KR20090109932A

KR20090109932A - 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제

Info

Publication number: KR20090109932A
Application number: KR1020080035430A
Authority: KR
Inventors: 하남출; 피아오퓨; 슈용빈; 염수환
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2008-04-17
Filing date: 2008-04-17
Publication date: 2009-10-21

Abstract

본 발명은 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열목록 1, 서열목록 3 및 하나 이상의 세린 또는 트레오닌이 인산화된 서열목록 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열목록에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 GSK-3 베타 억제제에 관한 것이다.

GSK-3 베타, 인산화, II형 당뇨병

Description

글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제{Glycogen synthase kinase beta inhibitor}

본 발명은 II형 당뇨병, 고지혈증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 골다공증, 탈모증, 조울증 및 뇌손상으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환을 치료하거나 예방하는 데에 유용한 글리코겐 합성효소 키나이제(GSK-3) 베타 억제제에 관한 것이다.

Wnt 유전자는 초파리의 발생을 조절하는 유전자(wingless)가 생쥐의 암 발생 유전자(Int-1)와 같은 것이라는 사실로부터 유래되었고, 그 이후 Wnt 신호전달체계는 약 20개의 유사 유전자군으로 구성되며, 이들은 특정 수용체, 즉 Frizzled 수용체(Fz)와 LRP5/6보조 수용체를 통하여 세포 내로 신호를 전달한다고 알려져 있다.

Fz와 LRP를 통해 전달된 신호는 Dvl(Dishevelled), APC(adenomatous polyposis coli), Axin을 거쳐, 궁극적으로는 글리코겐 합성효소 키나아제 베타(glycogen synthase kinase 3β; GSK3β)에 의한 β-카테닌의 활성화를 조절하고, 결과적으로 β-카테닌은 Wnt 신호전달체계의 핵심조절 인자이다.

한편, β-카테닌은 TCF(T-cell factor)/Lef(lymphoid enhancing factor)와 결합하여 다양한 유전자의 전사를 조절하고, β-카테닌을 포함한 Wnt 신호전달 구성 요소의 이상은 가장 대표적인 암 발생 인자이다.

또, GSK3β는 세린/트레오닌 단백질 키나아제로, 각종 수용체-연결된 신호 경로들에서 중추적인 역할을 수행한다. 이들 경로들 내에서의 이상조절은 몇몇 인간에 만연한 질환들, 예로서 II형 당뇨병, 알츠하이머병, 조울성 질환 및 신경퇴행성 질환들과 같은 중추신경계(CNS) 질환들 및 만성 염증성 증상들의 발생에 있어 결정적인 것으로 알려져 있다.

이들 질병들은 GSK3β이 어떤 역할을 하는 특정 세포 신호 경로들의 비정상적 작동에 의해 유발되거나, 또는 그러한 비정상적 작동을 일으킬 수 있다.

예를들어, 과도한 GSK3β 활성에 의해 인슐린 신호가 작동하지 않아 II형 당뇨병 및 고지혈증이 야기되며, 높아진 GSK3β 활성에 의해 과도한 Tau의 인산화가 일어남으로써 알츠하이머병이 야기되며, 과도한 GSK3β 활성에 의해 Wnt 신호가 작동되지 않아 골다공증, 탈모 등과 같은 질환이 야기된다.

또한, 줄기세포를 원하는 세포로 분화시키기 위해서는 Wnt 신호의 활성화가 중요한데, GSK3β 억제제에 의해 GSK3β 활성을 낮춤으로써 Wnt 신호를 활성화시켜 줄기세포의 분화를 촉진할 수 있다.

따라서, GSK3β 억제제를 개발함으로써 GSK3β 활성과 관련된 질환의 치료 또는 예방에 획기적인 전기를 마련할 필요가 있다.

본 발명의 목적은 GSK3β 활성과 관련된 질환 예를들어, II형 당뇨병, 고지혈증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 골다공증, 탈모증, 조울증 또는 뇌손상 등과 질환의 치료 또는 예방에 획기적인 전기를 마련할 수 있는 GSK3β 억제제를 개발하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열목록 1, 서열목록 3 및 하나 이상의 세린 또는 트레오닌이 인산화된 서열목록 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열목록에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 글리코겐 합성효소 키나이제(GSK-3) 베타 억제제를 제공한다.

