KR100275591B1

KR100275591B1 - 단백질 키나아제 npk-110

Info

Publication number: KR100275591B1
Application number: KR1019970702885A
Authority: KR
Inventors: 만델코우 에크하트; 만델코우 에바-마리아; 비니르나트 자세크; 드레베스 게라르트
Original assignee: 크리스타 헤르 조크; 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 뷔센샤프텐 이.브.
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 2001-02-01
Also published as: US20030104516A1; WO1996013592A2; CN1168699A; US20040038361A1; NZ295371A; AU3870295A; JPH10508199A; ATE417930T1; NO971966L; WO1996013592A3; US7485712B2; US6579691B1; EP0791067B1; MX9703101A; NO971966D0; DE69535901D1; AU714636B2; HUT77081A; EP0791067A2; CA2203910A1

Abstract

본 발명은 단백질 키나아제에 관한 것으로서,

DNA 서열은 미세소관에 결합되는 중요한 위치에서 단백질(MAP)이 결합된 다른 미세소관 뿐만 아니라 tau 단백질을 인산화는 신경 단백질 키나아제(NPK)를 코딩하며, 또한 세린 또는 트레오닌 잔기 및 상기 MAP 상에서 NPK에 의해 인산화된 상기의 잔기로 구성되는 에피토프에 관한 것이며, 상기 단백질 키나아제에 특이적으로 결합된 항체, 상기 단백질 키나아제에 저해제로 구성되는 의약적 조성물, 특히 알츠하이머병 및 암을 치료하며, 진단 키트 및 알츠하이머병 및 암의 검출을 위한 실험관내에서의 진단방법을 특징으로 한다.

Description

단백질 키나아제 NPK-100

제1도 : 뇌로부터 키나아제 활성에 의해 인산화된 4개의 반복 및 여러자리를 함유한 K18(Gustke 등, 1992)하는 tau의 막대 도표(이소형 htau 40, 중심 신경조직에서 가장 큰 것, Goedert 등, 1989).

N-말단 근처의 도해된 박스는 분화된 스플라이싱 때문에 결여된 삽입물이며 1 내지 4로 표시된 상기 박스는 반복을 나타낸다. 최대로 인산화된 자리는 반복영역 외부의 Ser-Pro 또는 Thr-Pro 요소 내에 있지만 뇌 키나아제 활성은 반복영역내, Ser262 및 Ser356의 두자리를 인산화한다.

제2도 : 돼지 뇌로부터 NPK110의 분리.

(A) 상기조직 추출물은 포스포셀룰로오즈상에 가하고, 0.15 내지 1MNaCl로 단계별 희석되었다. 칠해진 막대는 희석된 물질의 총 단백질 농도를 나타내며, 공 막대는 기질로서 tau 구성 K18로 측정되는 활성도를 나타낸다.

(B) 0.35 내지 0.5M NaCl로 희석된 물질은 황화 암모늄 침전물로 전달되었고 상기 침전물은 투석되고 Q-세파로즈 컬럼상에 가한다. 상기 폐기호는 단백질 농도를 나타내고, 개방기호는 활성단면을 나타낸다. 상기 구배 조성물은 우축상에 표시되어 있다.

(C) Q-세파로즈로부터의 프랙션 8 내지 15는 투석되고 SP-세파로즈 컬럼상에 가했다.

(D) SP-세파로즈로부터의 프랙션 12 내지 16은 투석되었고 Mono Q HR 5.5 컬럼상에 가했다.

(E) Mono Q로부터의 프랙션 9 내지 11은 슈퍼덱스 200 겔 여과 컬럼상으로 걸렸다. 분자량 지표들의 희석위치는 우축상에 표시되었다.

제3도 : ATP-세파로즈상 친화성 크로마토그래피에 의한 NPK110의 최종정제(SDS-PAGE, 레인 1 내지 3) 및 겔 내 인산화에 의한 특징화(자기 방사법, 레인 4 내지 6).

겔 여과 컬럼으로부터 가장 활성된 프랙션(레인 1)은 ATP 친화성 컬럼상에 걸렸다. 상기 키나아제는 5mM ATP로 특이적으로 희석되었다(레인 2M3). 은색으로 염색된 겔은 대략 110kDal의 분자량을 갖는 흐린 밴드를 나타내며, 두 번째로 95kDal 의 뚜렷한 밴드를 나타낸다. 레인 4-6은 레인 1-3내 시료의 겔 내 인산화의 방사능 사진을 나타낸다.

기질로서 tau(5μM)는 겔 매트릭스로 중합된다. 원형회복 및 g-³²p ATP와의 배양 후, 단지 110kDal 밴드는 tau를 향한 키나아제 활성을 제시한다는 것을 명백하게 나타낸다.

제4도 : 야생형 tau의 인산화 및 NPK110에 의한 K18(미세소관 결합 영역)건조.

Htau(10μM, 레인 1, 2) 및 2mM g-³²p-ATP로 37℃에서 2시간동안 인산화되었다. 분취량은 7-20% SDS 구배 겔 상에서 전기영동되었다 ： 레인 1, 2, 인산화 전후의 htau40, 레인 3, 4 인 산화 전후의 K18 레인 2 및 4내에서 표시된다.

제5도 : 야생형 tau(htau 40)의 트립신 포스포펩타이드 지도 및 NPK110으로 인산화된 K18 건조.

30 ㎍의 tau는 0.5 μU NPK110 으로 37℃에서 2시간 동안 인산화되었다.

(A) 전신대 4-반복 tau(Htau 40)

(B) K18 건조 (MT 결합영역, 전신대 tau의 잔기 244-372)

(C) 가장 현저한 스폿(Spot)의 도표： 상단 우측의 스폿 1은 Ser262를 함유하며, 상단 우측의 스폿 2는 Ser 356, 스폿 3(하기 1)은 Ser305, 스폿 4(항상 이중으로 중복되는 부분)은 Ser324, 스폿 5는 ser293을 함유한다. (상기 트립신 펩타이드 CGSK 는 아마도 작은 크기 때문에 HPLC 컬럼으로부터 회수되지 않는다. 그러나 상기 스폿은 자리-유도성 돌연변이 유발에 의해 확인될 수 있다).

(C) (A) 및 (B) SO 나타낸 포스포펩타이드로부터 유도된 총계(10,000cpm)의 동등한 양의 혼합물. (C)에 나타낸 인산화 자리의 동정은 HLPC-정제된 및 서열화된 펩타이드의 2차원적 분석에 의해 실시되었다(표 1에 명시됨). 10,000cpm의 정제된 각 펩타이드는 단독으로 5000cpm 분취량과 결합하여 분석되었다.

제6도 : tau의 미세소관과의 결합을 철폐하는 Ser262의 인산화.

(A) 분류적-안정된 미세소관(30 ㎛)으로의 tau의 결합은 실시예 2내 하기에 기술된 공침강 분석으로 측정되었다. 전상대 야생형 tau(′wt′, htau 40) 및 Ala 돌연변이체인 Ser262(10 ㎛)는 37℃에서 2시간동안 NPK110(최종농도 8.5 μU/ml)로 앞서서 인산화되었다. 곡선들은 비-선형 회귀에 의해 수득되었다(Biernat 등, 1993). 야생형 tau의 결합은 인산화에 의해 완전히 철폐되었고(폐환), 반면에 A262 돌연변이체는 더 낮은 친화성(삼각형)을 가지고 있음에도 불구하고 여전히 결합되어 있다. 대조를 위해, 탈인산화된 tau의 결합 또한 나타나 있다(개방환).

(B) NPK110에 의한 인산화 동안 성립된 미세소관-결합 tau.

htau 40(10 ㎛)은 분류적-안정된 미세소관(30 ㎛)과 함께 배양되었다.

t = 0에서 NPK110은 최종농도 10μU/ml에 첨가되었고, 분취량이 1시간으로부터 20시간까지의 시간 간격으로 빠져나왔고 펠렛이 되었다. tau는 SDS 겔의 밀도계에 의해 (펠렛 및 상청액을)측정되었다(폐환). 혼입된 인은 겔 조각의 체렌코프(Cerenkov)계산에 의해 측정되었고(개방환), 우축상에 지시되었다. 미세소관 없이 tau내 혼입된 인은 더 빠르게 진행되는 것이 나타나있다(정사각형).

제7도 : 미세소관의 암영역 영상 검경 및 tau 상 Ser262의 인산화 효과.

미세소관(5㎛ 소관)은 2. 5㎛ tau(이소형 htau 40) 및 10 μU/ml 의 NPK110 의 존재하에서 바다 성게 정자 축사상에서 응집되었다. A ：ATP 없이 20분. B ： ATP 존재. A에서 상기 미세소관은 계속적으로 성장하며, B에서 Ser262는 미세소관은 불안정화 및 축소를 야기하는 인산화가 될 수 있다. 바아 = 10㎛

제8도 : 암영역 검경에 의해 측정된 축사 응집된 미세소관의 길이상 탈인산환 및 NPK110-인산화 tau의 효과.

각 조건 500 내지 600 미세소관 플러스 말단이 측정되기 위해 ； 상기 평균길이가 시간에 대해 표시되었다. 소관 농도는 5㎛였고, tau 첨가없이는 상기 농도내 미세소관이 관찰되지 않는다는 것을 주목하라.

tau는 모든 경우내에서 2.5㎛였다. 대조군 실험에서 ATP는 생략되었다.(′-ATP′)

(A) NPK110에 의해 미리-인산화된 tau는 미세소관 성장(채워진 환)을 촉진하지 않지만 미리-인산화된 점 돌연변이체 A262 성장을 촉진한다(삼각형, 도6BSO 시간에 따른 결합 분석).

(B) 튜뷸린과 tau는 4℃에서 2mM Mg-ATP의 존재(폐환)또는 부재(개방환)내 10μU/ml 의 NPK110(최종농도)와 혼합되었다. t=0에서, 온도는 37℃까지 올린다. 야생형 tau와 함께 ATP 없이, 미세소관은 계속적으로 성장하였다(개방환) ； 상기 같은 결과는 돌연변이체 Ser262-Ala가 수득된다(삼각형). 그러나 야생형 tau와 ATP의 합은 수반되는 축소 아닌 개시 성장을 야기한다(폐환).

(C-E) BS내 상응하는 곡선의 5분 및 30분에서의 미세소관 길이 히스토그램. 각 시료는 5분 후에 20㎛ 주변에서 피크를 나타낸다(공환). Mg-ATP가 비었다면, (C) 또는 Ser262는 Ala(E)로 돌연변이화되었고, 상기 분포는 30분에서 더 넓어졌고, 더 길어진 길이로 바뀌었다. 대조적으로 tau의 인산화는 배양(D)의 30분내에 평균 미세소관 길이를 성공적으로 감소시켰다.

제9도 : 야생형 tau(gtau 40) 및 (A)뇌 추출물, (B)NPK110, (C)PKC 또는 (D) PKA로 각각 인산화된 K18 건조의 트립신 포스포펩타이드 지도.

상기 스폿의 번호 매김은 제5도와 유사하다(스폿 1：Ser262, 스폿 2：Ser356, 스폿 3：Ser305, 스폿 4：Ser324, 스폿 5：Ser293). 우측상 틀은 각 키나아제에 대한 전상대 tau의 상응하는 2차원적 포스포아미노산 분석을 나타낸다.

제10도 : tau-미세소관 상호반응상 다른 인산화 자리의 영향을 나타내는 다이아그램.

Ser/Thr-Pro 요소의 대부분은 반복 영역의 측면 영역내에 있으며, tau의 결합상에 적은 영향만을 미친다. 상기 반복 4영역은 여러 인산화될 수 있는 비-Ser-Pro자리, 특히 4개의 KXGS 요소를 함유한다. 상기의 첫 번째 KIGS 요소내 Ser262는 미세소관 결합상에 훨씬 더 큰 영향을 미친다.

제11도 : NPK110에 의해 인산화된 재조합 MAP2c의 포스포펩타이드 지도.

펩타이드는 하기의 인산화된 잔기를 함유한다 ： I=Ser1707, Ⅱ=Ser1676, Ⅲ=Ser37 및 Ser1536, Ⅳ=Ser1792, Ser1796 및 Ser1799(잔기의 번호매김을 Albala 등에 따른다. 1993).

제12도 : NPK110에 의해 인산화된 MAP4 융합 단백질의 포스포펩타이드 지도.

펩타이드는 하기의 인산화된 잔기를 함유한다. Ⅰ=Thr829, Ⅱ=Ser941, Ⅲ=Ser928, Ⅳ=Thr873, Thr874 및 Thr876, Ⅴ=Ser899 및 Ser903, Ⅵ=Ser1073, Ⅶ=Ser928(잔기의 번호매김은 West 등에 Ek른다. 1991)

제13도는 탈인산화된 및 NPK110-인산화된 MAP4, MAP2 및 MAP2c의 암영역 검경에 의해 측정된 축사 응집된 미세소관의 길이상에 미치는 효과.

