KR101890289B1 - 아르마딜로 반복 도메인 2의 치료적 용도를 위한 조성물 - Google Patents

아르마딜로 반복 도메인 2의 치료적 용도를 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2, AR2) 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아르마딜로(Armadillo) 폴리펩타이드의 AR2 도메인 및 Klp64D의 꼬리 도메인이 Arm-Klp64D 결합에 필수적인 역할을 하고, Klp64D 꼬리 도메인이 Arm의 AR2 도메인과 결합하여 Wg 신호에 중요한 역할을 하며. AR2 반복 부위가 Wg 신호를 강력하게 저해하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

아르마딜로 반복 도메인 2의 치료적 용도를 위한 조성물{Compositions for the therapeutic use of a Armadillo repeat domain 2 associated sequence}
본 발명은 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2, AR2) 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
Wnt는 다양한 조직 및 장기에서 발현되며, 초파리에서의 분할; C. 엘레강스(C. elegans)에서의 내배엽 발달; 및 포유류에서의 세포분화, 극성유지, 운반, 운동, 성 결정, 및 뇌 발달을 포함한 많은 발생 과정들에 필요하다(Parr, et al. (1994) Curr. Opinion Genetics & Devel. 4: 523-528).
Wnt 신호 전달 경로의 과활성화는 줄기세포의 조기 노화 및 줄기세포 기능의 손실을 유도하는 것으로 알려져 있으며(Brack et al., 2007; Liu et al., 2007), Wnt/beta-catenin 경로의 과활성화는 종종 다른 세포의 성장 조절 유전자 돌연변이와 함께 작용하여, 비정상적인 세포 성장을 일으켜 암을 유발할 수 있다(Brack et al., 2007; Liu et al., 2007). 예로, 결장직장암의 90%가 Wnt/beta-catenin 경로의 주된 억제인자인 APC(adenomatosis polyposis coli) 유전자의 손실에 의해 개시된다(Kinzler and Vogelstein, 1996; Sjoblom et al., 2006). 또한, Wnt경로 활성화가 흑색종, 유방암, 간암, 폐암, 및 위암에 관련되어 있을 수 있다는 것을 암시하는 증거들이 점점 더 늘어나고 있다.
베타카테닌(beta-catenin)은 전사 조절자(transcriptional regulators) 중 하나로, Wnt/Wg 신호 변환에 중요한 역할을 한다(MacDonald et al.,2009). Wnt 신호가 존재하지 않는 경우에는, 베타카테닌은 AXIN, GSK3β(glycogen synthase kinase 3β) 및 APC(adenomatous polyposis coli)로 이루어지는 파괴 복합체에 의해 분해된다. WNT 리간드가 frizzled 수용체 및 LRP(low density lipoprotein receptor-related protein) 공동 수용체에 결합하여 Wnt/베타카테닌 경로가 활성화되면, DVL(dishevelled) 폴리펩타이드는 AXIN-GSK3β-APC 복합체의 분해를 촉진시켜 결국 베타카테닌을 안정화시킨다.
아르마딜로(Armadillo, Arm)는 척추동물의 베타카테닌 역할을 하는 초파리의 상동(homologue) 유전자이며, 이는 Wg(Wingless) 신호 및 부착 접합(AJs, adherens junctions) 국부화(localization)에 매우 중요한 역할을 한다. Klp64D는 Kif3A 키네신(kinesin) Ⅱ 서브 유닛의 초파리 상동 유전자이며, 이는 날개 발달 동안 Arm을 조절함으로써 Wg 신호에 필요하다고 알려져있다.
Arm은 N- 말단 영역, C- 말단 영역 및 그 중간에 위치하는 긴 반복 영역으로 구성되어 있다. N-말단 영역은 부착 접합에 중요한 역할을 하며, C-말단 영역은 Wg 신호 전달 기능에 필수적이고, Arm 폴리펩타이드의 중앙 3분의 2 영역은 Arm 반복 도메인(Arm repeat domain)으로 불리며, Wg 이펙터 기능에 필요하다고 알려져 있다(Orsulic and Peifer, 1996b). 그러나, 반복 도메인이 Wg 신호 전달에 미치는 특정 역할에 대해서는 아직 완전히 밝혀지지 않았다.
