개발하기 위해 연구를 수행한 결과, LRG1 당단백질 및 Fc 도메인과 융합된 LRG1-Fc 융합 단백질이 음경 해면체 내피세포 및 신경 세포의 재생을 유도하여 음경 발기력을 증가시키고, 우수한 혈관 및 신경 재생 효과를 보임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질과 Fc 도메인이 융합된 LRG1-Fc 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질과 Fc 도메인이 융합된 LRG1-Fc 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 말초 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발기부전의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 말초 신경질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질은 내피세포 및 신경세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 해면체 내피세포 및 신경세포의 재생을 유도하고 음경 발기력을 증가시키는 등 우수한 발기부전 개선 효과를 가지고 있는바, 발기부전의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질은 혈관 및 신경 재생 효과를 가지고 있어, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 재조합 벡터를 곤충세포에서 발현시킨 후, 분리한 LRG1-Fc 융합 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 재조합 벡터를 포유동물 세포에서 발현시킨 후, 분리한 LRG1-Fc 융합 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 인간 유래 LRG1 당단백질을 인간 IgG1의 Fc 도메인과 링커로 연결한 LRG1-Fc 융합 단백질의 개략도이다 (신호 펩타이드(1~28)-인간 LRG1(29~340)-링커 (AAA)(341~343)-Fc 도메인(344~570, 인간 IgG1)).
도 4는 마우스 유래 LRG1 당단백질을 인간 IgG1의 Fc 도메인과 링커로 연결 한 LRG1-Fc 융합 단백질의 개략도이다 (신호 펩타이드(1~28)-마우스 LRG1(29~338)- 링커(AAA)(339~341)-Fc 도메인(342~568, 인간 IgG1)).
도 5는 당뇨성 발기부전 마우스 모델에서 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 투여에 의한 음경신경 전기자극에 따른 음경해면체 내압(발기력) 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 음경신경손상 발기부전 마우스 모델에서 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 투여에 의한 음경신경 전기자극에 따른 음경해면체 내압(발기력) 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 당뇨성 발기부전 마우스 모델의 음경해면체 조직에서 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 투여에 의한 혈관내피세포 특이적 단백질인 혈소판-내피세포 부착 분자- 1(PECAM-1: Platelet/Endothelial Cell Adhesion Molucule-1) 및 증식 세포 표지 인자인 BrdU (5-bromo-2-deoxyuridine)의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 당뇨성 발기부전 마우스 모델 음경 조직의 배부신경에서 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 투여에 의한 신경성산화질소생성효소(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 당뇨성 발기부전 마우스 모델 음경 조직의 음경해면체 내에서 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 투여에 의한 신경성산화질소생성효소(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 당뇨성 발기부전 마우스 모델 음경 조직의 음경해면체 내에서 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 투여에 의한 다양한 신경재생 특이적 단백질 및 그 수용체의 발현 정도를 웨스턴블롯으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 고혈당으로 허혈을 유도한 HUVEC 및 마우스 음경해면체 내피세포(MCECs: Mouse Cavernous Endothelial Cells)에서 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 처리에 따른 튜브 형성 정도를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 고혈당으로 허혈을 유도한 대동맥 절편 (aortic ring)에서 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 처리에 따른 미세 혈관신생 정도를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 정상 마우스의 주골반신경절(major pelvic ganglion, MPG)을 고혈당 조건에서 배양함으로써 말초 신경질환 모델을 만든 후, 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 처리에 따른 신경세포 특이적인 단백질인 신경미세섬유(neurofilament) 및 베타-III 튜뷸린의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 정상 마우스의 후근신경절(dorsal root ganglion, DRG)을 고혈당 조건에서 배양함으로써 말초 신경질환 모델을 만든 후, 인간 LRG1-Fc 융합 단백질 처리에 따른 신경세포 특이적인 단백질인 베타-III 튜뷸린의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질과 Fc 도메인이 융합된 LRG1-Fc 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에서 “LRG1(Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1)”은 8개의 류신 중복성 부위 (leucine-rich repeat; LRR)를 가지는 혈청 당단백질을 의미하는 것으로, 인간, 마우스 등 다양한 포유동물 유래의 LRG1 당단백질을 모두 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 LRG1 당단백질은 바람직하게는 인간 또는 마우스 유래로서 예를 들어, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.
상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명의 LRG1 당단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 LRG1 당단백질의 변이체란 LRG1 당단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 LRG1 당단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
본 발명의 LRG1 당단백질은 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열로 암호화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동등한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
상기 “기능적으로 동등한”이란 염기의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열에 의해 코딩된 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 코딩할 수 있는 염기서열을 의미한다. 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 상기 LRG1 당단백질을 코딩하는 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.
본 발명에서 “Fc 도메인”은 Ig(immunoglobulin, 면역글로불린)의 Fc 도메인을 의미한다. 상기 Ig의 Fc 도메인은 Ig의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분이 포함될 수 있다. 상기 Ig의 Fc 도메인은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, Ig의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 또한 상기 Ig의 Fc 도메인에는 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 포함된다.
