KR101645654B1 - Rage로부터 유래된 폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 폴리펩티드는 RAGE의 리간드인 HMGB1에 결합할 수 있는 RAGE로부터 유래된 폴리펩티드이며, HMGB1과 RAGE의 결합을 방해하여 뇌혈관질환의 예방 및 치료에 효과적이다.

Description

RAGE로부터 유래된 폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Polypeptides derived from receptor for advanced glycation end products (RAGE) and pharmaceutical composition for preventing and treating cerebrovascular disease comprising the same}

본 발명은 최종당화산물 수용체(receptor for advanced glycation end products : RAGE)와 그 리간드인 High-mobility group box1(HMGB1)와의 결합을 방해하기 위해 개발된, RAGE로부터 유래된 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

뇌혈관 질환은 뇌출혈 등에서 볼 수 있는 출혈성 뇌질환과 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환 등 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 이 중 허혈성 뇌질환은 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환으로, 허혈성 뇌혈관질환은 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack) 및 소경색(lacune)등으로 세분할 수 있다. 허혈성 뇌질환은 주로 혈전과 색전 등에 의해 뇌에 혈류를 공급하는 혈관에 병리학적 이상이 생긴 질환을 말하며, 허혈성 뇌졸중 등이 포함된다.

대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 뇌조직에 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포의 ATP 감소, 부종(edema) 등으로 인해 뇌의 광범위한 부위에 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. (Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62, 201-208, 1984; Kirino T. Brain Res., 239, 57-69, 1982). 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62, 201-208, 1984; Kirino T. Brain Res., 239, 57-69, 1982).

뇌졸중 치료에는 급성기 치료와 재발 방지를 위한 예방 치료가 있으며, 뇌졸중이 발생한 3시간 이내에 병원에 가서 급성 뇌졸중 치료를 받아야 치료 효과를 볼 수 있고, 이보다 늦어지면 치료 효과를 보기 힘든 것으로 알려져 있다. 즉, 일단 뇌혈관 질환에 이환되면 비가역적인 신경세포 손상으로 인해, 운동능력 저하, 성적능력 저하, 기억력 감퇴 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, 최근 뇌신경 세포의 재생이 가능하다는 것이 보고되기는 하였으나, 이러한 뇌신경 세포의 재생은 그 조직학적 특성을 고려하건대 용이하지는 않을 것으로 예상된다.

이러한 뇌혈관 질환의 특성을 고려할 때, 신속한 급성기 치료와 예방이 강조되고 있으며, 효과적으로 뇌허혈에 의한 신경세포 손상을 방지할 수 있는 약제의 개발이 요구되고 있다.

High-mobility group box 1 (HMGB1) 단백질은 모든 포유류의 핵 안에 고농도로 존재하며 DNA의 구조를 안정화 시키는 역할을 한다. HMGB1에 대한 연구들은 세균 감염이나 외상적 충격 등으로 인해 손상된 세포로부터 HMGB1이 수동적으로 나오거나 면역세포로부터 염증반응과 같은 신호에 따라 능동적으로 분비되어 혈청에서의 농도가 증가하는 것을 보여주었다. 또한 HMGB1은 위험신호분자 (endogenous danger signal molecules)로써 염증, 발생과 같은 생체반응과 뇌졸중, 알츠하이머, 당뇨 등 다양한 질병들에 관여한다.

허혈성 뇌졸중 환자의 혈청에서는 HMGB1의 농도가 높게 나타나며, 실험적 허혈성 뇌혈관질환 모델인 백서(SD-Rat)의 중대뇌동맥 폐색(MCAO) 유도 시 HMGB1은 핵에서 세포질로 분비되며 anti-HMGB1 항체를 처리하면 ischemia에서 유도되는 Blood brain barrier (BBB) 파괴를 막을 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 알츠하이머 환자에서 HMGB1 은 β-amyloid 의 독성을 강화시키는 역할을 한다. 쥐를 이용한 알츠하이머 동물모델의 죽은 신경세포 주변에 HMGB1 농도가 높게 나타나며, 쥐를 이용한 알츠하이머 모델에 HMGB1을 주사할 경우 β-amyloid가 제거되지 않아 알츠하이머가 더 악화되었다(Takata, K. et al. J. Neurosci. Res. 78, 88091, 2004).

RAGE는 Ig superfamily에 속하는 다양한 내재성 리간드의 수용체로서 세포 안쪽에 짧고 강한 극성을 띠는 cytosolic tail과 세포 바깥쪽에 한 개의 V 도메인과 두 개의 C-면역글로블린 유사 도메인, 그리고 리간드와 결합할 수 있는 수용성 도메인으로 구성되어 있다(도1). RAGE는 V-domain을 통해서 advanced glycation end products (AGE) proteins, S100/calgranulins, Aβ(amyloid-β), HMGB1 등 다양한 리간드와 결합한다. RAGE의 활성은 활성산소의 생성과 NF-kB의 활성 및 전염증성 세포의 침착 등과 연관되어있음이 알려져 있으며, 염증성 세포의 부착과 침착에 직접적으로 연관되어 있음이 알려져 있다. TLR과 같은 패턴 인식 수용체들이 외인성 병원체(exogenic pathogen)를 리간드로 인식하여 면역반응을 매개하는 것과는 달리 RAGE는 여러 내인성 리간드들과 상호작용을 하면서 만성 염증성 반응을 유발하여 여러 다양한 만성 염증성 질환의 병태 생리에 관여하는 것으로 여겨지고 있다. 또한, RAGE의 일부는 막 관통 도메인 및 세포질 도메인이 없는 혈장용해성 RAGE(soluble RAGE, sRAGE)로 존재하며, 혈중에 존재하는 RAGE 리간드들과 결합하여 세포막 RAGE 수용체와 결합하는 작용을 길항하는 역할을 하는 것으로도 알려져 있다.