이에, 본 발명자들은 암을 유발하는 Wnt 신호 경로를 억제하는 약학적 조성물을 개발하기 위해 노력하던 중, 아르마딜로(Armadillo) 폴리펩타이드의 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2, AR2) 및 Klp64D의 꼬리 도메인이 Arm-Klp64D 결합에 필수적인 역할을 하고, AR2 반복 부위가 Wg 신호를 강력하게 저해하는 것을 확인하였으며, Wg/Wnt 신호전달에서 Arm의 기능이 베타카테닌과 진화적으로 매우 잘 보존되어 있기 때문에, 본 발명의 AR2 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 Wnt 신호계의 과활성화로 인한 암 치료용 약학적 조성물의 후보물질로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 목적은 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2, AR2) 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2) 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2) 폴리펩타이드 및 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드와 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드와 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드의 결합 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 억제된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드와 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드과 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 결합 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 억제된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 아르마딜로(Armadillo) 폴리펩타이드의 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2, AR2) 및 Klp64D의 꼬리 도메인이 Arm-Klp64D 결합에 필수적인 역할을 나타내고, Klp64D 꼬리 도메인이 Arm의 AR2 도메인과 결합하여 Wg 신호에 중요한 역할을 하며. AR2 반복 부위의 과발현이 Wg 신호전달을 강력하게 저해하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 AR2 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 초파리 키네신-Ⅱ(Kinesin-Ⅱ)의 도메인 구조를 나타낸 도이다.
도 1b는 아르마딜로(Armadillo, Arm) 도메인 구조를 나타낸 도이다.
도 1c는 GST-Klp64DFL 및 GST에 의한 Arm의 12개 AR 도메인 폴리펩타이드의 풀-다운 결과를 나타낸 도이다.
도 1d는 GST-Klp64DT 및 GST에 의한 Arm의 AR 도메인 폴리펩타이드의 풀-다운 결과를 나타낸 도이다.
도 1e는 AR2, ArmΔAR2, Klp64DΔtail 및 Klp64Dtail 폴리펩타이드를 이용한 풀-다운 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 Arm와 인간 베타카테닌의 AR2 도메인 서열을 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 AR2와 결합하는 Klp64D 도메인을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3A는 Klp64D와 인간 Kif3a(hKif3a)의 C-terminal 꼬리 부분의 서열의 유사성 비교하여 나타낸 도이다.
도 3B는 Klp64D의 꼬리 부분과 AR2 도메인과의 결합 여부를 시험한 결과 아미노산 641-670의 폴리펩타이드 서열이 중요함을 확인한 도이다.
도 4는 AR의 도메인이 Wnt 신호에 영향을 미치는지 in vivo 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 AR2 도메인이 Arm 기능에 필수적임을 확인한 결과이다.
도 6은 AR2에 의한 날개 패임현상을 Klp64D 전체 혹은 Klp64Dtail 꼬리부분을 과발현하여 억제할 수 있음을 나타낸 도이다.
도 7은 Klp64DK1 돌연변이에 의한 클론의 성장억제가 Klp64D에 의해 회복되지만 꼬리 부분이 없는 Klp64D△tail 에 의해서는 회복되지 않음을 이매지날 디스크에서의 생체실험을 통해 보여주는 도이다.
도 8은 Wg 신호 활성을 TopFlash 분석법으로 측정한 결과, AR2 도메인에 의해 Arm의 Wg 신호전달기능이 거의 완전히 억제됨을 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2) 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 폴리펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않으며, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 아르마딜로 반복 도메인 2(AR2)폴리펩타이드와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 말한다. 여기서, 실질적으로 동질의 활성이란 상기에서 기재한 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩타이드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩타이드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　폴리펩타이드와　융합으로 만들어진　융합폴리펩타이드　등이 이에 포함될 수 있다.