본 발명에서, Ig는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM을 포함하며, 바람직하게는 IgG이다. 상기 IgG는 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 랫트, 기니피그 등의 포유동물 유래일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이다. 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하며, 바람직하게는 IgG1이다.
본 발명에 따른 일실시예에서는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 IgG1의 Fc 도메인을 이용하였다. 상기 인간 IgG1의 Fc 도메인은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 암호화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동등한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 융합 단백질은 LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질과 Fc 도메인이 링커로 연결된 형태일 수 있다.
본 발명에서, "링커(linker)"란 기본적으로는 두 개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소 결합, 정전기적 상호작용, 반데르 바알스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미하는데, 바람직하게는 펩타이드 링커이다.
상기 펩타이드 링커는 임의의 아미노산 서열을 가진 펩타이드로서, 기능기를 갖지 않으며 크기가 작은 아미노산이 적합하며, 바람직하게는 알라닌, 글라이신 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 LRG1 당단백질 및 Fc 도메인과의 결합능을 방해하지 않으며, 적절한 배양성을 유지할 수 있도록 유연성을 줄 수 있는 개수의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 1 내지 수십개의 아미노산으로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 LRG1-Fc 융합 단백질은 예를 들어, 서열번호 7 또는 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명에 따른 Fc 도메인은 혈관내피세포 표면의 FcRN(neonatal Fc-receptor)과 결합하는데, 낮은 pH에서는 FcRN에 결합하고 중성 pH에서는 분리되는 특성을 가진다. 이러한 특성에 의하여 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질은 혈관내피세포로 엔도시토시스 되고, 다시 엑소시토시스 되어 혈액 내로 배출되는 특성을 가지고, 이로 인해 융합 단백질의 혈액 내 반감기가 현저히 늘어나는 장점을 가진다. 또한, Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질은 Fc 도메인과의 융합에 의해 수용성 및 안전성을 개선하는 효과를 내며, 약물의 생산 측면에서도 정제 및 분리가 간편하여 생산비용을 절약할 수 있는바, LRG1 당단백질만을 이용할 때에 비해 장점을 가지고 있다.
또한, 본 발명은 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 전사, 번역 과정을 거쳐 본 발명의 LRG1-Fc 융합 단백질을 암호화하는 것이라면 제한 없이 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 추가적으로 발현된 단백질의 분비를 위한 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 신호 펩타이드 서열은 단백질의 발현 및 정제 과정 후에는 절단되어 제거되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 LRG1-Fc 융합 단백질은 예를 들어, 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드와 기능적으로 동등한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현벡터이며, 상기 발현벡터란, 목적하는 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
상기 발현 벡터는 융합 단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 "태그(tag)"란, 정량 가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광 분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 본 발명의 융합 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
상기 세포는 본 발명의 융합 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에 따른 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질은 내피세포 및 신경세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 해면체 내피세포 및 신경세포의 재생을 유도하고 음경 발기력을 증가시키는 등 우수한 발기부전 개선 효과를 가지고 있다. 또한, 본 발명에 따른 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질은 혈관 및 신경 재생 효과를 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질은 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
이에 본 발명은 LRG1 당단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 의약외품 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발기부전의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRG1 당단백질 또는 상기 LRG1-Fc 융합 단백질을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 말초 신경질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 이용하여 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 증상을 차단하거나, 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명의 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 이용하여 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "발기부전"은 성생활에 충분한 발기가 되지 않거나 유지되지 않은 상태를 의미하며, 일반적으로 이러한 상태가 3개월 이상 지속되었을 경우 발기부전으로 정의한다. 상기 발기부전은 심리적인 요인에 기인하는 심인성 발기부전과 육체적인 장애에 기인하는 기질성 발기부전으로 크게 나눌 수 있으며, 본 발명의 LRG1 당단백질 또는 LRG1-Fc 융합 단백질은 궁극적으로 음경의 기능을 개선시켜 심인성 및 기질성 발기부전을 모두 치료할 수 있다. 상기 기질성 발기부전은 당뇨병, 음경조직손상, 관상동맥질환, 신장병증, 신경병증, 고혈압, 동맥경화 또는 고지혈증 등의 질병에 의한 것일 수 있으나, 상기 예시에 한정되는 것이 아니며 발기에 영향을 줄 수 있는 질병이라면 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어, "해면체"는 포유류의 음경이나 음핵의 주체를 이루는 발기조직으로, 주위가 탄성섬유를 함유하는 두껍고 튼튼한 결합조직의 막으로 쌓여 있으며, 이 막이 내부로 들어가 있어 해면상의 작은 방을 이루고 있다. 남성의 음경 내부에는 좌우에 2개의 음경 해면체와 그 아래쪽에 1개의 요도 해면체가 있고, 여성에게는 음경 해면체와 비슷한 구조를 가진 음핵 해면체와 요도 해면체가 있다. 해면체에 정맥혈이 가득차게 되면 음경이 발기하게 된다. 음경 해면체 평활근과 음경 혈관은 평상시 아드레날린성 교감 신경에 의해 수축 상태에 있으며, 이완에 의한 발기 반응 후, 아드레날린성 교감 신경계의 자극에 의해 다시 수축 상태로 되돌아온다. 이렇듯 발기조직은 평상시 수축 상태를 유지하지만, 성적 각성시 뇌 중추에서 보내는 신호와 신경계의 자극, 체 내 및 발기조직 내의 여러 신경 전달 물질 및 호르몬 등에 의해 발기조직이 이완되고, 발기가 시작되며, 발기가 유지된다. 이러한 발기반응이 끝난 후, 다시 발기조직은 수축 상태를 유지하게 된다.