상기 서열목록 1 및 서열목록 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열목록에 의해 표시되는 아미노산 서열은 세포 내에서 인산화되어야 하며, 상기 하나 이상의 세린 또는 트레오닌이 인산화된 서열목록 3은 서열목록 3의 6번 위치에 존재하는 세린 및 서열목록 1의 9번 위치에 존재하는 트레오닌이 인산화되는 것이 바람직하다.

상기 글리코겐 합성효소 키나이제(GSK-3) 베타 억제제는 II형 당뇨병, 고지혈증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 골다공증, 탈모증, 조울증 및 뇌손상으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환을 치료하거나 예방할 수 있다.

또한, 상기 글리코겐 합성효소 키나이제(GSK-3) 베타 억제제는 Wnt 신호를 활성화하여 줄기세포의 분화를 촉진할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자는 Wnt 신호의 수용체인 LRP6 또는 5의 세포내 서열 중 PPPSPxS 모티브(도 1의 아미노산 서열 참조)가 세포내 GSK3β를 직접 저해하는 것을 발견하였다.

즉, 상기 PPPSPxS 서열을 포함하여 좌우 10-15개 아미노산을 합한 서열인 miniCL이라는 서열(도 1의 아미노산 서열 참조)을 세포 내에서 과발현시켰을 때, 세포내 GSK3β 활성이 떨어져서 결국, 글루코겐 합성효소(glycogen synthase)의 인산화가 감소하며, β-카테닌의 레벨이 상승하는 것을 관찰하였다.

글루코겐 합성효소의 인산화는 인슐린 신호의 마지막 단계이며, β-카테닌의 레벨이 올라가는 것은 Wnt 신호가 활성화된 것을 의미한다. 따라서, 상기 서열은 인슐린 신호의 활성화도 증대시키며, Wnt 신호의 활성도도 증대됨을 확인할 수 있었고, 또한 Wnt 신호의 활성도가 증대되는 것은 개구리(Xenopus) 알에 직접 상기 서열을 찔러넣는 실험으로도 다시 확인할 수 있었다.

특히 본 발명자가 처음으로 사용한 miniCL 서열은 GSK3β 또는 CK1 보다 바람직하게는 GSK3β에 의해 인산화된 후에 비로소 GSK3β를 억제할 수 있었고, 이러한 특징은 인산화되지 않은 펩타이드가 그대로 약으로 사용되어 세포 내에서 작용한다면, 세포내 GSK3β의 활성이 병적으로 높아진 세포에 대해서만 GSK3β의 활성을 억제할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 GSK-3 베타 억제제를 질환 치료 또는 예방 조성물로 사용하는 경우에는 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 1 내지 10 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 이러한 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 조성물은 Wnt 신호의 수용체인 LRP6/5의 세포내 서열 중 일부 모티브를 이용한 것이므로, 안전하다.

본 발명에 따른 글리코겐 합성효소 키나이제(GSK-3) 베타 억제제는 세포 내 에서 과발현되면, 세포내 GSK3β 활성이 떨어져서 결국 글루코겐 합성효소(glycogen synthase)의 인산화가 감소하며, β-카테닌의 레벨이 상승하게 됨으로써 GSK3β 활성이 과도하게 상승되어 야기되는 질환 예를들어, II형 당뇨병, 고지혈증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 골다공증, 탈모증, 조울증, 뇌손상 등과 같은 질환을 치료하거나 예방하는 데에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 하기에 제시한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 트랜스펙션과 단백질 분석

1) 트랜스펙션을 위한 플라스미드 제조

LRP6의 miniCL (아미노산 잔기 1470 - 1510, 인간 LRP6 numbering; 서열목록 2)를 코딩하는 DNA조각은 인간 cDNA 라이브러리로부터 PCR을 이용하여 얻어졌으며, pEGFP-C1 벡터 (Clontech)의 HindIII와 BamH1 사이트에 GFP(Green fluorescence protein) 태그가 있는 단백질을 제작하기 위해서 삽입하였다. 이 벡터를 pEGFP-miniCL이라고 명명하였다.

