KR101294725B1 - 인산화된 ｇｒａｓｐ를 포함하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물 - Google Patents

인산화된 ｇｒａｓｐ를 포함하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인산화된 GRASP(Golgi reassembly stacking protein)을 포함하는 단백질 폴딩이상으로 인한 질병 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인산화된 GRASP를 포함하는 약학 조성물을 이용하면, 낭포성섬유증의 치료뿐만 아니라 단백질의 폴딩이상으로 인하여 발생되는 질병을 치료할 수 있어 유용하다.

Description

인산화된 ＧＲＡＳＰ를 포함하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical Composition for Treating of Cysctic Fibrosis Comprising Phosphorylated GRASP}
본 발명은 인산화된 GRASP(Golgi reassembly stacking protein)을 포함하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
낭포성섬유증(Cystic Fibrosis)은 백인에게서 흔하게 나타나는 치명적인 유전성 질환으로, 유럽의 경우 2000-2500명 당 1명의 비율로 발생하고 있다. 낭포성섬유증은 fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR) 유전자의 돌연변이에 의해 발생하고, 가장 흔한 돌연변이인 △508은 낭포성섬유증 환자의 90% 이상에서 나타난다. CFTR은 여러 상피조직에서 음이온통로로 작용하는 중요한 세포막 단백질이다. CFTF은 골지(Golgi)를 통한 전형적인 분비 경로(conventional secretory pathway)를 통해 세포막에 도달하고 이 과정에서 글라이코실화(glycosylation) 되는 전형적인 당단백질(glycoprotein)이다. 따라서 정상적으로는 복잡한 형태의 글라이코실화를 가지는 성숙된 CFTR (band C라고도 불림)이 상피조직의 내강막쪽에 발현한다. △508 돌연변이의 경우 단백질 폴딩이상(protein misfolding)을 일으켜 ER에 머물다가 결국 ER-관련 분해(ER-associated degradation (ERAD)) 과정을 거쳐서 분해되게 된다. 결과적으로 △508-CFTR의 경우 거의 세포막에 도달하지 못하며, 세포 내에서 코어-글라이코실화(core-glycosylation)된 비성숙된 형태 (band B라고도 불림)로 존재하게 된다. 그러나 △508-CFTR의 경우 세포막에 도달하게 되면 일부 Cl- 이온통로기능을 유지하고 있는 것으로 알려져 있다.
GRASP65와 GRASP55은 포유세포에 존재하는 미리스토이레이티드 단백질(myristoylated protein)로써 골지 어셈블리(Golgi assembly)와 관계된다고 보고되어 있다. 최근, D. discoideum에 존재하는 상동(homologue)인 GrpA의 경우 수용성 세포질 단백인 AcbA의 비전형적 경로를 통한 이동에 관여한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 초파리의 dGRASP이 인테그랄(integral) 세포막 단백인 α-integrin의 비전형적인 경로를 통한 이동에 필요하다는 것이 밝혀졌다.
인산화는 단백질의 기능에 negative 영향을 줄 수 있는데, 그 한 예로 PKC라는 인산화효소에 의해서 양이온통로 단백인 TRPC6의 S448이 인산화되면 TRPC6의 양이온통로 기능이 억제된다(Journal of Biological Chemistry, Vol. 285, 40534, 2010).
최근 낭포성섬유증을 치료를 목적으로 △508-CFTR의 세포막 발현을 회복시킬 수 있는 약물 혹은 생물학적 제재를 찾고자 하는 연구가 활발히 진행되어 오고 있으며, GRASP가 CFTR의 세포막으로의 비전형적인 이동에 관여한다는 연구가 발표된 바 있다(Molecular cell Biology, Vol.10, 154, 2009).
그러나, GRASP를 이용하여 미스폴딩된(misfolding) CFTR의 세포막 발현을 회복시킬 수 있는지, 특히 인산화된 GRASP를 과발현시킴으로써 미스폴딩된 CFTR의 세포막 발현을 회복시키고 이에 따라 낭포성섬유증을 비롯하여 단백질 폴딩이상으로 인한 질병을 치료할 수 있는지에 대하여 명확히 밝혀진 바 없다.
이에 본 발명자들은 GRASP가 미스폴딩된 CFTR의 세포막 발현을 회복시키는 기전을 밝히고, GRASP의 유사분열 시 GRASP의 인산화 정도에 의해 단백질의 활성이 조절된다는 점에 착안하여 인산화된 GRASP를 과발현시킴으로써 미스폴딩된 CFTR의 세포막 발현을 효과적으로 회복시킬 수 있음을 확인하고, GRASP를 포함하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 인산화된 GRASP를 포함하는 약학 조성물을 제공하여, 코어-글라이코실화된 CFTR의 세포막 이동을 촉진함으로써, 낭포성섬유증을 치료하고, 나아가 단백질의 폴딩이상에 의해 발생하는 질병을 치료하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 인산화된 GRASP(Golgi reassembly stacking protein) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 인산화된 GRASP는 미스폴딩된(misfolding) CFTR을 회복시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 인산화된 GRASP(Golgi reassembly stacking protein) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 단백질 폴딩 이상(protein misfolding)으로 인한 질병 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 인산화된 GRASP 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 상향조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 작용제임을 판별하는 단계를 포함하는 단백질 폴딩 이상으로 인한 질병 치료용 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한,
(a) 인산화된 GRASP 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 GRASP 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 유전자의 발현량이 상향조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 작용제임을 판별하는 단계를 포함하는 단백질 폴딩 이상으로 인한 질병 치료용 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, GRASP를 인산화시켜서, 제 1항의 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 GRASP는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 서열번호 1은 GRASP55, 서열번호 2는 GRASP65 단백질의 서열목록을 나타낸 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 폴딩이상으로 인한 질병은 낭포성섬유증, 마르판 증후군, 파브리병, 색소성 망막염 3, 알츠하이머병, 제2 당뇨병 및 파킨슨병으로 구성된 군에서 선택되는 것이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다(Beremans Ltd., Nick Miller, 2004).