본 발명에서 용어, “허혈성 질환”은 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈류 공급 감소 상태를 나타내는 질환을 의미하는 것으로, 관련되는 신체 기관 또는 원인에 따라 심근경색, 뇌경색, 허혈성 급성신부전증, 허혈성 급성간부전증, 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 신증, 허혈성 대장염, 심근비대증, 외과수술 부작용에 기인한 허혈성 질환 또는 기관 조직 손상 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 상기 외과수술 부작용에 기인한 허혈성 질환은 허혈성 심부전, 허혈성 신부전, 허혈성 간부전 또는 허혈성 뇌졸중 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 상기 기관 조직 손상은 허혈 후 재관류를 동반하는 장기 수술 또는 이식, 외상성 절단사지 재접합으로 인한 것을 포함한다. 상기 장기는 신장, 간장, 췌장, 폐 또는 심장 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, “말초 신경질환”은 말초 신경의 손상 또는 사멸에 의해 발생하는 질환을 의미하는 것으로, 말초신경손상, 당뇨성 신경병증(당뇨성 말초신경병증) 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 상기 당뇨성 신경병증은 당뇨 합병증의 하나로 고혈당에 동반되는 신경세포의 대사 이상 또는 영양 혈관의 장애 등에 의해 발생하며, 대칭성 말초성 다발신경장애, 당뇨병성 근육위축증, 단신경장애형 신경장애, 자율신경장애, 무통성 심근허혈, 운동 장애등의 증상을 나타낸다.
본 발명의 조성물이 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료를 목적으로 약학적 조성물로 제형화 될 경우, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러나 경구 투여 시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 LRG1 당단백질과 함께 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약외품 조성물로 사용할 경우, 상기 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 용어, '건강기능식품'이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. LRG1 당단백질의 제조
LRG1 당단백질은 공지된 인간 유래 LRG1 당단백질 또는 마우스 유래 LRG1 당단백질의 아미노산 서열 정보를 기반으로 합성 및 정제하여 이용하였다. 실험에 이용된 인간 유래 LRG1 당단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며, 마우스 유래 LRG1 당단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시된다. 이때, LRG1 당단백질의 오리지널 신호 펩타이드의 서열은 MSSWSRQRPKSPGGIQPHVSRTLFLLLLLAASAWG(서열번호 13)인데, 발현을 용이하게 하기 위해 발현벡터의 신호 펩타이드인 MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGS(서열번호 11)를 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열에 붙여 사용하였다.
실시예 2. LRG1 당단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 제조
Fc 도메인은 혈관내피세포 표면의 FcRN(neonatal Fc-receptor)과 결합하는데, 낮은 pH에서는 FcRN에 결합하고 중성 pH에서는 분리되는 특성을 가진다. 이러한 특성에 의하여 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질은 혈관내피세포로 엔도시토시스 되고, 다시 엑소시토시스 되어 혈액 내로 배출되는 특성을 가지고, 이로 인해 융합 단백질의 혈액 내 반감기가 현저히 늘어나는 장점을 가진다. 또한, Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질은 Fc 도메인과의 융합에 의해 수용성 및 안전성을 개선하는 효과를 내며, 약물의 생산 측면에서도 정제 및 분리가 간편하여 생산비용을 절약할 수 있는바, LRG1 당단백질만을 이용할 때에 비해 장점을 가지고 있다.
상기와 같은 배경하에서, 실시예 1의 LRG1 당단백질의 의약 용도로서의 활용 가능성을 높이기 위하여 Fc 도메인과의 융합 단백질을 제조하였으며, 이를 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
2-1. 곤충 세포에서의 발현 및 분리
먼저, 신호 펩타이드, LRG1 당단백질 및 인간 IgG1의 Fc 도메인을 포함하는 유전자를 pVL1391 벡터에 삽입하였다. 이때 LRG1 당단백질과 인간 IgG1의 Fc 도메인은 링커(AAA)로 연결하였다. 신호 펩타이드로는 발현벡터의 신호 펩타이드인 MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGS(서열번호 11)를 이용하였다. 상기 융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 SF9 세포를 활용하여 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질 생산용 배큘로바이러스를 제작하였다. 상기 재조합 배큘로바이러스를 단백질 발현용 Hi5 세포에 감염시켰다. 4일 후 Hi5 세포에서 발현된 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질이 배지로 분비되었으며, 이를 분리, 정제하였다. 보다 구체적으로, LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질이 포함된 Hi5 세포의 배양배지를 Protein A 레진에 로딩하였다. 레진에 결합한 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 0.1M 글라이신 완충액(pH 2.7)으로 용출하였다. LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질이 포함된 용출 분획을 1M Tris 완충액(pH8.0)으로 중화하였다(최종 Tris pH8.0 완충액의 농도는 100mM임). 정제 분리된 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 농축하고, 탈염 컬럼(desalting column)을 이용하여 PBS로 완충액 교환을 수행하였다. 최종적으로 농도 2mg/ml의 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 이후 실험에 이용하였다. 상기 레진에 결합한 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 용출한 후, SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 이를 도 1에 나타내었다.