각 조건 500 내지 600 미세소관 플러스 말단이 측정되었다.： 평균 길이는 시간에 대해 점으로 표시되었다. 튜뷸린 농도는 5μM이었으며： MAP은 1μM이었다. MAP의 추가 없이는 상기 농도에서 미세소관이 발견되지 않는다는 것을 주목하라.

(a) 튜뷸린과 MAP4는 2mM Mg-ATP의 존재(폐환)또는 부재(개방환) 내 10μU/ml 의 NPK110(최종농도)와 4℃에서 혼합되었다. MAP4는 있고 ATP가 없으면, 미세소관은 계속적으로 성장한다(개방환). 그러나 MAP4 플러스 ATP는 MAP4가 인산화되어서 미세소관으로부터 분리되고, 미세소관이 불안정하기 때문에 기질 감소(폐환)을 제외한 초기의 성장을 유도한다.

(b) MAP2를 사용하지 않고 같은 실험을 하며, 유사한 결과가 산출된다.

(c) MAP2c를 사용하지 않고 같은 실험을 하며, 유사한 결과가 산출된다.

제14도는 마커 cDNA 프로브로, 성인 및 태아의 사람 조직의 노던 블롯.

좌측 ： 성인 조직

레인 1 ： 이자(Pa)

레인 2 ： 신장(Ki)

레인 3 ： 근육(Mu)

레인 4 ： 간(Li)

레인 5 ： 폐(Lu)

레인 6 ： 태반(P1)

레인 7 ： 뇌(Br)

레인 8 ： 심장(H)

우측 ： 태아조직

레인 9 ： 신장(Ki)

레인 10 ： 간(Li)

레인 11 ： 폐(Lu)

레인 12 ： 뇌(Br)

제15도 : 재조합 야생형 MAP2C 및 MAP2C 점 돌연변이체의 p110 마커에 의한 인산화의 영향하에서 택솔로 안정된 미세소관과의 결합(30uM 튜뷸린 다이머).

개방환 ： 비인산화된 야생형 MAP2c. 상기 결합은 단단하며(약 0.25μM의 Kd), 주위의 17μM 리간드 또는 2개의 튜뷸린 다이머 당 약 1개의 MAP2c 분자를 포화한다. 폐환 ： p110마커(2.0milliUnits/ml ； 1 Unit는 30 ℃에서 1분당 MAP2c로 이동되는 인의 1μmol과 일치한다)로 2시간동안 미리 인산화된 야생형 MAP2c. 상기에 본질적으로 결합이 없다는 것을 주목하라. 폐 및 개방 사각형 ： p110마커(2.5milliUnit/ml)로 2시간동안 미리 인산화된 MAPcA319 및 MAP2cA350. 상기 돌연변이체 내에서 첫 번째 또는 두 번째 반복영역내 KXGS 요소내의 세린 319 또는 350 은 알라닌으로 점 돌연변이되었다. 미세소관에 대한 친화성은 화학량론 잔류물이 야생형 MAP2c와 유사하더라도 현저하게 감소한다.(Kd≒7uM). 삼각형 ： p110 마커(2.5 milliUnits/ml)로 2시간 동안 미리 인산화된 MAP2cA319/A350. 상기 돌연변이체에서 세린 319 및 350 모두는 알라닌으로 돌연변이 되었다. 탈인산화된 단백질과 유사한 상기 결합은 인산화에 대한 민감성이, 2개의 KXGS 요소가 더 이상 인산화할 수 없기 때문에 사라진다는 것을 나타낸다.

제16도 : 암영역 검정에 의해 측정된 자가-응집된 미세소관의 길이 상에서 탈인산화되었고 p110마커-인산화된 MAP(A), MAP2(B), MAP2c(C) 및 MAP2c 점 돌연변이체의 효과

각 조건 500 내지 800의 미세소관이 분석되고 상기 평균 길이는 시간에 대해 점으로 표시되었다. 튜뷸린 농도는 모든 경우에 10μM 이었고, MAP4 및 MAP2의 농도는 1μ이었고, MAP2c의 농도는 2 μM이었다. 대조군 실험에서, ATP는 생략되었다('-ATP-').

A, B 및 C내 개방환 ：MAP은 ATP 없이 2.5 mUnits/ml p110 마커(최종농도)로 30분 동안 전배양되었다. 10μM 튜뷸린을 첨가함에 의해 미세소관은 응집되었으며 평균 미세소관 길이는 30분내에 약 20μM 로 증가하였다. 대조적으로 ATP가 존재한다면, 자가-응집은 발생하지 않으며 상기는 MAP의 인산화가 미세소관 형성을 방해한다는 것을 나타낸다. 약 2μM 길이의 짧은 미세소관은 단지, 시드되는 응집을 촉진하는 축사(10-100fM)을 첨가함에 의해 관찰될 수 있다(A, B, C 내 개방 삼각형).

A. B 및 C 내 폐환 ： 튜뷸린과 MAP은 4℃에서 2.5mUnits/ml 의 p110 마커(최종농도)와 혼합되었고 온도는 37 ℃로 즉시 상승되었다(그래서 처음에 MAP이 탈인산화되었다). 미세소관 성장은 모든 세 경우에서 촉진되었지만, 최종 평균 미세소관 길이는 탈인산화된 MAP으로 관찰되는 것의 반이었다(개방환과 비교).

D ：MAP2c의 인산화 자리 점 돌연변이의 효과. 모든 단백질은 상기 기술된 대로 인산화되었다(30분의 예비배양과 함께). 삼각형 ; 야생형 MAP2c, 폐환 ; MAP2cA319 (KXGA로 돌연변이된 첫번째 반복 내 KXGS), 사각형; MAP2cA350(KXGA로 돌연변이된 두번째 반복 내 KXGS), 폐사각형; MAP2cA350(KXGA로 돌연변이된 두 반복 내 KXGS).

실시예에서 기술되는 tau 단백질에 관하여, 오직 이. 콜라이에서 발현되는 재조합 사람 tau 단백질이 사용된다. cDNA 클론은 엠. 고더트(Goedert et al., 1989)에 의해 기술된 것과 같이 제조되며, pET 발현 벡터의 변이체를 사용하여 발현된다(Studier et al., 1990). 상기의 단백질은 tau 및 MonoS FPLC의 열안정성을 이용하여 정제된다(Hagestedt et al., 1989). K18의 구조는 4-반복 tau 이소형에서 유도되고, 잔기 244 내지 372의 미세소관 결합 영역으로 구성된다(Biernat et al., 1993). 돌연변이체 'A262'는 가장 긴 사람 이소형을 기본으로 한다. 단일 잔기 Ser262는 종래의 기술을 사용하여 알라닌으로 변화시킨다. 포스포셀룰로오스-정제된 튜뷸린(PC-튜뷸린)은 만델코브(Mandelkow)등에 따라(1985) 돼지의 뇌에서 제조되었다. 단백질 키나아제 A 촉매 서브유니트(소의 심장에서 분리, 캠프타이드를 기본으로 활성 27nU/μl, 카제인을 기본으로 100pU.μl)가 Promega에서 수득되고, 단백질 키나아제 c(쥐의 뇌에서 분리, 히스톤 H1을 기본으로 활성 80pU/μl)가 Boehringer Mannheim에서 수득된다.

본 발명은 미세소관과의 결합에 중요한 자리에서 단백질(MAP)과 결합된 다른 미세소관 뿐만 아니라 tau 단백질을 인산화하는 신경 단백질 키나아제(NPK)로 코딩되는 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세린 또는 티오린 잔기 및 상기 MAP 상의 NPK에 의해 인산화된 잔기로 구성되는 에피토프, 단백질 키나아제에 특이적으로 결합된 항체, 특히 알츠하이머병 및 암의 치료를 위한 상기 단백질 키나아제의 저해제로 구성되는 의약적 조성물, 진단 키트 및 알츠하이머병 및 암의 검출을 위한 실험관내 진단 방법에 관한 것이다.

미세소관 결합 단백질(MAP)은 신경돌기 성장을 유도(Hirokawa에 의해 최근에 관찰된, 1994)하는 미세소관 네트워크의 재배열 및 기능성을 조절한다.

MAP 의 인산화 상태라고 제시되는 여러 라인의 증명은 지금까지 알려지지 않은 방법내에서 단백질 키나아제 및 탈인산가수분해효소에 의해 비교되며, 상기 경우의 조절내에서 중요한 역할을 한다. 포유류 뇌내 MAP 종류인 tau 단백질은 (Cleveland 등., 1997) 생체 내 여러 자리에서 인산화되며(Butler & Shlanski 1986 ； Watanbe 등., 1993) 실험관 내 많은 단백질 키나아제를 위한 기질이다.(Lee 1993； Goedert 1993； Mandelkow & Mandelkow 1993； Anderton 1993에 의해 관찰됨). 알츠하이머병내 신경단위의 퇴화동안 tau 단백질은 특징적인 신경원섬유의 손상의 주된 섬유 성분이 한쌍의 나선형 필라멘트(PHFs)로 모인다(Lee & Trojanowski에 의해 관찰됨., 1992). 상기 집합물로부터 분리된 tau 는 고인산화가 가장 두드러진 몇 가지 생화학적 개조를 제시한다(Grundke-Iqbal 등 1986； Brion 등 1991； Ksiezak-Reding 등 1992 ； Goedert 등 1992). 대부분의 알려진 이상한 인산화 자리는 Ser/Thr-Pro 서열이며(Lee 등 1992 ； Biernat 등 1992 ； Lichtenberg-Kraag 등 1992 ； Gustke 등 1992 ； Watanabe 등 1992), 프롤린-유도된 키나아제(Drewes 등 1992 ； Mendelkow 등 1992 ； Hanger 1992 ； Vulliet 등 1992 ； Baumann 등 1993 ； Paudel 등 1993 ； Kobayasi 등 1993 ) 또는 유사한 탈인산 가수분해효소(Drewes 등 1993 ； Gong 등 1994) 의 불량조절을 제시한다. ‘정상의’ tau 와 고인산화된 ‘병리학적인’형태 사이에서 기술될 수 있는 인산화-의존성 항체는 여러 실험실에 의해서 준비되었다(Kondo 등 1988； Lee 등 1991 ； Merken 등 1992 ； Greenberg 등 1992). 모든 상기 항체는 상기 Ser/Thr-Pro 형태의 에피토프의 반대방향으로 관찰되었다(Lee 등 1991 ； Biernat 등 1992 ； Lichtenberg-Kraag 등 1992 ； Lang 등 1992 ； Watanobe 등 1993 ).

tau 의 미세소관 결합 영역(제1도)은 각각이 이소형(isoform)의 의존하는 31 잔기의 3개 또는 4개의 가반복을 포함한다(Lee 등 1989 ； Goedert 등 1989； Himmler 등 1989). 상기 영역은 아마 한쌍의 나선형 필라멘트의 제조 구획을 형성한다(Kondo 등 1988 ； Wischik 등 1988 ； Ksiezak-Reding & Ten 등 1991 ； Wille 등 1992 ). 상기 14 내지 16 Ser/Thr-Pro 요소를 함유하지 않으며 상기는 측면에 반복된 서열의 영역내 축적된다. 그러나 상기는 뇌로부터 추출된 조직에 의해 인산화된 우세한 자리 중 하나로 발견된 첫 번째 반복서열내 서열 KIGS 내에 보존된 세린 잔기(Ser262)를 함유한다(Gustke 등 1992). 상기 자리는 또한 '정상의' tau 또는 태아의 tau 내에서는 아니지만 알츠하이머 PHF-tau 내에서는 인산화된다는 것이 발견되었다(Hasegawa 등 1992). 지금까지 단지 병리학적인 인산화 자리가 tau의 반복 영역내에서 발견되었다. 최근에 자리-유도 돌연변이과정 접근은 상기 자리에서 tau의 인산화가 상기의 미세소관 결합 수용력을 크게 감소시키며, 반면 Ser/Thr-Pro 요소상 인산화는 중요하지 않은 효과를 가졌다는 것을 보여주었다(Biernat 등 1993). 상기는 Ser262에서 tau를 인산화할 수 있는 신경원 조직내 단백질 키나아제 탐색을 개시하였다. 본 발명의 기초를 이루는 기술적 문제는 사람 tau 단백질 및 상응하는 뉴클레오티드 서열의 중대한 세린 262 잔기를 인산화함에 의해 알츠하이머병의 발병의 원인이 되는 단백질 키나아제를 제공했다. 상기 기술적인 문제의 용액은 청구항에서 특징화된 실시예를 제공함에 의해 수득되었다.

그러므로 본 발명은 신경원의 단백질 키나아제(NPK) 또는 하기 특성에 의해 특징화된 tau MAP4, MAP2 MAP2c so KXGS 형의 동기 서열을 인산화할 수 있는 그의 기능적인 단편을 코딩하는 DNA 서열에 관한 것이다；

(a) 표 6내 마커-1로 묘사된 아미노산 서열로 코딩된다；

(b) 표 6내 마커-2로 묘사된 아미노산 서열로 코딩된다； 또는

(c) (a) 또는 (b)의 DNA로 융합된다.