본 발명에 있어서, 상기 인산화는 GRASP의 441번 위치의 세린(Serine)이 인산화되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시료"는 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 양 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRCpress), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다. RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 단일가닥 cDNA를 제조한다. 이어, 단일가닥 cDNA를 주형으로 이용하고, 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 유전자-특이적 프라이머 세트는 하기 표 2에서 열거 되어 있다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 유전자의 발현량 변화를 측정한다.
단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체에는, 희석제, 부형제, 붕해제 및 결합제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피아, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명에 따른 인산화된 GRASP를 투여하면, CFTR의 C 말단과 GRASP가 상호결합함으로써 CFTR이 비전형적인 이동경로를 통해 세포막으로 이동하여 세포막 발현 효과가 나타나게 되고, 따라서 낭포성섬유증을 치료할 수 있고, 낭포성섬유증 이외에도 단백질 폴딩이상으로 인해 발생되는 질병들을 치료할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "단백질 폴딩"이란 단백질이 개개의 단백질에 고유한 접힌 구조를 만드는 과정을 의미하며, "단백질 폴딩이상(protein misfolding)" 단백질의 적절한 접힘이 이루어지지 않음으로써 구조적으로 미스폴딩되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 인산화된 GRASP를 포함하는 약학 조성물을 이용하면, 낭포성섬유증의 치료뿐만 아니라 단백질의 폴딩 이상으로 인하여 발생되는 질병을 치료할 수 있어 유용하다.
도 1은 HEK 293세포 내에서 ER에서 골지(ER-to-Golgi)로의 이동 억제 후의 코어-글라이코실화된 CFTR의 표면 발현에 관한 실험 결과를 나타낸 것이다(A-C)세포 표면에서 CFTR은 바이오티닐레이션되고 면역블럿팅되었음, (D)CFTR 표면 라벨링, (E) 면역세포화학,(F) WT-CFTR의 전체 세포 Cl- 흐름, (G) △508-CFTR의 전체 세포 Cl- 흐름).
도 2는 GRASP가 코어-글라이코실화된 CFTR의 비전형적인 표면 이동에 관여함에 관한 실험 결과를 나타낸 것이다((A-B) HEK293 세포는 WT(A) 또는 △508-CFTR(B)로 트랜스펙션됨, (C) STX3 또는 STX18 결실은 코어-글라이코실화된 CFTR에 영향을 미치지 않음, (D) 다양한 세포주에서 GRASP55 및 GRASP65의 발현, (E-F) 우성-음성 GASP55 G2A 돌연변이 E는 GRASP55 결실은 WT(E) 및 △508-CFTR(F)의 비전형적인 멤브레인 이동을 막음).
도 3은 CFTR-GRASP 간의 단백질-단백질 결합에 관한 실험 결과를 나타낸 것이다((A-B) 면역침강 및 풀-다운 분석에서 사용된 CFTR 및 GRASP의 계통도(schematic diagram), (C) 단백질 샘플은 anti-Myc(GRASP55)로 침강되고 anti-HA(CFTR)로 면역블럿팅됨, (D-F) 면역침강법을 이용한 GRASP와 상호작용하는 CFTR 도메인의 확인, (G) 풀-다운 분석).
도 4는 GRASP 의존적인 비전형적 이동의 상향조절에 의한 △508-CFTR의 회복에 관한 실험 결과를 나타낸 것이다((A) 정상 및 낭포성섬유증 환자의 췌관 세포 유래의 CAPAN-1 및 CFPAC-1 세포의 우성 발현, (B-C) CFPAC-1 세포에서 CFTR의 비전형적인 이동에 있어서 GRASP65의 역할, (D-F) HEK293 세포에서 GRASP 과발현에 의한 △508-CFTR의 회복, (G) 마우스 성장, (H) 생존 분석, (I) CFTR에 의한 short circuit current (Isc), (J) 면역염색(immunostaining)).
도 5는 낮은 온도에서 탑시가르긴(thapsigargin)을 처리한 경우의 코어-글라이코실화된 CFTR의 표면 발현에 관한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 도1A-도1C의 면역블럿팅 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 CFTR Cl- 채널활성의 마이크로플루오메트릭(microfluorometric) 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 도 2A의 면역블럿팅 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 도 2B의 면역블럿팅 이미지를 나타낸 것이다.
도 10은 탑시가르긴(thapsigargin)에 의해 유도되는 코어-글라이코실화(core-glycosylated)CFTR의 세포막 이동에 GRASP가 필요한지를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 탑시가르긴(thapsigargin)으로 처리한 세포 내에서 GRASP55의 표면 발현에 관한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 GRASP에 의한 △508-CFTR의 회복에 CFTR의 C 말단 PDZ결합 부위의 역할에 관한 실험 결과를 나타낸 것이다((A)△508-CFTR의 표면 발현에 있어서 PDZ 결합 모티프 결실의 영향, (B) 전체 세포 Cl- 흐름 측정).
도 13은 GRASP55(TgGRASP55)로 형질전환된 마우스에 관한 실험 결과를 나타낸 것이다((A)GRASP55-음성 및 GRASP55-양성 한배새끼(littermate)로부터 다양한 조직 용해물의 면역블럿팅, (B) TgGRASP55(+) 마우스와 CftrF508del 마우스의 교배).
도 14는 마우스 콜론에서 short circuit current(ISC)의 대표적인 흔적을 나타낸 것이다.