2-2. 포유동물 세포에서의 발현 및 분리
먼저, 신호펩타이드, LRG1 당단백질 및 인간 IgG1의 Fc 도메인을 포함하는 유전자를 pcDNA3.1 벡터에 삽입하였다. 이때 LRG1 당단백질과 인간 IgG1의 Fc 도메인은 링커(AAA)로 연결하였다. 신호 펩타이드로는 발현벡터의 신호 펩타이드인 MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGS (서열번호 11)를 이용하였다. 상기 융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 Expi293F 세포에 트렌스펙션하였다. 4일 후, Expi293F 세포에서 발현된 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질이 배지로 분비되었으며, 이를 분리, 정제하였다. 보다 구체적으로, LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질이 포함된 Expi293F 세포의 배양배지를 Protein A 레진에 로딩하였다. 레진에 결합한 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 0.1M 글라이신 완충액(pH 2.7)으로 용출하였다. LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질이 포함된 용출 분획을 1M Tris 완충액(pH9.0)으로 중화하였다(최종 Tris pH9.0 완충액의 농도는 100mM임). 정제 분리된 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 투석을 통해 PBS로 완충액 교환을 수행하였으며, 최종적으로 농도 2.8mg/ml가 되도록 농축하고 이후 실험에 이용하였다. 상기 용출한 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 이를 도 2에 나타내었다.
2-3. 서열 분석
상기 실시예 2-1 또는 2-2와 동일한 방법으로 인간 유래 LRG1 당단백질(서열번호 1) 및 인간 IgG1의 Fc 도메인(서열번호 3)을 포함하는 융합 단백질과, 마우스 유래 LRG1 당단백질(서열번호 2) 및 인간 IgG1의 Fc 도메인(서열번호 3)을 포함하는 융합 단백질을 각각 제조하였으며, 이의 아미노산 서열 분석을 수행하였다.
인간 유래 LRG1 당단백질을 인간 IgG1의 Fc 도메인과 링커로 연결한 융합 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되며, 마우스 유래 LRG1 당단백질을 인간 IgG1의 Fc 도메인과 링커로 연결한 융합 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시된다. 상기 서열에는 28개의 아미노산(MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGS, 서열번호 11)으로 구성된 신호 펩타이드는 포함되어 있지 않으며, 신호 펩타이드는 LRG1 당단백질의 N-말단의 앞쪽에 위치해있다. 상기 융합 단백질의 개략도를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
실험예 1. LRG1 당단백질의 발기부전 치료 효과 검증
1-1. 당뇨성 발기부전 동물모델의 디자인
생후 2개월 된 수컷 마우스(C57BL/6)에 스트렙토조토신 (streptozotocin)을 투여하여 당뇨병에 의한 발기부전을 유도하였으며, 하기와 같이 총 4 개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다 (N = 10/군):
1군- 정상 마우스;
2군- 스트렙토조토신을 이용한 당뇨 유도[50 mg/kg 농도로 5일 연속으로 복강 내 투여 후 8주째 된 마우스];
3군- 스트렙토조토신을 이용한 당뇨 유도[50 mg/kg 농도로 5일 연속으로 복강 내 투여 후 8주째 된 마우스] + 음경해면체에 PBS(phosphate-buffered solution)[20 μL]를 투여한 마우스;
4군- 스트렙토조토신을 이용한 당뇨 유도[50 mg/kg 농도로 5일 연속으로 복강 내 투여 후 8주째 된 마우스] + 음경해면체에 실시예 2에서 수득한 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 2번 주사[day -3, 0; 5 μg/20 μL]한 마우스.
1-2. 음경 신경손상 발기부전 동물모델의 디자인
생후 3개월 된 수컷 마우스(C57BL/6)에 겸자로 양측 음경신경에 약 2분간 압착손상을 가해서 음경신경손상에 의한 발기부전을 유도하였으며, 하기와 같이 총 3 개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다 (N = 6/군):
1군- 샴 수술 [sham operation] 마우스;
2군- 음경신경손상 마우스 + 음경해면체에 PBS(phosphate-buffered solution)[20 μL]를 투여한 마우스;
3군- 음경신경손상 마우스 + 음경해면체에 실시예 2에서 수득한 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 2번 주사[day -3, 0; 5 μg/20 μL]한 마우스.