상기 용어 “DNA 서열”은 게놈성 또는 cDNA, 반합성 또는 합성의 DNA 서열을 의미한다.

놀랍게도 종래 키나아제는 상기 인산화와 결합하는 생물학적 및 병리학적 효과를 설명하기에 충분한 범위인 tau의 반복 영역내 4개의 KXGS 요소의 인산화를 매기하지 않는다는 것이 발견되었다. 상기는 특히 알츠하이머병의 발병을 지시하는 세린 잔기 262임에 틀림없다. 대신에 본 발명은 알츠하이머병의 발병에 중대한 아미노산 잔기의 인산화를 초래하는 상기 명시화된 특징을 가진 단백질 키나아제를 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. 상기 단백질 키나아제는 또한 본 출원을 통해 NPK, MARK-1 또는 MARK-2로 명칭되었다. 본 출원에 속하는 아미노산 잔기의 번호매김은 가장 긴 사람 tau 이소형, htau 40의 서열과 관련하여 일어난다(441 잔기, Goedert 등 1988).

바람직한 실시예에서 본 발명은 신경원의 단백질 키나아제(NPK)가 하기 특성에 의해 특징화되는 DNA 서열에 관한 것이다.：

(a) SKS-PAGE에 의한 측정에 따라 명백하게 분자량 110kD를 가진다：

(b) 사람 tau 단백질의 세린 잔기 262, 293, 305, 324, 356을 인산화한다：

및

(c) 하기 아미노산 서열을 구성한다.

본 발명의 DNA 서열의 바람직한 실시예에서, NPK는 하기 특성에 의해 더욱 특징화되었다.

(d) 포스파타아제 PP-2A에 의해 불활성화된다； 및

(e) 미세소관-결합 단백질(MAP)MAP2, MAP2c 및 MAP4와 관련된 하기 세린 또는 트레오닌 잔기를 인산화한다.

MAP2/MAP2c： S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ： T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073

(f) 미세소관으로부터 tau, MAP4, MAP2 및 MAP2c의 분해를 야기한다.

본 발명에 따른 다른 놀라운 발견은 tau 보다 다른 미세소관-결합 단백질을 인산화함에 의해 NPK 가 미세소관으로부터 상기 단백질들의 분해를 야기한다는 것이다. 상기는 또한 상기 미세소관의 불안정화, 그의 증가된 기능적 불안정성 및 세포증식, 세포분화, 또는 세포 퇴화상에 확실한 효과를 야기했다. 그러므로 본 발명의 NPK는 tau 또는 다른 MAP의 인산화를 경유하여 뇌 내 미세소관의 기능성 및 재배열을 조절하는 능력을 가진다. 상기에 속한 발견은 암의 발생에서 본 발명의 키나아제의 역할과 중요한 관련이 있다.

상기에서 암은 기본적으로 세포 증식이 억제되지 않는 것이라고 믿기 때문이다. 그러므로 많은 항암약은 미세소관을 해치는 세포의 분열 및 증식을 방해한다. 한편, “온코진(incogene)”은 종종 키나아제, 손상된 세포의 조절이다. 본 발명의 NPK와 같거나 일치한 키나아제의 비조절은 다양하나 세포형의 미세소관의 안정성에 심각한 효과를 가질 수 있다. 세포 분열에서 미세소관이 중요한 역할을 하기 때문에 상기 NPK의 비조절은 또한 억제되지 않는 세포 분열과 정상 세포의 암 세포로의 변형을 야기할 수 있다. 선택적으로, 상기 NPK 의 비조절은 분배되는 자극으로 (분배되지 않는) 뉴런과 같이 유사분열 후의 마지막으로 분화된 세포를 제공할 수 있다. 상기 “비정상”자극은 그들이 분배할 수 없는 분화 상태를 야기하기 때문에 아폽토시스(APOPTOSIS)(그리고 그래서, 알츠하이머와 같은 상태)로 직접 뉴런을 유도한다.

본 발명의 DNA 서열의 상기 실시예내에서, 상기 NPK는 하기 단계에 따라 뇌조직으로부터 수득될 수 있다.：

(a) 뇌추출물의 균질화 및 연속적인 그의 원심분리 ；

(b) 상기 NPK 활성 프랙션이 200 내지 400mM 사이로 용출되는 셀룰로오즈포스페이트상에서 (a)단계에서 수득된 상청액의 크로마토 그래피 ；

(c) 단계 (b)내에서 수득된 활성 프랙션의 황화 암모늄 침전 및 상기 침전물의 투석 ；

(d) 약 0.2M NaCl에서 단독 피크를 갖는 상기 NPK 활성 프랙션이 용출되는 점에서 Q-세파로즈(Pharmacia)상 (c)단계내에서 수득된 투석물의 음이온 교환 크로마토그래피 및 연속적인 활성 프랙션의 투석 ；

(e) Mono S HR 10/10(Pharmacia)상 양이온 교환 크로마토그래피；

(f) 약 250 mM NaCl 에서의 상기 NPK 활성 프랙션이 용출되는 점에서 Mono Q HR 5/5 상 크로마토그래피 ；

(g) 100kD의 명백한 분자량을 갖는 상기 NPK 활성 용출액인 점에서 Superdex G-200 상 겔 여과 크로마토그래피 ； 및

(h) SDS-PAGE에 의해 결정된 약 110kD의 명백한 분자량을 갖는 상기 NPK 활성 프랙션이 용출되는 점에서 ATP-셀룰로오즈 상 친화성 ；

그점에서 상기 NPK 활성은 방사성으로 라벨된 ATP의 존재내 사람 성인 tau의 아미노산 잔기 255로부터 267로 구성되는 펩타이드의 배양, 상기 펩타이드로 혼입되는 방사성의 결정에 의해 측정된다.

더 상세하는 분리될 수 있는 110kD의 명백한 분자량(NPK-110)을 가지는 한 개의 실시예인 본 발명의 상기 NPK는 실시예 1에 제공된다. 그러나 당 분야에 보통의 기술을 가진 사람은 상기 설명을 보충하려는 방법을 기술적인 가르침으로부터 알게될 것이다.

본 발명의 상기 NPK는 척추동물의 뇌에서 추출된다. 바람직한 실시예내에서 상기 NPK는 포유류의 뇌로부터 추출된다.

본 발명은 DNA 서열에 상보적인 RNA 서열에 관한 것이다.

특히 바람직한 실시예 내에서 상기 포유류 뇌는 사람 또는 돼지 뇌이다.

본 발명은 DNA 서열 또는 기능적 단편 또는 그의 유도체로 코딩된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드, 단편 또는 유도체는 후번역적이거나 화학적으로 변형되었다. 상기 명세서에서 특히 지시되어 있지 않으면 용어 NPK 또는 선택적으로 MARK(1 또는 2)는 또한 단편 또는 유도체를 구성한다.

본 발명은 또한 미세소관 -결합 단백질(MAP) MAP, MAP2c 및 MAP4와 관련된 NPK-110에 의해 인산화된 하기의 세린 또는 트레오닌 잔기에 관한 것이다.；

MAP2/MAP2c ； S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ； T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073

그리고 상기 인산화된 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성되는 에피토프에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 NPK에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

상기 항체는 유도된 세륨 또는 모노클론 항체이다. 소망되는 에피토프를 얻기 위한 모노클론의 또는 폴리클론의 항체 모두의 생산은 당 분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, Harlow & Lane Antibodies, a Lavoratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988을 참조). 게다가 상기 항체는 당 분야에서 잘 이해되는 기술에 의해 유도된 키메라성 항체와 같은, 자연적 또는 유전적 기술에 의해 유도된 항체이다. 그리고, 상기에 사용된 용어 항체도 또한 Fab, F(ab)₂또는 Fv 단편과 같이, 특이적 에피토프에 결합할 수 있는 능력이 보존되는 항체의 단편을 언급한다.

부가적으로, 본 발명은 MAP2, MAP2c 및 MAP4의 상기 인산화된 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

MAP2/MAP2c ； S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ； T829, T873, T876, T874, S899, S903, S928, S941, S1073

다시, 상기 항체는 폴리클론의 또는 모노클론의 항체 또는 결합 특이성을 보존하는 그의 단편이다.

바람직한 실시예에서, 본 발명의 상기 항체는 모노클론 항체 또는 단편 또는 그의 유도체이다.

본 발명의 더 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 단편 또는 그의 유도체이다.

그리고 본 발명은 선택적으로 의약적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석액과 조합된, 본 발명의 상기 NPK의 특이적 저해제를 함유하는 의약적 조성물에 관한 것이다.

상기 용어 “본 발명의 상기 NPK의 특이적 저해제”는 본 발명의 단백질 키나아제의 효소적 작용을 특이적으로 저해하는 물질을 언급한다. 단백질 키나아제와 같은 효소의 저해제와 그의 작용 모드는 당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 상기 저해제는 효소의 촉매적 영역과 결합해서 그의 기질을 변형시키는 능력을 만든다. 상기 의약적 조성물은 상기 경우에 정통한 내과 의사에 의해 적당하게 생각되는 경로와 조제에 의해 그의 필요에 따라 환자에게 투여되었다. 의약적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 당 분야에 잘 알려져 있으며, 투여 경로 또는 환자의 특수한 질병 현상에 따라 처방된다.

상기 바람직한 실시예내에서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 의한 의약적 조성물에 관한 것이다.

다시 상기 의약적 조성물은 경로에 의한 그의 필요내 및 상기 경우를 취급하는 내과 의사에 의해 적당하다고 고려되는 조제에 의해 환자에게 투여되었다.

또한 바람직한 실시예내에서, 본 발명의 상기 의약적 조성물은 암의 치료에 사용되었다.

상기에 지적된대로 본 발명의 상기 NPK 의 비조절은 결국은 상기 세포의 종양적 변형을 일으키는 경로로 미세소관 결합 단백질을 발현하는 세포의 형태의 변화를 일으킬 수 있다. 따라서, NPK 저해제의 의약적으로 효과적인 양은 변형과정을 정지 및/또는 역전시킬 것이다. 투여되는 저해제의 양은 각각의 경우를 취급하는 내과 의사에 의해 결정될 것이다.

본 발명의 의약적 조성물의 더욱 더 바람직한 실시예내에서, 상기 저해제는 본 발명의 항체이며, 본 발명의 상기 NPK를 탈인산화시킬 수 있는 포스파타아제, 바람직하게는 포스파타아제 PP-2A, 상기 NPK의 활성화된 키나아제의 저해제, Ser262 잔기로 구성된 tau 유도 펩타이드, 또는 MAP2, MAP2c 또는 MAP4의 세린 또는 트레오닌 잔기 중 적어도 어느 하나로 구성되는 MAP2, MAP2c 또는 MAP4 유도 펩타이드이다：

MAP2/MAP2c ； S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ； T829, T873, T876, S899, S903, S928, S941, S1073

여기에서 사용된 상기 용어 “tau”는 Ser262 잔기로 구성된 펩타이드에서 유도되고 MAP2, MAP2c 또는 MAP4는 MAP2, MAP2c 및 MAP4의 세린 또는 트레오닌 잔기 중 적어도 한 개로 구성되는 펩타이드에서 유도된다.

MAP2/MAP2c ； S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ； T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073

는 상기(MAP) MAP2, MAP2c, 및 MAP4로 언급되는 시린 잔기 262(tau) 또는 다른 잔기로 구성된 에피토프와 관련되어 tau 단백질 또는 MAP2, MAP2c 또는 MAP4 단백질의 자연적 조성물을 재구성하는 3차원적 구조내의 펩타이드를 언급한다. 상기 펩타이드들은 본 발명의 상기 NPK의 가자연적 기질(즉, tau 또는 MAP과 관련된 tau)일 것이며, 생물학적 효과와 결합한 NPK는 제시하지 않을 것이다. 단독으로, 에피토프를 구성하거나 부가물로 측면의 아미노산으로 구성된 상기 펩타이드의 합성은 당 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 하기로 진단 조성물에 관한 것이다.：

(a) 본 발명의 NPK ；

(b) 본 발명의 항체 또는 단편 또는 유도체 ； 및/또는

(c) 상기에 기술된 tau, MAP2, MAP2c, 또는 MAP4의 인산화될 수 있는 세린 또는 트레오닌으로 구성된 펩타이드.

상기 진단 조성물은 예를 들면, 알츠하이머병 또는 암 또는 그의 발병의 발견에 유용하다. 본 발명의 상기 항체는 상기 병을 지시하는 비정상, 특히 본 발명의 상기 NPK의 높아진 농도 또는 수준, 상기 NPK의 더 높아진 활성화 정도를 발견하는데 사용된다. 상기 조성물을 가지고 유도된 상기 NPK 는 내부 조절로 사용될 수 있다. 한편, 상기 정의된 펩타이드는 본 발명의 상기 NPK의 비정상적인 활성을 발견하는 기질로서 사용된다. 다시, 진단 조성물내 구성된 상기 NPK의 활성은 내부 조절로서 제공된다.