도 15는 GRASP의 인산화 여부를 알아보기 위한 밴드 이동(band shift) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 GRASP의 인산화 위치를 알아보기 위한 질량 분석법(mass spectrometry) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 GRASP의 441번 위치가 △508-CFTR의 회복에 미치는 영향을 알아보기 위한실험 결과를 나타낸 것이다.
코어- 글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR 의 세포막 이동에 관한 분자적 기전의 확인
ER 형태의 CFTR이 세포막에 도달할 수 있는지를 확인하기 위해서, 우리는 HEK293 세포에서 전형적인 골지(Golgi)를 통한 이동 기전을 막았다 (도 1). 먼저, 우리는 안테로그래이드 코트 프로틴 콤플렉스 II(anterograde coat protein complex II (COPII)) 복합체의 중요한 요소인 Sar1의 우성-음성 형태(dominant-negative form)를 사용하여 COPII를 매개로 한 ER에서 골지(ER-to-Golgi)로의 이동경로를 억제하였다. GDP가 결합한 돌연변이 형태의 Sar1-T39N은 CFTR의 글라이코실화를 완전하게 억제하였지만, ER 형태의 CFTR이 세포막에 존재함을 표면 바이오닐레이션(surface bioinylation)을 통해서 알 수 있었다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 바이오틴(biotin)이 표지된 단백만 분리한 분획에는 세포질 혹은 ER 단백의 오염은 없었다. 주목할 만한 것은 Sar1 돌연변이에 의해 ER에서 골지로의 이동경로가 막혔을 때 WT-CFTR 뿐만 아니라 △508-CFTR도 세포막에 도달하였다는 것이다. 우성-음성(Dominant-negative) Arf1-Q71L 혹은 syntain (STX) 5를 과발현시켜서 전형적인 ER에서 골지로의 이동경로를 막았을 때도 같은 현상을 관찰할 수 있었다 (도 1C). Arf1은 COPI 콤플렉스(complex)의 구성요소이다. COPI은 주로 pre-Golgi나 골지에서 ER로의 역방향으로의 이동경로를 매개한다고 알려져 있지만, ER에서 골지로의 vesiculotubular 요소들의 전진 이동에도 관여한다. STX는 표적 용해성의 N-ethylmaleimide (NEM)-sensitive factor attachment 단백질 수용체(t-SNARE)의 하나로써 COPII 소포체의 골지 멤브레인과의 융합에 필요하다. STX5의 과발현은 다른 SNARE 단백과의 수적인 불균형을 일으켜서 ER에서 골지로의 이동경로를 억제한다는 것이 이전에 보고되었다. 도 1C에서 볼 수 있듯이, STX5의 과발현은 ER에서 골지로의 이동경로를 억제하여 CFTR 글라이코실화를 방해하는 반면에 STX13 (endosome recycling에 관여함)의 과발현에서는 이러한 현상이 나타나지 않는다. 따라서 돌연변이 Sar1 혹은 Arf1를 발현시키거나 STX5를 과발현시켜서 ER에서 골지로의 이동경로를 억제하더라도 비성숙한 코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR은 세포막에 도달하는 것을 알 수 있다. 표면 레이블링(Surface labeling (도 1D))과 면역형광 현미경검사(immunofluorescence microscopy (도 1E)) 결과로 위의 결과와 일치하였다.
세포막에 도달한 코어- 글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR 의 이온통로기능 확인
세포막에 도달한 비성숙한 코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR은 이온통로기능을 가지고 있을 것인지를 알아보았다. 도 1F에서 볼 수 있는 것처럼 ER에서 골지로의 이동경로가 막혔을 때도 WT-CFTR의 Cl- 전류는 대조군과 비슷하였다. 이것은 비전형적인 이동경로를 통해서 세포막에 도달한 CFTR도 이온통로기능을 가지고 있다는 것을 의미한다. 더욱이 ER에서 골지로의 이동경로 차단 시 세포막에 도달한 △508-CFTR도 WT-CFTR의 10-15%에 해당하는 Cl- 전류를 나타내었다 (도 1G). [Cl-]i-sensitive fluorophore와 microfluorometry를 이용하여 세포막 Cl- 투과성(permeability) 측정결과에서도 ER에서 골지로의 이동경로 차단 시 △508-CFTR이 기능하고 있음을 알 수 있었다.
코어- 글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR 의 세포막 이동경로의 특성 확인
코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR이 세포막으로 이동하는 비전형적인 이동경로의 특성을 규명하고자, 코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR의 세포막에 이동에 관여하는 인자들을 조사하여 보았다. WT-CFTR (도 2A)과 △508-CFTR (도 2B)을 발현하는 세포에서 전형적인 이동경로를 차단하고 표면 바이오티닐레이션(surface biotinlyation) 실험을 수행하였다. 바이오틴(Biotin)이 표지된 세포막 단백분획에는 세포질이나 ER 단백의 오염되지 않았음을 대조군 면역블럿(immunoblot)을 통해 알 수 있다 (도 8 및 9). 20 ℃에서 세포를 배양하면 trans-Golgi network (TGN)에서 세포막으로 과는 과정을 억제한다고 알려져 있지만 코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR의 세포막 이동에는 별다른 영향을 주지 않았다. 하지만 코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR의 세포막 이동은 NEM, nocodazole 및 ATP 제거에 의해서 억제되었다 (도 2A 및 2B). NEM은 SNARE의 기능을 억제하여 세포막 융합을 억제한다고 알려져 있고, nocodazole은 미세소관(microtubule)을 해중합(depolymerization)시켜 그 기능을 억제한다. 따라서 코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR이 세포막으로의 이동하는 경로는 세포막 융합 및 미세소관의 기능을 필요로 하고 에너지를 소비하는 능동적인 과정이나 TGN에서 세포막으로 이동하는 과정을 포함하지는 않는다. 이러한 여러 가지 요건을 만족하는 메커니즘 중의 하나가 ER 멤브레인과 세포막의 직접 융합이다. STX18은 ER에 존재하는 tSNARE로써 ER-mediated phagocytosis와 같이 ER과 세포막의 직접 융합이 일어날 때 작용한다고 알려져 있다. 하지만, siRNA을 이용하여 STX18의 기능을 억제한 경우에도 CFTR의 비전형적인 경로를 통한 세포막 이동은 영향을 받지 않는다. 더욱이 Rab1, Rab6, Rab11, STX3 및 STX16과 같은 기존에 CFTR의 세포 내 이동에 관계된다고 보고된 여러 인자들을 siRNA로 그 기능을 제거한 경우에도 코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR의 세포막 이동은 별다른 영향을 받지 않았다 (도 2C(STX3)).
