KR20230068866A - 결핵균의 Rv3364c 단백질에서 유래한 패혈증 치료용 펩타이드 - Google Patents

결핵균의 Rv3364c 단백질에서 유래한 패혈증 치료용 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SNX9의 BAR 도메인과 직접 결합할 수 있는 Rv3364c 유래 펩타이드에 관한 것으로서, 본 발명의 Rv3364c 유래 펩타이드는 SNX9에 의존하여 TLR4 매개 염증반응을 조절할 수 있는바 결핵균 감염 질환의 예방 및 치료와 함께 패혈증과 패혈증 쇼크의 예방 및 치료 용도에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

결핵균의 Rv3364c 단백질에서 유래한 패혈증 치료용 펩타이드{PEPTIDE FOR TREATING SEPSIS DERIVED FROM RV3364C PROTEIN OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS}
본 발명은 결핵균의 Rv3364c 단백질 유래의 펩타이드에 관한 것으로서, SNX9와 상호작용에 필수적인 Rv3364c 유래의 펩타이드의 패혈증 치료 용도 등에 관한 것이다.
박테리아 항원은 숙주 면역 방어와 박테리아가 숙주 면역으로부터 피하거나, 스스로를 보호하도록 하는 메커니즘 사이의 상호작용을 유발한다. 이러한 숙주-병원체 상호작용은 세포 내 병원체에 의해 매우 복잡한데, 예로서 결핵의 원인인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)이 있다. 결핵균의 세린 단백질분해효소 억제제(serine protease inhibitor)로 알려진 Rv3364c는 결핵균에 노출된 대식세포에 높은 수준으로 발현되고, 결핵균 및 대식세포의 배양 상층액과 용해물에서 강하게 발현되는 항원이다. Rv3364c는 Roadblock/LC7 도메인을 포함하며 진핵생물의 외부/내부 편모 디네인(outer/inner flagellar dynein), Myxoccus xanthus의 세포질 디네인 (cytoplasmic dynein)과 연관되어 있으며, 상기 각 디네인의 구조와 기능 조절 역할을 수행한다. 또한 Rv3364c 효과 단백질(effector protein)은 대식세포의 세포막에 세린 프로테아제 카뎁신 G (serine protease cathepsin G)와 결합하여 이의 효소적 활성과 그 하위 반응경로에 있는 카스파아제(caspase-1) 의존적 세포사멸을 억제한다. 그러나, Rv3364c와 숙주세포와의 상호작용의 이해는 아직 미흡한 실정이며, 대식세포와 Rv3364c 사이의 상호관계를 이해하는 것은 효과적인 감염병 치료 전략 수립에 중대한 기여를 할 것으로 기대된다.
패혈증(sepsis)은 감염에 대한 숙주의 반응이 조절되지 않아 일어나는 생명과 관련된 장기 기능 장애로 정의된다. 패혈증에 걸리면 병원체에 의해 시작된 면역반응이 항상성을 유지하지 못하고, 과도한 염증과 세균 증식이 지속되는 병리학적 증후군을 일으키게 된다. 패혈증의 사망률은 25%에 가까우며, 높은 발생률과 사망률 때문에 세계적으로 이에 대한 비용 지출이 상당한 상태이다. 패혈증의 발병에 대한 이해 수준은 높아졌지만, 아직 표적 치료 방법에 대한 부분은 미흡한 상태이다.
한편, 펩타이드와 단백질은 치료제로서 큰 잠재력을 가지고 있다. 현재, 작은 크기의 소분자 약물이 대부분의 제약시장을 차지하고 있는데 이들과 같은 전형적인 소분자 약물과 비교하여, 펩타이드 및 단백질은 표적 특이성을 가져 부작용과 독성이 적고, 비천연 아미노산을 이용하여 쉽게 최적화할 수 있다는 장점이 있다. 치료를 목적으로 한 펩타이드와 단백질이 지속적으로 연구되고 있음에도 불구하고, 전신에 걸친 안정성과 특정 부위에 전달을 증가시키는 방법이 논의되고 있다. 그리고 세포에 침투하는 펩타이드의 표적 특이성의 결여는 임상 개발에서 주요 장애물로 남아있다.
EMBO Molecular Medicine 2020, vol.12, issue12: e12497 "Mycobacterium tuberculosis Rv2626c-derived peptide as a therapeutic agent for sepsis"
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 Rv3364c에서 SNX9와 상호작용에 관여하는 영역의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 패혈증 치료 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 Rv3364c 유래의 펩타이드를 패혈증 치료용 펩타이드로서 제공한다.
본 발명에서 상기 Rv3364c 유래 펩타이드는 Rv3364c에서 SNX9와 상호작용에 관여하는 영역의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 SNX9와 상호작용에 관여하는 영역의 최소 범위는 Rv3364c 단백질의 12-17 a.a 아미노산 서열(서열번호 14)이다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 패혈증 치료용 펩타이드는 12번째 및 17번째 아미노 잔기(W12 및 F17)의 기능적 성질에 영향을 미치지 아니한다면 그 N-말단 및/또는 C-말단에 추가의 아미노산을 하나 또는 2 이상 포함할 수 있으며, 상응되는 의미에서 상기 패혈증 치료 용도에 제공되는 Rv3364c 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 패혈증 치료용 펩타이드는 상기 Rv3364c 유래 펩타이드의 N-말단에 세포투과 펩타이드가 연결된 것일 수 있으며, 상기 세포투과 펩타이드는 HIV-TAT (서열번호 15), TAT (서열번호 16), dNP2 (서열번호 17), VP22 (서열번호 18), MPG (서열번호 19), PEP-1 (서열번호 20), EB1 (서열번호 21), transportan (서열번호 22), p-Antp (서열번호 23), hCT(18-32)(서열번호 24), KLA (서열번호 25) 및 올리고아르기닌 (서열번호 26)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 패혈증 예방 또는 치료 약제의 제조를 위한 상기 펩타이드의 용도를 제공한다.
본 발명자들은 결핵균 유래 Rv3364c 단백질이 숙주의 SNX9와 반응함을 확인하고, SNX9와 직접 상호작용하는 영역을 확인하여 SNX9의 BAR 도메인과 직접 결합할 수 있는 Rv3364c 유래 펩타이드를 제작하였다. 상기 Rv3364c 유래 펩타이드는 SNX9에 의존하여 TLR4 매개 염증반응을 조절할 수 있는바 결핵균 감염 질환의 예방 및 치료와 함께 패혈증과 패혈증 쇼크의 예방 및 치료 용도에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b은 CDI HuProt™ Human Proteome Microarray에서 rRv3364c와 잠재적으로 상호작용할 것으로 예상되는 후보 단백질을 선별한 결과이다. 각 도면은 양성반응을 보여주는 단백질 어레이의 섹션을 나타낸다. 532nm 에서의 신호는 대조군보다 rRv3364c 그룹에서 보다 강하게 나타났다.
