KR20230170884A - 결핵균의 Rv2626c 단백질에서 유래한 패혈증 치료용 펩타이드 - Google Patents

결핵균의 Rv2626c 단백질에서 유래한 패혈증 치료용 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 결핵균의 Rv2626c 단백질에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 패혈증 치료 용도에 관한 것으로, 상기 펩타이드는 대식세포에 의해 유도되는 염증반응을 효과적으로 억제하고, 박테리아 콜로니 수의 증가를 억제하는 효과가 뛰어나므로 패혈증 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

결핵균의 Rv2626c 단백질에서 유래한 패혈증 치료용 펩타이드{PEPTIDE FOR TREATING SEPSIS DERIVED FROM RV2626C PROTEIN OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS}
본 발명은 결핵균의 Rv2626c 단백질에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 패혈증 치료 용도에 관한 것이다.
박테리아 항원은 숙주 면역 방어와 박테리아가 숙주 면역으로부터 피하거나, 스스로를 보호하도록 하는 메커니즘 사이의 상호작용을 유발한다. 이러한 숙주-병원체 상호작용은 세포 내 병원체에 의해 매우 복잡한데, 예로서 결핵의 원인인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB) 결핵균이 있다. 결핵균 항원인 Rv2626c는 저산소, 일산화질소(NO) 노출로 인한 스트레스 조건에서 가장 강하게 발현되는 단백질로, 배양 여과액과 용해액에서도 확인되며, 활성화된 대식세포와 폐에서 많이 발현되는 것이 관찰되었다. Rv2626c는 결핵균을 가지고 있는 환자에서 강한 혈청 항체 반응을 일으키며, 질환 상태의 면역 프로파일링에서 중요하다고 생각되지만 Rv2626c가 맡은 역할은 아직 밝혀지지 않았다. 대식세포와 Rv2626c 사이의 상호관계를 이해하는 것은 효과적인 결핵 치료의 개발에 중요하다.
패혈증(sepsis)은 감염에 대한 숙주의 반응이 조절되지 않아 일어나는 생명과 관련된 장기 기능 장애로 정의된다. 패혈증에 걸리면 병원체에 의해 시작된 면역반응이 항상성을 유지하지 못하고, 과도한 염증과 세균 증식이 지속되는 병리학적 증후군을 일으키게 된다. 패혈증의 사망률은 25%에 가까우며, 높은 발생률과 사망률 때문에 세계적으로 이에 대한 비용 지출이 상당한 상태이다. 패혈증의 발병에 대한 이해 수준은 높아졌지만, 아직 표적 치료 방법에 대한 부분은 미흡한 상태이다.
한편, 펩타이드와 단백질은 치료제로서 큰 잠재력을 가지고 있다. 현재, 작은 크기의 소분자 약물이 대부분의 제약시장을 차지하고 있는데 이들과 같은 전형적인 소분자 약물과 비교하여, 펩타이드 및 단백질은 표적과 만나는 부위가 많기 때문에 선택적으로 이용할 수 있다. 또한, 펩타이드 및 단백질의 선택성이 증가하면 부작용과 독성은 감소될 수 있다. 치료를 목적으로 한 펩타이드와 단백질이 지속적으로 연구되고 있음에도 불구하고, 전신에 걸친 안정성과 특정 부위에 전달을 증가시키는 방법이 논의되고 있다. 그리고 세포에 침투하는 펩타이드의 표적 특이성의 결여는 임상 개발에서 주요 장애물로 남아있다.
이러한 상황에서 본 발명자들은 결핵균의 Rv2626c에서 유래한 펩타이드가 항염증 활성을 갖고, 상기 펩타이드, 세포투과 펩타이드 및 대식세포 표적 펩타이드의 접합체가 우수한 패혈증 치료 활성을 갖는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 결핵균의 Rv2626c에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 패혈증 치료 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 패혈증 치료용 펩타이드를 제공한다.
패혈증은 감염에 대한 비정상적인 염증 반응으로 인해 전신적인 장기 기능 장애가 일어난 상태를 말한다. 미생물 감염에 의해 시작된 면역반응이 항상성을 유지하지 못하고, 과도한 염증과 미생물 증식이 지속되므로 염증 억제 및 미생물 증식을 억제하는 것이 중요하다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열(LPEHAIVQF)은 결핵균 Rv2626c 단백질의 CBS2 도메인에서 유래한 서열이며, 본 발명의 일 구체예에 따르면 항염증 및 패혈증 치료 활성을 나타낸다.