LRP6의 miniCL 중 세린(S) 1490번을 알라닌(A)으로 치환한 LRP6 돌연변이체 (S1490A)를 제작하기 위해서 PCR 기반으로 돌연변이체를 제작하여, pEGFP-miniCLMT라고 명명하였다.

2) 항체 준비

항체는 제조자의 설명서를 참조하여 사용되었다. 마우스 모노클론 항체 (mouse monoclonal antibody)인 항-β-카테닌 (Santa Cruz), 항-GFP (Santa Crutz)과 토끼 폴리클론 항체 (rabbit polyclonal antibody)인 항-GSK3β (Cell signaling), 항-phospho GSK3β (Ser9) (Cell signaling), 항-포스포 LRP6 (Ser1490) (Cell signaling), 항-포스포-글리코겐 합성효소 (Ser641) (Cell signaling) 등이 사용되었다.

3) 트랜스펙션과 단백질 분석

pEGFP-miniCL 및 pEGFP-miniCLMT 벡터들은 HepG2 세포에 jetpei를 이용하여 제조자 설명서를 참고하여 트랜스펙션하였다. 즉, 2 μg DNA와 jetpei 혼합물을 HepG2 세포에 넣고, 시럼(serum)이 없는 조건에서 3시간 동안 둔 후에, 여기에 동 부피의 20% 시럼이 포함된 DMEM 배지를 첨가하였다.

24시간 후에 세포를 RIPA를 이용하여 모았으며, 곧바로 그 단백질 라이세이트(lysate) 20 μg을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. PVDF 막에 단백질을 트랜스퍼한 후, 시료들은 적절한 항체들과 인큐베이션한 후 웨스턴 블랏을 수행하였다.

대조군, miniCL(야생종) 및 miniCLMT(돌연변이종)는 하기에서 초록색 형광을 통해 검출하며, β-카테닌은 항-β-카테닌 항체를 이용하여 검출하며, 핵은 DAPI 염색에 의해 검출하였다. 각각 다음 실시예를 참조한다.

<실시예 2> 면역형광 염색

트랜스펙션된 HepG2 세포를 100% 메탄올로 20분간 -20℃에서 고정시켰다. PBS로 세정한 후에 블로킹 버퍼(PBS + 0.05% BSA)로 블로킹한 후에, 고정된 세포는 β-카테닌 항체로 실온에서 2시간동안 인큐베이션 시켰다.

다시 PBS로 세정한 후, 세포는 로다민(rhodamine)이 컨쥬게이션된 항-마우스 항체로 2시간 동안 인큐베인션 하였다. 핵을 보기 위해서, 세포는 DAPI로 5분동안 염색하였다. PBS로 세정한 후, β-카테닌, GFP와 DAPI를 형광현미경으로 관찰하였다.

도 2a에 도시된 바와 같이, 야생종 및 돌연변이종 miniCL이 모두 세포질에 골고루 퍼져 있었으나(GF), 야생종 miniCL만이 β-카테닌의 핵 내로의 이동을 촉진시켰다.

도 2b를 참조하면, β-카테닌은 항-β-카테닌 항체에 의해 검출하고, GSK3β에 의해 인산화된 GS의 레벨을 측정하는 p-GS는 항 글리코겐 합성효소(Ser641) 항체에 의해 검출하고, GSK3β의 인산화된 Ser9를 나타내는 p-S9-GSD-3β는 항-포스포 GSK3β(Ser9) 항체에 의해 검출하고, 트랜스펙션된 단백질 레벨은 모노클론 GFP 항체를 이용하여 검출하였으며, Pan-Ras는 로딩 대조군이다.

도 2b에 도시된 바와 같이, miniCL 트랜스펙션에 의해 β-카테닌의 증가된 레벨을 관찰할 수 있었다. 또한, 야생형 miniCL만이 글루코겐 합성효소의 인산화를 억제하였다.

<실시예 3> 루시퍼레이즈 분석

β-카테닌의 전사능력을 검토하기 위해서, Top-플래쉬와 Fop-플래쉬 벡터 [Vogelstein B과 Kinzler KW (Johns Hopkins Univ.)가 제공함]를 각각 293 세포에 트랜스펙션하였다. 즉, Top-플래쉬 및 Fop-플래쉬 루스퍼레이즈 리포터 LEF1 및 miniCL을 각각 293 세포에 트랜스펙션시켰다.