면역블럿팅 , 면역침강 및 면역형광염색
면역침강을 위해서 세포 혹은 조직을 라이시스 버퍼(lysis buffer) (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 200 mM NaCl, 1% (v/v) Nonidet P-40, 0.25% (v/v) sodium deoxycholate 및 complete protease inhibitor mixture (Roche Applied Science, Mannheim, Germany))를 이용하여 용해물을 만든 후, 적절한 일차항체와 섞은 후 4 ℃에서 overnight 배양하였다. 면역침강체는 protein A/G bead을 이용하여 분리하였으며 이후 라이시스 버퍼로 네 번 세척하였다. 면역블럿팅(Immunoblotting)은 단백질 샘플을 2X sodium dodecyl sulfate (SDS) buffer와 섞은 후 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행하여 분리하였다. 분리된 단백은 나이트로셀룰로즈 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰고, 이후 일차항체 및 이차항체로 처리한 후 enhanced chemiluminescence (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)로 현상하였다.
마우스 대장조직의 동결절편은 조직을 optimal cutting temperature (OCT) compound (Miles, Elkhart, IN)에 넣고 액체질소로 동결시킨 후 4-㎛ 두께의 절편으로 만들었다. 세포의 경우에는 커버슬립(coverslip)에다가 배양 후 트랜스펙션(transfection) 후 2일 후에 면역형광염색을 수행하였다. 동결절편 및 세포를 -20 ℃에서 10분간 메탄올 처리하여 고정 및 permeabilization 시켰다. 항체의 비특이적 반응을 없애기 위해 블러킹 배지(blocking medium) (5% goat serum, 1% bovine serum albumin, 및 0.1% gelatin in 0.1 mL of phosphate-buffered saline (PBS))를 이용해서 블러킹한 후, 적절한 일차항체 및 형광염료가 붙어 있는 이차항체를 처리하였다. CFTR M3A (Millipore, Billerica, MA), calnexin (Abcam, Cambridge, MA), BiP (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), β-actin, HA, Myc, GRASP55 및 GRASP65 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 항체는 구입하여 사용하였다. 마우스 대장의 면역형광염색은 CFTR R4 항체를 사용하여 수행하였으며 이 항체는 이전에 보고되었다. 형광사진은 Zeiss LSM 710 confocal microscope (Carlzeiss, Berlin, Germany)을 이용하여 얻었다.
표면 바이오티닐레이션 ( Surface biotinylation ) 및 표면 효소결합면역흡착검사( surface enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ))
트랜스펙션(transfection) 이틀 후, HEK 293 세포를 4 ℃에 두고 PBS로 세 번 세척하였다. 이후 세포에 sulfo-NHS-SS-biotin (Pierce, Rockford, IL)를 30분간 처리하여 세포막 단백에 바이오틴(biotin)을 표지하였다. 이후 quenching buffer을 사용하여 반응하지 않은 바이오틴을 제거한 후 PBS로 두 번 세척하였다. 세포를 용해시킨 후, 아비딘 비드(avidin bead (UltraLink Immobilized NeutrAvidin Beads 10%, Pierce))와 4 ℃에서 overnight동안 반응시켰다. 아비딘에 붙은 단백들만 침전시키고 이후 라이시스 버퍼로 세 번 세척하였다. 바이오틴이 표지된 단백들을 2X 샘플 버퍼를 사용하여 분리해 낸 후 이후 면역블럿팅을 진행하였다. 표면 ELISA는 extracellular HA epitope-tagged CFTR 플라스미드1을 이용하여 수행하였다. 트랜스펙션한 지 이틀 된 HEK 293 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정한 후, 블러킹 버퍼(blocking buffer) (PBS with 2 mg/mL bovine serum albumin, 4% nonfat milk, 및 1% fish gelatin)로 blocking하였다. 세포를 HA 항체로 1시간 처리한 후 horseradish peroxidase (HRP)가 붙어 있는 이차항체로 반응시켰다. 이후 HRP의 기질인 o-phenylenediamine (OPD, Sigma, Louis, MO)를 넣어 상온에서 15분간 반응시켰다. 발색반응은 405 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 분석하였다.
풀 다운 분석( Pull - down assays )
모든 재조합 단백들은 BL-21 (DE3) Escherichia coli strain을 이용하여 만들었다. glutathione-S-transferase (GST) 혹은 His6가 붙은 단백을 0.5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 이용하여 30 ℃에서 induction하였다. 이후 GST가 붙어 있는 단백은 glutathione SepharoseTM beads (Amersham Bioscience)를 이용하여 분리하였고, His6가 붙은 단백은 니켈-나이트릴로트라이아세트산 단백질 정제 시스템(nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) protein purification system (Qiagen))을 이용하여 정제하였다. 정제된 His6가 붙은 단백를 Glutathione SepharoseTM에 붙어 있는 50 ㎍ GST가 붙어 있는 단백과 섞어 주었다. 4 ℃에서 overnight동안 반응시킨 후, 비드에 결합되어 있는 단백을 세척하고 SDS 샘플 버퍼로 분리해 낸 후, 면역블럿팅을 진행하였다.