도 2는 생체 내에서 rRv3364c와 상호작용하는 단백질을 선별하기 위하여 BMDM 세포와 HEK293T 세포에 rRv3364c를 처리하고 공동면역침강을 수행하여 상호작용 단백질을 확인한 결과이다. 구체적으로 (A)는 1μg/ml rRv3364c의 처리 시간을 달리한 BMDM 세포를 수확하고 αHis로 면역침강(Immunoprecipitation: IP)를 수행하고 αSNX9, αYEATS4, αZBTB46 및 αEGFLAM를 사용하여 면역블롯(immunoblot: IB)을 수행한 결과이다. WCL을 IB에 αHis 또는 αActin와 함께 사용하였다. (B)는 293T 세포에 Flag-Rv3364c와 Myc-tagged SNX9, YEATS4, ZBTB46 또는 αEGFLAM을 공동-형질감염(co-transfection)하고 αFlag (왼쪽) 또는 αMyc (오른쪽)으로 IP 수행 후 αMyc 또는 αFlag을 사용하여 IB를 수행한 결과이다. WCL을 IB에 αHis 또는 αActin와 함께 사용하였다.
도 3a 및 도 3b는 세포 내에서 rRv3364c의 위치를 확인한 결과이다.
도 3a는 1μg/ml rRv3364c의 처리 시간을 달리한 Raw264.7를 핵과 세포질로 분획하고 αHis로 IP를 진행한 후 αSNX9 또는 αYEATS4를 IB를 진행한 결과이다. WCLs를 IB에 αSNX9, αYEATS4 또는 αHis를 함께 사용하였다.
도 3b는 1μg/ml rRv3364c의 처리 시간을 달리한 BMDM 세포에 His-rRv3364c (Alexa Fluor 568)와 SNX9 또는 YEATS4 (Alexa Fluor 488) 항체를 이용하여 면역형강을 수행한 결가이다. DAPI(파란색)은 핵을 염색한 것이고, 눈금 막대는 10μm이다.
도 4 및 도 5는 Rv3364c가 SNX9 및 YEATS4와 상호작용하는 영역을 확인한 결과이다.
도 4는 10 a.a 길이의 Rv3364c 유래 펩타이드를 설계하고 그 N-말단에 Tat 펩타이드가 융합한 Tat-rRv3364c 펩타이드를 제작한 후 각 Tat-rRv3364c 펩타이드가 rRv3364c와 SNX9(A) 및 YEATS4(C)의 결합을 방해하는 정도를 확인하여 Rv3364c에서 각 단백질과 상호작용하는 영역을 확인한 결과이다. 구체적으로, Flag-Rv3364c와 함께 Myc-SNX9로 형질감염한 293 세포에 12시간 동안 Tat-Rv3364c 펩타이드(5μM)를 처리하고 αFlag로 IP를 수행한 후, αMyc으로 IB를 수행한 결과이다. WCLs는 IB에 αMyc, αFlag, αActin과 함께 사용했다. 그리고, 타겟과 반응성이 높은 Tat-Rv3364c 펩타이드의 농도를 달리한 세포에서 면역침강 및 면역블롯을 수행하였다(B 및 D).
도 5는 SNX9와 상호작용에 필수적인 rRv3364c 단백질의 영역을 탐색한 결과이다.
도 6은 rRv3364c 단백질과 상호작용하는 SNX9의 영역을 탐색한 결과이다. 구체적으로, 야생형 SNX9의 각 도메인을 분리한 펩티이드를 설계하고(A) 239T 세포에 Flag-rRv3364c와 함께 Myc-SNX9 펩타이드를 공동 형질감염시킨 후 αFlag (B) 또는 αMyc (C)와 함께 IP를 수행한 후, IB를 αMyc (B) 또는 αFlag (C)와 함께 수행한 결과이다.
도 7은 Rv3364c가 SNX9 및 YEATS4와 상호작용하는 영역과 세포 내 위치를 나타낸 모식도이다.
도 8a 내지 도 8d는 대식세포에서 Rv3364c가 SNX9와 상호작용하여 TRL4 매개 염증반응을 조절할 수 있음을 확인한 결과이다.
구체적으로, 도 8a는 WT, TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/-, TRIF-/-, IRAK1-/-, TRAF6-/-, 및 TBK1-/- 마우스의 DMBM 세포에 1μg/ml rRv3364c 또는 rVector을 18시간 동안 처리하고 그 배양 상층액을 수확하여 ELISA를 통해 TNF-α, IL-6, IL-12p40, 및 IL-10의 수준을 측정한 결과이다.
도 8b는 SNX9-/- 마우스의 DMBM 세포에 1μg/ml rRv3364c 또는 rVector을 18시간 동안 처리하고 그 배양 상층액을 수확하여 ELISA를 통해 TNF-α, IL-6, IL-12p40, 및 IL-10의 수준을 측정한 결과이다.
도 8c는 SNX9+/+ 또는 SNX9-/- 마우스의 BMDM 세포에 TAT-Rv3364c 펩타이드(12WLVSKF17) (1, 5, 10μM)로 1시간 동안 전처리하고, 100ng/ml LPS로 18시간 동안 차극 후에 그 배양 상층액을 수확하여 ELISA를 통해 사이토카인의 발현 수준을 확인한 것이고, 도 8d는 세포를 채취하여 AKT, MAPK (ERK, p38, JNK), IκBα의 인산화 형태와 전체 IκBα를 IB를 통해 확인한 결과이다.