RAGE는 다양한 면역관련 질병-류마티스성 관절염, 염증성 질환 및 패혈성 쇼크에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지며, 심혈관계에서는 동맥 경화와 심근경색에서의 재관류 손상, 고혈압, 대동맥 질환에서의 RAGE의 역할에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다.

한편, 단백질은 생명체의 기능 및 구조에 있어 기본물질이며, 인체를 구성하는 단백질은 약 100만종이 넘을 것으로 추정된다. 이는 질병과도 직접적인 관련성이 있어, 치료제 개발에 중요한 연구대상이 되고 있으며, 이들을 이용한 단백질 또는 펩티드 의약품은 합성 의약품에 비해 부작용이 적고 약효가 빨라 의약품의 혁신분야로 평가되고 있다.

제약 산업이 과거의 천연물 의약품이나 화학적 합성 의약품에서 단백질 또는 펩티드 의약품의 개발로 바뀌어가고 있는 추세이며, 세계 의약품 시장 중 단백질 또는 펩티드 약물의 시장은 2006년 437억 달러에서 2011년 885억으로 확대되었으며, 국내 단백질 의약품 시장이 세계 시장에서 차지하는 비율은 2006년 3%에서 2021년 7%로 확대될 전망이다.

현재 주요 제약사의 파이프라인에 있어 바이오의약품의 중요성이 점차 증가하고 있으나 펩티드(Peptides)와 같은 특정 바이오의약품이 출시되기까지 주요 기술적 문제가 존재한다. 구체적으로 전달 기술 향상, 안정성 및 반감기를 늘린 펩티드 개발, 긴(long-chain) 펩티드 합성 등이 상업화의 걸림돌로 작용하고 있다. 펩티드는 약 50개 이하의 아미노산으로 구성되어 있는 것을 말하며 펩티드 약물로 성공하기 위해서는 짧은 서열이면서 활성을 나타내는 것을 발굴하는 것이 관건인 것으로 알려져 있다. 펩티드 길이가 길면 합성 비용이 많이 들고 제조가 용이하지 않으며, 인체 흡수상의 문제가 있는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 뇌혈관질환의 신규한 치료제를 발굴하고자 연구하던 중, RAGE로부터 유래된 특정 폴리펩티드가 뇌졸중의 예방 및 치료에 탁월한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기‘폴리펩티드’는 최종당화산물수용체(receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)의 V 도메인의 아미노산 서열(서열번호 1)에서 유래되는 것으로, 서열번호 2 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있으며, 바람직하게 서열 번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 더욱 바람직하게 서열번호 2, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.

상기 서열번호 2, 4 및 6으로 표시되는 아미노산 서열은 N-연결 당쇄화 부위(N-linked glycosylation site)를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 당쇄화 부위(N-linked glycosylation site)는 Asn-Ile-Thr 또는 Asn-Gly-Ser 서열로 이루어지는 것이 특징이다. N-연결 당쇄화 부위(N-linked glycosylation site)는 HMGB1 과 본 발명의 폴리펩티드들 간의 단백질-단백질 상호작용에 있어 중요한 역할을 하며, 특히 N-연결 당쇄화 부위의 폴리펩티드 내 위치에 따라 본 발명의 폴리펩티드들과 HMGB1간의 단백질 결합 정도가 조절될 수 있다.

본 발명의 명세서 실시예에서는, 염증 억제 효과를 나타낸 서열번호 2, 4 또는 6의 폴리펩티드가 공통적으로 RAGE의 N-연결 당쇄화 부위인 Asn-Ile-Thr 또는 Asn-Gly-Ser 서열을 포함하고 있음을 확인하였다. 이때 가장 강한 억제 효과를 보인 서열번호 2 폴리펩티드의 경우 아스파라긴25(N25) 자리를 포함하고 있음을 확인하였고, RAGE의 N-연결 당쇄화 부위인 아스파라긴25(N25) 자리가 RAGE-HMGB1의 결합에 중요한 역할을 함을 확인하였다(도4).

본 발명의 폴리펩티드는 동등한 생리 활성을 나타내는 기능적 동등물을 포함하며, 모든 종류의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 펩티드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함한다. 상기에서 '동등한 생리활성'이란 High-mobility group box 1 (HMGB1)과 결합할 수 있는 활성을 갖으며, RAGE와 HMGB1의 결합을 방해하는 것을 말한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 2, 3, 4, 및 6으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(homology)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 펩티드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 펩티드의 변이체란, 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 펩티드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press,New York, 1979).

경우에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation),당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도있다.

본 발명의 폴리펩티드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩티드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and MolecularPrinciples, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). 또한 본 발명의 펩티드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩티드'라 함은 본 발명에 따른 펩티드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

상기 유전공학적 방법에 의해 제조된 폴리펩티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드는 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명의 상기‘뇌혈관질환(cerebrovascular disease)’은 뇌의 정상적인 혈액공급 장애에 의해 신경학적 결손 (neurologic deficit)이 나타나는 것을 의미하는 것으로, 뇌혈관 사고(cerebrovascular accident, CVA) 또는 뇌졸중(stroke)이라고도 하며, 우리나라에서는 옛날부터 중풍이라고 불렀다.

본 발명의 뇌혈관 질환은 당업계에 공지된 뇌혈관질환이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 바람직하게 허혈성 뇌혈관질환과 출혈성 뇌혈관질환을 포함한다.

상기 허헐성 뇌혈관질환이란 뇌혈관이 막혀서 뇌에 혈액과 산소공급을 하지못하여 뇌세포가 죽게 되어 발생하는 질환을 의미하는 것으로, 예를 들어 뇌혈전증, 뇌색전증을 포함하는 뇌경색과 뇌동맥경화증 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

상기 출혈성 뇌혈관질환은 뇌혈관이 터져 피가 흐르고 고여서 뇌 손상이 오는 경우를 의미하는 것으로, 예를 들어 뇌실질내출혈, 지주막하출혈, 뇌실내출혈 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 뇌혈관 질환은 가장 바람직하게 뇌졸중, 뇌경색, 뇌색전증, 뇌혈전증 및 뇌동맥경화증으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 허혈성 뇌혈관질환 일 수 있다.