RT - PCR 분석
HEK 293세포의 전체 RNA를 TRIZOL (Invitrogen)을 이용하여 분리하였다. AccuScriptTM High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 RNA를 42℃에서 60분간 역전사반응을 시켜서 cDNA로 만들었다. RT-PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다. STX3, 정방향 프라이머 5'-GAC CGT CTG GAG CAG CTG AA-3' 및 역방향 프라이머 5'-GAC GTT GTT GGC CCT TTT CT-3'; STX18, forward primer 5'-CGG TGG ACA TCA CGC TGC TA-3' and reverse primer 5'-GGG CAT CCT GGT CTA TCT GG-3'; and β-actin, 정방향 프라이머 5'-GAC CCA GAT CAT GTT TGA GAC C-3' 및 역방향 프라이머 5'-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3'. PCR 증폭과정은 95 ℃에서 10분 동안 initial PCR 활성화 단계(activation step), 95 ℃에서 1분 동안 변성 단계(denaturation step), 55 ℃에서 1분 동안 어닐링 단계(annealing step), 및 72 ℃에서 1분 동안 확장 단계(extension step)이였고, 30회 반복하였다. PCR 산물은 Tris/acetic acid/EDTA buffer 로 만들어진 2% 아가로스겔에서 분리한 후 ethidium bromide을 이용하여 관찰하였다.
Cl - 채널의 활성 측정
HEK 293세포에서 CFTR의 Cl- 이온통로기능은 홀-셀 패치 클램프(whole-cell patch clamp)를 이용하여 기록하였다. 피펫 용액(Pipette solution) 조성은 140 mM N-methyl d-glucamine chloride (NMDG-Cl), 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 1 mM Tris-ATP 및 10 mM HEPES (pH 7.4)이였고, bath solution의 조성은 140 mM NMDG-Cl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glucose 및 10 mM HEPES (pH 7.4)이였다. 모든 실험은 상온에서 진행하였다. 세포를 홀-셀 컨피겨레이션(whole-cell configuration)으로 만든 후, CFTR을 아데닐산고리화효소 액티베이터(adenylyl cyclase activator)인 5 mM 포스콜린(forskolin)으로 활성화시켰다. CFTR에 의한 전류는 다음과 같은 세가지 특징을 가지고 있다. 1) cAMP (forskolin)에 의해 전류가 활성화 됨, 2) 직선형의 전류-전압 관계, 3) CFTR 억제제 CFTRinh-172 (10 mM)에 의해 전류가 억제됨. 전류 측정시의 홀딩 포텐셜(holding potential)은 0 mV였고, 커런트 아웃풋(current output)은 5 kHz로 필터링(filtering)하였다. 전류는 AxoScope 8.1 시스템과 Digidata 1322A analog/digital converter (Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 디지털화하였다. -80 mV에서의 평균 전류를 current density (pA/pF)으로 나타내었다. CFTR 억제제인 CFTRinh-172는 Sigam-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
Microfluorometric [ Cl - ] i 측정
CFTR에 의한 Cl-/NO3 - 이온교환기(exchanger) 활성을 Cl--quenching fluorescent indicator N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide (MQAE) (Molecular Probes, Eugene, OR)를 이용하여 측정하였다. CFPAC-1이나 HEK 293 세포에 MQAE를 10 mM 농도로 상온에서 30분, 얼음에서 40분간 처리하였다. MQAE가 처리된 세포를 Zeiss inverted microscope (Axio Observer A1, Carlzeiss)에 둔 다음 Cl- 버퍼를 관류시켜 주었고 적당한 부분을 선택하여 활성을 측정하였다. CFTR에 의한 MQAE 형광 변화는 MetaView software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)을 이용하여 350 nM 파장으로 활성화시킨 형광을 460 nM에서 측정함으로써 관찰하였다. Cl- 투수성(permeability)을 측정하기 위해서 세포를 HEPES-buffered solution A (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM d-glucose 및 10 mM HEPES (pH 7.4))를 관류시켜 주다가 10 mM 포스콜린과 함께 용액 A의 Cl-을 NO3 -로 대체한 NO3 --함유 용액으로 바꾸어 주었다. MQAE 형광 증가는 Origin software package (Ver 8.1, OriginLab, Northhampton, MA)을 이용하여 기준치 보정 후 계산하였다.
Shot - circuit current 측정
마우스 대장 조직을 떼어낸 후 근육 및 결체조직을 제거하고, 세로방향으로 절개한 다음 Ussing chamber (World Precision Instruments, Stevenage, UK)에 장착하였다. Ussing chamber의 노출면의 면적은 12.6 mm2이였다. 조직의 양 측면은 10 mL의 HCO3 --buffered solution (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM d-glucose, 5 mM HEPES 및 25 mM NaHCO3 (pH 7.4))로 관류하였고, 용액(solution)의 온도는 37 ℃로 유지하였고, 95% O2-5% CO2 gas로 버블링하였다. 조직은 EVC-4000 voltage clamp (World Precision Instruments)을 이용하여 0 mV로 voltage-clamping하였으며 short-circuit currents (Isc)은 PowerLab data acquisition system (AD Instruments, Castle Hill, Australia)를 이용하여 측정하였다.
통계 및 생존분석
결과는 반복된 결과값의 평균±표준오차로 표시하였다. 통계분석은 Student t test을 하거나 Turkey's multiple comparison test 후 분산분석을 하였다. 생존분석은 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 분석하였으며 각 실험군 사이의 차이는 log-rank method로 분석하였다. P value가 0.05미만일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
이하,본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 CFTR의 단백질 폴딩이상에 의한 낭포성섬유증의 치료 효과만을 확인하였으나, 본 발명에서 규명한 GRASP와 미스폴딩된 CFTR의 세포막 발현 회복간의 분자적 기전내용을 토대로, 인산화된 GRASP의 과발현을 통해 낭포성섬유증뿐만 아니라 단백질 폴딩이상으로 인해 발생되는 다른 질병에도 치료 효과를 얻을 수 있음은 당업자에게 자명한 사항이다.