상기 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드는 아르마딜로 폴리펩타이드에서 유래한 것이며, 포유류의 베타-카테닌(beta-catenin)의 동속체인 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 in vitro 에서 Arm에 의한 Wg 신호전달을 억제하며, 초파리를 이용한 in vivo 실험에서도 Wg 신호전달을 억제한다. 따라서, Wnt 신호를 억제하여 암세포의 성장을 억제할 수 있는 후보 물질임을 특징으로 한다.
상기 암은 유방암, 결장-직장암, 간암, 폐암, 흑색종, 및 위암 등 Wnt와 관련된 것으로 알려진 다양한 암을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 아르마딜로(Armadillo) 폴리펩타이드의 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2, AR2) 및 Klp64D의 꼬리 도메인이 Arm-Klp64D 결합에 필수적인 역할을 하며(도 1 참조), AR2 도메인이 과발현된 초파리는 날개성장억제로 인한 패임 증상을 보이고, Wg 신호의 하위 타켓인 Sens 폴리펩타이드의 발현이 저하되며(도 4 참조), Klp64D 꼬리 도메인이 Arm의 AR2 도메인과 결합하여 Wg 신호에 중요한 역할을 하는 것을 밝혔다(도 6 참조). 또한, Wg 신호 활성을 TopFlash 분석법으로 측정하여, AR2 반복 부위가 Wg 신호를 강력하게 저해하는 것을 확인함으로써(도 8 참조), 본 발명의 AR2 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.
비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 피부외용으로 사용한다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 상기 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 양을 기준으로 0.01 내지 2000 ㎎이고, 바람직하게는 30 내지 500 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2) 폴리펩타이드 및 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징한다.
상기 결합억제제는 아르마딜로 폴리펩타이드의 아르마딜로 반복 도메인 2 및 Klp64D 폴리펩타이드의 Klp64D 꼬리 도메인의 결합을 억제하고, 이때, 아르마딜로 반복 도메인 2는 서열번호 1로 기재되는 서열을 가지며, Klp64D 꼬리 도메인은 서열번호 2로 기재되는 서열을 갖는 것이 바람직하다.
상기 결합억제제는 Klp64D 폴리펩타이드에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득 할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.
상기 항체는 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드에 특이적이고 직접적으로 결합하여 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드를 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 아르마딜로(Armadillo) 폴리펩타이드의 AR2 도메인 및 Klp64D의 꼬리 도메인이 Arm-Klp64D 결합에 필수적인 역할을 하며(도 1 참조), Klp64D 꼬리 도메인이 Arm의 AR2 도메인과 결합하여 Wg 신호에 중요한 역할을 하고(도 6 참조), AR2 반복 부위가 Wg 신호를 강력하게 저해하는 것을 확인함으로써(도 8 참조), 본 발명의 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드 및 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 결합억제제는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은,
1) Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드와 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드와 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드의 결합 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 억제된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은,
1) 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드와 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드와 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 결합 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 억제된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 피검물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩타이드, 효소, 폴리펩타이드, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 결합 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 아르마딜로(Armadillo) 폴리펩타이드의 AR2 도메인 및 Klp64D의 꼬리 도메인이 Arm-Klp64D 결합에 필수적인 역할을 하며(도 1 참조), Klp64D 꼬리 도메인이 Arm의 AR2 도메인과 결합하여 Wg 신호에 중요한 역할을 하고(도 6 참조), AR2 반복 부위가 Wg 신호를 강력하게 저해하는 것을 확인함으로써(도 8 참조), 본 발명의 AR2 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> Klp64D와 결합하는 Arm 반복 도메인 확인
이전의 연구 결과에서 Klp64D의 꼬리 부분의 C-말단 부분이 Arm 반복 도메인과 상호작용함을 확인하였기에, Arm의 어떤 부분이 Klp64D 결합에 관련 있는지 확인하기 위하여 GST 풀 다운(GST pull down)을 수행하였다.