상기에서 열거되고 MAP4, MAP2 및 MAP2c내 구성된 인산화된 세린 잔기와 특이적으로 결합되는 상기 항체는 암을 지시하는 상기 미세소관 결합 단백질의 비정상적 현상 또는 양식을 발견하는데 사용된다.

상기 진단 조성물의 적용은 하기에 기술되었다. 그러므로, 한 실시예에서, 상기 진단 조성물은 상기에 언급된 에피토프 중 하나로 유도된 본 발명의 항체로 구성된다. 예를 들면 시료의 병 상태와 서로 관련된 알츠하이머병 또는 암은 한 개 이상의 상기 에피토프를 인지하는 항체를 가진 상기 시료를 취급함에 의해 발견될 수 있다. 상기 항체-에피토프(불완전항원)복합체는 본 발명의 항체로 유도된 두 번째 항체를 사용하고, 당 분야에 공지된 방법에 따라 표시하는 것으로 나타내었다(예를 들면, Harlow 와 Lane을. 참조).

본 발명의 다른 실시예내에서, 상기 진단 조성물은 상기에 언급한 에피토프와 본 발명의 항체로 구성된다. 상기 항체를 가진 시료의 취급은 상기 시료에 대한 상기 항체의 결합이 상기에서 사용된 참고 시료로 언급된 상기 에피토프에 대한 상기 항체의 결합과 관련되어 일어난다면, 상응하는 특허의 병 증상과 관련하여 판정한다.

다른 실시예내에서, 상기 진단 조성물은 상기 언급된 에피토프, 본 발명의 상기 NPK, 본 발명의 항체를 구성한다. 키나아제 활성은 본 발명의 에피토프의 인산화와 대조되는 시료의 인산화에 대하여 검사된다. 수량된 NPK 활성으로부터 상기 시료에 함유되어 있는 tau 단백질 또는 MAP2, MAP2c 또는 MAP4의 인산화 상태와 한자의 병 상태가 추론된다. 상기 키나아제 활성은 예를 들면, 같은 반응내 기질 유연화합물을 포함하는 것에 의해 추론되며, 상기는 효소적 변환이 가시적으로 발견된다. 상기 기질 유연화합물은 당 분야에서 널리 사용된다. 선택적으로, 시료내 인산화된 tau 단백질 또는 MAP2, MAP2c 또는 MAP4의 양은 인산화된 에피토프로 유도되는 본 발명의 항체의 사용, 국제 표준에 따른 진단 조성물에 의해 제공된 항체-에피토프 복합체의 정량의 사용, 또는 예를 들면, 당 분야내 잘 알려진 방사성 추적 방법에 의해서 상기 NPK에 의한 tau 단백질 또는 MAP2, MAP2c 또는 MAP4로의 혼입되는 인의 양의 결정에 의해, 본 발명의 키나아제를 가진 취급 후 발견된다.

그러나 진단상의 원칙에 정통한 당 분야에 보통의 기술을 가진 사람을 WCK 또는 3차의 레벨된 또는 레벨되지 않은 항체, 또는 효소와 기질을 갖는 조성물을 다른 방법 또는 보충으로 상기 화합물과 쉽게 결합될 수 있다는 것을 상기해야 하낟. 실시예가 또한 본 발명에 의해 제공된다.

다른 실시예내에서, 본 발명은 실험관내 방법 및/또는 환자에서 분리한 뇌척수액을 분석하거나 신경조직(예를 들면, 후각 상피)의 생감법에 대해 알츠하이머병 검사 및 본 발명의 상기 NPK의 존재를 위한 상기 조직 검사에 관한 것이다.

본 발명은 또한 실험관내 진단 방법 및/또는 환자의 분리된 뇌척수액을 분석하거나 신경조직(예를 들면, 후각 상피)의 생감법을 포함하는 알츠하이머병 검사 및 본 발명의 상기 NPK의 비생리량의 존재 또는 상기 NPK의 비생리적 활성을 위한 상기 조직 검사에 관한 것이다.

상기 생감법에 적합한 신경 조직의 예는 후각 상피이다.

본 발명의 방법은 예를 들면 본 발명의 진단 조성물을 사용하거나 특히 상기 NPK로 유도되는 항체를 사용함에 의해 수행된다. 그러므로, 본 발명의 상기 실시예내에서, 본 발명의 상기 NPK는 상기 NPK와 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체의 의해 발견된다.

부가적으로, 본 발명은 하기 자리내 미세소관 결합 단백질(MAP) MAP2, MAP2c 및 MAP4와 관련된 tau의 인산화된 세린 또는 트레오닌 잔기의 존재하에서 또는 본 발명의 상기 NPK 또는 NPK 특이 탈인산 가수분해 효소의 비생리적인 양의 존재를 위한 적합한 조직 또는 체액 분석을 포함하는 암 또는 암의 발병을 위한 실험관내 진단 방법에 관한 것이다.：

MAP2/MAP2c ； S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ； T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073

상기 세린 또는 트레오닌 잔기의 인산화 현상은 비생리적인 것으로 이해된다. 인산화 현상같은 결정 방법은 참고문헌에 의해 여기에 실시예된 PCT/EP 92 02 829 내 상세히 기술되어 있다.

상기 인산화된 세린 또는 트레오닌 잔기의 분석은 예를 들면 상기 인산화된 잔기 또는 에피토프를 구성하는 상기 잔기들을 특이적으로 발견하는 항체를 사용함에 의해 수행된다.

시료의 상기 NPK의 양은 상기로 특이적으로 유도되는 항체를 사용, 또는 적합한 기질, 예를 들면, 비-인산화 상태내 상기 언급된 세린 또는 트레오닌 또는 탈인산화 상태내 MAP2, MAP2c 및 MAP4로 구성되는 펩타이드를 사용한 그들의 활성측정에 의해 측정된다.

단백질의 인산화 현상을 측정하기 위한 방법은 PCT/EP 92 02 829 내 상세히 기술되어 있다.

포스파타아제, 예를 들면 PP-2A, PPI 또는 칼시뉴린의 활성은 본 발명의 진단 조성물내에 포함되는 상기 기질 NPK를, 제공하며 검사될 것이다.

본 발명의 상기 실험관 내 방법을 수행하기에 적합한 조직 또는 체액은 뇌척수액, 혈, 조직의 생감법(예를 들면, 간 또는 피부)이다.

본 발명의 다른 목적은 실험관내 정상적인 MAP2, MAP2c 또는 MAP4를 본 발명의 상기 NPK의 취급에 의해 암 또는 암의 발병을 유도하는 상기 인산화 현상이 일어나는 자리에서 인산화되는 단백질로 전환되는 방법을 제공한다；

MAP2/MAP2c ； S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ； T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073

상기 MAP의 인산화가 허용되는 조건은 본 출원에 의해 제공된 하기의 일반적 가르침에 의해 결정될 수 있다. 상기 인산화된 MAP은 특이적 항체에 의해 인지될 수 있다. 상기 실험관내 방법의 결과는 암의 발생으로의 통찰을 허락할 것이다.

게다가, 상기 지시된 자리내에서 정상인 것을 인산화된 MAP 단백질로 전환시키는 것을 방해하는 저해제도 검사될 수 있다. 상기 “저해제”는 에피토프를, 예를 들면 항원 결정부 블로킹에 의해, 특이적으로 인산화하거나, 그들이 생물학적 활성을 저해 또는 방해하는 한, 본 발명의 단백질 키나아제, NPK상 다양한 영역으로 유도된다. 다른 유형의 발명은 상기 MAP 또는 상기 NPK상의 탈인산 가수분해 효소에 상반되는 작용 또는 상기 NPK의 활성화되는 키나아제의 저해이다. 그리고, 본 발명의 방법에 의해 생성된 상기 MAPS는 실험관내 및 생체내 미세소관 구조로의 결합연구에 사용된다. 그러므로 암의 근원 분자적 해명에 기여한다.

더욱이, 본 발명은 암 또는 암의 발병을 나타내는 특이적 항체의 생성을 위한 MAP의 인산화된 세린 또는 트레오닌 잔기, 또는 상기의 잔기로 구성된 에피토프의 용도에 관한 것이다.

상기 항체를 수득하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. ； 그래서 폴리클론의 또는 모노클론의 항체의 생성은 표준방법을 사용하여 실시된다(예를 들면, Harlow 와 Lane 참조). 올리고-또는 폴리펩타이드가 항체의 생성에 사용된다면, 소의 혈청 알부민 또는 구멍 삿갓조개 헤모시아닌과 같은 상기 에피토프의 면역반응을 유도하거나 강화할 수 있는 적합한 담체 분자에, 항원 결정부를 구성하는 펩타이드를 짝지우는 것이 바람직하다. 합텐(항원 결정부를 구성하거나 이와 동일한) 및 담체의 짝지움 방법도 또한 당 분야에 잘 알려져 있다(Harlow 와 Lane을 볼 것). 소망되는 항체를 생성하기에 적합한 동물은 그 대신에 사용될 것으로 이해된다.

단백질 키나아제 NPK110의 정제 및 특성화

모든 작업은 4℃에서 실시한다. 신선한 돼지의 뇌(대략 1kg)를 지역 도축장에서 얻고, 1리터의 완충액 A(5mM EGTA, 100mM NaF, 1mM PMSF, 1mM 벤즈아미딘, 1mM Na₃VO₄, 1mM DTT, 0.1% Brij-35를 함유하는 50mM 트리스, pH 8.5)에서 균질화한다. 상기 균질물을 차게 실험실로 옮기고, 1시간 동안 30,000g으로 원심분리한다. 상기의 상청액은 초원심분리기(50,000g, 30분)로 제거하고, 상기의 pH는 6.8로 적정한다. 저진공을 사용하여 완충액 B(50mM MES, pH 6.8, 2mM EGTA, 50mM NAF, 1mM PMSF, 1mM 벤즈아미딘, 1mM Na₃VO₄, 1mM DTT, 0.1% Brij-35)로 평형된 150ml의 Whatman P11을 함유하는 뷰흐너 깔대기상에 가한다. 상기 포스포셀룰로오스는 완충액 B 500ml로 세척하고, 단계적으로 0.15M-1M NaCl(제2(a)도)를 함유하는 각 완충액 B 150ml로 용출시킨다. 프랙션은 필수적으로 기술된 것과 같이(Drewes et al., 1992) 4개의 미세소관 결합반복을 구성하는 tau 구조(K18)의 인산화에 의해 활성을 스크린한다. 활성 프랙션은 황산암모늄 침전물에 의해 분류된다. 30 내지 50% 포화도로 수득된 침전물은 차게 밤새 완충액 A에 투석시킨다. 상기 투석물(대략 50ml)이 초원심분리기에 의해 제거되고, Superloop(Pharmacia)를 사용하여 음이온 교환 컬럼(Q-세파로스 HR, Pharmacia, 80 × 16mm)상에 가한다. 완충액 A 100ml로 컬럼을 세척한 후에, 0-0.5M Nacl의 단계적 구배로 용출시키며 (제2(b)도, 유속 5ml/분, 프랙션 크기는 7ml이다.), 활성 프랙션(대략 40ml)은 완충액 B에서 투석하고, 양이온 교환 컬럼(SP-세파로스 HR, Pharmcia, 60 × 16mm)상에 가한다(제2(c)도, 유속 5ml/분, 프랙션 크기는 6ml이다). 0-0.5M NaCl로 용출한 후, 활성 프랙션(대략 40ml)을 모으고, 상기 완충액은 세파덱스 G25 컬럼(300 × 26mm) 상에서 완충액 A로 교환하고, Mono Q HR 5/5 컬럼(Pharmacia)상에 가하며, 단계별 NaCl 구배로 용출시킨다(제2(d)도, 유속 0.5ml/분, 프랙션 크기 1ml). 활성 프랙션은 Centricon 30 마이크로컨센트레이터(Microconcentrator)에서 2배로 농축하고, 평형인 겔여과컬럼(Superdex 200, Pharmacia, 300 × 16mm) 상에 가하고, 완충액 A(pH 7.8, 150mM NaCl 및 10% 글리세롤을 함유한다)로 용출시킨다. 상기 유속은 0.2ml/분이고, 프랙션 크기는 2ml이다.