도 9는 LPS 자극 하에서 SNX9와 p47phox의 상호작용과 Tat-rRv3364c (12-17 a.a) 펩타이드가 엔도솜 내의 ROS 생성을 억제함을 확인한 결과이다. 구체적으로 (A)는 BMDM과 THP-1을 TAt-Rv3364c 펩타이드 (12WLVSKF17) (1, 5, 10μM)로 1시간 동안 전처리하고 100ng/ml LPS 또는 30분으로 자극한 후 αSNX9로 IP를 수행한 후 αp47phox로 IB를 진행한 결과와(위) NADPH 산화효소의 활성을 확인한 결과이다(아래). (B)는 BMDM을 TAT-Rv3364c 펩타이드 (12WLVSKF17) (1, 5, 10μM)로 1시간 동안 전처리하고, 100ng/ml LPS 또는 30분으로 자극한 후, αSNX9로 IP를 수행한 후, αp22phox, αp67phox, αp91phox와 함께 IB를 수행한 결과이다. WCL는 αp22phox, αp67phox, αp91phox 또는 αActin와 함께 IB에 사용하였다.
도 10는 엔도솜의 구획을 sucrose flotation gradient assay으로 원심분리 및 정제하고 면역형광현미경 단계를 수행하여 엔도솜 내의 SNX9의 이동을 추적하고 엔도솜 내에서 신호전달 및 분자의 동적을 관찰한 결과이다.
구체적으로, 도 10a의 위는 엔도솜 sucrose flotation gradient assay을 사용하여 SNX9+/+ 또는 SNX9-/- 쥐의 BMDM의 동등한 부피 분량을 각 구배 구획에서 SDS-PAGE로 분리하고 IB를 통해 조사한 결과이다: Rab5와 EEA1 (EE 마커), Rab7 (LE 마커), LAMP1 (LE 및 리소솜 마커), Histone H3 (핵 마커). 도 10a의 아래는 Tat-Rv3364c 펩타이드 (12WLVSKF17) (5μM)로 1시간 동안 전처리하고 100ng/ml LPS로 30분 동안 자극한 Raw 264.7 또는 BMDM을 SNX9 (Alexa Fluor 488) 또는 p47phox (Alexa Fluor 568)에 대한 항체로 면역염색한 결과이다. 도면의 눈금막대는 10 μm를 표시한다.
도 10b는 엔도솜 막 분포는 SNX9+/+ 또는 SNX9-/- 마우스의 BMDM에서 sucrose flotation gradient을 사용하여 분석한 결과로, 동등 부피 분량을 각 구배 구획에서 SDS-PAGE로 분리하고 IB를 통해 조사했다: Rab5와 EEA1 (EE 마커), Rab7 (LE 마커), LAMP1 (LE 및 리소솜 마커), Histone H3 (핵 마커).
도 10c는 TAT-Rv3364c 펩타이드 (12WLVSKF17) (5μM)로 1시간 동안 전처리하고 100ng/ml LPS로 30분 동안 자극한 Raw264.7 또는 BMDM을 SNX9(Alexa Fluor 488) 또는 p47phox(Alexa Fluor 568)에 대한 항체로 면역염색한 결과이다. 도면의 눈금막대는 10 μm를 표시한다.
도 11의 (A)는 p47phox 도메인 구조의 개략과(위) p47phox와 Myc-SNX9 및 p47phox의 각 도메인을 293T 세포에 공동 형질감염하고, αV5 또는 αMyc으로 IP를 수행한 후 αMyc, αV5 또는 αactin와 함께 IB를 수행한 결과이다. (B)는 p47phox와 Myc-SNX9 및 p47phox의 각 도메인을 293T 세포에 공동 형질감염하고, αV5 또는 αMyc으로 IP를 수행한 후 αMyc, αV5 또는 αactin와 함께 IB를 수행한 결과이다.
도 12는 293T 세포에 V5-p47phox와 Myc-SNX9을 Flag-Rv3364c (1, 5, 10μg)와 함께 12시간동안 공동 감염하고, αMyc (왼쪽) 또는 αV5 (오른쪽)로 IP를 수행한 후, αMyc, αV5, αFlag 또는 αactin과 함께 IB를 수행한 결과이다.
도 13은 rRv3364c에 의해 매개되는 TLR 신호 경로의 조절에 대한 모식도이다. Rv3364c 유래 펩타이드 12WLVSKF17는 SNX9의 BAR 도메인과 직접적으로 상호작용하여 LPS 자극하에 유도되는 초기 엔도솜에서 SNX9와 p47phox의 상호작용을 억제함으로서 ROS 생성과 염증성 사이토카인의 발현 수준을 감소시킬 수 있다.
본 발명자들은 숙주의 방어 매커니즘 작용을 방해하는 결핵균의 효과단백질(effector protein)을 발견하고, 숙주 세포 내에서 결핵균 유래 단백질의 분자적 작용을 확인하였다. 예를들어, Rv2626c는 TRAF6(TNF Receptor-Associated Factor 6)의 RING 도메인(N-말단)과 직접적으로 결합하여 TRAF6의 라이신63-유비퀴틴화를 방지함으로써 TLR4 면역 반응을 억제하는 것을 확인하였다. 재조합 Rv2626c-CA 펩타이드는 CLP 유도 패혈증 마우스 모델에서 유의한 치료 효과를 나타내었다. 또한, 결핵균의 분비단백질인 MPT63이 TBK1 및 p47phox와 상호작용하고 MPT64가 TBK1 및 HK2와 상호작용을 확인하고 상기 각 분비단백질의 상호작용 모티프(motif)를 조합한 재조합 MPT 단백질을 제조하여 대식세포 내에서 시험관 내 및 생체 내 결핵균의 수 감소를 촉진함을 확인하였다.
본 출원발명은 이전 연구의 계속으로 결핵균 유래의 Rv3364c 단백질의 숙주세포 내 분자와의 상호작용을 확인하고, 숙주의 방어 매커니즘 작용에 방해 기작을 파악하여 이를 역으로 이용하여 Rv3364c 유래의 펩타이드를 패혈증 치료 용도에 제공하는 것이다.
먼저 본 발명자들은 Rv3364c가 숙주세포에서 상호작용하는 인자를 확인하기 위하여 무세포 시스템에서 단백질과 상호작용 여부를 맞춤형 단백질 결합 분석을 통해 확인하고 Rv3364c와 상호작용할 것으로 예측되는 118개 후보 단백질을 선정하였으며, 각 후보 단백질과 Rv3364c의 친화력(affinity)을 확인하여 SNX9 (sorting nexin 9), YEATS4 (YEATS domain-containing protein 4), ZBTB46 (zinc finger and BTB domain-containing 46), 및 EGFLAM (EGF-like Fibronectin type III and Laminin G domains)의 총 4 종의 단백질을 선별하였다. 이어서, 생체 내에서도 상호작용하는지 확인하기 위하여 세포 내에서 공동면역침강법을 수행하여 상기 4종 단백질과 Rv3364c의 상호작용을 확인한 결과 최종적으로 SNX9 및 YEATS4을 선별할 수 있었다(실험결과 1).