상기 본 발명의 폴리펩티드는 HMGB1에 의해 유도되는 염증을 억제하는 효과가 있어, 뇌혈관질환(뇌졸중) 특히 허혈성 뇌혈관질환의 발생 억제 및 치료 효과를 가지는 것이 특징이다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 허혈성 뇌혈관질환의 이환(罹患)으로 인한 뇌 조직의 손상을 억제하고, 이후 발생하는 운동 기능 장애를 예방 및 회복하는 효과를 나타낸다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다.

본 발명의 일실시예에서는 Raw264.7 세포에 HMGB1을 60분동안 처리하여 염증신호를 유발하였으며, HMGB1에 의해 유도되는 염증신호가 서열번호 2 내지 7의 후보 폴리펩티드에 의해 억제 되는 효과를 확인했다. 그 결과 서열번호 2,3,4 및 6의 폴리펩티드 처리군에서는 ERK, AKT, p65, p38의 인산화가 억제되었음을 확인하였으며 특히 AKT와 p65의 인산화의 억제가 두드러졌다(도 2). 가장 효과적으로 염증억제를 보인 서열번호 2를 대량 합성하여 AKT와 p65의 신호를 확인한 결과 두드러진 효과를 볼 수 있었다(도 3). 또한 서열번호 2의 처리에 의해 효과적으로 Matrix metalloproease(MMP)의 활성이 억제되었음을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 쥐의 허혈성 재관류손상(MCAO) 모델에 본 발명의 폴리펩티드를 투여하여, 뇌경색 억제 효과를 확인하였다. 그 결과 본 발명의 폴리펩티드 투여군에서는 병변 부위에서 p-p65, p-AKT, p-ERK의 증가를 볼 수 없었었다. 또한 본 발명의 폴리펩티드 투여군에서 혈청 속 HMGB1의 양이 현저히 감소하였고, DAB 염색을 통해 병변 부위의 조직에 HMGB1이 남아있는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 펩티드로 인하여 HMGB1이 혈청으로 분비되는 것이 억제되었음을 나타낸다. 또한, 본 발명에서 쥐의 허혈성 재관류손상(MCAO) 모델에 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여한 경우 뇌경색으로 인해 발생하는 운동 기능 장애가 회복되었다.

따라서, 본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 단독으로 함유하거나 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성믈을 제공한다. 이에 한정되지 않지만 상기 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게 염증 억제용 조성물이며, 더욱 바람직하게 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제로는 분산제, 습윤제, 현탁제, 희석제 및 충진제가 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는Remington's Pharmaceutical Sciences(19 th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.특정의 약학적으로 허용되는 담체와 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 발현 벡터의 비율은 조성물의 용해도와 화학적 성질, 특정의 투여방식 등에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 약학적 조성물의 치료학적 또는 예방학적 유효량은 투여대상, 연령, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 약학적으로 허용되는 염으로는 무기염기와의 염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염 및 염기성 또는 산성 아미노산과의 염이 포함된다. 무기 염기와의 염은 예를 들면 나트륨 염 및 칼륨 염과 같은 알칼리 금속 염, 칼슘 염 및 마그네슘 염과 같은 알카리 토금속 염, 알루미늄 염 및 암모늄 염이 포함된다. 유기 염기와의 염으로는 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실아민 및 N,N-디벤질에틸렌디아민과의 염을 예로 들 수 있다. 무기산과의 염의 예로는 염산, 붕산, 질산, 황산 및 인산과의 염을 들 수 있다. 유기산과의 염을 예로 들면 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 석신산 말산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산 또는 p-톨루엔설폰산과의 염이 포함된다. 염기성 아미노산과의 염은 예를 들면 아르기닌, 라이신, 오르니틴이 포함된다. 산성 아미노산과의 염의 예로는 아스파르트산 및 글루탐산과의 염을 들 수 있다. 적절한 염의 목록은 본 명세서에서 그 전문을 참고로 인용한 문헌(Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17th ed.,Mack Publishing Company, Easton, PA, p1418, 1985)에 개시되어 있다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 이에 한정되지 않지만 경구 투여용 제형으로 제조될 수 있다. 경구 투여용의 경우, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 약학적으로 허용 가능한 염을 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 그 자체를 그대로 투여하거나 상술한 바와 같은 여러 제형으로 제조되어 투여될 수 있으며, 바람직하게는 원하는 효과 즉, 염증 억제 및 뇌혈관질환(뇌질환)의 증상 완화 결과가 도출될 때까지 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 즉, 경구 또는 비경구, 예컨대 구강, 근육내, 정맥내, 피내, 동맥내, 골수내, 경막내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 설하 또는 피하 투여되거나, 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용되며, 가장 바람직하게는 정맥 투여할 수 있다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 표적 세포나 조직(예: 피부 세포나 피부 조직)에 고친화성 결합을 유발하는 분자와 결합되거나 상기 분자 내에 캡슐화된 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 스테롤(예: 콜레스테롤), 지질(예: 양이온 지질, 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제(예: 표적세포 특이적 수용체에 의해 인지되는 리간드)와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예컨대 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오테이트 (SPDP) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 개체에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 본 발명의 약학적 조성물은 투여 목적에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내에서, 바람직하게는 0.01-10mg/Kg 범위 내로 투여될 수 있으나 당 분야의 통상적인 지식을 가진자라면 투여목적에 따라 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하며, 상기 폴리펩티드에 관한 설명은 전술한 바와 같다.

상기 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 상기한 폴리펩티드들과 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단쇄, 또는 이중쇄일 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다.

바람직하게 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8, 9, 10 및 12로 표시되는 염기서열을 갖는다.

상기 폴리뉴클레오티드는 천연에서 분리되거나 당업계에 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 제공한다.

상기‘벡터’는 구체적으로 상기 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 의미한다.