구체적으로, 우선 하기 재조합 폴리펩타이드를 종래의 방법을 이용하여 발현 및 정제하였다; GST-Klp64DFL, GST-Klp64DC, GST-Klp64DN, GST-Klp64DT, MBP-ArmFL, MBP-Arm 반복(repeats), MBP-ArmC, MBP-ArmN 및 MBP-AR 도메인(Cadigan and Nusse, 1997a). 또한, Klp64D와 결합하는 Arm 부위를 찾기 위해 Arm 반복 부위를 12 조각으로 나누어 재조합 폴리펩타이드를 제조하였다; AR1(aa 141-180), AR2(aa 181-223), AR3(aa 224-264), AR4(aa 265-306), AR5(aa 307-349), AR6(aa 350-390), AR7(aa 391-429), AR8(aa 430-473), AR9(aa 474-519), AR10(aa 520-582), AR11(aa 583-623), 및 AR12(aa 624-664). 박테리아 셀 용해물은 기존에 공지된 방법에 의해 준비하였으며(Frangioni and Neel, 1993), 동일한 양의 GST, 글루타치온 세파로즈 4B 비드(beads), GST 퓨전(fusion) 폴리펩타이드 또는 비드 단독으로 세포 용해물을 포함하는 MBP-퓨전 폴리펩타이드과 함께 4℃에서 밤 동안 두고, 이를 풀다운 버퍼(20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10% glycerol, 0.1% Triton X 100, 1mM DTT 및 프로테아제 억제 칵테일(protease inhibitor cocktail)을 이용하여 수차례 세척한 다음, 샘플 버퍼를 첨가하고, 비드는 제거 후, 폴리펩타이드를 추출하여 12% SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리 아크릴아미드 겔에 전기영동한 후 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겨주었다. 분리된 폴리펩타이드가 옮겨진 막은 항체와의 비특이적인 결합을 막기 위해 TBST 완충액(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5% Tween-20)에 10%로 녹인 탈지유(skim milk)로 전처리하였고, 1차 염소-항 GST(Santa Cruz) 및 토끼 항-MBP 항체(Santa Cruz)를 3% BSA(Bovine Serum Albumin) 용액에 희석하여 반응시켰다. 1차 항체를 인지하는 2차 염소 항-토끼 또는 항 염소(Molecular Probes) 항체를 TBST 완충액에 5%로 녹인 탈지유에 희석하여 반응시킨 후 ECL 시약(GenDepot)을 사용하여 관찰하였다.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, AR 2, 3, 7, 8 및 10 부위가 Klp64D와 복합체를 형성하였다(도 1). 또한, 상기 다섯 부위 중 AR2만이 Klp64D 꼬리 도메인에 결합하며, AR2 부분이 제거된 Arm△AR2는 Klp64D 및 꼬리 도메인이 제거된 Klp64D△tail과 모두 결합하지 않았다. 이는 AR2 및 Klp64D의 꼬리 도메인이 이들의 결합에 필요 충분 조건을 충족함을 나타낸다.
아울러, 상기 AR2 및 Klp64D 꼬리 도메인의 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 서열
아르마딜로 반복 도메인 2 (서열 번호 1) KEASRHAIMNSPQMVAALVRAISNSNDLESTKAAVGTLHNLSH
Klp64D의 꼬리 도메인
(서열 번호 2)		 KEPDFLDLSHVYLSYNTDGYSNPMRSKSA
< 실시예 2> Arm와 인간 베타카테닌의 AR2 도메인 서열 비교
본 발명의 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2) 폴리펩타이드와 인간 베타카테닌의 서열을 비교하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 초파리 AR2(아미노산 181-223)와 인간 베타카테닌의 AR2(189-231)은 67% 동일 서열 및 83% 유사서열을 보이는 것을 확인하였다(도 2).
< 실시예3> AR2와 결합하는 Klp64D 도메인의 확인
상기 <실시예 1>에서 AR2와 Klp64D 꼬리 도메인에 결합함을 확인하였으며, 이에 Klp64D의 도메인 서열을 확인하여, AR2도메인과의 결합에 중요한 서열 부위를 판별하였다.