SNX9은 지질 이중층과 결합하여 세포 내 이입 (endocytosis)에 중요한 역할을 수행하며 박테리아 감염과 염증 반응에 중요한 신호전달 인자로 기능한다. 본 발명자들은 SNX9 결합에 관여하는 Rv3364c의 모티프(motif)를 탐색하고자 Rv3364c를 10개 아미노산을 갖는 펩타이드로 조각하여 각 펩타이드의 N-말단에 세포 투과를 위한 HIV-1 Tat 단백질의 세포투과 도메인, 즉 트랜스덕션 도메인을 융합하여 총 13종의 Tat-Rv3364c 펩타이드를 제작하고 SNX9와 상호작용을 관찰하였다. 그 결과 Tat-Rv3364c (11DWLVSKFARE20) 펩타이드가 SNX9와 Rv3364c의 결합을 차단하였는바, Rv3364c의 11-20 a.a가 SNX9와 결합에 관여하는 영역임을 확인하였으며, 그 중에서도 특히 Rv3364c의 12-17 a.a 영역이 SNX9와의 상호작용에 필수적인 영역임을 확인하였다(실험결과 2).
이어서, 본 발명자들은 Tat-Rv3364c (12WLVSKF17) 펩타이드가 SNX9와의 상호작용을 통해 숙주세포 내의 면역반응에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. rRv3364c가 대식세포에서 TLR4 매개 염증반응을 유도하는 것과 달리 Tat-Rv3364c (12WLVSKF17) 펩타이드는 TLR4 매개의 염증반응을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 Tat-WLVSKF는 TLR4 리간드 유도의 PI3K, MAPK, 및 NF-ĸB 신호 경로를 차단하는 음성 조절제(negative modulator)로 기능함을 확인하였다(실험결과 3).
나아가, 본 발명자들은 세포 내 이입(endocytosis)에 관여하는 SNX9의 기능으로부터 엔도솜에서 Tat-WLVSKF의 작용을 확인하고자 하였다. LPS 자극 하에서 SNX9는 초기 엔도솜에서 p47phox과 상호작용하여 ROS 생성 및 염증반응을 유도한다. 한편, Tat-WLVSKF은 초기 엔도솜에서 SNX9와 p47phox의 결합을 차단하여 ROS 생성 및 염증반응을 억제함을 확인하였다(실험결과 4).
본 발명자들은 결핵균의 Rv3364c 단백질이 SNX9와 상호작용하는 모티프를 이용하여 SNX9 이후에 TLR4 매개 염증반응을 차단할 수 있음을 확인하고, 상기 SNX9와 상호작용하는 Rv3364c의 영역 (12-17 a.a.)으로 이루어지거나 이를 포함하는 펩타이드를 패혈증 치료 용도로 제공하고자 한다.
본 발명에서 패혈증 치료 용도로 제공하는 Rv3364c 유래 펩타이드는 Rv3364c 단백질의 12-17 아미노산 영역을 포함하고, 소수성 무극성 곁사슬을 가진 W12와 F17 아미노산의 기능적 성질에 영향을 미치지 아니한다면 그 N-말단 및/또는 C-말단에 추가의 아미노산을 하나 또는 2 이상 포함할 수 있으며, 상기 Rv3364c 단백질의 12-17 아미노산 영역을 포함하는 펩타이드는 Rv3364 단백질을 조각내어 획득하거나 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 유전공학적 방법 등에 의해 제조할 수 있다.
본 명세서에서 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단의 순서로 나열되어 있으며, 본 발명의 SNX9와 상호작용하는 Rv3364c 유래 펩타이드를 구성하는 아미노산은 각각 독립적으로 L-형태 또는 D-형태일 수 있으며, 각 아미노산은 아미노산 유사체, 방사선 라벨링 아미노산, 또는 형광 태그 아미노산일 수 있다.
또한, 본 발명의 Rv3364c 유래 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 아미노(N-) 말단 또는 카르복시(C-) 말단의 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체 내 투여 시의 증가된 반감기를 가질 수 있다.
한편, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 세포 투과성을 높이기 위하여 상술한 Rv3364c 유래 펩타이드의 N-말단에 세포투과 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPP)는 HIV-TAT (서열번호 15), TAT (서열번호 16), dNP2 (서열번호 17), VP22 (서열번호 18), MPG (서열번호 19), PEP-1 (서열번호 20), EB1 (서열번호 21), transportan (서열번호 22), p-Antp (서열번호 23), hCT(18-32)(서열번호 24), KLA (서열번호 25) 및 올리고아르기닌 (서열번호 26)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 HIV-TAT 서열(GRKKRRQRRRPG; 서열번호 15)이 사용될 수 있다. 상기 HIV-TAT 서열은 인간 면역결핍 바이러스-1 (Human immunodeficiency virus-1)에서 유래한 서열로 양전하를 갖는 아미노산이 높은 빈도로 존재한다.
또한, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드의 아미노 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 보호기가 결합될 수 있으며, 펩타이드의 카르복시 말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH2), 아자이드(-NHNH2) 등으로 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드의 말단 또는 아미노산의 R-잔기(R-group)에 지방산(fatty acids), 당사슬(oligosaccharides chains), 모든 나노입자(골드입자, 리포솜, 헤파린, 하이드로젤 등), 아미노산, 담체 단백질(carrier proteins) 등을 결합할 수 있다. 상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 역가(potency)와 안정성을 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 생체 내(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(상온, 냉장, 냉동 보관 시 저장 안정성 포함)도 의미한다.
본 발명은 SNX9와 상호작용하는 Rv3364c 영역(12-17a.a)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 패혈증 치료용 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 임상 투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드를 의약품으로 사용하는 경우, 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
즉, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합되어 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여(single dose)로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여(multiple dose)에 의해 장기간 투여될 수 있다. 상기 투여 형태, 기간은 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 패혈증 치료 효과가 우수하므로 패혈증 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 상기 패혈증 치료용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있으며, 상기 상기 개체는 패혈증을 유발하는 원인균에 감염되거나 감염이 의심되는 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간 또는 가축일 수 있다.