본 발명에서 용어, “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아(Escherichia)속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스(Bacillus)속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열,항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaC_l2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를들어 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포일 수 있다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 형질전환체는 바람직하게 형질 전환 세포, 더욱 바람직하게 형질전환 진핵 세포를 의미하는 것으로, 가장 바람직하게 Human Embryonic Kidney 293T cell일 수 있다.

본 발명의 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 조성물은, 최종당화산물 수용체인 RAGE와 그 리간드인 HMGB1의 결합을 방해하여 뇌혈관질환의 예방 또는 치료에 효과가 있다. 본 발명의 조성물은 뇌혈관질환으로 인한 염증반응을 억제하고, 손상된 신경세포를 보호 및 회복시키는 데에 효과적이다.

도 1은 HMGB1과 결합할 수 있는 폴리펩티드를 합성하기 위한, RAGE 단백질의 모식도를 나타낸다[N 말단에 약 22개 아미노산의 시그날(S)펩티드를 가지고 있고 Variable domain (23-116), 2개의 Constant domain (124-221, 227-317), Transmembrane domain (343-363, M domain), C-말단의 Intracellular cytoplasmic tail (364-404)으로 이루어짐].
도 2는 합성한 6종(서열번호 2 내지 7을 순서대로 P1 내지 P6으로 표시)의 폴리펩티드가 HMGB1에 의해 유발된 염증 신호를 저해하는 효과를 평가한 결과를 나타낸 것으로, 서열번호 2의 폴리펩티드의 효과가 가장 높게 나타났다.
도 3은 상기 도2에서 가장 좋은 효과를 보인 서열번호 2의 폴리펩티드에 의해서 HMGB1에 의해 유발되는 염증신호인 AKT와 p65의 인산화가 억제됨을 Raw 264.7 cells에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 RAGE WT (wild type), RAGE N25Q 및 RAGE N81Q를 트랜스팩션 시킨 293T세포에서 발현된 RAGE WT, RAGE N25Q, RAGE N81Q가 각각 HMGB1과 결합하는지 면역침강법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것으로, RAGE N25Q는 HMGB1과 결합 하지 못함을 확인하였다(WCE: whole-cell extract, IP: immunoprecipitation).
도 5는 쥐의 허혈 재관류 손상 모델에서 서열번호 2번 폴리펩티드(P1)를 투여하여 뇌경색 보호효과를 확인하기 위한 동물실험 요약도이다. 허혈 재관류 손상(MCAO) 유도하기 한 시간 전에 폴리펩티드(P1)를 정맥주사한 후, MCAO 유도 48시간 후에 희생하여 뇌 조직을 채취하였다.
도 6의 A는 MCAO 유도 한 시간 전에 P1 폴리펩티드를 정맥주사한 후, MCAO 유도 48시간 후에 희생하여 채취한 뇌 조직을 니슬 염색하여 병변 부위의 부피를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(n=5 **p<0.01).
도6의 B는 MCAO 유도 한 시간 전에 P1 폴리펩티드를 정맥주사한 후, MCAO 유도 48시간 후에 희생하여 채취한 뇌 조직을 니슬 염색하여 얻은 이미지로 뇌경색 정도를 비교한 결과이다(P1 펩티드 투여 시 대조군에 비해 효과적으로 경색이 줄어드는 것을 보여줌, vehicle 은 PBS 투여군을 의미).
도 7은 SD-Rat MCAO 모델에서 서열번호 2번 폴리펩티드(P1) 투여에 의한 염증신호 전달의 변화를 western blot 으로 확인한 결과를 나타낸다(MCAO 유도 한 시간 전에 P1 폴리펩티드를 정맥주사한 후, MCAO 유도 48시간 후에 희생하여 뇌조직을 채취하였으며, C; 대측 반구, I; 병변 반구를 의미, P1은 1mg/Kg, 3mg/Kg로 각각 투여).
도 8은 SD-Rat MCAO 모델에서 서열번호 2번 폴리펩티드(P1)의 투여로 인하여 HMGB1의 분비가 억제되는지를 western blot으로 확인한 결과를 나타낸다(MCAO전과 MCAO 유도 2일 후의 혈청에서 동량의 단백질을 분석함).
도 9는 쥐의 허혈 재관류 손상 모델(SD-Rat MCAO 모델)에서 서열번호 2번 폴리펩티드(P1)를 투여한 후, 뇌 조직을 Diaminobenzidine 염색(A) 및 형광 염색(B)한 결과를 나타낸다.
도 10은 쥐의 허혈 재관류 손상 모델에서 서열번호 2번 폴리펩티드(P1)를 투여한 후, 뇌조직에서의 MMP 활성을 Zymography로 확인한 결과를 나타낸다(C; Contralateral hemisphere 대측 반구 I; Ischemic hemisphere 병변 반구).
도 11은 쥐의 허혈 재관류 손상 모델에서 서열번호 2번 폴리펩티드(P1)를 투여한 후, 기능적 회복을 조사하기 위한 Limb placing test(A)와 Corner turn test (B)를 시행한 결과를 보여준다. 3mg/Kg 투여한 쥐에서 유의적으로 운동기능이 회복되었다. n=5, *p<0.05 (Pre: MCAO 유도 전, 1D: P1 폴리펩티드 투여 후 MCAO 유도 1일째, 2D: P1 폴리펩티드 투여 후 MCAO 유도 2일째 )

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

HMGB1 에 대한 펩티드 저해제 합성

본 발명에서는 HMGB1과 RAGE의 결합을 방해하는 펩티드를 개발하기 위하여 HMGB1과 RAGE의 결합부위인 V domain의 아미노산 서열(서열번호1)을 중심으로 합성할 폴리펩티드의 아미노산 서열을 선정하였다. 리간드 결합에 중요할 것으로 생각되는 프롤린, 트립토판을 포함하는 부분과 당쇄화(Glycosylation)가 일어나는 부분을 포함시켜 총 여섯 종류의 펩티드(서열번호 2 내지 7, 표 1 참조)를 합성하였다(펩트론, 한국).