구체적으로, Klp64D와 인간 Kif3a(hKif3a)의 서열을 비교하였으며, Klp64D 도메인을 세 조각(Frag 1, Frag 2 및 Frag 3)으로 나눈 다음 <실시예 1>의 GST 풀 다운 방법과 동일하게 수행하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, Klp64D에서 아미노산 641-670의 폴리펩타이드 서열이 중요함을 확인하였다(도 3).
< 실시예 4> Klp64D 기능에 영향을 끼치는 Arm 2 도메인 확인
상기 <실시예 1>에서 Kpl64D 도메인과 결합하는 AR의 5가지 도메인을 확인하였으며, 상기 AR의 도메인이 Wnt 신호에 영향을 미치는지 in vivo 실험을 통해 확인하였다.
구체적으로, Arm 반복 도메인 부위(AR2, AR3, AR7, AR8, AR10), AR2 도메인이 제거된 Arm 도메인(Arm△AR2) 및 Klp64D의 꼬리(Klp64Dtail) 도메인을 pUAS-attB 벡터(Brand and Perrimon, 1993)에 클로닝하여 형질전환 초파리 라인을 제작하였다. 상기 형질전환 초파리를 C96-Gal4 초파리(Bloomington Drosophila Stock center, USA)와 교미하여 날개 디스크(wing disc)에 상기 도메인을 과발현시켜 관찰하였다.
그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, AR 3, 7, 8 및 10을 과발현한 경우, 초파리 날개 발생에 어떠한 변화도 없었으며, AR2가 과발현된 경우 날개 성장억제로 인한 톱니모양의 패임 현상이 나타났으며, Wg 신호의 하위 타켓인 Sens 폴리펩타이드의 발현이 저하됨을 확인하였다(도 4). 이는 AR2가 Wg 신호를 방해하는 우성-음성(dominant negative) 요소임을 나타낸다.
이에, 상기 AR2 과발현의 효과가 Klp64D과의 특정 간섭으로 인해 유발되었는지 확인하기 위해, AR2 효과가 Klp64D의 수준을 감소 또는 증가시킴으로써 변경될 수 있는지 여부를 실험하였다.
구체적으로, 상기 형질전환 C96-Gal4 초파리와 UAS-klp64D RNAi(10642R-1 and 10642R-2 from National Institute of Genetics, 일본)을 교미하여 날개 디스크에 klp64D를 넉다운하여 관찰하였으며, 상기 넉다운 형질전환 초파리에 다시 UAS-klp64D(Sarpael et al., 2003) 유전자를 가진 초파리를 교미하여 klp64D 발현을 회복시켜 관찰하였다.
그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, AR2 과발현에 의한 날개 찢어짐 표현형은 Klp64D의 RNAi 넉다운에 의해 감소되었고, 이는 Klp64D의 과발현에 의해 다시 회복되었다(도 4). 그러나 상기 AR2에 의한 날개 찢어짐 표현형은 대조군인 UAS-GFP를 처리하였을 때는 개선되지 않았다. 종합하여, 이러한 결과는 AR2의 과발현은 Klp64D-Arm의 상호작용의 간섭으로 인한 Wg 신호의 우성-음성 요소임을 시사한다.