1-3. 전기 자극에 따른 발기력 측정
상기 실시예 1-1 및 1-2과 같이 발기부전 동물모델의 음경해면체에 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 주사하고 2주 후에 음경해면체의 신경을 자극하고 발기력을 측정하였다. 보다 구체적으로, 발기력 측정을 위하여, 각 마우스의 하복부에서 좌측 표피부분을 개복하고, 전립선의 후외측에 위치한 음경해면체신경(음경신경)이 잘 보이도록 준비하였다. 음경신경의 전기자극을 위해서 백금 전극을 음경신경에 위치시킨 후, 5 볼트, 12 헤르츠의 강도로 약 1분 동안 전기 자극을 가하였다. 전기자극을 가하게 되면, 음경은 발기를 하게 된다. 이때 발기 시 음경 내부의 압력(음경해면체 내압)을 음경해면체에 삽입된 카테터를 통해 컴퓨터와 연결되어 있는 압력 전달기(바이오스팩 시스템, 미국)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5A 및 6A에서의 세로축의 ICP (Intracavernous Pressure: 음경해면체내 압력)는 발기 시 음경 내부의 압력(음경해면체 내압)을 의미하며, 일반적으로 발기력을 나타내는 지표이다. 도 5A 및 6A에서의 가로축은 전기자극 후의 시간을 나타내며, 1분간의 전기자극 기간은 가로축에 검정색 막대로 표시하였다.
또한, 도 5B 및 6B는 최고 음경해면체 내압 (Maximal ICP)을 평균 수축기 혈압 (MSBP)으로 나눈 값을 나타낸 것이고, 도5C 및 6C는 음경해면체 내압 곡선의 면적 (Total ICP[area under the curve])을 평균 수축기 혈압 (MSBP)으로 나눈 값을 나타낸 것으로 이는 혈압 자체가 음경해면체 내압에 영향을 줄 수 있기 때문에 발기력을 측정하기 위해 확인하는 값이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 투여한 군(LRG1)은 비처리 당뇨군(NT) 및 PBS 투여군(PBS)에 비해 높은 발기력 개선효과를 보였으며, 정상 대조군(Control)의 약 90% 정도까지 발기력이 회복됨을 확인하였다. 특히, 음경발기와 관련한 두 가지 변수, 즉 최고 음경해면체 내압과 음경압력곡선의 면적이 LRG1 당단백질 투여 후 현저한 상승 효과를 나타냄을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 투여한 군(LRG1)은 음경신경손상 발기부전 동물모델에서도 당뇨성 발기부전 동물모델의 결과와 마찬가지로 최고 음경해면체 내압과 음경압력곡선의 면적이 증가하는 등 샴 (Sham) 수술군에 비해 현저하게 개선된 발기력을 보임을 확인하였다.
1-4. 음경해면체 및 음경 배부 신경에서 혈관내피세포 특이적 단백질 및 신경성산화질소생성효소의 발현에 미치는 영향 분석
음경은 음경발기의 기능을 담당하는 해면체 조직과 이에 영양을 공급하는 소혈관들로 이루어져 있다. 그러나 당뇨, 고지질증, 신경손상 등에 의한 병적 조건하에서는 이러한 혈관과 신경을 포함한 해면체 조직에 병변이 생기고 상기 조직의 구조가 비정상적으로 되어 발기부전을 초래한다.
상기 실시예 1-1의 당뇨성 발기부전 동물모델의 음경해면체 및 음경 배부 신경에서 혈관내피세포 특이적 단백질인 혈소판-내피세포 부착 분자-1(PECAM-1), 세포 증식 표지 인자인 BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine), 및 신경성산화질소생성효소(nNOS)의 발현 정도를 분석하기 위하여, 면역조직화학염색 후 공초점 현미경을 이용하여 혈관내피세포의 양적 변화, 혈관내피세포의 핵 속에 표지 된 BrdU의 양적 변화 및 신경성산화질소생성효소의 양적 변화를 조사하였다.