서열 번호 2 내지 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 합성하여(펩트론, 한국), reverse-phase HPLC으로 95%이상의 순도로 정제하고, 질량분석법(mass spectrometry analysis)으로 확인하였다. 합성된 폴리펩티드는 5 또는 10mM 농도로 하여 DMSO에 녹여 stock solution을 제조하여 실험에 사용하기 전까지 보관하였다.

nit, ngs : N-linked glycosylation site; p:proline; w:tryptophan

< 실시예 2>

HMGB1 에 대한 펩티드 저해제의 뇌졸중에 대한 효능 평가

<실험 준비>

1. 세포 배양, 발현 벡터 및 세포의 형질전환, 면역침강

Raw 264.7세포와 293T세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂인 표준 조건에서 배양하였다. pCI-neo RAGE WT와 RAGE의 당쇄화 자리인 N25와 N81 부분에 아스파라긴(N)을 글루타민(Q)으로 바꾸어 당쇄화가 일어나지 않은 단백질을 발현하는 돌연변이 플라스미드인 pCI-neo RAGEN25Q 및 pCI-neo RAGEN81Q 포유류 발현 플라스미드는 H.Yamamoto (Kanazawa University, Japan)로부터 제공받아 사용하였다. 상기 RAGE WT, RAGEN25Q 및 RAGEN81Q 단백질을 발현하는 플라스미드를 293T세포에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 트랜스펙션하였다. 구체적으로 트랜스펙션은 셀을 60파이에 10의 6승으로 깔고 다음날 각 1ug의 플라스미드를 Lipofectamine으로 트랜스팩션시킨 후 6시간 후에 미디아 체인지하였다. 36시간 후에 세포를 0.5% Nonidet P-40 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40 및 protease inhibitors)로 용해시킨다. 세포 용해물을 anti-HMGB1 항체와 4℃에서 3시간동안 배양하였고, 생성된 면역복합체는 protein G-agarose(Roche Applied Science)와 4℃에서 1시간동안 배양시킴으로서 회수하였다. 세척한 후, 면역침강된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고 전기영동이 끝난 후 젤을 PVDF(Polyvinylidene Fluoride membrane, Millipore) 멤브레인으로 트랜스퍼 한 후 상온에서 1시간 동안 5% BSA로 블록킹(blocking) 하였다. 블록킹한 멤브레인은 적정 일차 항체인 anti-RAGE (Millipore,MA, USA) 항체와 anti-HMGB1(Abcam, UK) 항체를 실험에 따라 상온에서 두시간 반응시키고 5분씩 세 번 버퍼로 세척하고 다시 한시간동안 anti-mouse 나 anti-rabbit 2차 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 처리하여 반응시켰다. 반응 후에 10분씩 세 번 이상 충분히 세척한 후 ECL 검출 키트(Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA)을 사용하여 밴드를 확인한 후 분석하였다(도 4 참조).

2. Western blot 분석 및 면역형광염색

MCAO(middle cerebral artery occlusion)를 통해 허혈성 재관류 손상(I/R injuries)을 유도하고 2일 후, 쥐(n=5 per group)의 뇌조직을 채취하였고, 성상 교세포 (astrocyte) 및 Raw cell 또한 각각 실험 조건에 맞추어 harvest 하였다. 각 세포와 뇌조직은 0.5% Nonidet P-40 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40 및 protease inhibitors)로 용해시킨다. 비교하는 샘플간에 동량의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 전기영동이 끝난 후 젤을 PVDF(Polyvinylidene Fluoride membrane, Millipore) 멤브레인으로 트랜스퍼 한 후 상온에서 1시간 동안 5% BSA로 블록킹(blocking) 하였다. 블록킹한 멤브레인은 실험에 따라 적정 단백질에 대한 일차 항체, ERK, phospho-ERK, phospho-AKT, phospho-p65, phospho-p38 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), IkB, HMGB1, RAGE 및 β-actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 를 상온에서 두시간 반응시키고 5분씩 세 번 버퍼로 세척하고 다시 한시간 동안 2차 항체(anti-mouse 또는 anti-rabbit)를 처리하여 반응시켰다. 반응 후에 10분씩 세 번 이상 충분히 세척한 후 ECL 검출 키트(Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 밴드를 확인한 후 분석하였다.

뇌조직의 면역형광염색(Immunofluoresent staining)은, 채취한 뇌조직으로 부터 40μm 저온 관상면 절편(cryopreserved 40-μm coronal section)을 제작하여 수행하였다. 제작된 절편은 블로킹하고 항 HMGB1 항체와 반응(probed)시킨다. 세척한 후, 절편들을 fluorophore로 표지된 이차 항체와 30분 동안 반응시켜(도 9 B)염색하거나, peroxidase 기질인 diaminovenzidine(DAB, Dako, Carpinteria, CA, USA)와 5분 동안 반응시켜(도 9 A) 염색하였다. 세포핵은 4, 6-diaminodino-2- phenylnodole (DAPI)로 염색하여 관찰하였다. 공초점 레이져 스캔 현미경(LSM 410 META; Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 관찰하여, 두 방법 모두에서 양성인 세포(double positive cell)수를 측정하였다. 경색 주변부(peri-infarction area)의 미리 정해진 여섯 개의 절편을 사용하여 세포수를 측정하였다.