10 μl의 세포 라이세이트에 루시퍼레이즈 분석 키트 (Promega)를 이용하여 루시퍼레이즈 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 2c와 같이 트랜스펙션된 miniCL의 세포질 내 발현은 Top-플래쉬 활성을 유도하였으나, 돌연변이인 miniCLMT는 유도하지 못하였다.

<실시예 4> 인산화된 재조합 단백질의 발현과 정제

마우스 GSK-3β의 효소활성 도메인 (아미노산 잔기 27-393)과 CK1ε (아미노산 잔기 1-319)는 이전 보고와 같은 방법으로 발현되고, 정제되었다(Mol Cell 15: 511-521, 2004).

β-카테닌 N말단 부위 (아미노산 잔기 1-133)는 대장균에서 GST-융합 단백질로서 발현되었고, 글로타싸이온-아가로즈를 이용하여 정제되었다. GST-태그는 TEV 프로티에이즈로 잘랐으며, 반복적인 HiTrapQ 음이온 교환수지 크로마토그래피를 이용하여 제거하였다.

β-카테닌의 N말단 부위는 그후 CK1ε (0.28 mg/ml)을 37℃에서 20분 동안 50 mM Tris (pH 8.0), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드를 함유하는 버퍼에서 인큐베이션하여 인산화시켰다.

인산화된 β-카테닌 조각은 HiTrapQ 음이온 교환수지에 의해 사용된 CK1ε을 제거하기 위해 심화적인 정제과정을 거쳤다. 마우스 Axin GBD 단백질 (아미노산 잔기 512-530 mouse Axin numbering으로), LRP6 miniCL (아미노산 잔기 1470-1510 human LRP6 numbering으로), LRP6 miniCLMT (아미노산 잔기 1470-1510, Ser1490이 Ala으로 치환됨), LRP6 PPPSPxS (아미노산 잔기 1485-1497), and LRP6 PPPAPxS (아미노산 잔기 1485-1497, Ser1490이 Ala으로 치환됨)은 대장균에서 GST-융합 단백질들로서 발현되어 글루타싸이온-아가로즈를 이용하여 정제했으며, 상기와 동일하게 인산화 시키거나 인산화를 시키지 않았고, 연속적인 HiTrapQ 음이온 교환수지에 의해 심화 정제되었다.

최종적으로 GST-융합 단백질은 20 mM Tris (pH 8.0) 버퍼로 Centriprep (10 kDa cutoff, Millipore)를 이용하여 버퍼교환되었다.

이때, 사용된 펩타이드는 솔리드 페이즈 합성법에 의해 합성되었다. 사용된펩타이드의 서열은 도 1에 도시되어 있다. 모든 펩타이드의 N-말단과 C-말단은 바이오틴과 아미데이션(amidation)으로 각각 수식되어 있다.

바이오틴 결합은 sulfo-NHS-SS-biotin (Pierce)로 수행되었고, 합성된 펩타이드는 질량분석을 통해 순도와 합성정확도가 확인되었다.

<실시예 5> In vitro GSK3β 활성 측정

10% DMSO에 녹아 있는 펩타이드가 존재하는 조건에서 GSK-3β 활성을 측정하기 위해서, 반응 혼합물(7.5 μl)은 37℃에서 30분간 인큐베이션 하였다. 각 반응 혼합물은 50 mM Tris (pH 8.0), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-메르캅토에탄올, 1 mM ATP, 2 ng의 재조합 GSK3β, 7 μM의 프라임된 β-카테닌 N-말단 조각(CK1으로 세린 45번을 미리 인산화시킨 것; 1-133번 아미노산)과 동 부피(0.3 μl)의 다양한 농도의 실시예 4에서 합성된 합성펩타이드를 함유하였다.

반응은 SDS-로딩 버퍼를 넣고 끓임으로써 정지시켰으며, 결과물은 15% SDS-폴리아크릴 아마이드 젤로 분석하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, GSK3β 효소 활성에 의해서 upshift된 밴드의 강도를 IMAGEQUANT를 통해서 정량화하였다.

그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 두 곳 인산화된 펩타이드는 GSK3β에 대해 농도의존적으로 강한 저해효과를 보였지만, 인산화되지 않은 펩타이드는 100 μM까지는 저해효과를 보이지 않았다.