보다 구체적으로, 각 마우스의 음경 조직으로부터 음경 배부 신경 및 음경 해면체를 분리한 후, 이를 4% 파라포름알데히드에서 4℃, 24 시간 동안 고정하였다. 상기 조직을 동결용 포매제를 이용하여 고정시킨 후, 동결 절편기에서 7㎛ 두께로 잘라 조직 절편을 준비하였다. 다음으로, 준비된 조직 절편을 슬라이드 상에 올리고 PECAM-1, BrdU 및 nNOS의 발현 분석을 위해 4% 파라포름알데히드에서 약 5분간 고정시켰다. 고정된 음경조직 절편을 세척 버퍼(2% FBS + 0.1% Sodium Azide in PBS)로 3회 세척한 후, 비특이적 단백질 차단 버퍼(5% BSA in PBS)로 1시간 동안 블락킹하였다. 그 후, 1차 항체(항-PECAM-1 햄스터 항체, 항-BrdU 랫트 항체, 1:100, 항-nNOS 랫트 항체)와 함께 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 남아 있는 항체를 제거하기 위해서 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 2차 항체(FITC-표지된 항-햄스터 항체 또는 TRITC-표지된 항-랫트 항체, 1:1000)와 함께 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 남아있는 항체를 제거하기 위해 세척 버퍼로 다시 2회 세척한 후 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; 2 ㎍/㎖)를 넣고 5분간 상온에서 반응시켜서 세포 핵을 염색시켰다. 다시 세척 완충액으로 2 회 세척한 후에 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 7 내지 9에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 비처리 당뇨군(DM) 또는 PBS 투여군(DM+PBS)의 음경해면체 조직에서는 정상 마우스 (Control)에 비해 혈관내피세포의 수가 현저하게 감소되어 있으나, 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 투여한 군(DM+LRG1)의 음경해면체 조직에서는 대조군(DM 또는 DM+PBS)에 비해 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM-1의 발현이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 비처리 당뇨군(DM) 또는 PBS 투여군 (DM+PBS)의 음경 배부신경과 음경해면체 조직에서는 정상 마우스(Control)에 비해 신경성산화질소생성효소(nNOS)의 발현이 현저하게 감소되어 있으나, 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 투여한 군(DM+LRG1)의 음경 배부신경과 음경해면체 조직에서는 대조군(DM 또는 DM+PBS)에 비해 신경성산화질소생성효소의 발현이 증가함을 확인하였다.
1-5. 음경해면체 조직에서 신경 재생 관련 단백질 발현에 미치는 영향 분석
인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질이 신경재생에 미치는 영향을 규명하기 위하여, 상기 실험예 1-1의 당뇨성 발기부전 동물모델의 음경해면체 조직에서 신경성장인자 (nerve growth factor, NGF), 뉴로트로핀-3 (neurotrophin-3, NT-3), 뇌-유래 신경영양인자 (brain-derived neutrophic factor, BDNF), 및 신경성장인자의 수용체인 TrkA 단백질 발현 정도를 확인하였다.
보다 구체적으로, 각 마우스로부터 분리한 음경 해면체 조직을 PBS로 완전하게 세척한 다음 단백질 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)이 포함된 세포 분해 완충액(RIPA buffer)을 넣고 용해시킨 후, 4℃에서 13,000rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액만 회수하였다. 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 이용하여 상기 용해물 내 단백질 농도를 측정하였다. 추출된 단백질들을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 전기영동한 후, 겔 속에 있던 단백질들을 니트로셀로로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시키고, 5% 탈지유(skim milk)로 차단(blocking) 하였다. 그리고 신경성장인자 (nerve growth factor, NGF), 뉴로트로핀-3 (neurotrophin-3, NT-3), 뇌-유래 신경영양인자 (brain-derived neutrophic factor, BDNF), 및 신경성장인자의 수용체인 TrkA에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 16시간 반응시켰다. 그 후 남아 있는 항체를 제거하기 위해서 세척 완충액으로 다시 3회 세척한 다음, 2차 항체(HRP-labeled anti-mouse or HRP-labeled anti-rabbit antibody, 1:200)와 함께 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 남아있는 항체를 제거하기 위해 세척 완충액으로 다시 3회 세척한 후에 발색시켰다. 단백질 발현 정량을 위한 하우스키핑 단백질로는 β-액틴을 이용하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, PBS 투여군(DM+PBS)의 음경해면체 조직에서는 정상 마우스 (Control)에 비해 신경성장인자, 뉴로트로핀-3, 뇌-유래 신경영양인자 및 신경성장인자의 수용체인 TrkA의 발현이 감소되어 있으나, 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질을 투여한 군(DM+LRG1)의 음경해면체 조직에서는 상기 신경재생 특이적 단백질의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, LRG1 당단백질은 당뇨 또는 음경 손상 등에 의하여 감소된 신경세포의 재생을 유도함으로써, 그에 따라 발기력 회복 효과를 나타냄을 확인하였다.
실험예 2. LRG1 당단백질의 허혈성 질환 치료 효과 검증
2-1. 혈관내피세포를 이용한 혈관 형성 유도 효과 분석
관형성 (tube formation) 단계는 혈관신생 과정 중 이동, 증식한 내피세포들이 분열을 계속하여 속이 빈 튜브 모양으로 성장하여 최종 혈관으로 분화하고 여기에 혈액이 들어가 혈관 생성이 완성되는 단계이다.
LRG1 당단백질이 발기부전뿐 아니라 다른 다양한 허혈성 질환의 치료에 이용될 수 있는지를 확인하기 위하여, 관형성능(tube formation)에 미치는 영향을 분석하였다. 이를 위해 HUVEC과 마우스 음경해면체 내피세포 (MCECs: Mouse Cavernous Endothelial Cells)를 사용하여 실험을 수행하였다. 각 세포는 정상 범위의 혈당 수치와 유사한 5mM 글루코스 (Normal glucose), 및 고혈당 수치에 해당하는 30 mM 글루코스(High glucose) 조건에서 48 시간 동안 노출시켰으며, 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질(0.2 ㎍/㎖ 또는 2 ㎍/㎖)을 글루코스와 동시에 48 시간 동안 처리하였다. 대조군은 글루코스와 동시에 PBS를 처리하였다. 여기서 고농도 글루코스는 허혈성 질환의 원인 중 하나로서 in vitro에서 허혈성 질환 모델을 제조하기 위한 공지 방법 중의 하나이다.