3. 실험 동물 및 일과성 국소 뇌허혈 재관류 손상 모델( transient focal cerebral ischemia -reperfusion injury model )

일과성 국소 뇌허혈 재관류 손상 모델(transient focal cerebral I/R injury, 본 명세서에서 MCAO 모델과 같은 의미)은 Longa et al .의 내경동맥 혈관내 폐색법(endovascular internal carotid artery suture method)을 일부 변경하여 유도하였다 (Lee SH, Kim M, Yoon BW, Kim YJ, Ma SJ, Roh JK, Lee JS, Seo JS. Targeted hsp70.1 disruption increases infarction volume after focal cerebral ischemia in mice. Stroke.2001;32:2905-2912). 체중이 250-300g의 수컷 백서(Sprague-Dawley male rats; KOATECH, South Korea)를 대상으로 실험을 진행하였으며 서울대학교 의생명연구원의 동물실험관련 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of the Biomedical Research Institute at Seoul National University Hospital)에서 승인한 지침에 따라 사용하였다. 1%케타민(30mg/Kg)과 염산 자일라진(4mg/Kg)으로 마취를 시행하고 좌측 목의 중간 부위를 절개하여 좌측 경동맥을 조심스럽게 박리해서 외경동맥과 날개구개동맥을 4-0 silk로 결찰하고 내경동맥을 부분절개한 후, 3-0 nylon monofilament를 중뇌동맥과 전뇌동맥 기시부까지 15mm이상을 삽입한 후 monofilament를 고정하여 수술 부위를 봉합한다. 이 후, 120분 결찰 시간이 지난 후 monofilament를 제거하여 중대뇌동맥(Middle cerebral artery)을 재관류(reperfuse) 하였다. 허혈성 재관류 손상(I/R injury)을 유발하기 한시간 전에 PBS(vehicle) 또는 서열번호 2의 폴리펩티드를 각각 1mg/kg, 3mg/kg로 최종 부피 1mL로 하여, 32-게이지 바늘을 이용하여 정맥주사 하였다.(도 5)

4. 뇌경색 부피 측정

4% 파라포름알데하이드로 심장관류(cardiac perfusion)하여 고정시킨 뇌조직은 동결박편제작기(CM3050S, Leica)를 사용하여 40μm두께로 관상면으로 잘라 절편을 제작하였다(40-μm-thick coronal section). 총 12개 뇌조직 절편을 니슬 염색(Nissl staining)한 후, 각 group간 infarct의 volume을 image analyzer (Image-Pro plus, Media Cybernatics)를 이용하여 뇌경색 부피를 측정, 비교하였다. 뇌경색의 비율(백분율)은, 병변 반대쪽 뇌 반구 전체 부피와 경색 부위의 부피를 비교하여 뇌경색의 비율을 결정하였다(도 6).

5. Zymography 분석

이전 문헌(Leber TM, Balkwill FR. Zymography: A single-step staining method for quantitation of proteolytic activity on substrate gels. Analyticalbiochemistry.1997;249:24-28)에 기재된 방법에 따라 gelatine zymography를 통해 MMP 활성을 평가하였다. 2mg/ml gelatine을 함유하는 비환원SDS/폴리아크릴아미드 겔(10%)을 사용하여 25mM TrisHCl, 250 mM glycine 및 1% SDS를 포함하는 완충액에서 전기영동하여 단백질을 분리한다. 겔은 2.5% Triton X-100 으로 상온에서 세척한 후 5 mM CaCl₂, 200mM NaCl,0.02% Brij35, 50 mM TrisHCl(pH8.5)에서 37℃에서 하룻밤동안(16시간) 인큐베이션한다. 겔은 Coomassie Brilliant Blue R250 (1%, w/v)로 염색하고 methanol/acetic acid/water (45:10:45)로 탈색(destaine)한다. gel zymograph 상에서 젤라틴이 분해된 부분(젤라티나아제 활성이 있는 부분)은 젤라틴이 분해되지 않은 푸른색 부분(background)에 비해 투명하게 나타난다(도 10).

6. 운동 기능 분석

신경학적 평가는, 허혈성 재관류 손상(MCAO)을 유발하기 전과 유발한지 1일, 7일, 14일 후에 동물실험군(n=10) 각각을 블라인드 테스트하여 앞다리 운동(forelimb placing test) 시험과 모서리 행동(corner turn test) 시험을 통해 수행되었다. 앞다리 운동기능 시험은 수염에 의해 유발된 앞다리 운동을 시험하는 방법으로 점수를 매겨 측정하였다(Bland ST, Schallert T, Strong R, Aronowski J, Grotta JC, Feeney DM. Early exclusive use of the affected forelimb after moderate transient focal ischemia in rats : Functional and anatomic outcome. Stroke.2000;31:1144-1152). 각각의 시험은 10회 시행하였으며, 테이블 윗면의 가장자리(모서리)에 실험동물을 위치시키고 회당 한번씩 앞다리와 동측(같은쪽)에 있는 수염을 빗어주어 움직임을 유도하였다. 정상 동물군은 테이블 윗면에 앞다리를 빠르게 내려놓았고, 성공적인 앞다리 운동 반응 (successful placing response) 비율(백분율)을 측정하였다(도 11 A). 모서리 행동 시험은 이전 문헌(Zhang L et al., J Neurosci Methods. 2002; 117:207-214)에 언급된 방법을 일부 변경하여 시행하였다. 간략하게 설명하면, 쥐를 30°각도를 이루고 있는 모서리를 향하여 진행하게 하였고, 왼쪽 또는 오른쪽으로 모서리를 도는 횟수를 측정하였다. 상기 실험은 10회 반복하였으며, 오직 완전하게 한쪽 벽을 따라 회전하는 경우만을 turn으로 포함하였다. (도 11 B). 각각의 회전 후에 쥐들을 즉각적으로 들어 올리지 않았는데, 이렇게 함으로써 그들의 우세 회전 반응(prepotent turning response)에 대한 혐오감을 형성하지 않도록 하기 위함이었다.