먼저 상기 컬럼은 마커 단백질 키트(Pharamacia)로 보정한다. 활성 프랙션을 모으고, 상기 완충액은 세파덱스 G25 컬럼(100×16mm)상에서 완충액 C(40mM B-글리세로포스페이트, 10mM MgCl₂, 2mM EGTA, 1mM 벤즈아미딘, 0.2mM DTT, 0.1% Brij-35)로 교체한다. G25 컬럼에서 단백질 풀(10-15ml)은 ATP-세파로스 컬럼상에 0.1ml/분에서 가한다(Upstate Biotechnology Ind., Lake Placid, USA, 15×5mm). 상기 컬럼을 5ml의 완충액 C로 세척하고 5mM MgATP를 함유하는 완충액 C 2ml로 용출시킨다. 상기 용출물을 농축하고, Mono Q PC 1.6/5 컬럼('Smart' 시스템, Phatmacia)에서 ATP 및 완충물질을 제거하고, 250 mM NaCl, 1mM EGTA, 0.2mM DTT, 1Mm 벤즈아미딘 및 0.03% Brij-35를 함유하는 25mM 트리스-HClm pH 7.4로 용출시킨다. 활성 프랙션은 50%(v/v)글리세롤과 혼합하고, -20℃에서 저장한다. 상기의 조건하에서, 활성은 적어도 한달간 유지된다.

사용된 6개의 클로마토그래프 단계로 돼지의 뇌조직 추출물에서 Ser262인 산화 활성의

10,000배 정제가 얻어진다. 제2도에서 상세히 알려진 것과 같이, 포스포셀룰로오스(A), Q- 및 SP-세파로스상에서 이온교환크로마토그래피와, Mono Q(B, C, D), 겔여과(E) 및 부동성 ATP를 사용하여 친화크로마토그래피가 사용된다. 상기 조직 추출물에서 키나아제의 활성이

0.2mU/mg이고, 상기 친화-정제된 키나아제의 활성은

2U/mg이다.(1 유니트는 분당 인의 1μmol을 전달한다). 상기 효소의 분자량은 겔여과에 의해 대략 90-100 kDal 이지만, 상기의 활성 피크는 넓고, 종종 현저한 꼬리끌기를 보인다(제2(e)도). SDS 겔상에서, 상기의 정확한 분자량은

110kDal이다(제 3도). 상기 효소는 겔상에서 재생된다 ; tau가 기질로서 겔 매트릭스로 종합화되고, 상기 겔이 γ-³²P-ATP로 배양되면, 상기 110kDal 밴드가 방사선 사진에서 뚜렷하게 나타나며(제3도, 라인 4-6), 은염색된 겔에서 나타난 몇 가지 작은 오염은 감지가능한 활성은 갖지 않는다. NPK-110으로 인산화후에, 전체 tau 및 K18의 구조는 SDS PAGE에서 작지만 구별되는 이동성의 변화가 보인다(제4도, 라인 1-4). 통합된 인의 최종량은 효소의 농도 및 활성에 의존하여 tau의 몰당

1.0-2.5mol이고; 상기 인산화의 수준은

2시간 후에 얻어질 수 있다. 인산나화반응은 하기와 같이 실시된다:

인산화반응은 2mM ATP, 5mM MgCl₂, 2mM EGTA : 1mM DTT, 0.1mM PMSF, 0.03% Brij-35를 함유하는 pH 7.2의 Hepes 40mM에서 실시된다. 키나아제 제조의 추출물 또는 원프랙션이 스크린되었을 때, 50mM NaF 또는 1μM 오카다산(LC Services, Woburn, MA, USA)이 포함된다. 반응은 95℃로 가열함에 의해 종결된다. 인산화는 SDS 겔(Steiner et al., 1990) 또는 포스포셀룰로오스 페이퍼 디스크(Gibco)(Casnellie, 1991)에서 분석된다.

In-겔 인산화분석은 게알렌(Geahlen) 등(1986)의 방법에 따라 실시된다.

tau에 대한 NPK110의 특이성은 인산화 단백질의 트립신 침지에 의해 실시되고, 연속적으로 2차원 박막 전기영동 및 크로마토그래피를 실시한다(제5도). 상기는 재조합 완전한 길이 4-반복 tau(제5(a)도) 및 4-반복 절편 K18(제5(b)도)에서 수득된 인산화형태와 비교하면, 최대로 인산화된 펩타이드가 반복영역에서 생성되는 것이 명백하다. 상기는 양쪽 시료의 혼합물을 분석하여 확인된다(제5(d)도), 두번째 접근에서, 상기 트립신 침지는 HPLC에 의해 재용해된다(보이지 않음). 더 상세하게, 상기 접근은 하기와 같이 실시된다:

하기의 인산화 반응에서, 상기 키나아제는 0.5M NaCl/10mM DTT내 시료를 끓이고, 원심분리하여 제거된다. Tau 단백질은 상청액에 남고, 15% TCA로 침전된다. 시스테인 잔기가 퍼포름산 처리에 의해 변형된다(Hirs, 1967).

상기 단백질은 1：10 - 1：20(w/w)의 비율로 효소를 두배로 사용하여 0.1mmM CaCl₂존재하에서 트립신(Promega, sequencing grade)으로 밤새 침지된다. 박막 셀룰로오스 판에 2차원 포스포펩타이드 지도화(mapping)Macherey & Nagel, D

ren, FRG)가 보일(Boyle)등(1991)에 의해 실시되었다. 간단히, 1차원 전기영동이 포름산(88%)/아세트산/물(50/156/1794)내 pH 1.9에서 실시되고, 2차원 크로마토그래피가 n-부탄올/피리딘/아세트산/물(150/100/30/120)에서 실시된다. 서열화에 의한 인산화 자리의 지도화를 위해, 재조합 사람 tau(200ug, 클론 htau 40)가 2시간 동안 NPK110 및³²P-ATP(100 Ci/mol)로 인산화된다. 상기 인산화는 간단한 열처리에 의해 종결된다. 상기 단백질은 6M 우레아 및 2mM DTT에서 배양하고, 카제인은 비닐피리딘(Tarr et al., 1983) 또는 퍼포름산 처리로 블로킹된다. 10mM 탄산 수소산 암모늄에서 투석한후에, 상기 단백질이 냉동건조되고, 0.1mM CaCl₂존재하에서 트립신(1：20)으로 침지된다. 펩타이드의 분리는 μ RPC C2/C18 SC 2.1/10 컬럼('Smart' 시스템 Pharmacia)에서 실시되는 2개의 연속적인 HPLC에 의해 실시된다. 상기 침지물은 아세트산(5%v/v)으로 산화되고, 10mM 아세트산암모늄내 아세토니트릴의 구배를 사용하여 HPLC에 의해 분류된다. (유속 0.1ml/분, 120분내 0-25%, 20분내 25-50%). 펩타이드는 214, 254 및 280nm에서 UV 흡수에 의해 검출되고, 통합된 인산염은 신틸레이션 계수기(Hewlett-Packard TriCarb 1900 CA)내 크렌코브 조사(Crenkov radiation)로 측정된다. 상기 준위에서 병렬 프렉션 및 방사성 피크가 부가적으로 TFA내 아세토니트릴의 준위를 사용하여 정제된다(유속 0.1ml/분, 60분내 0% 아세토니트릴/0.075% TFA 내지 66% 아세토니트릴/0.05%TFA). 펩타이드의 서열분석은 477A 펄스 액체상 순서결정기(sequencer) 및 120A 온라인 PTH 아미노산 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 실시된다. 포스포세린은 시체상 서열화에 의해 디히드로알라닌의 디티오트레이톨 부산물로 확인된다(Meyer et al. 1991).

직접적인 포스포펩타이드의 서열화 및 포스포아미노산 분석에 의해 분석된 몇 개의 레벨된 펩타이드가 수득되었다. 포스포아미노산 분석 ： 침지시료의 분취량이 부분적으로 6N HCl에 의해 가수분해되고(110℃, 60분), pH 1.9 및 pH3.5에서 2차원 전기영동에 의해 분석된다(Boyle et al., 1991). 상기 포스포펩타이드 서열화의 결과는 표 1에 기술하였다.

[표 1]

NPK110으로 인산화된 htau40에서 트립신 포스포펩타이드가 HPLC에 의해 수득되었다. 상기의 서열은 주된 방사성 피크를 갖는다. 두 번째 정제가 실시된 후에, 수득된 카운트의 수, 물질의 정량, 인산화 잔기를 갖는 서열(S-에틸시스테인과 동일), 인산화 자리(htau 40 에 따른 넘버링)가 기록되어 있다. 제2 반복에서 트립신 포스포펩타이드 CGSK 가 HPLC에 의해 검출되지 않았으며(아마도 작은 크기와 친수성 때문에). 이와 같이 포스포펩타이드 지도화 및 자리-방향성 돌연변이화에 의해 확인되어진다.

대부분의 방사성은 인산화된 Ser-262을 함유하는 펩타이드내에서 발견되었다. Ser365(sp 번째 반복의 KIGS 요소내) 및 Ser324(세번째 반복의 KCGS 요소에서)가 방사성으로 라벨된 것이 발견되었다. 상기의 정제된 펩타이드의 2차원 분석이 제5(c)도에서 알려진 것과 같이 스폿(spot)의 동일성을 이끈다. 상기는 Ser262(스폿 1)이 Ser365(스폿2)에 이끌어지는 tau 상에 NPK110의 주 표적 자리임을 보여준다. 스폿 3은 Ser305를 함유하는 펩타이드와 동일하고, 스폿 4는 Ser324(세번째 반복의 KCGS 요소에서)를 함유하는 펩타이드와 동일하고, 스폿 5는 Ser293(두 번째 반복의 KCGS 요소에서)를 함유하는 펩타이드와 동일하다. 상응하는 트립신 펩타이드(²⁹¹CGSK)가 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 직접 분리되며, 아마도 그의 쇼오트성 및 친수성 때문이다. 그러므로 모두 네 개의 KXGS 요소(Ser 226, 293, 324, 356)내 세린이 알라닌으로 전환되는 K18의 점 돌연변이체를 사용하여 자리 방향된 돌연변이화에 의해 동일하다. NPK110으로 인산화한 후에, 스폿 3(Ser305)은 가시적이고, 스폿 1, 2, 4 및 5가 사라지는 동안 Ser293을 갖는 스폿 5와 동일하다.

[실시예 2]

Tau-미세소관 결합 및 기능적 불안정성

우선 Ser262의 인산화는 강하게 tau 및 미세소관사이에서 반응이 감소되는 것을 보여준다： 즉 해리상수가 감소될 뿐만 아니라 화학량이 감소된다. 상기의 관찰을 확인하기 위해, NPK110에 의해 tau의 인산화후에 유사한 결과가 얻어졌다. 사실상, 제6(a)도는 확실한 결합내 감소를 보여준다 ： 완전하게 NPK110은 도달가능한 농도범위안에서 미세소관 결합을 제거한다. 상기의 결합이 약해져서 해리상수 및 화학량을 측정하는 것이 불가능하다. 즉 NPK110은 효율적으로 미세소관에 tau의 결합 손실을 일으킨다. 결합에 대한 연구가 하기와 같이 실시되었다 ：

결합에 대한 연구는 30㎕-시료의 초원심분리(Beckman TL 100)에 의해 톡솔-안정된 미세소관(30 ㎕) 및 tau의 공-고화를 측정함에 위해 실시된다. 펠렛 및 상청액의 분취량을 SDS-PAGE 및 코마시 블루 염색을 사용하여 분석된다. 건조된 겔의 스캐너 농도계가 단백질의 정량분석을 위해 사용된다(자세한 것은 Gustke et al., 1992을 볼 것).

상기의 결과를 입증하기 위해 점 돌연변이(Ser262에서 Ala)가 tau로 도입되어, 상기의 자리는 더 이상 인산화되지 않는다. 이 경우에, NPK110을 갖는 돌연변이체를 배양하여 상기 미세소관 결합용량이 본래대로 남지만, 친화 및 화학량이 약간 감소한다(

25%, 제6(a)도). 상기는 종래의 연구에서 하기의 두 가지 점을 확인한다 ; (i) Ser262의 인산화가 미세소관에 대해 tau의 친화를 조절하는 주된 스위치이고, (ii) 키나아제에 의해 인산화된 다른 자리는 결합상에 오직 작지만 측정가능한 효과를 갖는다(예를 들면 반복 2, 3 및 4의 KXGS 요소에서 주된 당가의 세린).