1-1: 플라스미드( plasmids ), 세포 배양 및 트랜스펙션( transfection )
세포주에서 발현 가능한 GRASP 플라스미드를 만들기 위해서 인간 GRASP55 (accession number NM_015530.3)의 코딩 영역을 HEK 293세포의 상보적인 DNA로부터 중합반응을 통해 증폭하였다. GRASP65 플라스미드는 I.M.A.G.E consortium (clone accessions BC07854.1)에서 구입하였다. GRASP55와 GRASP65의 코딩 영역은 EcoRI 및 KpnI 제한효소를 이용하여 pCMV-Myc 벡터 (Clontech, Mountain View, CA)에 삽입하였다. GRASP55와 GRASP65의 G2A 돌연변이 플라스미드는 중합효소반응을 이용하여 점돌연변이화하여 제작하였다. His6을 가지는 GRASP55 도메인 특이적 플라스미드들은 다음과 같은 (Full length [아미노산 1-452], PDZ1 [아미노산 5-75], PDZ2 [아미노산 86-169], PDZ1+PDZ2 [아미노산 1-198], 및 SPR domain [아미노산 212-452]) 중합효소 산물을 박테리아 발현 플라스미드인 pET-28C(+) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 EcoRI과 XhoI를 이용하여 삽입하여 만들었다. pCIneo-HA-STX5와 pCIneo-Myc-Sar1 플라스미드는 Singapore, National University of Singapore의 B. L Tang 교수가, pcDNA3-HA-Arf1 플라스미드는 Japan, Kyoto University의 S. Wakatsuki 교수가, pCMV-CFTR (pCMVNot6.2) 은 Canada, Hospital for Sick Children의 J. Rommens 박사가 각각 제공하였다. 세포주에서 발현 가능한 HA-tagged CFTR 플라스미드들은 전에 논문에 발표되었다. HEK 293 세포는 10% fetal bovine serum과 penicillin (50 IU/mL)/streptomycin (50 ㎍/mL)을 첨가해 준 Dulbecco's modified Eagle's medium-HG (Invitrogen, Carlsbad, CA) 배지를 사용하여 배양하였다. HEK 293 세포에 플라스미드를 트랜스펙션하기 위해서 Lipofectamine Plus Reagent (Invitrogen)을 이용하였다. 낭포성섬유증 환자의 췌장 상피에서 유래된 CFPAC-1 세포는 10% fetal bovine serum과 penicillin (50 IU/mL)/streptomycin (50 ㎍/mL)을 첨가해 준 Iscove's modified Dulbecco's medium (Invitrogen) 배지를 사용하여 배양하였다. GRASP, syntaxin 및 대조군 scrambled siRNA는 Dharmacon (Lafayette, CO)에서 구입하였다. siRNA는 HEK 293 혹은 CFPAC-1 세포에 DharmaFect (Dharmacon)를 이용하여 트랜스펙션하였다.
1-2: 마우스( mouse )
CftrF508del 마우스는 USA, University of Utah의 K. R. Thomas로부터 제공받았다. 본 연구에서 TgGRASP55 마우스를 새롭게 제작하였다. pCMV-Myc-GRASP55 플라스미드를 SphI과 ScaI 제한효소 처리하였다. 제한효소로 처리된 CMV 프로모터, Myc-에피토프(epitope), 인간 GRASP55 코딩 서열(coding sequence) 및 SV40 poly A signal을 포함하는 2.5 kb 크기의 DNA 단편(fragment)은 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 이용하여 아가로스겔로부터 추출하였다. 4 ng/mL의 농도로 추출된 DNA fragment를 C56BL/6 마우스의 단일세포 배아에 현미주사(microinjection)하여 주입하고, 단일배아는 대리모에 착상시켰다. 현미 주사한지 3주 후에 태어난 새끼 마우스를 CMV 프로모터 및 GRASP55 코딩 영역의 일부분을 증폭시키는 프라이머 (5'-CGT GGA TAG CGG TTT GAC TC-3' 및 5'-TCT TGT ACC CGC AGA ACG TG-3')를 사용하여 genotyping을 하였고 후에 C57BL/6 마우스와 교배하여 유지하였다. GRASP55의 germ-line transmission이 확인되고 GRASP55 단백의 발현이 강한 두 개의 수컷(male) 마우스를 선택하였고, 이후 C57BL/6 마우스와 6세대 이상 backcrossing을 하여 형질전환된 TgGRASP55 마우스를 확립하였다. 마우스를 이용한 실험은 연세의학센터(Yonsei Medical Center) 실험동물연구규정에 따라 진행되었으며, 본 연구는 연세의학센터의 실험동물위원회의 승인(연구계획서 승인번호 09-213)을 받았다. 마우스는 사료 제한을 가하지 않았으며 12시간 light cycle로 유지하였다. CftrF508del 마우스와 TgGRASP55(+) 마우스를 교배하여 F1 세대에서 TgGRASP55(-) CftrWT /F508del 및 TgGRASP55(+) CftrWT /F508del 마우스를 얻었다. 이후 이들 F1 세대 마우스를 교배하여 F2 세대에서 TgGRASP55(-) CftrWT / WT, TgGRASP55(-) CftrF508del/F508del, TgGRASP55(+) CftrWT / WT, TgGRASP55(+) CftrF508del /F508del의 유전자형을 가지는 4 종류를 마우스를 얻어서 실험에 사용하였다.