7. 통계학적 분석

실험 값은 평균값과 표준편차(mean±s.d.)로 표시하였다. 데이터는 unpaired Student’s t-test 및 ANOVA (analysis of variance, 분산분석) test 를 적절히 사용하여 분석하였다. 그 외에, 서로 독립되거나 독립되지 않은 샘플(unpaired or paired samples)에 대하여는 nonparametric MannWhitney U test 또는 Wilcoxon signed-rank test를 각각 이용하여 분석하였다. p 값이 0.05 미만(two-tailed value of P<0.05)인 경우 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

<실험결과>

1. HMGB1 에 의해 유도되는 염증 억제 효과 확인

HMGB1에 의해 유도되는 염증반응을 효과적으로 저해하는 폴리펩티드를 선정하기 위해 Raw264.7 세포의 HMGB1에 의해 유도되는 염증신호가 서열번호 2 내지 7의 후보 폴리펩티드에 의해 억제 되는 효과를 확인했다.

Raw264.7 세포를 serum-free 배지에서 3시간동안 신호를 억제시킨 후 HMGB1을 60분동안 처리하여 염증신호를 주었으며 이때 표 1의 각 폴리펩티드를 같이 처리한 후 세포를 0.5% Nonidet P-40 lysis buffer로 용해시킨다 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, and protease inhibitors). 동량의 단백질로 전기영동을 한 후 ERK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), phospho-ERK, phospho-AKT, phospho-p65, phospho-p38 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), IkB, HMGB1, RAGE 및 β-actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 특이적인 항체를 사용하여 세포신호전달을 보기 위한 western blot을 실시, 그 결과를 분석하였다.

서열번호 2 폴리펩티드(P1)의 경우 p-AKT와 p-p65에서 두드러진 억제 효과를 보였으며 p-ERK와 p-p38 도 감소했다. 정도의 차이가 있었지만 서열번호 3, 4 및 6 폴리펩티드(각각 P2,P3 및 P5)의 경우에도 억제 효과를 보였다(도 2). 가장 효과적인 서열번호 2의 폴리펩티드(P1)를 대량 생산하여 동물실험에 적용하였으며, p-AKT와 p-p65항체로 억제효과를 반복 확인하였다 (도 3).

2. 폴리펩티드의 N-연결 당쇄화가 HMGB1 과의 반응성에 미치는 영향 확인

서열번호 2 내지 7 폴리펩티드 중에서 가장 강한 염증 억제 효과를 나타낸 서열번호 2와 6은 공통적으로 N-연결 당쇄화 부위를 포함하고 있으며 가장 강한 억제 효과를 보인 서열번호 2 폴리펩티드의 경우 아스파라긴25(N25) 자리를 포함하고 있음을 확인하고, N-연결 당쇄화 자리가 RAGE-HMGB1의 결합에 중요한 역할을 하는지를 확인하고자 RAGE의 당쇄화 자리인 N25와 N81 부분에 아스파라긴(N)을 글루타민(Q)으로 바꾸어 당쇄화가 일어나지 않은 돌연변이(RAGEN25Q 및 RAGEN81Q) 플라스미드를 과발현시키는 실험을 통해, HMGB1과 결합하는 지 여부를 알아보았다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

pCI-neo RAGE WT과 pCI-neo N25Q 및 pCI-neo RAGEN81Q 플라스미드를 293T cell에 트랜스팩션하였다. 36시간 후에 세포를 0.5% Nonidet P-40 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, and protease inhibitors)로 용해시킨다. anti-HMGB1 항체와 4℃에서 3시간동안 반응시킨 후, 생성된 면역복합체를 회수하여 G-agarose(Roche Applied Science)와 4℃에서 1시간동안 반응시킨다. 세척한 후, 면역침강된 단백질은 anti-RAGE 항체와 anti-HMGB1 항체를 사용하여 western blot법으로 분석하였다(도4).

293T cell에서 과발현시킨 RAGEWT과 RAGEN81Q는 HMGB1과 효과적으로 강하게 결합하는 반면 RAGE25Q는 HMGB1과 결합하지 못했다(도 4). 이는 RAGE의 N25 부위의 당쇄화가 RAGE-HMGB1의 결합에 중요한 역할을 함을 증명하며 또한 이 부위는 가장 효과적인 염증 억제 효과를 보인 서열번호 2가 가지는 부위이다. 그러므로 서열번호 2 폴리펩티드는 RAGE-HMGB1 결합을 방해하여 염증을 억제하는 효과를 나타낼 수 있음을 제시하였다.

3. 뇌경색 동물모델에서 HMGB1 펩티드 저해제 투여 후 뇌경색 억제효과 확인

중대뇌동맥 폐색(MCAO,middle cerebral artery occlusion)으로 뇌허혈 유도된 백서(SD-Rat)에서 서열번호 2 폴리펩티드(P1)의 투여가 뇌경색에 미치는 효과를 탐구하였다 (도 6). MCAO 유도 한 시간 전에 서열번호 2의 폴리펩티드를 1mg/Kg, 3mg/Kg의 농도로 Intravenous route를 통해 투여하였으며, MCAO 유도 48시간 후에 쥐를 희생하였다. 그 결과 도 6 A에서 보는 바와 같이, 서열번호 2 폴리펩티드에 의해 농도 의존적으로 뇌경색이 감소하였다(대조군: 38.90%, 1mg/Kg: 10.5%, 3mg/Kg: 8.66%; **p<0.01). 도 6의 B는 니슬 염색한 뇌 조직을 보여준다.

서열번호 2의 폴리펩티드(P1)가 염증반응에 미치는 신호전달 변화를 보기 위해 허혈성 재관류 손상(MCAO) 유도 48시간 후에 병변 반구 (ischemic hemisphere)와 병변 반대쪽 반구 (contralateral hemisphere)를 추출하여 웨스턴 블랏팅을 통해 p-p65, p-AKT, p-ERK의 변화 양상을 보았다. 대조군의 쥐에서는 뇌경색 병변 부위의 뇌에서 반대쪽 뇌에 비해 효과적으로 p-p65, p-AKT, p-ERK가 증가하였으며 서열번호 2 폴리펩티드 3mg/Kg를 투여한 쥐 그룹에서는 병변 부위에서 p-p65, p-AKT, p-ERK의 증가를 볼 수 없었다. 1mg/Kg의 서열번호 2 폴리펩티드를 투여한 쥐 그룹에서도 대조군에 비해서 p-AKT와 p-p65의 증가가 억제되었다. 서열번호 2 폴리펩티드를 1mg/Kg 투약한 경우에 p-ERK의 경우 p-ERK1은 억제하였으나 p-ERK2는 억제시키지 못했다 (도 7).