미세소관은 NPK110에 의해 인산화된 tau를 보호하는지가 문제이다. 상기의 경우에, 일단 미세소관에 결합된 tau는 미세소관에 대한 높은 친수성을 유지한다. 상기의 문제점을 해결하기위해, 톡솔-안정화 미세소관은 먼저 tau로 포화되고 NPK110에 의해 배양된다. 제6(b)도에서 설명한 것과 같이, 대개 인산화를 수반하는 미세소관에서 tau가 해리된다. 이와같이, 키나아제에 의해 tau의 미세소관 지연 인산화가 방지되지 않는다.

tau의 한가지 중요한 기능은 미세소관을 안정화하고, 그들의 기능적 불안정성을 억제한다. 이와같이, tau가 미세소관의 결합성을 손실한다면, 기능적으로 안정한 미세소관을 기대할 수 있다. 상기의 효과는 편모 염색사상에 심어진 개개의 미세소관의 비디오 다크 필드 현미경에 의해 설명될 수 있다. 상기의 실험은 다음과 같이 실시될 것이다.： 염색사상에 응집된 미세소관의 비디오 현미경은 (Trinczek et al., 1993)에 기술된 것과 같이 필수적으로 실시되었다. 간단하게 5 μM PC-튜뷸린, 2.5μM tau(인산화되지 않거나 또는 인산화된) 및 소량의 성게 정자 염색사(10-100fM)가 3mM MgCl₂,2mM EGTA, 1mM GTP 및 1mM DTT를 함유하는 50mM Na-Pipes, pH 6.9와 혼합된다. 시료의 1.0㎕를 슬라이드상에 놓고, 18×18mm의 커버를 덮고, 밀봉하여, 5초안에 온도 조절 공기 흐름내에서 37℃이상으로 온도를 올린다. 37℃의 일정한 온도가 공기흐름에 의해 유지된다. 미세소관을 응집한 염색사가 온도를 전이시킨 후 2.5, 5, 10, 15, 20, 25 및 30분에서 기록된다. 각 시간 및 조건에서, 시료의 3 내지 5의 염색사 및 10-20개의 실험이 분석되고, 결국 500-600개의 미세소관의 길이가 측정되었다. 표적판내에 분명하게 위치한 미세소관을 고려한다. 용액의 깊이는 3.4㎛이고, 촛점깊이는 1-2㎛이다.

제8(a)도의 실험에서, 튜뷸린의 농도(5μM)는 미세소관이 스스로 결합된 것이 아니라, (인산화되지 않은) tau의 첨가에 의해 성장되는 것을 선택한다.

NPK110으로 인산화된 tau는 상기 돌연변이체 Ser262-Ala와 같이 성장을 지지하지 않는다. 즉 돌연변이체가 했던 것과는 대조적으로 미세소관과 반응하지 않기 때문에 Ser262에서 인산화한 tau는 “tau가 아닌 것”처럼 행동한다. 좀더 놀라운 것은 키나아제의 영향하에서 기능적으로 미세소관의 전환에 있다. 제8(b)도의 실험에서 미세소관은 tau 의 존재하에서 염색사가 성장하지 않으며, 20분이상

50㎛로 증가한 평균 길이가 기록되었다. 평행실험에서 ATP를 갖는 NPK110이 첨가되었다(또는 대조로서 ATP가 없음). 대조 실험에서 미세소관이 연속적으로 성장할 수 있고 약간의 기능적 불안정성을 보인다(제8(b)도, 개방 서어클). ATP가 첨가되자마자 상기의 평균길이는 20㎛까지 증가하고, tau의 점차적인 인산화에 의해 다시 떨어지고, 미세소관 기능하에서 동시에 증가한다(채워진 서어클). 상기 돌연변이체(Ser262-Ala가 사용될 때, 대개 상기 키나아제 및 ATP가 존재할 때(삼각), 미세소관은 성장한다. 상기의 결과는 제8(c)도 및 제8(d)도의 막대 히스토그램내에 요약하였다. 초기에, 결집된 미세소관이 짧게 길이를 균질화하고(5분에서 개방 서어클의 피크), 방해받지 않는 성장의 후시간에서, 상기 미세소관은 길고, 넓은 길이 분포를 보여준다(제8(c)도 및 제8(e)도에서 채워진 서어클). 그러나 상기 키나아제가 Ser262를 인산화하도록 허용하면(예를들면, 상기 키나아제, ATP 및 Ser262를 갖는 야생형 tau가 존재한다), 미세소관은 짧게 나타난다(제9(d)도에서 개방 서어클).

[실시예 3]

tau의 반복 영역을 인산화하는 다른 키나아제

기능, 표적 또는 다른 것에 의존하여, tau가 몇 개의 비교에 의해 분류될 수 있는 많은 키나아제에 의해 실험기관내에서 인산화될 수 있다. 흥미롭게 알츠하이머병을 진단하는 특정 프롤린-방향성 키나아제(상기를 유도하는 항체 반응때문에)는 상기의 반복 측면의 영역을 인산화하지만 tau-미세소관 결합상에서 약간의 영향을 나타낸다. 반대로 tau의 반복영역이 상기의 기능을 포함할 것으로 사료되고, 상기에 기술된 NPK110의 결과에 의해 확인되기 때문에 상기의 반복 영역을 인산화하는 키나아제는 미세소관 결합에 영향을 준다. 그러므로 상기 키나아제가 반복영역에서 tau를 인산화하는 다른 키나아제와 어떻게 비교하는지가 문제로 나타난다. 상기의 몇 가지 문제가 하기에 기술될 것이다(표 2).

[표 2]

인산화자리 및 키나아제의 요약은 반복 및 tau의 인접 영역에 영향을 준다(오직 비-프롤린 방향성 키나아제 및 자리가 기술되었다). 주된 자리는 X에 의해 인용되고, 작은 것은 (x)에 의해 인용된다. 상기의 결과는 하기의 다른 방법에 의해 수득된다： (1) 단백질 분해, 펩타이드의 분리 및 포스포펩타이드의 서열화에 의한 tau의 인산화(Steiner et al., 1990, Steiner, 1993, Gustke et al., 1992； Scott et al., 1993), (2) 서열화와 결합된 포스포펩타이드의 질량 분석(Hasegawa et al., 1993), (3) 합성펩타이드의 인산화(Correas et al., 1992), (4) 서열화와 조합된 포스포펩타이드의 2차원 지도화(상기에 기술). 상기의 데이터가 반복 영역 K18에서 유도되기 때문에, 상기에는 반복영역 외부의 가능한 인산화 자리에 대한 정보는 포함하지 않는다.

예를 들면, PKA는 반복영역밖에서 Ser214, Ser409 및 Ser416을 인산화시키고, 작은 자리는 반복여역안에서 Ser324 및 Ser356을 포함한다(Scott et al., 1993; Steiner, 1993). Ser262는 자리중의 하나가 아니기 때문에, 우리의 관찰에 따라 미세소관 결합에 주된 효과를 기대하지 않는다. PKC 자리는 반복 3내에 KCGS 요인을 포함하여(Correas et al., 1992 ; Steiner, 1993), 우리쪽에 미세소관 결합에 주된 효과가 없다. 부분적으로 정제된 키나아제 활성은 우선 인산화된 모두 네개의 KXGS 요소를 기술하며, 뇌 추출물에서 키나아제 활성은 보고된 Ser262에 의한 미세소관 결합에 강한 효과를 주는 Ser262 뿐만 아니라 Ser/Thr-Pro 요소 및 Ser365을 인산화한다(Gustke et al., 1992). 상기 연구에서 사용된 방법은 HPLC에 의해 분리되는 것이다. 대개 상기는 다른 자리에서 인산화의 상대량을 판단하는 것이 어려워 많은 펩타이드가 선형이 아닌 상태로 생성된다.

불확실성 때문에 다른 접근방법에 의해 안산화 자리를 재조사한다. 상기 포스포펩타이드는 HPLC 및 서열화 뿐만 아니라 상대 분포의 명확한 설명을 주는 박막의 셀룰로오스판에 2차원 지도화에 의해 분석된다. 완전한 길이의 4-반복 tau 및 반복 영역(K18)이 뇌추출물, NPK110, PKC 및 PKA로 인산화된다. 상기는 tau의 반복영역내 인산화 자리의 비교를 가능하게 하고, 각 키나아제에 의해 htau 40내 상기 인산화 정도를 나타낸다. 상기의 결과는 제9도에 기술되어 있으며, K18에서 유도된 포스포펩타이드는 제5도에 따라 레벨된다. 다른 키나아제에 의해 생성된 포스포펩타이드 스폿은 NPK110(데이타를 보이지 않음)으로 인산화된 K18 시료와 각 시료를 런닝함에 의해 확인되었다.

제9(a)도에서 보여진 패턴은 뇌추출물과 완전한 길이의 tau 및 K18을 인산화함에 의해 수득된다.

완전한 길이의 tau 와 스폿 1(Ser262)은 명백히 알 수 있고, 스폿 2(Ser365)은 겨우 볼 수 있다. 상기는 K18의 인산화 양식에서 좀 더 현저하다

NPK110에 의한 K18의 인산화가 조사되었을 때, 뇌추출물과 유사한 펩타이드 패턴이 형성되고(제9(a)도 및 제9(b)도와 비교하여); 가장 우수한 스폿은 Ser262 및 Ser365을 함유하는 1 및 2이고, Ser305(스폿 3), Ser324(스폿 4) 및 Ser293(스폿 5)는 작은 성분을 나타낸다. 상기는 주된 Ser262 키나아제로서 NPK110의 역할을 확인한다. 반면에, 초기 키나아제 활성의 재조사는 비상동성 결과를 수득한다.(Biernat ET AL., 1993). NPK110으로 같은 세린의 인산화에도 불구하고, 상기의 중량은 다르고, 뇌추출물내 상기 키나아제 활성은 적어도 10배가 낮다. 상기는 초기에 기술된 것과 같이 미세소관에 결합된 tau의 부분적인 억제를 유도하는 키나아제의 활성을 갖는 tau의 오랜 배양을 설명한다.

제9(c)도에서 알 수 있는 것과 같이, PKC는 K18내에서 상당한 정도로 Ser305(스폿 3), Ser324(스폿 4) 및 Ser293(스폿 5)를 인산화한다. (화살표)왼쪽에 대해 얼룩 및 최대의 스폿은 tau에서 유도되는 포스포펩타이드가 아니며, 또한 상기는 tau의 구조가 첨가되지 않은 대조실험에서 나타난다(보이지 않음). 남은 두 개의 스폿은 확인되지 않는다; 오른쪽위에 스폿은 Ser262(스폿 1) 또는 Ser365(스폿 2)과 같이 배양되지 않는다. 완전한 길이의 tau에서 얻어진 것을 상기의 패턴과 비교하면 PKC의 주된 인산화 자리가 반복영역 밖에 있음을 알 수 있다. 오직 Ser305(스폿 3)가 패턴에서 희미하게 보인다(상기의 오른쪽의 스폿은 대조실험에서 확인된 것과 같이 k18의 오른쪽위의 스폿과 동일하지 않다)

완전한 길이의 tau 및 K18의 구조를 인산화하기 위해 정제된 PKA를 사용하여, 주로 Ser365(스폿 2), Ser305(스폿 3), Ser324(스폿 4) 및 Ser293(스폿 5)가 발견되었다. Ser262(스폿 1)는 작은 인산화 자리이다. 완전한 길이의 tau의 인산화(제9(d)도, 왼쪽 패널)는 tau의 반복 영역밖의 부가적 자리와 유사한 스폿을 만든다. 상기의 결과는 대개 초기의 데이터와 동일하다(Scott et al., 1993; Steiner, 1993). 또한 몇 개의 자리가 이미 기술된 “35/41 kDal” 키나아제 활성을 알 수 있다(Biernet et al,., 1993). 연속된 실험에서, 상기 41kD 성분이 PKA의 촉매적 서브유니트이다(데이타에 보여지지 않음, H Hilz, Hamburg에서 얻어진 PKA에 대항하는 항체를 사용한다. 상기는 데이터에서 부분적으로 겹쳐서 설명한다. PKC는 Ser305, Ser293 및 Ser324를 주로 인산화시키지만(Correas et al., 1992), Ser262는 되지 않는다(제9(c)도).

[실시예 4]

키나아제 NPK110에 의해 인산화된 MAP2 및 MAP4의 자리 MAP2 및 MAP4는 tau로서 같은 MAP족에 속하는 두 개의 미세소관 결합된 단백질이며, 상기는 미세소관에 결합된 단백질의 3 또는 4의 내부 반복영역에서 높은 상동성을 보인다(Chapin & Bulinski, 1992를 볼 것). 바람직하게 뇌에서 MAP2가 일어나고, 대개 뉴런의 소마토덴드리트 구획(somatodentritic compartment)에서 일어난다. tau와 같이, MAP2는 선택적 재접합에 의해 다른 형태로 발현될 수 있다(Kindler et al., 1990)： 두 번째 반복은 나타나지 않을 수 있다(상기는 “클래식컬” MAP2이다)； 더욱이 잔기 152-1514의 영역(예를 들면 1830 잔기 이외의 1363)은 나타나지 않을 것이다(367개의 잔기를 갖는 단백질이 생성, 상기의 형태는 주로 MAP2c로 불린다). 상기에 기술된 인산화 실험은 이. 콜라이에서 발현되는 재조합 MAP2c로 실시되어진다(표 3).

[표 3]

NOTE ： *는 인산화된 잔기이다. 잔기의 수는 albala 등(1993)에 따른다.

MAP4는 아마도 유사분열에 포함되는 편재된 MAP이고, 또한 몇 개의 재접합 이소형으로 나타낸다(West et al., 1991). 상기 인산화 실험은 C-말단 496 잔기(반복영역을 포함하는)로 구성된 재조합 MAP4 구조로 실시되며, 이. 콜라이에서 발현된다(표 4).