상기 패혈증 치료용 약학적 조성물은 이미 설명한 패혈증 치료용 펩타이드를 유효성분으로 포함하므로 중복되는 내용은 기재를 생략한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 투여로 패혈증의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, "유효 성분으로 함유"라는 용어는, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량과 횟수는 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
따라서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 펩타이드가 유효 성분으로 함유되는 한, 약학적으로 허용 가능한 다양한 담체를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여용의 경우에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있고, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여용의 경우에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수도 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 패혈증 치료용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 상기 패혈증 치료용 펩타이드를 사용하므로 이 둘 사이에 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서, 상기 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 유효성분인 패혈증 치료용 펩타이드 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에서는 아미노산 서열을 IUPAC-IUB 명명법에 따라 아래와 같이 약어로 기재하였다.
아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 글루타민(Gln, Q), 아스파라진(Asp, N), 메티오닌(Met, M), 루신(Leu, L), 이소루신(Ile, I), 발린(Val, V), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 시스테인(Cys, C), 아스파르트산(Asp, D) 글루탐산(Glu, E), 노르루신(Nle)
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실험 방법 및 재료]
1. 마우스 및 세포 배양
야생형 C57BL/6 마우스를 샘타코 바이오 코리아(경기도, 대한민국)로부터 구입하였다. 1차 골수-유래 대식세포(primary bone marrow-derived macrophages, BMDMs)는 C57BL/6 마우스로부터 분리하여 M-CSF (R&D Systems, 416-ML)가 첨가된 DMEM에서 3일 내지 5일 동안 배양하였다. C57BL/6 마우스의 BMDM 세포(TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/-, TRIF-/-, IRAK1-/-, TRAF6-/-, 및 TBK1-/-)는 이철호 박사님(Laboratory Animal Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology; 대전, 대한민국)로부터 제공받았으며, SNX9-/- C57BL/6 쥐는 Zhigang Xu 박사님(Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cells and Developmental Biology, Shandong University, Jinan, P.R. China)으로부터 제공받아 실험을 진행하였다.
10% FBS (Gibco), 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 비필수 아미노산(nonessential amino acids), 페니실린 G(penicillin G) (100IU/ml), 스트렙토마이신(streptomycin) (100IU/ml)을 함유한 DMEM에 HEK293T (ATCC-11268; American Type Culture Collection) 및 RAW264.7 (ATCC TIB-71)을 배양하였다. 인간 단핵구 THP-1(ATCC TIB-202) 세포는 10% FBS로 보충된 RPMI 1640/글루타맥스(glutamax)에서 배양시키고, 24시간 동안 20nM PMA (Sigma-Aldrich)로 처리하여 대식세포로 분화를 유도한 후 PBS로 3회 세척하였다. 제조사의 지침에 따라 293T에서 인산칼슘(Clontech)을 사용하여 일시적 형질감염(transient transfection)을 수행하였다.
2. 재조합 단백질 제작
재조합 Rv3364c(rRv3364c) 단백질을 제조하기 위하여 MTB H37Rv 균주 Rv3364c (GenBank accession no. NP_217881) 염기서열을 제조사에서 권장하는 프로토콜에 따라 N-말단 6xHis 태그를 사용하여 pRSFDuet-1 벡터(Novagen)에 클로닝하고 대장균 BL21(DE3)pLysS 균주에서 발현 유도, 수확, 및 정제하였다. 정제한 rRv3364c를 투과성 셀룰로오스 막으로 투석하고 Limulus amebocyte lysate assay (BioWhittaker)로 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS) 오염을 테스트하였다. 이하 실험은 rRv3364c 및 돌연변이 단백질을 20 pg/ml 이하 농도로 함유하였다. 정제된 rRv3364c (13kDa)는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 면역블롯팅을 통해 검증하여 사용하였으며, 대식세포에서 유의한 rRv3364c 유도 세포독성은 관찰되지 않았다.
3. 시약 및 항체
LPS (Escherichia coli O111:B4)는 Invivogen으로부터 구입하였다. phospho-(Ser473)-AKT, phospho-(Thr202/Tyr204)-p42/44, phospho-(Thr180/Tyr182)-p38, phospho-(Thr183/Tyr185)-SAPK/JNK, 및 phospho-(Ser32/36)-IκB-α 특이적 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다. SNX9 (ab181856), YEATS4, (ab50963), ZBTB46 (ab277100), 및 EGFLAM (ab101398) 특이적 항체는 Abcam plc에서 구입하였다. IκB-α (C-21), p22phox (FL-195), gp91phox (H-60), p47phox (H-195), p67phox (H-300), Lamin B1 (B-10), Tubulin (5F131), CD68 (KP1), F4/80 (BM8), CD3 (PC3/188A), CD19 (SJ25-C1), His (His17), Flag (D-8), V5(H-9), Myc (9E10), 및 Actin (I-19)에 특이적인 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다.
4. 플라스미드 설계
SNX9, YEATS4, ZBTB46, 및 EGFLAM 플라스미드는 Addgene에서 구입하였다. 전장(full-length) p47phox와 이의 돌연변이를 암호화하는 플라스미드는 이전의 연구와 동일하게 제작하였다(Biomaterials 2016, 89, 1-13). SNX9의 서로 다른 영역(1-595, 1-250, 250-361, 및 392-595)을 클로닝한 플라스미드는 전장 SNX9 cDNA으로부터 각 영역을 PCR로 증폭하여 pEF-IRES-Puro 발현 백터의 BamHI 및 NotI 영역 사이에 서브클로닝하여 제작하였다. 모든 플라스미드의 염기서열은 ABI PRISM 377 automatic DNA sequencer를 이용하여 확인하였다.
5. 펩타이드
Tat-결합 Rv3364c 펩타이드는 세포에서 비정상적인 반응을 피하기 위해 Peptron(대한민국)에서 합성하여 아세테이트 염 형태로 정제하였다. 각 펩타이드의 아미노산 서열은 표 1에 기재하였다. Limulus amebocyte lysate assay (BioWhitaker)을 이용하여 내독소 함량을 측정하였으며, 이하 실험에서 이용된 펩타이드는 3-5 pg/㎖ 농도로 포함되어 있다.