두개 중 한 곳 인산화된 펩타이드는 서로 다른 양상을 보여주었다. 즉, 두번째 세린 잔기에 인산화된 펩타이드는 약간의 저해효과를 보였지만, 첫번째 세린 잔기에 인산화된 펩타이드는 두 곳 인산화된 펩타이드와 가까운 저해효과를 보여주었다.

따라서, 두 곳 인산화된 펩타이드가 GSK3β를 직접 저해하며, 이 과정에서 첫번째 세린잔기의 인산화가 두번째 세린잔기의 인산화보다 중요하다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 인산화된 LRP6 펩타이드의 GSK3β에 대한 Ki 값 측정

50 mM Tris (pH 8.0), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-메르캅토에탄올, 1 mM ATP, 8 ng의 재조합 GSK3β, 6 μM의 프라임된 β-카테닌 N말단 조각과 다양한 농도의 두곳 인산화된 펩타이드를 함유한 30 μl의 반응혼합물은 37℃에서 인큐베이션 하였다.

각 시간 포인트마다, 7.5 μl씩 반응혼합물에서 SDS-PAGE 분석을 위해 취해졌다. GSK3β 활성은 쿠마시-염색된 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 앞서 언급한 방법으로 수행되었다.

시간별 GSK3β 활성 그래프에서, 초기 속도를 구한 후에, 하기 수학식 1을 이용하여 Ki값을 결정하였다.

[수학식 1]

(V₀/V_i) - 1 = [peptide]/K_i

두 곳 인산화된 펩타이드의 GSK3β에 대한 저해 상수(Ki)를 13μM로 steady-state kinetic analysis를 바탕으로 정하였고, 그 결과는 도 5에 도시된 바와 같이 인산화된 LRP6 모티프가 GSK3β의 인산화된 N말단 부위(Ki= ~700 μM)보다 훨씬 강한 저해제라는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6에 도시된 바와 같이, 두 곳 인산화된 펩타이드의 세 번째 프롤린(P)를 류신(L)으로 치환된 펩타이드는 야생종 두곳 인산화된 펩타이드에 비해 약 2배 정도 GSK3β 저해효과를 감소시켰다.

Axin GBD의 두 곳 인산화된 펩타이드의 GSK3β에 관한 활성저해 효과를 검토하기 위해서, 최종 1, 5, 10 μM의 GST-융합 Axin GBD를 7.5 μl의 반응 혼합물 속에 함께 첨가하였다.

즉, 실질적으로 Wnt/β-카테닌 신호와 관련이 있는 Axin complex 속의 GSK3β도 인산화된 LRP6 모티프에 의해 저해될 수 있는지를 검토하였다. 반응 혼합물 속에서 Axin에 결합한 GSK3β를 만들기 위해서, 정제된 Axin의 GSK3β 결합 도메인(GBD)을 첨가하였다.

비록 전체길이의 Axin은 GSK3β가 β-카테닌의 인산화하는 것을 드라마틱하게 증가시키지만, Axin의 GBD는 실제로는 도 7에 도시된 바와 같이 GSK3β 활성을 조금 감소시켰다.

두 곳 인산화된 PPPSPxS 펩타이드는 Axin에 결합한 GSK3β에 대해서도 강한 저해효과를 보였으며, 이는 아무것도 결합하지 않은 GSK3β에서 보인 효과와 일치한다.

Axin은 GSK3β의 활성부위에 결합하지 않으며, 인산화된 PPPSPxS 모티프가 Wnt/β-카테닌 신호에서 중요한 GSK-3β의 저해물질임을 확인할 수 있다.

<실시예 7> Xenopus laevis 배를 이용한 실험

Xenopus 배(embryo) 발생과정에서 Wnt는 GSK-3β의 활성을 저해하며, 저해된 GSK-3β 활성은 Xenopus 배의 두번째 체축을 유도한다고 잘 알려져 있다. PPPSPxS 모티프의 in vivo 효과를 관찰하기 위해서, 합성 펩타이드를 Xenopus 배 속에 극소량의 Xenopus Wnt8와 함께 주입하였다. 이때 주입된 Xenopus Wnt8은 두번째 체축을 유도할 만큼의 양은 아니었다.