보다 구체적으로, 마트리겔(Matrigel)이 코팅된 세포 배양 접시에 정상 농도 글루코스, 고농도 글루코스, 그리고 고농도 글루코스와 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질에 노출시킨 HUVEC 및 마우스 음경해면체 내피세포를 3 × 105 cells/㎠만큼 넣고, 튜브 형성을 위해 각각 8 시간 또는 16 시간 동안 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, 현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 고농도 글루코스에 노출된 HUVEC 및 마우스 음경해면체 내피세포(MCECs)는 정상 농도 글루코스(Normal glucose) 처리군에 비해 튜브 형성 정도가 현저하게 감소되어 있었다. 반면, 고농도 글루코스와 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질에 함께 노출된 HUVEC 및 마우스 음경해면체 내피세포(MCECs)에서는 튜브 형성이 현저하게 증가하였다. 이는 LRG1 당단백질이 당뇨로 인해 활성이 저해된 혈관내피세포 또는 해면체 내피세포의 분화에 영향을 주어 혈관 및 해면체 형성을 유도한다는 것을 의미한다.
2-2. 대동맥 절편을 이용한 혈관 형성 유도 효과 분석
대동맥 절편을 이용한 혈관신생 효과 평가(arotic ring angiogenesis assay)는 치료 후보물질의 혈관신생 능력을 평가하는데 널리 사용되고 있는 방법이며, 이 결과를 토대로 치료 후보물질이 다양한 허혈성 질환에 사용될 수 있는지를 객관적으로 평가할 수 있는 중요한 실험방법이다 (Baker M et al, Nature Protocol, 7: 89, 2012).
LRG1 당단백질의 허혈성 질환 치료 효과를 확인하기 위하여, 대동맥 절편에서 혈관신생에 미치는 영향을 분석하였다. 이를 위해 생후 2개월 된 수컷 마우스(C57BL/6)의 대동맥 절편을 사용하여 실험을 수행하였다. 각 대동맥 절편을 정상 범위의 혈당 수치와 유사한 5 mM 글루코스 (Normal glucose) 및 고혈당 수치에 해당하는 30 mM 글루코스 (High glucose)의 조건에 3일 및 6일간 동안 노출시켰으며, 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질(0.2 ㎍/㎖)을 글루코스와 동시에 3일 또는 6일간 처리하였다. 대조군은 글루코스와 동시에 PBS를 처리하였다.
보다 구체적으로, 마트리겔(Matrigel)이 코팅된 조직 배양 접시에 정상 농도 글루코스, 고농도 글루코스, 그리고 고농도 글루코스와 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질에 노출시킨 대동맥 절편을 넣고, 각각 3일 또는 6일 동안 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, 현미경을 통해 대동맥 절편으로부터 미세 혈관신생을 관찰하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 고농도 글루코스에 노출된 대동맥 절편(PBS)은 정상 농도 글루코스(Normal glucose) 처리군에 비해 미세 혈관신생 정도가 현저하게 감소되어 있음을 알 수 있었다. 반면, 고농도 글루코스와 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질에 함께 노출 시켰던 대동맥 절편에서는 미세 혈관신생이 현저하게 증가하였음을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, LRG1 당단백질은 우수한 혈관신생 유도 효과를 가지고 있는바, 발기부전 치료뿐만 아니라 다양한 허혈성 질환의 치료에도 이용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 3. LRG1 당단백질의 말초 신경질환 치료 효과 검증
주골반신경절 (major pelvic ganglion, MPG)으로부터 음경발기조직을 지배하는 음경신경이 유래되며 이는 발기신호와 관련된 신호전달의 주된 역할을 한다. 한편, 척수의 후근신경절 (dorsal root ganglion)은 중추 구심성 (afferent) 신경경로로서 치료 후보물질의 신경재생 또는 보호 능력을 평가하는 데 널리 사용되고 있는 방법이며, 이 결과를 토대로 치료 후보물질이 다양한 말초 신경질환에 사용될 수 있는지를 객관적으로 평가할 수 있는 중요한 실험방법이다 (Jin GZ et al., Neuroscience Letter, 501: 10, 2011).