Rv3364c 펩타이드 아미노산 서열 서열번호
Rv3364c(1-10 aa) MKARLPDSPL 1
Rv3364c(11-20 aa) DWLVSKFARE 2
Rv3364c(21-30 aa) VPGVAHALLV 3
Rv3364c(31-40 aa) SVDGLPVAAS 4
Rv3364c(41-50 aa) EHLPRERADQ 5
Rv3364c(51-60 aa) LAAVTSGLAS 6
Rv3364c(61-70 aa) LAGGAAQLFD 7
Rv3364c(71-80 aa) GGQVLQSVVE 8
Rv3364c(81-90 aa) MQNGYLLLMQ 9
Rv3364c(91-100 aa) VGDGSALAAL 10
Rv3364c(101-110 aa) AATGCDIGQI 11
Rv3364c(111-120 aa) GYEMAILVER 12
Rv3364c(121-130 aa) VGGVVQSCRR 13
6. HuProt™ 마이크로어레이를 이용하여 rRv3364c 결합 단백질의 식별
rRv3364c와 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 20,000개 이상의 전장 재조합 인간 단백질을 포함하는 human protein microarrays (CDI Labs, USA)를 이용하였다. 구체적으로 단백질 마이크로어레이는 차단 완충액 (2% BSA in PBS, 0.1% in 20)으로 2시간 동안 처리하였다. 3μg의 바이오티닐레이드(biotinylated)를 4℃에서 8시간 동안 상기 마이크로어레이에 처리하였다. 이어서, 각 어레이를 4℃에서 1시간 동안 1μg의 스트렙트아비딘 형광 Alexa Fluor 532nm로 처리하였다. 마이크로어레이 결과는 GenePix 4100A 마이크로어레이 레이저 스캐너 (Molecular Devices, USA)를 이용하여 검출하였다.
7. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
제조업체의 권장 프로토콜에 따라서 BD OptEIA ELISA set(BD Pharmingen)을 이용하여 세포 배양 상층액 및 취 혈청에서 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-18, IL-12p40 및 IL-10)을 측정하였다. 모든 실험은
8. CLP 유도 패혈증 동물 제작 및 박테리아 계수
6주령의 C57BL/6 암컷 마우스(Samtako Bio, 경기도, 한국)에 맹장 결찰 및 천자(Cecal ligation and puncture, CLP)를 수행하였다. 구체적으로, 마우스를 펜토탈 나트륨(pentothal sodium) (50 ㎎/㎏, i.p.)으로 마취시키고, 작은 복부 중간선 절개를 수행하여 맹장을 노출시켰다. 그런 다음 맹장을 회맹판(ileocecal valve) 아래에 연결하고 22-게이지 바늘로 표면을 두 번 뚫고 복부를 봉합하였다. 마우스의 생존율은 10일 동안 매일 확인하였다. CLP 수행 후 12시간 및 24시간 후 마우스에 PBS, 진통제 (1.5 mg/kg nalbuphine; Sigma-Aldrich), 및 항생제 칵테일을 복강주사하였다. 상기 항생제 칵테일은 100 μl PBS에 세프트리악손(ceftriaxone) (25 mg/kg; Sigma-Aldrich) 및 메트로니다졸(metronidazole) (12.5 mg/kg; Sigma-Aldrich)을 포함한다. 대조군(Sham)으로는 결찰 및 구멍을 뚫지 않고 맹장 노출 수술만 수행한 마우스를 이용하였다.
박테리아 수는 다음과 같이 확인하였다. CLP 수행 후 정해진 시간에 마우스의 심장 구멍 또는 복막 세첵액으로 혈액을 수집하고, 수집한 혈액을 연속 희석하였다. 이후 각 희석액 5μl를 혈액 한천 플레이트(blood agar plate)에 도말하고 37
Figure pat00001
에서 24시간 동안 배양하였다. 박테리아 수는 전체 복막 세척액 또는 혈액 당 콜로니 형성 단위(colony-forming units: CFU)를 계수하는 것으로 계산하였다.
모든 동물은 병원체가 없는 환경에서 사육하였으며, 모든 실험절차는 한양대학교 동물모호 및 이용위원회(protocol 2020-0060)의 검토 및 승인하에 수행하였다. CLP 수행 이후 진통제, 항생제, 및 수액의 투여는 "Minimum Quality Threshold in Pre-Clinical Sepsis Studies"에 정의된 국제지침에 따라 수행하였다.
9. 조직학적 분석
조직 분석을 위해 마우스의 비장, 간 및 폐를 10% 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 넣어두었다. 파라핀 섹션(4 ㎛)을 절단하고, 헤마토자일린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 조직병리학적 점수(0 내지 4)는 치료군에 대한 사전 지식 없이 조직 내 염증 세포의 수와 분포 및 염증의 중증도에 기초하여 병리학자가 각 장기 섹션을 독립적으로 채점하였다.
10. 생체 내 이미지
DATPT에 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합된 Cy5.5 염료를 첨가하여 FL-DATPT을 제조하였다. CLP 마우스에 FL-DATPT 복강투여(i.p)하였다. FL-DATPT 투여 후 마우스를 서로 다른 시점에 희생시키고 주요 장기를 절제한 후 IVIS Spectrum-CT in vivo imaging system (PerkinElmer, Inc.)을 이용하여 이미지화하여 조직내의 생체 분포를 관찰하였다.
11. 통계 분석
모든 데이터는 다중 비교를 위해 Bonferroni 조정 또는 ANOVA와 함께 Student's t-test를 사용하여 분석하였고, 평균±SD로 기재하였다. 통계 분석은 SPSS (Version 12.0) 통계 소프트웨어 프로그램 (SPSS, Chicago, IL, USA)으로 수행하였다. 차이는 p <0.05에서 유의한 것으로 간주되었다. 생존률은 GraphPad Prism (버전 5.0, La Jolla, CA, USA)을 사용하였으며, 비교를 위해 log-rank (Mantele-Cox) 테스트를 사용하여 Kaplan 및 Meier의 제품 제한 방법으로 데이터를 그래프화하고 분석하였다.
[실험 결과]
1. Rv3364c와 SNX9 및 YEATS4의 직접 상호작용 확인
rRv3364c는 대식세포의 막단백질인 카뎁신 G(cathepsin G)와 결합하여 그 효소적 활성을 억제하고 그 하위 단계인 카스파아제-1 의존적 세포사멸 활성화를 억제한다. rRv3364c가 숙주세포에서 상호작용하는 인자를 확인하기 위하여 무세포 시스템에서 특정 단백질과 상호작용 여부를 관찰하였다. 상호작용 단백질을 식별하기 위하여 맞춤형 단백질 결합 분석을 사용하였으며, rRv3364c와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 후보 단백질을 선별하였다. rRv3364c과 결합이 예상되는 118개 후보 단백질 중에서 SNX9 (sorting nexin 9), YEATS4 (YEATS domain-containing protein 4), ZBTB46 (zinc finger and BTB domain-containing 46), 및 EGFLAM (EGF-like Fibronectin type III and Laminin G domains)가 rRv3364c와 높은 친화력을 나타내었다(도 1a 및 1b). 도 1a에서 친화도 점수 (A score)는 중복된 두 지점의 정규화된 신호 강도이고, 특이도 점수 (B score)는 단백질의 친화도 점수와 그 옆에 랭크된 단백질의 차이이다.