< 실시예 5> Arm 기능에 필수적인 AR2 및 Klp64D 꼬리 도메인 확인
상기 <실시예 4>를 통해 Wg 신호에서 AR2 과발현의 우성-음성 효과가 AR2-Klp64D과의 상호작용에 중요함을 확인하였다. 이에, AR2 도메인이 Arm의 기능에 필수적인지 확인하기 위해 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, 초파리 유충의 Arm 돌연변이 MARCM을 유도하고, 이의 세번째 유충시기의 이매지날 디스크(imaginal discs)를 분석하였다. MARCM 돌연변이 클론을 제작하기 위해, hs-FLP, FRT 19A tub-Gal80;nub-Gal4 및 UAS-GFP/UAS-GFP의 유전자를 가진 수컷 초파리를 FRT19A arm2/FM7c 유전자를 가진 암컷 초파리와 교미시켰다. 대조군 클론은 hs-FLP, FRT19A, Tub-Gal80;nub-Gal4, UAS-GFP/UAS-GFP 의 유전자를 가진 수컷 초파리를 FRT19A/FRT19A 유전자를 가진 암컷 초파리와 교미시켜 제작하고, klp64Dk1 클론도 동일한 방법을 수행하여 제작하였다. 상기 클론은 37℃에서 한시간 동안 열 처리(heat shock)하여 산란 60시간 후에 유도되었으며, 유충은 실온에서 세번째 유충 시기까지 키운 후, 이매지날 디스크를 해부하였다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 야생형 세포와 동형접합의 대조군 클론은 정상적인 디스크 형태와 클론을 나타내었다. 반면에, 동형접합의 Arm 돌연변이 클론은 매우 작고, 이매지날 디스크의 성장도 저조하였다(도 5B). 그러나 상기 돌연변이 클론은 야생형의 Arm을 함께 과발현시켰을 경우 부분적으로 회복되는 형태를 보였으나(도 5C), Arm에서 AR2가 제거된 도메인을 함께 과발현시킨 경우는 이러한 회복이 저해되는 현상을 확인하였다(도 5D). 이와 같은 결과는 AR2가 우성-음성 효과뿐만 아니라 Arm의 Wg 신호전달기능에 필수적임을 나타낸다.
< 실시예 6> Klp64D 꼬리 도메인의 과발현에 의한 AR2의 우성-음성효과 억제 확인
Klp64D 꼬리의 과발현에 따른 변화를 확인하기 위해, 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, C96-Gal4 초파리에 Klp64D 꼬리 도메인을 과발현시킨 후, 초파리 날개 패임 증상을 확인하였다.
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이 lp64D 꼬리(Klp64Dtail) 도메인 과발현의 경우 AR2보다는 약하지만 날개 변두리 부분들이 패이는 효과를 보였으며, 이는 그 자체로도 우성-음성 효과가 있음을 나타낸다(도 6D). 또한, Klp64D 및 Klp64D 꼬리(Klp64Dtail)는 모두 AR2 우성-음성 효과를 유사하게 억제하며, 이는 Klp64D 꼬리(Klp64Dtail)가 AR2의 날개 찢어짐 효과를 억제하기에 충분함을 나타낸다.
< 실시예 7> Klp64D 꼬리부분이 Klp64D 기능에 필수적임을 확인
또한, 상기 결과를 바탕으로 Klp64D 꼬리 도메인이 모터 단백질 기능에 필요한지 여부를 시험하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 5>의 실험 방법과 동일한 방법으로 수행하였으며, klp64Dk1 MARCM 유도 초파리와 UAS-klp64D 및 UAS-Klp64DΔtail 초파리를 교미시킨 후, 유충의 이매지날 디스크를 관찰하였다.
그 결과 도 7A와 7B에 나타난 바와 같이, klp64Dk1 클론은 매우 작았고, klp64D의 MARCM 동형 접합 돌연변이는 야생형 klp64D 발현에 의해 klp64D 돌연변이 클론의 증식이 회복되었다. 반면에 kpl64D에서 꼬리 부분이 제거된 Klp64DΔtail을 발현시킨 경우, 회복되지 않았다(도 7C). 이로 인해, Arm의 AR2 도메인과 결합하는데 필요한 Klp64D 꼬리 도메인이 Klp64D 단백질의 기능에 중요함이 밝혀졌다.
< 실험예 1> AR2에 의한 Wg 신호 억제 확인
AR2가 Wg 신호를 직접적으로 억제하는지 확인하기 위하여, Wg 신호 활성을 TopFlash 분석법으로 측정하였다.