GRASP 과발현에 의한 △ 508- CFTR 의 세포막 발현 회복 확인
2-1: 코어- 글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR 의 세포막 이동과 GRASP 간의 관련성 확인
포유세포에 존재하는 미리스토이레이티드 단백질(myristoylated protein)로써 골지 어셈블리(Golgi assembly)와 관계된다고 알려진 GRASP이 코어-글라이코실화(core-glycosylated)도니 CFTR의 세포막 이동에 필요한지를 알아보기 위해, 우리는 돌연변이 형태의 GRASP55-G2A을 과발현시키거나 GRASP55-specific siRNA를 처리함으로써 GRASP55의 기능을 억제하였다. GRASP G2A 돌연변이는 myristoylation을 억제하여 GRASP이 멤브레인으로부터 떨어지도록 한다. 흥미롭게도 GRASP55의 기능을 억제하면 WT와 △508-CFTR의 비전형적 경로를 통한 세포막으로의 이동 또한 억제되었다 (도 2E 및 2F).
2-2: CFTR 과 GRASP 의 상호결합 여부 확인
CFTR과 GRASP이 서로 상호결합을 하는지를 조사하였다. 도 3A과 3B는 단백-단백 상호작용 연구에 사용된 CFTR 및 GRASP55 플라스미드의 도메인 구성을 보여주고 있다. 평상시에는 GRASP65만 CFTR과 약한 결합을 나타내었고, GRASP55는 결합하지 않았다. 주목할 만한 것은 면역침강실험에서 Sar1-T39N 돌연변이나 STX5를 과발현시켜서 전형적인 이동경로를 차단한 경우 코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 CFTR과 GRASP의 결합력이 강해지는 것을 알 수 있다 (도 3C). 도메인 특이적인 CFTR 플라스미드를 사용하여 실험한 결과, PDZ-바인딩 모티프(PDZ-binding motif)를 포함하고 있는 CFTR의 C-말단이 GRASP55와의 결합에 중요한 역학을 한다는 것을 알 수 있다 (도 3D, 3E 및 3F). 또한 GRASP55의 PDZ 도메인 (PDZ1)이 CFTR의 C-말단에 결합함을 확인하였다(도 3G).
2-3: GRASP 과발현에 의한 △ 508- CFTR 의 세포막 발현 회복
GRASP 기능 증가가 △508 돌연변이에 의한 장애를 교정할 수 있는지를 조사하였다. 놀랍게도 HEK 293세포에서 GRASP55나 GRASP65을 과발현시킨 것만으로도 △508-CFTR의 세포막 발현을 회복시켰다 (도 4D). GRASP 과발현에 의한 △508-CFTR의 세포막 발현 회복 정도는, ER 스트레스를 유도할 뿐만 아니라 CF 환자의 췌장에서 유래된 CFPAC-1 세포주에서 성숙하게 글라이코실화된(maturely glycosylated) △508-CFTR의 세포막 발현을 유도하는 것으로 알려진 탑시가르긴(thapsigargin)을 처리한 것과 비슷한 정도였다.뿐만 아니라, GRASP에 의한 세포막에 발현된 △508-CFTR이 전형적인 CFTR Cl- 이온통로로 작용한다는 것을 홀-셀 패치 클램프(whole-cell patch clamp) 실험을 통해 알 수 있었다 (도 4E 및 4F). △508-CFTR의 C-말단의 PDZ-binding motif을 결손(DC4) 시킨 경우 GRASP의 교정효과가 사라지는 것을 통해 GRASP과 특이적 결합이 △508-CFTR의 회복에 중요하다는 것을 알 수 있다 (도 12).
2-4: GRASP 과발현에 의한 △ 508- CFTR 의 세포막 발현 회복(마우스 실험)
GRASP에 의한 CFTR의 세포막 이동이 실제 체내에서 생태병리학적인 의미를 가질 수 있는 알아보기 위해, 우리는 GRASP 기능증가가 CFTR의 이동과 활성에 미치는 영향을 마우스모델에서 알아보기로 하였다. GRASP55를 과발현하는 형질전환마우스(TgGRASP55)을 제작하였고, △508-CFTR (CftrF508del) 마우스와 교배하였다 (도 13). WT-CFTR나 △508-CFTR가 동형접합체(homozygote)인 마우스들만 실험에 사용하였다. TgGRASP55 마우스의 경우 6개월 정도까지 관찰한 결과 외관상에 결손이나 장애는 없었다. 그러나 CftrF508del 마우스의 경우 기존에 보고된 것과 같이 심각한 성장장애를 보였다. 중요한 것은 이러한 CftrF508del 마우스의 성장장애가 GRASP55의 발현에 의해 완벽하게 회복되었다는 것이다 (도 4G). 모든 CftrF508del 마우스의 경우 10주 정도되면 사망하였다. 놀랍게도 형질전환에 의한 GRASP55의 발현은 CftrF508del 마우스의 생존을 회복시켜서, 우리가 관찰한 3개월 동안 19마리 중에서 1마리만 사망하여 사망률이 5% (1/19)에 불과하였다 (도 4H). 마우스에서 △508 돌연변이는 호흡기보다는 소화기에서 장애를 일으킨다고 알려져 있다. 1개월 정도 되었을 때 일부 마우스를 희생시켜 대장조직을 이용하여 기능측정 실험을 하였다. GRASP55의 발현은 CftrF508del 마우스 대장에서 CFTR에 의한 short circuit current (Isc)을 WT 마우스와 비교했을 때 63% 정도까지 회복시켰다 (도 4I 및 도 14). 이와 더불어 surface biotinylation (도 13)과 면역형광조직염색 (도 4J) 실험 결과, 형질전환에 의한 GRASP55의 발현은 대장 crypt cell의 내강막 쪽에 코어-글라이코실화(core-glycosylated)된 △508-CFTR의 세포막 발현을 회복시킨다는 것을 알 수 있었다.