일시적으로 (15-30분) 대식세포와 HEK293T 세포에서 공동면역침강법을 수행하여 생체 내에서 rRv3364c와 상호작용하는 단백질을 분석한 결과 rRv3364c는 ZBTB46 및 EGFLAM와는 달리 내재성 및 외재성 SNX9 및 YEATS4와 강하게 상호작용함을 확인할 수 있었다(도 2).
SNX9은 지질 이중층과 결합하여 세포 내 이입 (endocytosis)와 YEATS4의 핵으로 이동을 조절하는 바, 대식세포에서 rRv3364c의 세포 내 위치를 확인을 위하여 세포 분획 (fractionation) 및 면역 염색 (immunostaining) 분석을 수행하였다. 그 결과, rRv3364c는 초기에 SNC9와 세포질에서 결합하고 이후에 핵으로 이동하여 YEATS4와 결합함을 확인할 수 있었다(도 3a 및 도 3b). 상기 결과로부터 rRv3364c가 세포질에서 SNX9와 핵에서 YEATS4와 시간 의존적 방식으로 직접 상호작용함을 알 수 있다.
2. SNX9 또는 YEATS4와 상호작용에 필수적인 Rv3364c의 영역 확인
다음으로 SNX9 또는 YEATS4와의 상호작용에 관여하는 Rv3364c의 펩타이드 서열을 확인하고자 하였다. Rv3364c을 10 a.a. 길이로 자른 Rv3364c 유래 펩타이드를 설계하고(표 1), 세포 내 이동과 단백질 분해 방지를 위하여 HIV-1 Tat 단백질의 트랜스덕션 도메인(transduction domain)을 윱합시켜 레트로 인버소 (retro-inverso) 펩타이드 (Tat-Rv3364c peptide)를 형성하였다. 이어서, HEK293T 세포에서 상기 펩타이드 조각과 SNX9 및 YEATS4와의 상호작용을 확인하였다.
그 결과, Tat-Rv3364c (11DWLVSKFARE20) 펩타이드는 SNX9와 Rv3364c의 상호작용을 차단할 수 있고, Tat-Rv3364c (1MKARLPDSPL10)는 YEATS4와 Rv3364c의 상호작용을 차단할 수 있었으며, 이러한 작용에 Tat 펩타이드는 영향이 없음을 확인할 수 있었다(도 4). 그리고, SNX9와 상호작용에 필수적인 최소 펩타이드는 (12WLVSKF17 : 서열번호 14)으로 소수성 무극성 곁사슬을 가진 W12와 F17 아미노산이 SNX9와의 상호작용에 필수적임을 알 수 있었다(도 5).
이어서, SNX9의 다양한 절단 돌연변이를 제작하고 Rv3364c와 상호작용하는 SNX9의 도메인을 확인한 결과 Rv3364c는 BAR(Bin-Amphiphysin-Rvs) 도메인을 통해 SNX9와 상호작용함을 알 수 있었다(도 6). 상기 결과로부터 Rv3364c는 세포질에서 12-17 a.a. 펩타이드(서열번호 14)가 SNX9의 N-말단을 통해 BAR 도메인을 특이적으로 표적하고, 핵에서 1-10 a.a. 펩타이드가 YEATS4와 상호작용함을 알 수 있다(도 7).
3. WLVSKF 펩타이드의 SNX9와 상호작용을 통한 TLR4 신호경로의 음성적 조절기능 확인
대식세포에서 ELISA를 이용하여 rRv3364c 유도의 사이토카인 생성 수준을 측정하였다.
rRv3364c는 TLR4/MyD88/TRAF6/TBK1-IRAK1 경로를 통하여 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, 및 IL-12p40) 및 항염증성 사이토카인(IL-10) 생성을 촉진함을 확인하였다(도 8a). 또한, SNX9+/+ 대식세포와 비교하여 SNX9-/- 대식세포에서 rRv3364c 유도의 염증성 사이토카인 생성이 유의하게 감소하였다(도 8b). 상기로부터 대식세포에서 rRv3364c에 의해 TLR4-SNX9 의존성 염증반응이 유도됨을 알 수 있다.
이어서, TLR 매개의 염증신호 경로에서 SNX9와 상호작용하는 rRv3364c 펩타이드(12WLVSKF17)의 역할을 확인하기 위하여, Tat-Rv3364c 펩타이드인 Tat-WLVSKF가 LPS/TLR에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 생성을 억제하는지 확인하였다. 그 결과, SNX9-/- 대식세포에서와 달리 SNX9+/+ 대식세포에서는 Tat-WLVSKF에 의하여 TLR4 매개의 염증성 사이토카인의 생성이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 8c).
상기로부터 rRv3364c는 세포 내에서 TLR4 신호 경로를 조절한다고 가정하고, 이를 검증하기 위하여 대식세포에서 LPS 유도 염증성 신호 전달에 관여하는 PI3K, MAPK 및 NF-κB의 활성화에 Tat-WLVSKF이 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, SNX9-/- 대식세포에서와는 달리 Tat-WLVSKF 전처리는 SNX9+/+ 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 AKT, MAPK, 및 IĸBα의 인산화와 IĸBα의 분해를 억제함을 확인하였다(도 8d). 상기 결과는 Tat-WLVSKF가 TLR4 리간드 유도의 PI3K, MAPK, 및 NF-ĸB 신호 경로 활성화를 억제하는 음성 조절제 역할을 수행하여 대식세포에서 염증성 사이토카인 생성을 억제함을 의미한다.
4. WLVSKF 펩타이드의 엔도솜에서 p47phox와 상호 작용하는 SNX9의 BAR 도메인 억제 활성 확인
NADPH 산화효소(NOX) 유도의 ROS 생성은 TLR4 매개 면역반응에 필수적이다. 특히, 세포질의 NOX 서브유닛인 p47phox는 감염 시 혈장막에서 PX (Phox homology) 도메인을 통해 이동하여 NOX 서브유닛과 결합한다. SNX9의 PX 도메인은 다양한 phosphoinositides과 반응하며 세포 내 도입 (endocytosis)에 중요한 역할을 수행한다.