구체적으로, 기존의 공지된 방법으로 초파리 S2R+ 세포에 외부에서 추가된 Wg과의 반응에 필요한 Wg 신호 구성 요소들을 발현시켰으며(Yanagawa et al., 1998), USA-HA를 S2 세포에 발현하여 대조군으로 사용하였다. Arm, ArmΔAR2 및 USA-HA의 형질도입(transfection)을 위해, 1 ㎍ DNA, 1 ㎍ wisir(luciferase reporter plasmid) 및 1 ㎍ VP-Gal4(UAS-HA의 웰 안에)를 포함하는 98 ㎕ EC 버퍼를 6-웰 플레이트에서 배양 배지 3.5 x 106 세포/1.6 ㎖ 내 16 ㎕ 인핸서(Enhancer, Qiagen), 38 ㎕ 이펙텐(Effectene, Qiagen)과 혼합하였다. Wg 신호의 Arm 및 ArmΔAR2의 효과를 평가하기 위해, Wg 폴리펩타이드가 있거나 또는 없는 배지 400 ㎕를 형질도입 2일 후에 첨가하였다. 1일 후, 상기 세포는 이중-루시퍼라제 리포터 어세이 시스템(Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega)을 이용하여 루시페라아제 수준을 평가하기 위해 용해시켰다. 루시페라아제 활성은 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase)의 파이어플라이(firefly)의 비율로 계산되었으며, 3회씩 독립적으로 수행한 후 HA 대조군과 비교하여 SEM(Standard error of the mean)으로 산출하였다. 통계적 유의성은 two-tailed t test에 근거하였다. Wg 함유하는 배지를 얻기 위해, S2 Tub-Wg 세포(DGRC) 및 S2 세포를 M3 배지(Sigma)에서 기존에 공지된 방법으로 생장시켰다Cherbas et al., 1994). 세포는 원심분리하여 침전물을 얻었으며, Wg 폴리펩타이드의 존재는 마우스-항-Wg 항체(DSHB)를 이용하여 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, Wg 폴리펩타이드가 없는 경우 루시페라아제 비율은 거의 0에 가까우며, Wg 폴리펩타이드를 첨가한 경우 루시페라아제 비율이 0.7까지 상승하였다(도 8). 이러한 활성은 Arm을 발현시켰을 때 2.3까지 상승한 반면, Arm과 함께 AR2를 발현한 경우 Wg 신호가 기저 레벨(0.004)까지 감소하였다. 이러한 결과는 AR2 반복 부위가 Wg 신호를 강력하게 저해할 수 있음을 나타낸다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Compositions for the therapeutic use of a Armadillo repeat domain 2 associated sequence <130> 2015P-06-012 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Drosophila <400> 1 Lys Glu Ala Ser Arg His Ala Ile Met Asn Ser Pro Gln Met Val Ala 1 5 10 15 Ala Leu Val Arg Ala Ile Ser Asn Ser Asn Asp Leu Glu Ser Thr Lys 20 25 30 Ala Ala Val Gly Thr Leu His Asn Leu Ser His 35 40 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Klp64D tail domain <400> 2 Lys Glu Pro Asp Phe Leu Asp Leu Ser His Val Tyr Leu Ser Tyr Asn 1 5 10 15 Thr Asp Gly Tyr Ser Asn Pro Met Arg Ser Lys Ser Ala 20 25

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 아르마딜로 반복 도메인 2(Armadillo repeat domain 2) 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 시험관 내 또는 초파리 내에서의 Wg 신호전달 억제용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 1) 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드와 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드와 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드의 결합 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 억제된 피검물질을 선별하는 단계;
    를 포함하는 아르마딜로 반복 도메인 2 및 Klp64D 꼬리 도메인의 결합 억제제의 스크리닝 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 단계 2)의 결합 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  11. 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드와 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 아르마딜로 반복 도메인 2 폴리펩타이드와 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Klp64D 꼬리 도메인 폴리펩타이드의 결합 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 억제된 피검물질을 선별하는 단계;
    를 포함하는 아르마딜로 반복 도메인 2 및 Klp64D 꼬리 도메인의 결합 억제제의 스크리닝 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 단계 2)의 결합 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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Development. Vol. 141, No. 16, pp. 3222-3232 (2014)
Mammalian Genome. Vol. 21, No. 9-10, pp. 450-457 (2010)

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