[표 4]

NOTE ：*는 인산화된 잔기이다. 잔기의 수는 West 등(1991)에 따른다.

상기 인산화 방법은 실시예 2에서 기술된 것과 동일한다. MAP2 및 MAP4가 방사성 ATP를 사용하여 NPK110으로 인산화되고, 상기 인산화된 단백질은 트립신으로 침지되고, 2차원 포스포펩타이드 지도화에 의해 분석된다(MAP2c에 대해 제11도, MAP4구조에 대해 제12도). 그리고 상기 펩타이드는 두 개의 HPLC 준위 컬럼에 의해 정제된다. 상기의 정제된 방사성 펩타이드가 서열화되고 (인산화된 잔기를 확인하기 위해), 2차원 포스포펩타이드 지도화에 의해 확인된다.

미세소관과 반응상에서 인산화 효과：

NPK110에 의한 MAP2 및 MAP4의 인산화 효과는 tau에서와 같으며, 즉 미세소관에 대한 친화는 몇 배 감소되고, 미세소관의 기능적 불안정성은 더 증가되었다. 예를 들면 문제의 MAP, 키나아제 NPK110 및 ATP의 존재하에서 미세소관의 평균 길이의 감소에 의해 주장될 수 있다(인산화를 요구함). 제13도는 MAP4, MAP2 및 MAP2c 경우의 예를 보여준다. 미세소관의 결집이 0시간에서 시작한다. 공동 서어클은 ATP가 존재하지 않을 때 평균 길이의 증가를 보여준다(인산화되지 않음). 채움 서어클은 ATP 존재하에서(그러므로 인산화된 MAP) 평균 길이가 대조군의 반임을 보여준다.

새로운 NPK-110의 생물학적 중요성은 하기와 같이 요약될 수 있다：

NPK-110은 tau, MAP2, MAP2c 및 MAP4의 반복영역에 대한 효율적 키나아제이다. tau에서 모두 네 개의 KXGS 요소가 인산화되고, 첫 번째 및 네 번째는 가장 뚜렷한 자리를 나타낸다(Ser262 및 Ser365). 상기에서 키나아제가 뇌추출물에서 키나아제 활성을 갖는 초기의 관찰을 재연한다.(Gustke et al., 1992 및 제9도를 볼 것). 키나아제의 가장 현저한 효과는 실제로 미세소관에 결합된 tau를 제거하는 것이고(제6(b)도), 미세소관에서 tau의 분리를 일으키며, 비디오 현미경에서 볼 수 있는 것과 같이 안정한 미세소관에서 기능적으로 불안정한 것으로 전환시킨다. 주로 상기의 효과는 점 돌연변이 Ser262-Ala에 의해 보여진 것과 같이 Ser262의 인산화에 의존한다. 상기의 특징은 뉴런내 미세소관의 결집을 조절하는 NPK110이 후보효소가 된다. 또한 미세소관을 안정화 및 결합시키는 tau의 결핍은 축삭돌기의 운반을 파괴 및 정지시킨다고 가정하면 상기는 “알츠하이머병의 가설”로 구성한다.

상기는 미세소관에서 tau의 부착에 의해서 또는 미세소관에 결합된 tau의 새로운 합성을 억제함에 의해 일어날 수 있으며, 양쪽의 경우는 인산화에서 기인된다. 상기의 개요에 따라서, NPK110이 떨어지거나 또는 그의 준위활성의 케스케이드가 꺼지도록 조절은 알츠하이머병의 치료에 적당하다.

부가적으로 요소 KXGS는 tau 반복영역내에 뿐만 아니라, 신경 MAP2 및 편재된 MAP4내와 같은 다른 MAP내에 유지되는 것이 알려져 있다(Chapin & Bulinski, 1992). 그러므로 NPK-100은 다른 MAP 및 다른 단백질에 영향을 주는 일반적인 역할을 갖는다. 가상의 한 가지 역할은 암의 발생에서 NPK-100을 포함한다.

[실시예 ]

본 발명의 NPK의 부가적 특성

[cDNA 클론의 설명]

올리고펩타이드를 변성시키는 쥐뇌의 cDNA 라이브버리의 스크린에서 서열화된 9개의 클론을 수득하여 브레인-p110MARK 펩타이드 서열을 유도한다.

상기는 70%가 서로 상동인 적어도 두 개의 다른 유전자에서 적어도 두 개의 다른 키나아제를 코딩한다. 상기의 펩타이드 서열은 완전하게 MARK-1과 같은 커다른 클론(NPK-110에 상응하는)과 맞추고, 상기의 8′-프라임 말단은 분실된다(코딩된 단백질의 물중량은 대략 90kDal이다). 상기의 더 작은 cDNA MARK-2는 81kDal의 단백질을 코딩한다. 상기 cDNA 라이브러리를 스크린하기 위해 올리고 누클레오티드를 디자인하는데 적당한 펩타이드가 표 5에 제공된다. 동일한 클론의 상기 아미노산 서열은 표 6에 제공되었다.

[상동]

동일하지는 않지만 연관된 두 개의 서열이 수득된 상동의 서열에 대한 데이터베이스 조사

MMKEM(X70764), 알려지지 않은 기능의 추정 단백질 키나아제를 코딩하는 쥐 cDNA(Inglis et al., 1993)는 MARK-1에 대해 73%의 상동성 및 MARK-2에 대해 96%의 상동성을 보인다.

HUMP78A(M80359), 공개되지 않은 사람 cDNA 서열은 MARK-1에 대해 73%의 동성 및 MARK-2에 대해 69%의 상동성을 보인다. 모든 키나아제는 사카로 마이시스 세리비제(Saccharomyces cervisiae)에서 KIN1 및 KIN2 단백질에 대해 낮은 상동성(약 25%)을 보인다(Levin et al., 1987, 19990)

[조직분포]

노던 블록팅에 의해(제14도). MARK-1 및 MARK-1 mRNA가 태아 및 성인의 조직에 편재되어 발현된다. 근육, 뇌 및 태아의 신장(성인 제외)에서 높게 발현된다.

[활성]

뇌에서 제조된 p110/MARK은, 이. 콜라이에서 발현된 MARK 보다 적어도 100배 이상의 활성을 갖는다. 상기의 활성은 Ser 및/또는 Thr 잔기 상에서 MARK 자체의 인산화에 의존하며, 포스파타아제 2A로 탈이산화한후에 모든 활성은 손실되었다.

p110/MARK의 인산화는 SDS 겔상에서 110kD의 뚜렷한 분자량을 보이며, cDNA 서열화에서 예측된 분자량은 90kD이다. 명백한 분자량내 전이는 종종 포스포프로테인과 함께 관찰된다.

[표적]

P110/MARK은 tau 단백질 뿐만 아니라 효소의 넓은 기능을 나타내는 MAP2 또는 MAP2c(신경 MAP는 대개 소마토덴드리트 구획에 한정된다)와 MAP4(편재된 MAP)와 같은 연관된 MAP를 인산화한다. 상기 주된 인산화 자리는 상기의 MAP 내와 유사하며, 즉 반복영역내 KXGS 요소에서 세린이다. 또한 인산화 효과는 상당하며, MAP의 미세소관-결합 용량내에서 강하게 감소되며, 미세소관의 안정성을 손실한다(예를 들면 제15, 16도를 볼 것).

[표 5]

[표 6]

쥐(Rattus norvegicus) cDNA 라이브버리에서 수득된 MARK-1 및 MARK-2의 cDNA 서열에 상응하는 아미노산 서열

MARK-1(더 크다. 부분적 cDNA 클론) 전체 잔기수 ：779

MARK-2(더 작다, 완전한 cDNA 클론) 전체 잔기수 ： 722

두 개의 정렬된 잔기가 동일함을 보여주는 문자는 “1”이다.

서열 목록

(1)일반적 정보

(i) 출원인 ：

(A) 이름 ： 막스-플란크-게셀샤프트 추르 푀르데룬 데트 비센샤프텐 이. 뷔.

(B) 거리 ： 없음

(C) 도시 ： 베를린

(E) 국가 ： 독일

(F) 우편번호(ZIP) ： 없음

(A) 이름 ： 만델코우, 에크하트

(B) 거리 ： 바론- 보그트-스트라세 212a

(C) 도시 ： 함부르크

(E) 국가 ： 독일

(F) 우편번호(ZIP) ： 22607

(A) 이름 ： 만델코우, 에바-마리아

(B) 거리 ： 바롬-보그트-스트라세 212a

(C) 도시 ： 함부르크

(E) 국가 ： 독일

(F) 우편번호(ZIP) ： 22607

(A) 이름 ： 비이르나트, 자세크

(B) 거리 ： 조이하우스스트라세 12

(C) 도시 ： 함부르크

(E) 국가 ： 독일

(F) 우편번호(ZIP) ： 20459

(A) 이름 ： 드레베스, 게라르트

(B) 거리 ： 렐링게르스트라세 53

(C) 도시 ： 함부르크

(E) 국가 ： 독일

(F) 우편번호(ZIP) ： 20257

(ⅱ) 발명의 명칭 : 단백질 키나아제(NPK-100)

(ⅲ) 서열수 : 32

(ⅳ) 컴퓨터 해독 형태 :

(A) 매개 형태 ： 플로피디스크

(B) 컴퓨터 ： IBM PC 호환형

(C) 운용체계 ： PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 ： PatentIn Release^#1.0, Version^#1.30(EPO)

(v) 현재 출원 데이터 ：

출원번호 ： WO PCT/EP95/04258

(vi) 종래 출원 데이터 ：

(A) 출원번호 ： EP 94 11 7122.5

(B) 출원일 ： 1994년 10월 28일

(2) 서열번호 1의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 20 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 1 ：

(2) 서열번호 2의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 19 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 2 ：

(2) 서열번호 3의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 14 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 3：

(2) 서열번호 4의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 8 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 3

(D) 기타 정보 ： /note = “위치 3에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열： 서열번호 4 ：

(2) 서열번호 5의 정보 ：

I) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 17 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ：펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 3

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 3에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 5 ：

(2) 서열번호 6의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 10 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 3

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 3에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 6 ：

(2) 서열번호 7의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 13 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 7

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 7에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 7 ：

(2) 서열번호 8의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 5 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 3

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 3에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 8：

(2) 서열번호 9의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 8 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 3

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 3에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 9：

(2) 서열번호 10의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 11 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 5

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 5에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 10 ：

(2) 서열번호 11의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 5 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 2

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 2에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 11 ：

(2) 서열번호 12의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 11 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 2

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 2에서 Ser은 인산화되었다”

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 6

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 6에서 Ser은 인산화되었다”

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 9

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 9에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 12 ：

(2) 서열번호 13의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 7 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 5

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 5에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 13 ：

(2) 서열번호 14의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 8 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 3

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 3에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 14 ：

(2) 서열번호 15의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 11 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 6

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 6에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 15 ：

(2) 서열번호 16의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 10 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 2

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 2에서 Thr은 인산화되었다”

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 3

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 3에서 Thr은 인산화되었다”

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 5

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 5에서 Thr은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 16 ：

(2) 서열번호 17의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 9 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 2

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 2에서 Ser은 인산화되었다”

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 6

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 6에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 17 ：

(2) 서열번호 18의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 5 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 3

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 3에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 18：

(2) 서열번호 19의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 11 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(ix) 특징 ：

(A) 이름/키이 ： 펩타이드

(B) 위치 ： 6

(D) 기타 정보 ： /note= “위치 6에서 Ser은 인산화되었다”

(xi) 서열 ： 서열번호 19 ：

(2) 서열번호 20의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 21 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 20 ：

(2) 서열번호 21의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 6 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 21 ：

(2) 서열번호 22의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 13 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 22 ：

(2) 서열번호 23의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 15 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 23 ：

(2) 서열번호 24의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 9 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 24 ：

(2) 서열번호 25의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 19 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 25 ：

(2) 서열번호 26의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 8 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 26 ：

(2) 서열번호 27의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 8 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 27 ：

(2) 서열번호 28의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 13 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 28 ：

(2) 서열번호 29의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 14 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 29 ：

(2) 서열번호 30의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 11 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 펩타이드

(xi) 서열 ： 서열번호 30 ：

(2) 서열번호 31의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 779 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 단백질

(xi) 서열 ： 서열번호 31 ：

(2) 서열번호 32의 정보 ：

(i) 서열 특성 ：

(A) 길이 ： 772 아미노산

(B) 형 ： 아미노산

(C) 쇄의 수 ： 1 본쇄

(D) 형태 ： 직쇄상

(ii) 서열의 종류 ： 단백질

(xi) 서열 ： 서열번호 32 ：

Claims

tau, MAP4, MAP2 및 MAP2c SO KXGS형의 서열 모티프를 인산화할 수 있고, (a) 표 6에서 MARK-1으로 기술된 아미노산 서열을 갖거나b) 표 6에서 MARK-2으로 기술된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 신경 단백질 키나아제(neuronal protein kinase ：NPK) 또는 그의 생물학적 활성 단편.
제1항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제는 (a) SDS-PAGE에 의해 측정된 110kD의 뚜렷한 분자량을 갖고; (b) 사람 tau 단백질의 세린 잔기 262, 293, 305, 324 및 356을 인산화하며; (c) 하기 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 신경 단백질 키나아제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제는 (d) 포스파타아제 PP-2A에 의해 불활성화되고 ： (e) 단백질(MAP) MAP2c 및 MAP4와 결합된 미세소관과 연관된 하기 tau 의 세린 또는 트레오닌 잔기를 인산화시키며 ：