LRG1 당단백질이 발기부전뿐 아니라 다른 다양한 허혈성 질환의 치료에 이용될 수 있는지를 확인하기 위하여, 주골반신경절 및 후근신경절에서 신경 재생 효과를 확인하였다. 이를 위해, 정상 마우스로부터 주골반신경절 및 후근신경절을 분리하였다. 적출한 주골반신경절 및 후근신경절을 배양 접시에 놓고 마트리겔을 덮어 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 15분간 배양하여 마트리겔을 굳혔다. 마트리겔이 굳으면 정상 농도 글루코스 (5 mM 글루코스, normal glucose)를 처리하거나, 고농도 글루코스 (30 mM 글루코스, high glucose) 하에 PBS와 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질 (0.2 μg/mL)을 각각 처리하였다. 여기서 고농도 글루코스는 말초 신경질환의 원인 중 하나로서 in vitro에서 말초 신경질환 모델을 제조하기 위한 공지 방법 중의 하나이다. 여기에 2% B-27 혈청-프리 보충제(Supplement), 0.5 mM GlutaMAX-I 보충제가 포함된 neurobasal 배지를 첨가한 후 3일 (주골반신경절) 또는 7일 (후근신경절) 동안 배양하였다. 배양 후 신경미세섬유(neurofilament) 및 βIII-튜뷸린의 발현 분석을 위해 4% 파라포름알데히드에서 약 15분간 고정하였다. 고정 후 비특이적 단백질 차단 버퍼 (5% BSA in PBS)로 1시간 동안 블락킹 하였다. 그 후 1차 항체 (항-neurofilament 마우스 항체, 항-βIII-tubulin 치킨 항체)와 함께 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 남아 있는 항체를 제거하기 위해서 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 2차 항체(FITC-표지된 항-마우스 항체 또는 TRITC-표지된 항-치킨 항체, 1:200)와 함께 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 남아있는 항체를 제거하기 위해 세척 버퍼로 다시 2회 세척한 후, 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 13 및 14에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 고농도 글루코스(High glucose)에 노출된 주골반신경절은 정상 농도 글루코스(Normal glucose) 처리군에 비해 신경세포의 증식이 현저하게 감소되어 있음을 확인하였다. 반면, 고농도 글루코스와 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질에 함께 노출된 주골반신경절은 신경세포의 증식이 현저하게 증가하였다.
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 고농도 글루코스(High glucose)에 노출된 후근신경절은 정상 농도 글루코스(Normal glucose) 처리군에 비해 신경세포의 증식이 현저하게 감소되어 있음을 확인하였다. 반면, 고농도 글루코스와 인간 LRG1-Fc 도메인의 융합 단백질에 함께 노출된 후근신경절은 신경세포의 증식이 현저하게 증가하였다. 이는 LRG1 당단백질이 당뇨로 인해 저해된 신경세포의 분화에 영향을 주어 신경세포의 재생을 유도한다는 것을 의미하다.
이상의 실험 결과를 통하여, LRG1 당단백질은 고농도 글루코스에 의해 유도되는 신경 손상 및 사멸을 억제하는바, 발기부전 치료뿐만 아니라 다양한 말초 신경질환의 치료에도 이용될 수 있음을 확인하였다.
종합적으로 본 발명에 따른 LRG1 당단백질 및 Fc 도메인이 융합된 융합 단백질은 내피세포 및 신경세포 특이적인 단백질의 수준을 음경 해면체 내피세포 및 신경세포의 재생을 유도하고 음경 발기력을 증가시키는 등 우수한 발기부전 개선 효과를 가지고 있다. 또한, 본 발명에 따른 LRG1 당단백질 및 Fc 도메인이 융합된 융합 단백질은 혈관 및 신경 재생 효과를 가지고 있다. 따라서 본 발명에 따른 LRG1 당단백질 및 Fc 도메인이 융합된 융합 단백질은 발기부전, 허혈성 질환 및 말초 신경질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
이하 본 발명에 따른 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1-1. 캡슐제의 제조
LRG1 당단백질 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-2. 주사제의 제조
LRG1 당단백질 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-3. 액제의 제조
LRG1 당단백질 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 식품 조성물의 제조
2-1. 건강식품의 제조
LRG1 당단백질 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

Claims (20)

  1. LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질과 Fc 도메인이 융합된 LRG1-Fc 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LRG1 당단백질은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, LRG1-Fc 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 LRG1 당단백질은 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는, LRG1-Fc 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG(Immunoglobulin G)로부터 유래한 것을 특징으로 하는, LRG1-Fc 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, LRG1-Fc 융합 단백질.
  6. 제4항에 있어서, 상기 IgG의 Fc 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, LRG1-Fc 융합 단백질.
  7. 제4항에 있어서, 상기 IgG의 Fc 도메인은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는, LRG1-Fc 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는, LRG1-Fc 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 7 또는 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, LRG1-Fc 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LRG1-Fc 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  13. 제12항의 벡터로 형질전환된 세포.
  14. LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  16. LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  17. LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  19. LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. LRG1 (Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein 1) 당단백질 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LRG1-Fc 융합 단백질을 포함하는 말초 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
PCT/KR2017/007949 2016-07-28 2017-07-24 Lrg1 당단백질을 포함하는 융합 단백질을 함유하는 발기부전, 허혈성 질환 또는 말초 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 WO2018021778A1 (ko)

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