인산화된 GRASP 의 기능 확인
인산화된 GRASP의 △ 508-CFTR의 세포막 발현 회복
GRASP의 인산화 여부를 알아보기 위해 먼저 band shift assay을 진행하였다. 이 방법은 인산화됨에 따라 SDS-PAGE상에서 밴드가 위쪽으로 이동하는 것을 이용하는 것으로, 박테리아에서 정제한 재조합 His6-GRASP55 full-length(FL), His6-SPR 도메인 및 His6-GRASP 도메인을 각각 nocodazole, 탑시가르긴(thapsigargin)(TG) 처리한 혹은 27 ℃에서 배양한 HEK 293 세포의 추출물(extract)와 섞어서 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 웨스턴블럿팅을 진행하고 anti-His antibody을 이용해서 현상하였다. 그 결과, UPR-포함하는 시료(UPR-inducing agent)인 TG을 처리했을 때 양성대조군인 nocodazole을 처리했을 때와 마찬가지로 GRASP55 FL 및 SPR 도메인이 위로 이동되었고, 인산화가되지 않는다고 알려진 GRASP 도메인의 경우에는 밴드 이동(band shift)이 나타나지 않음을 확인하였다(도15).
상기 band shift assay와 같은 방법으로 TG을 처리한 HEK 293 추출물(extract)과 정제한 His6-GRASP 도메인을 섞어서 반응시킨 후, SDS-PAGE을 진행한 후 쿠마시 염색(Coomassie staining)을 하였다. 이후 His6-GRASP 도메인에 해당하는 밴드를 오려내고 어느 위치가 인산화되었는지를 알아보기 위해 질량 분석법(mass spectrometry) 분석을 수행하였다. 그 결과 두 개의 위치(S441, S451)가 TG에 의해 인산화되었음을 알 수 있었다. 이 중 score value(57>45)도 더 높고, 여러 종(human, rat, mouse, chicken)에서 보전되어 있는 S441 위치에 대해 추가적인 실험을 진행하였다(도 16).
다음으로, S441 위치가 GRASP55에 의한 ΔF508의 교정에 미치는 영향을 알아보기 위해 S441 위치를 PCR-기반의 돌연변이유발(PCR-based mutagenesis)을 통해 비인산화 형태(non-phosphorylated form)인 S441A(441번째 serine을 alanine으로 치환함)와 인산화 형태(phosphor-mimetic form)인 S441D(serine을 glutamate로 치환)로 바꾼 GRASP55을 제작하였다. 이후 GRASP55, GRASP55 S441A 및 GRASP55 S441D를 ΔF508-CFTR과 같이 HEK 293 세포에 트렌스펙션한 후 표면 바이오티닐레이션(surface biotinylation)을 진행하였다. 그 결과, GRASP55와 GRASP55 S441D는 비슷한 효과를 나타내는 반면에, GRASP55 S441A의 경우 효과가 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 S441 위치의 인산화가 GRASP55의 ΔF508 교정 효과를 나타내는데 필요하다는 것을 의미한다(도 17).
이상으로, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (19)

  1. 인산화된 GRASP(Golgi reassembly stacking protein) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 GRASP는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 인산화된 GRASP는 미스폴딩된(misfolding) CFTR을 회복시키는 것을 특징으로 하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 인산화는 GRASP의 441번 위치의 세린(Serine)이 인산화되는 것을 특징으로 하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물.
  5. (a) 인산화된 GRASP 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 상향조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 작용제임을 판별하는 단계를 포함하는 낭포성섬유증, 마르판 증후군, 파브리병, 색소성 망막염3, 알츠하이머병, 제 2 당뇨병 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 단백질 폴딩 이상(protein misfolding)으로 인한 질병 치료용 작용제를 스크리닝하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 GRASP는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 단백질 폴딩 이상으로 인한 질병 치료용 작용제를 스크리닝하는 방법.
  7. (a) 인산화된 GRASP 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 GRASP 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 유전자의 발현량이 상향조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 작용제임을 판별하는 단계를 포함하는 낭포성섬유증, 마르판 증후군, 파브리병, 색소성 망막염3, 알츠하이머병, 제 2 당뇨병 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 단백질 폴딩 이상으로 인한 질병 치료용 작용제를 스크리닝하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 GRASP는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 단백질 폴딩 이상으로 인한 질병 치료용 작용제를 스크리닝하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 5 항에 있어서,
    상기 질병은 낭포성섬유증으로 인한 질병 치료용 작용제를 스크리닝하는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서,
    상기 질병은 낭포성섬유증으로 인한 질병 치료용 작용제를 스크리닝하는 방법.
  13. 제 5항에 있어서,
    상기 인산화는 GRASP의 441번 위치의 세린(Serine)이 인산화되는 것을 특징으로 하는 낭포성섬유증 치료용 작용제를 스크리닝하는 방법.
  14. GRASP를 인산화시켜서 제 1항의 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물을 제조하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 GRASP는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물을 제조하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 인산화는 GRASP의 441번 위치의 세린(Serine)을 인산화시키는 것을 특징으로 하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물을 제조하는 방법.
  17. 인산화된 GRASP(Golgi reassembly stacking protein) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 낭포성섬유증, 마르판 증후군, 파브리병, 색소성 망막염3, 알츠하이머병, 제 2 당뇨병 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 단백질 폴딩 이상으로 인한 질병 치료용 약학 조성물.
  18. 삭제
  19. 제 17항에 있어서,
    상기 인산화는 GRASP의 441번 위치의 세린(Serine)이 인산화되는 것을 특징으로 하는 단백질 폴딩 이상으로 인한 질병 치료용 약학 조성물.
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