HMGB1은 뇌허혈 유도시 세포 밖으로 나오며 환자의 혈청에 고농도로 존재하므로 허혈성 재관류 손상(MCAO) 유도 48시간 후, SD-Rat 에 서열번호 2 폴리펩티드를 투여할 시 HMGB1의 분비가 억제되는지 확인하였다. 허혈성 재관류 손상(MCAO) 유도 이전의 혈청과 허혈성 재관류 손상(MCAO) 유도 48시간 이후의 혈청을 웨스턴 분석법을 통해 비교해 본 결과 3mg/Kg의 서열번호 2 폴리펩티드를 투여한 쥐의 혈청에서 HMGB1의 양이 현저히 감소하였다 (도 8).

또한 경색 부위의 뇌조직을 HMGB1 항체로 Diaminobenzidine (DAB) 염색하였다. 대조군은 혈청에 HMGB1이 분비되었기 때문에 세포 내에서는 거의 남아있지 않은 반면 서열번호 2 폴리펩티드를 투여한 쥐의 병변 부위에서는 HMGB1이 조직에 남아있는 것을 확인하였다(도 9 A). 이를 형광 염색 하여 대조군에서 빠져나가는 HMGB1의 모습을 확인하였다(도 9 B).

4. Matrix metalloprotease ( MMP ) 활성 감소 효과 확인

MMP Zymography를 통해서 염증활성에 관계되는 단백질들을 분해시키는 분해효소인 MMP (Matrix metalloprotease)의 단백질 분해능을 확인한 결과, 서열번호 2 폴리펩티드를 처리한 경우 분해 기능이 현저히 상실함을 확인하였다(도 10). 이는 서열번호 2 폴리펩티드가 허혈성 뇌졸중의 급성기에 염증반응을 억제할 수 있음을 나타낸다.

5. 뇌경색 후 신경 보호 효과 확인 및 운동성 회복 능력 확인

본 발명의 펩티드가 HMGB1-RAGE 결합을 억제함으로 생기는 염증억제 작용이, 궁극적으로 뇌경색 후 신경보호 효과가 있는지 보았다. 서열번호 2 폴리펩티드를 처리한 허혈성 재관류 손상(MCAO) 쥐의 신경학적 기능을 검사에서 운동 기능에 유의적 회복을 보였다(도 11). 따라서 앞서 확인한 HMGB1-RAGE 결합을 방해하여 염증을 억제하는 효과가 궁극적으로 뇌경색 후 손상된 신경 세포를 보호하고 회복시키는 효과가 있음을 확인하였다.

이상에서 본 바와 같이, 본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 최종당화산물 수용체인 RAGE와 그 리간드인 HMGB1의 결합을 방해하여 뇌혈관질환으로 인한 염증반응을 억제하고, 손상된 신경세포를 보호 및 회복시키는 데에 효과적이므로 산업상 이용 가능성이 크다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Polypeptides derived from receptor for advanced glycation end products (RAGE) and pharmaceutical composition for preventing and treating cerebrovascular disease comprising the same <130> NP13-0082 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAGE v domain (amino acid sequence) <400> 1 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu 20 25 30 Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg 35 40 45 Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60 Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80 Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile 85 90 95 Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110 Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys 115 120 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st Polypeptide derived from RAGE _P1 <400> 2 Leu Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly 1 5 10 15 Glu Pro Leu Val 20 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd Polypeptide derived from RAGE_P2 <400> 3 Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro 1 5 10 15 Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3rd Polypeptide derived from RAGE_P3 <400> 4 Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn 1 5 10 15 Gly Ser Leu Phe Leu Pro 20 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4th Polypeptide derived from RAGE_P4 <400> 5 Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala 1 5 10 15 Arg <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5th Polypeptide derived from RAGE_P5 <400> 6 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu 20 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6th Polypeptide derived from RAGE_P6 <400> 7 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Val 20 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for 1st polypeptide derived from RAGE <400> 8 ctgtgggggg cagtagtagg tgctcaaaac atcacagccc ggattggcga gccactggtg 60 60 <210> 9 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for 2nd polypeptide derived from RAGE <400> 9 ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa 60 tggaaactg 69 <210> 10 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for 3rd polypeptide derived from RAGE <400> 10 ccccagggag gaggcccctg ggacagtgtg gctcgtgtcc ttcccaacgg ctccctcttc 60 cttccg 66 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for 4th polypeptide derived from RAGE <400> 11 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg t 51 <210> 12 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for 5th polypeptide derived from RAGE <400> 12 tgggacagtg tggctcgtgt ccttcccaac ggctccctct tccttccggc tgtcgggatc 60 caggatgag 69 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for 6th polypeptide derived from RAGE <400> 13 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 60

Claims (10)

1. 최종당화산물 수용체(receptor for advanced glycation end products: RAGE)의 리간드인 HMGB1에 결합할 수 있는 RAGE로부터 유래되며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 뇌혈관질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌색전증, 뇌혈전증, 뇌동맥경화증, 뇌출혈 및 지주막하출혈로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 뇌혈관질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 뇌혈관질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌색전증, 뇌혈전증 및 뇌동맥경화증으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 허혈성 뇌혈관질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 뇌 조직의 세포로부터 High-mobility group box1(HMGB1)의 분비를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 허혈성 뇌혈관질환으로 인한 신경 손상에 대해 보호 및 회복 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 RAGE로부터 유래된 폴리펩티드는 HMGB1에 결합하는 N-연결 당쇄화 부위인 Asn-Ile-Thr 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 RAGE로부터 유래된 폴리펩티드는 RAGE와 HMGB1의 결합을 방해하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
   
9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
   
10. 제9항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.

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