MAP2/MAP2c ： S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ： T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073

(f) 미세소관에서 tau, MAP4, MAP2 및 MAP2c의 해리를 일으키는 것을 특징으로 하는 신경 단백질 키나아제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제는 (a) 뇌 추출물을 균질화하고, 연속적으로 상기를 원심분리하는 단계 ； (b) 셀룰로오스포스페이트 상에서(a) 단계에서 얻어진 상청액을 크로마토그래피를 하여 상기의 NPK 활성 프랙션은 200 내지 400mM NaCl 사이로 용출되는 단계 ； (c) (b) 단계에서 수득된 활성 프랙션을 황산암모늄으로 침전시키고, 상기의 침전물을 투석하는 단계 ； (d) Q-세파로스(Pharmacia) 상에서 (c) 단계에서 수득된 투석물을 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하고, NPK 활성 프랙션을 용출하여 상기의 NPK 활성 프랙션은 활성 프랙션을 연속적으로 투석하여 약 0.2M NaCl에서 단일 피크로 용출되는 단계 ； (e) Mono S HR 10/10(Pharmacia)에서 양이온 교환 크로마토그래피를 실시하는 단계 ； (f) Mono Q HR 5/5 상에서 크로마토그래피를 실시하여 상기의 NPK 활성 프랙션은 약 250Mm NaCl에서 용출되는 단계 ； (g) Superdex G-200 상에서 겔 여과 크로마토그래피를 실시하고, 상기의 NPK 활성은 100kD의 뚜렷한 분자량으로 용출되는 단계 ； 및 (h) ATP-셀룰로오스 상에서 친화 크로마토그래피를 실시하고, 상기의 NPK 활성 프랙션은 SDS-PAGE에서 측정된 것과 같이 약 100kD의 뚜렷한 분자량으로 용출되는 단계에 의해 뇌조직으로부터 얻어지며, 여기서 상기 NPK 활성은 방사성으로 레벨된 ATP의 존재하에서 성인 사람 tau의 아미노산 잔기 255 내지 267로 구성된 펩타이드를 배양하고, 상기 펩타이드에 통합된 방사성을 측정함으로써 측정되는 것을 특징으로 하는 신경 단백질 키나아제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제는 포유류 뇌의 신경 단백질 키나아제인 것을 특징으로 하는 신경 단백질 키나아제.
제5항에 있어서, 상기 포유류의 뇌는 사람 또는 돼지의 뇌인 것을 특징으로 하는 신경 단백질 키나아제.
제1항에 따른 신경 단백질 키나아제를 코딩하는 DNA.
세린 또는 트레오닌 잔기 중 적어도 어느 하나로 구성되는 (MAP)MAP2, MAP2c 또는 MAP4가 결합된 미세소관과 연관된 tau의 하기의 아미노산 위치내에 있는 제7항의 신경 단백질 키나아제에 의해 인산화되는 것을 특징으로 하는 세린 또는 트레오닌 잔기.

MAP2/MAP2c ； S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ； T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073
제8항의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성되는 것을 특징으로 하는 에피토프.
제7항에 따른 신경 단백질 키나아제 또는 그의 단편에 특이적으로 결합된 것을 특징으로 하는 항체.
제9항에 따른 에피토프에 특이적으로 결합된 것을 특징으로 하는 항체.
재10항 또는 제11항에 있어서, 상기 항체는 상기 신경 단백질 키나아제 또는 그의 단편에 결합될 수 있는 모노클론 항체 또는 그의 유도체 또는 단편인 것을 특징으로 하는 항체.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 항체는 상기 신경 단백질 키나아제 또는 그의 단편에 결합될 수 있는 폴리클론 항체 또는 그의 유도체 또는 단편인 것을 특징으로 하는 항체.
제7항에 따른 신경 단백질 키나아제 또는 그의 단편에 대해 의약적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제와 선택적으로 결합되는 특이성 제해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제14항에 있어서, 알츠하이머병을 치료하는 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제14항에 있어서, 암을 치료하는 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제11항에 있어서, 상기 저해제는 제10항 또는 제11항에 따른 항체, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 탈인산화하는 포스파타아제, 바람직하게는 포스파타아제 PP-2A, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 활성화시키는 저해제, Ser262 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 tau, 또는 제8항에서 기술된 적어도 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 MAP4 또는 MAP2/MAP2c인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
(a) 제7항에 따른 신경 단백질 키나아제；(b) 제10항 또는 제11항에 따른 항체； 및/또는 (c) 제2(e)항에 따른 세린 잔기로 구성되는 펩타이드로 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 조성물.
환자에서 분리된 뇌척수액 샘플 또는 신경조직(예를 들면 후각상피)의 생검 샘플을 분석하는 단계 및 제7항에 따른 신경 단백질 키나아제 또는 그의 단편의 존재하에서 상기 샘플을 시험하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 실험관내에서 알츠하이머병의 검출 및/또는 기록방법.
환자에서 분리된 뇌척수액 샘플 또는 신경조직의 생검 샘플을 분석하는 단계 및 제7항에 따른 신경 단백질 키나아제 또는 그의 단편인 비생리량 또는 활성의 존재하에서 상기 조직을 시험하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 실험관내에서 알츠하이머병의 검출 및/또는 기록방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제가 제10항에 따른 항체에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병의 검출 및/또는 기록방법.
하기의 위치내 단백질(MAP), MAP2, MAP2c 및 MAP4와 결합된 미세소관과 연관되는 tau의 인산화된 세린 또는 트레오닌 잔기의 존재하에서 또는 제7항의 신경 단백질 키나아제 또는 그의 단편의 비생리량의 존재하에서 적당한 조직 또는 체액, 또는 상기 신경 단백질 키나아제 또는 그의 단편에 대한 특이성 포스파타아제를 분석하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 실험관내에서 암의 검출방법 또는 암의 발병방법.

MAP2/MAP2c ； S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ； T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073
인산화 상태는 암 또는 암의 발병을 나타내며, 제7항의 신경 단백질 키나아제 또는 그의 단편을 처리함으로써 정상 MAP2, MAP2c 또는 MAP4를 하기 위치에서 인산화된 단백질로 생체외에서 전환하는 방법.

MAP2/MAP2c ； S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799

MAP4 ； T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073
암 또는 암의 발병을 나타내는 특이성 항체를 생성하기 위해 제8항의 MAP의 인산화된 세린 또는 트레오닌 잔기 또는 제9항의 상기 잔기로 구성된 에피토프를 사용하는 것을 특징으로 하는 인산화된 세린 또는 트레오닌 잔기, 또는 에피토프의 사용방법.
제7항에 따른 DNA에 상보적인 것을 특징으로 하는 RNA.
제3항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제는 (a) 뇌 추출물을 균질화하고, 연속적으로 상기를 원심분리하는 단계； (b) 셀룰로오스포스페이트 상에서 (a) 단계에서 얻어진 상청액을 크로마토그래피를 하여 상기의 NPK 활성 프랙션은 200 내지 400mM NaCl 사이로 용출되는 단계； (c) (b) 단계에서 수득된 활성 프랙션을 황산암모늄으로 침전시키고, 상기의 침전물을 투석하는 단계 ； (d) Q-세파로스(Pharmacia) 상에서 (c) 단계에서 수득된 투석물을 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하고, NPK 활성 프랙션을 용출하여 상기의 NPK 활성 프랙션은 활성 프랙션을 연속적으로 투석하여 약 0.2M NaCl에서 단일 피크로 용출되는 단계； (e) Mono S HR 10/10(Pharmacia)에서 양이온 교환 크로마토그래피를 실시하는 단계 ； (f) Mono Q HR 5/5 상에서 크로마토그래피를 실시하여 상기의 NPK 활성 프랙션은 약 250Mm NaCl에서 용출되는 단계； (g) Superdex G-200 상에서 겔 여과 크로마토그래피를 실시하고, 상기의 NPK 활성은 100kD의 뚜렷한 분자량으로 용출되는 단계； 및 (h) ATP-셀룰로오스 상에서 친화 크로마토그래피를 실시하고, 상기의 NPK 활성 프랙션은 SDS-PAGE에서 측정된 것과 같이 약 100kD의 뚜렷한 분자량으로 용출되는 단계에 의해 뇌조직으로부터 얻어지며, 여기서 상기 NPK 활성은 방사성으로 레벨된 ATP의 존재하에서 성인 사람 tau의 아미노산 잔기 255 내지 267로 구성된 펩타이드를 배양하고, 상기 펩타이드에 통합된 방사성을 측정함으로써 측정되는 것을 특징으로 하는 신경 단백질 키나아제.
제3항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제는 포유류 뇌의 신경 단백질 키나아제인 것을 특징으로 하는 신경 단백질 키나아제.
제4항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제는 포유류 뇌의 신경 단백질 키나아제인 것을 특징으로 하는 신경 단백질 키나아제.
제2항에 따른 신경 단백질 키나아제를 코딩하는 DNA 분자.
제3항에 따른 신경 단백질 키나아제를 코딩하는 키나아제를 코딩하는 DNA 분자.
제4항에 따른 신경 단백질 키나아제를 코딩하는 DNA 분자.
제5항에 따른 신경 단백질 키나아제를 코딩하는 DNA 분자.
제6항에 따른 신경 단백질 키나아제를 코딩하는 DNA 분자.
제11항에 있어서, 상기 저해제는 제12항에 따른 항체, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 탈인산화하는 포스파타아제, 바람직하게는 포스파타아제 PP-2A, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 활성화시키는 저해제, Ser262 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 tau, 또는 제8항에서 기술된 적어도 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 MAP4 또는 MAP2/MAP2c인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제11항에 있어서, 제13항에 따른 항체, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 탈인산화하는 포스파타아제, 바람직하게는 포스파타아제 PP-2A, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 활성화시키는 저해제, Ser262 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 tau, 또는 제8항에서 기술된 적어도 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 MAP4 또는 MAP2/MAP2c인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 저해제는 제10항 또는 제11항에 따른 항체, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 활성화시키는 저해제, Ser262 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 tau, 또는 제8항에서 기술된 적어도 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 MAP4 또는 MAP2/MAP2c인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
상기 저해제는 제12항에 따른 항체, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 탈인산화하는 포스파타아제, 바람직하게는 포스파타아제 PP-2A, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 활성화시키는 저해제, Ser262 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 tau, 또는 제8항에서 기술된 적어도 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 MAP4 또는 MAP2/MAP2c인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 저해제는 제13항에 따른 항체, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 탈인산화하는 포스파타아제, 바람직하게는 포스파타아제 PP-2A, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 활성화시키는 저해제, Ser262 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 tau, 또는 제8항에서 기술된 적어도 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 MAP4 또는 MAP2/MAP2c인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 저해제는 제10항또는 제11항에 따른 항체, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 탈인산화하는 포스파타아제, 바람직하게는 포스파타아제 PP-2A, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 활성화시키는 저해제, Ser262 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 tau, 또는 제8항에서 기술된 적어도 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 MAP4 또는 MAP2/MAP2c인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 저해제는 제12항에 따른 항체, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 탈인산화하는 포스파타아제, 바람직하게는 포스파타아제 PP-2A,제7항의 신경 단백질 키나아제를 활성화시키는 저해제, Ser262 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 tau, 또는 제8항에서 기술된 적어도 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 MAP4 또는 MAP2/MAP2c인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 저해제는 제13항에 따른 항체, 제7항의 신경 단백질 키나아제를 탈인산화하는 포스파타아제, 바람직하게는 포스파타아제 PP-2A,제 7항의 신경 단백질 키나아제를 활성화시키는 저해제, Ser262 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 tau, 또는 제8항에서 기술된 적어도 하나의 세린 또는 트레오닌 잔기로 구성된 펩타이드를 유도하는 MAP4 또는 MAP2/MAP2c인 것을 특징으로 하는 의약적 조성물.
(a) 제7항에 따른 신경 단백질 키나아제；(b) 제12항에 따른 항체 ； 및/또는 (c) 제2(e)항에 따른 세린 잔기로 구성되는 펩타이드로 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 조성물.
(a) 제7항에 따른 신경 단백질 키나아제; (b) 제13항에 따른 항체； 및/또는 (c) 제2(e)항에 따른 세린 잔기로 구성되는 펩타이드로 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 조성물.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제가 제12항에 따른 항체에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병의 검출 및/또는 기록방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 신경 단백질 키나아제가 제13항에 따른 항체에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병의 검출 및/또는 기록방법.