Xenopus lavevis는 Xenopus I와 Nasco에서 구입하였다. 알은 800 U의 인간 chorionic gonadotropin(Sigma)를 이용하여 얻었다. 시험관 수정은 알려진 방법에 따라 수행되었다(Cell, 30: 675-686, 1982).

미세주입은 4% Ficoll-400(GE healthcare)를 포함한 0.33 x Modified Ringer (MR)에서 Nanoliter injector(WPI)를 이용하여 이루어졌다. 주입된 배는 0.33 x MR에서 stage 8까지 배양되었으며 이후 적절한 시기에 다다를 때까지 0.1 x MR로 옮겨졌다.

그 결과, In vitro에서 관찰했던 그 펩타이드들의 GSK-3β에 대한 저해효과와 매우 유사하게, 도 8과 같이 두곳 인산화된 펩타이드는 두번째 체축을 강하게 유도했지만, 인산화되지 않은 펩타이드는 두번째 체축형성에 도움을 주지 못하였다.

첫번째 세린 잔기에 인산화된 펩타이드는 두곳 인산화된 펩타이드 만큼 두번째 체축형성을 유도하였다. 이는 인산화된 PPPSPxS 모티프가 in vivo의 Wnt 유도체라는 것을 나타낸다.

하지만, Xenopus Wnt8 없이 단독으로 펩타이드를 주입했을 때에는 두번째 체축을 유도하지 못하였다. 이는 펩타이드 주입에 대한 실험적인 한계에서 비롯되었을 것으로 판단되며, 외부의 Wnt에 의해 약간의 GSK-3β 활성감소가 있는 상태에서만, 주입한 펩타이드가 Wnt/베타카테닌 신호를 활성화시킬 정도로 충분히 GSK-3β 활성저하를 야기시킬 것으로 추정하였다.

<실시예 8> GST-융합 단백질의 인산화 및 파웨스턴 블랏 분석

GST-융합 단백질의 인산화를 위해서 15 μg의 GST-융합 단백질이 4시간 동안 37℃에서 0.2 μg의 재조합 GSK3β와 0.4 μg의 재조합 CK1ε를 10 μl의 50 mM Tris (pH 8.0), 10 mM MgCl₂ _, 10 mM 2-메르캅토에탄올 버퍼에서 인큐베이션 하였다.

GST-융합 LRP6 조각 단백질들은 GSK3β와 CK1를 이용하여 인산화시켰고, 결합된 GSK3β가 GST-miniCL과 GST-miniCLMT 밴드 위에서 관찰되었지만, GST-PPPSPxS나 GST-PPPAPxS 밴드 위에서는 관찰되지 않았다.

LRP6의 세포내 부분, 즉 miniCL이 GSK3β와 인산화에 의존적으로 결합하는지를 검토하기 위하여, 재조합 GST-융합 LRP6 조각들 (miniCL, miniCLMT, PPPSPxS, PPPAPxS)과 GSK3β 단백질을 파웨스턴 블랏 실험(far western blot)을 통한 in vitro 결합실험을 수행하였다.

즉, 5 μg의 GST-융합 단백질 (GST-miniCL, GST-miniCLMT, GST-PPPSPxS, GST-PPPAPxS)을 SDS-PAGE 분석한 후 PVDF 막에 일렉트론 트랜스퍼 하였다. PVDF 막은 5% 탈지분유를 포함한 TBST [ 20 mM Tris (pH 7.6), 137 mM NaCl, 0.05% Tween 20]로 1시간동안 블로킹한 후에, TBST로 행구었다.

그리고, PVDF 막은 0.1 μg의 재조합 GSK3β를 넣은 5% 탈지분유를 포함한 TBST에서 인큐베이션 하였다. GSK3β의 결합은 토끼 항-GSK3β 항체를 이용하여 검출하였다.

도 9에 도시된 바와 같이, S1490A 치환은 LRP6가 GSK3β에 결합을 하는 데에는 영향을 끼치지 않았지만, LRP6 조각의 인산화는 4-5배 정도의 결합을 증가시켰다. 이는 LRP6/5의 Ser/Thr cluster가 인산화 되었을 때, GSK3β와의 결합력이 더 커지는 것을 나타낸다.