이하, LPS 자극 하에서 SNX9와 p47phox의 상호작용 여부와 Tat-WLVSKF이 엔도솜의 ROS 생산에 영향을 미치는지 여부를 확인하고자 하였다. 그 결과, LPS 유도하에 SNX9은 p47phox와 특이적으로 결합하였고, 이러한 SNX9와 p47phox의 상호작용은 Tat-WLVSKF에 의해 억제됨을 확인하였다. 또한, 마우스 및 인간 대식세포에서 NOX의 활성과 ROS 생성은 Tat-WLVSKF 용량 의존적으로 현저하게 감소하였다(도 9).
또한, 엔도솜의 구획을 sucrose flotation gradient assay으로 원심분리 및 정제하고 면역형광현미경 단계를 수행하여 엔도솜 내의 SNX9의 이동을 추적하고 엔도솜 내에서 신호전달 및 분자의 동적을 관찰하였다. 그 결과, LPS 유도의 SNX9와 p47phox의 결합은 초기 엔도솜에서 확인되었으며 후기 엔도솜에서는 관찰되지 않았고, 초기 엔도솜에서 LPS 유도의 SNX9와 p47phox의 결합은 Tat-WLVSKF에 의해 억제됨을 확인하였다(도 10a 내지 10c).
이어서, HEK293T 세포에서 다양한 p47phox의 절단된 형태와 SNX9를 이용한 맵핑을 통해 p47phox의 PX 도메인은 SNX9의 BAR 도메인과 결합에 필수적임을 확인하였다(도 11). 또한, Rv3364c 구조를 사용한 경쟁 분석 결과, HEK293T 세포에서 Rv3364c의 양이 증가함에 따라 SNX9와 p47phox 사이의 상호작용이 감소함을 확인하였다(도 12). 상기 결과로부터, SNX9는 초기 엔도솜에서 p47phox의 PX 도메인간의 결합을 통해서 ROS 매개 염증 반응의 필수적 양성 조절자이며, Tat-WLVSKF은 초기 엔도솜에서 SNX9와 p47phox의 결합을 차단하여 ROS 매개 염증반응을 억제함을 알 수 있다. 궁극적으로 Rv3364c 유래의 Tat-WLVSKF 펩타이드는 대식세포에서 LPS/TLR4 매개 면역반응을 특이적으로 억제하여 강력한 염증 조절자로서 기능할 수 있음을 알 수 있다(도 13).
5. CLP-유도 패혈증 동물모델에서 WLVSKF 펩타이드의 패혈증 치료 효과 확인
이어서, CLP 유도의 패혈증 마우스에서 Rv3364c 유래 펩타이드의 효과를 확인하고자 하였다. CLP 처리의 패혈증 유도 마우스에 0, 1, 및 2 시간 후에 20mg/kg Tat-Rv3364c를 복강 내 주사하였다. 그 결과, Tat-Rv3364c를 투여하는 경우 생존율이 50%까지 증가함을 확인할 수 있었다(도 14).
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> PEPTIDE FOR TREATING SEPSIS DERIVED FROM RV3364C PROTEIN OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS <130> APC-2021-0749 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(1-10 aa) <400> 1 Met Lys Ala Arg Leu Pro Asp Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(11-20 aa) <400> 2 Asp Trp Leu Val Ser Lys Phe Ala Arg Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(21-30 aa) <400> 3 Val Pro Gly Val Ala His Ala Leu Leu Val 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(31-40 aa) <400> 4 Ser Val Asp Gly Leu Pro Val Ala Ala Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(41-50 aa) <400> 5 Glu His Leu Pro Arg Glu Arg Ala Asp Gln 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(51-60 aa) <400> 6 Leu Ala Ala Val Thr Ser Gly Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(61-70 aa) <400> 7 Leu Ala Gly Gly Ala Ala Gln Leu Phe Asp 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(71-80 aa) <400> 8 Gly Gly Gln Val Leu Gln Ser Val Val Glu 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(81-90 aa) <400> 9 Met Gln Asn Gly Tyr Leu Leu Leu Met Gln 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(101-110 aa) <400> 10 Val Gly Asp Gly Ser Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(101-110 aa) <400> 11 Ala Ala Thr Gly Cys Asp Ile Gly Gln Ile 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(111-120 aa) <400> 12 Gly Tyr Glu Met Ala Ile Leu Val Glu Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(121-130 aa) <400> 13 Val Gly Gly Val Val Gln Ser Cys Arg Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(12-17 aa) <400> 14 Trp Leu Val Ser Lys Phe 1 5 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-TAT <400> 15 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 16 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dNP2 <400> 17 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 20 <210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP22 <400> 18 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 19 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MPG <400> 19 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP-1 <400> 20 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Cys 20 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EB1 <400> 21 Leu Ile Lys Leu Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys 20 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transportan <400> 22 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p-Antp <400> 23 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCT(18-32) <400> 24 Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro 1 5 10 15 <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KLA <400> 25 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligoarginine <400> 26 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5

Claims (10)

  1. 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 패혈증 치료용 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 N-말단 및/또는 C-말단에 1 내지 3개 아미노산을 추가로 포함하는 것인, 패혈증 치료용 펩타이드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 패혈증 치료용 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 패혈증 치료용 펩타이드는 N-말단에 세포투과 펩타이드가 연결된 것인, 패혈증 치료용 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 세포투과 펩타이드는 HIV-TAT (서열번호 15), TAT (서열번호 16), dNP2 (서열번호 17), VP22 (서열번호 18), MPG (서열번호 19), PEP-1 (서열번호 20), EB1 (서열번호 21), transportan (서열번호 22), p-Antp (서열번호 23), hCT(18-32)(서열번호 24), KLA (서열번호 25) 및 올리고아르기닌 (서열번호 26)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인, 패혈증 치료용 펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 대식세포의 SNX9의 BAR 도메인과 직접 상호작용하는 것인, 패혈증 치료용 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 대식세포에서 TLR4 매개의 염증 반응을 억제하는 것인, 패혈증 치료용 펩타이드.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 SNX9와 p47phox의 결합을 방해하여 ROS 생성을 감소시키는 것인, 패혈증 치료용 펩타이드.
  9. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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EMBO Molecular Medicine 2020, vol.12, issue12: e12497 "Mycobacterium tuberculosis Rv2626c-derived peptide as a therapeutic agent for sepsis"

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