다음으로 Axin에 결합된 GSK3β가 인산화된 LRP6 조각 (miniCL)와 결합할 수 있는지를 검토하기 위해서, GSK3β를 과량의 Axin GBD 단백질을 넣어서 GSK3β- Axin GBD 결합체를 만들고, 이것이 LRP6 조각과 결합하는데 어떤 영향을 미치는 지를 조사하였다.

도 10에 도시된 바와 같이, LRP6 조각들에 대한 GSK3β 결합은 Axin GBD에 의해 큰 영향이 없었으며, 이는 Axin GBD-GSK3β-LRP6 miniCL 간의 3중 결합체의 형성되었음을 나타내주고 있다.

종합적으로 살펴보면, GSK3β는 Axin과 LRP6/5와의 결합을 LRP6/5의 Ser/Thr 클러스터를 통해서 매개한다고 판단된다.

도 1은 본 발명에 따른 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제로서의 아미노산 서열목록을 도식화한 것이고,

도 2a는 본 발명에 따른 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제로 트랜스펙션된 세포내 분포를 형광 이미지로 나타낸 것이고,

도 2b는 본 발명에 따른 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제로 트랜스펙션된 세포의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이고,

도 2c는 본 발명에 따른 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제로 트랜스펙션된 세포의 Top-플래쉬 루시퍼레이즈 분석에 의한 Wnt/β-카테닌 신호 활성을 나타낸 것이고,

도 3은 In vitro GSK3β 활성을 나타낸 것이고,

도 4는 LRP6 모티브의 인산화 상태에 따른 PPPSPxS의 GSK3β 활성을 나타낸 것이고,

도 5는 인산화된 LRP6 모티브의 Ki를 나타낸 것이고,

도 6은 PPPSPxS 모티브의 세 번째 프롤린을 류신으로 치환한 펩타이드의 GSK3β 활성을 나타낸 것이고,

도 7은 Axin GBD과 무관한 인산화된 LRP6 모티브의 GSK3β 활성을 나타낸 것이고,

도 8은 Xenopus 배에 주입된 PPPSPxS 모티브의 효과를 나타낸 것이고,

도 9 및 도 10은 Axin의 존재 유무에 따른 LRP6 모티브에 대한 GSK3β의 결 합능력을 나타낸 것이다.

<110> Institute for research and industry cooperation, PNU <120> Glycogen synthase kinase beta inhibitor <130> DP-SL-2008-0031 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> miniCL <400> 1 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Lys Gly Thr Tyr Phe Pro Ala Ile Leu 1 5 10 15 Asn Pro Pro Pro Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ser His Tyr Thr Met Glu 20 25 30 Phe Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Pro Ser 35 40 <210> 2 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> miniCLMT <400> 2 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Lys Gly Thr Tyr Phe Pro Ala Ile Leu 1 5 10 15 Asn Pro Pro Pro Ala Pro Ala Thr Glu Arg Ser His Tyr Thr Met Glu 20 25 30 Phe Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Pro Ser 35 40 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PPPSPxS <400> 3 Leu Asn Pro Pro Pro Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ser His 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PPPAPxS <400> 4 Leu Asn Pro Pro Pro Ala Pro Ala Thr Glu Arg Ser His 1 5 10

Claims

서열목록 1, 서열목록 3 및 하나 이상의 세린 또는 트레오닌이 인산화된 서열목록 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열목록에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제.
제 1항에 있어서, 상기 서열목록 1 및 서열목록 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열목록에 의해 표시되는 아미노산 서열은 세포 내에서 인산화되는 것을 특징으로 하는 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 하나 이상의 세린 또는 트레오닌이 인산화된 서열목록 3은 서열목록 3의 6번 위치에 존재하는 세린 및 서열목록 1의 9번 위치에 존재하는 트레오닌이 인산화된 것을 특징으로 하는 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제.
제 3항에 있어서, 상기 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제는 II형 당뇨병, 고지혈증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 골다공증, 탈모증, 조울증 및 뇌손상으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환을 치료하거나 예방하는 것을 특징으로 하는 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제.
제 3항에 있어서, 상기 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제는 Wnt 신호를 활성화하여 줄기세포의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 글리코겐 합성효소 키나이제 베타 억제제.