구체적으로 본 발명자들은 Rv2626c 단백질의 CBS2 도메인이 TRAF6 (TNF Receptor-Associated Factor 6)의 RING 도메인(N-말단)과 직접적으로 결합하여 TRAF6의 라이신63-유비퀴틴화를 방지함으로써 TLR4 면역 반응을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 패혈증 진행시 박테리아 제거 과정에서 대식세포를 불러모으고, 식균 작용, M2 대식세포로의 분화를 향상시켰다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 패혈증 치료용 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 반복해서 포함하면 패혈증 치료 효과가 우수하다. 따라서, 상기 패혈증 치료용 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 1회 내지 15회, 바람직하게는 3회 내지 12회, 더욱 바람직하게는 5회 내지 10회 포함할 수 있다. 예를 들어, 패혈증 치료용 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 10회 반복해서 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 패혈증 치료용 펩타이드는 펩타이드의 세포 투과성을 높이기 위해 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단에 세포투과 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPP)는 HIV-TAT (서열번호 3), TAT (서열번호 5), dNP2 (서열번호 6), VP22 (서열번호 7), MPG (서열번호 8), PEP-1 (서열번호 9), EB1 (서열번호 10), transportan (서열번호 11), p-Antp (서열번호 12), hCT(18-32)(서열번호 13), KLA (서열번호 14) 및 올리고아르기닌 (서열번호 15)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 HIV-TAT 서열(GRKKRRQRRRPG; 서열번호 3)이 사용될 수 있다. 상기 HIV-TAT 서열은 인간 면역결핍 바이러스-1 (Human immunodeficiency virus-1)에서 유래한 서열로 양전하를 갖는 아미노산이 높은 빈도로 존재한다.
또한, 상기 패혈증 치료용 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일 말단에 터프신 펩타이드(서열번호 2)가 연결된 융합 펩타이드일 수 있다. 상기 터프신 펩타이드는 대식세포 표적 펩타이드로 대식세포 표적 펩타이드란 대식세포 표면의 특정 수용체에 결합하여 대식세포의 활성을 조절할 수 있는 펩타이드를 말한다. 상기 터프신은 4개의 아미노산 서열로 이루어진 테트라 펩타이드로 면역글로불린 G의 중쇄 Fc 도메인에서 유래하며, 면역자극 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 터프신 펩타이드는 1회 내지 20회, 바람직하게는 5회 내지 15회, 더욱 바람직하게는 7회 내지 12회 반복되는 형태로 패혈증 치료용 펩타이드에 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 패혈증 치료용 펩타이드에 터프신 서열을 5회 반복해서 포함시켰다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 패혈증 치료용 펩타이드는 세포투과 펩타이드, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및 터프신 펩타이드가 차례대로 연결된 융합 펩타이드(CP-CBS2-Tuftsin), 또는 세포투과 펩타이드, 터프신 펩타이드 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열이 차례대로 연결된 융합 펩타이드(CP-Tuftsin-CBS2) 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포투과 펩타이드, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및 터프신 펩타이드 각각은 펩타이드 링커로 서로 연결되며, 펩타이드 링커는 GG (서열번호 16), (GGGGS)n (n=1-5) (서열번호 17) 및 (EAAAK)n (n=1-5) (서열번호 18)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 펩타이드 링커는 GG (서열번호 16)를 사용하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 세포투과 펩타이드, 세포투과 펩타이드의 C-말단에 연결된 터프신 펩타이드 및 터프신 펩타이드의 C-말단에 연결된 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 융합 펩타이드(rRV2626c-CA)는 세포독성은 없으면서 패혈증을 유발한 마우스에서 염증 반응 억제 효과 및 박테리아 콜로니 형성 억제 효과가 현저히 우수하다. 특히 rRV2626c-CA는 rRV2626c-WT(CPP-CBS2)보다 250배(in vitro) 혹은 1000배(in vivo) 정도 우수한 IC50 값을 나타내었다.
본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 임상 투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드를 의약품으로 사용하는 경우, 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
즉, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합되어 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여(single dose)로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여(multiple dose)에 의해 장기간 투여될 수 있다. 상기 투여 형태, 기간은 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 패혈증 치료 효과가 우수하므로 패혈증 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 상기 패혈증 치료용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 패혈증 치료용 약학적 조성물은 이미 설명한 패혈증 치료용 펩타이드를 유효성분으로 포함하므로 중복되는 내용은 기재를 생략한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 투여로 패혈증의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, "유효 성분으로 함유"라는 용어는, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량과 횟수는 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
따라서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 펩타이드가 유효 성분으로 함유되는 한, 약학적으로 허용 가능한 다양한 담체를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여용의 경우에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있고, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여용의 경우에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수도 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 패혈증 치료용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 상기 패혈증 치료용 펩타이드를 사용하므로 이 둘 사이에 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서, 상기 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 유효성분인 패혈증 치료용 펩타이드 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 대식세포에 의해 유도되는 염증반응을 억제하는 효과가 우수하고, 박테리아 콜로니 수의 증가를 억제하는 효과가 뛰어나므로 패혈증 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1에서 A는 pET-23b (-) 벡터에서 클로닝된 Rv2626c의 개략도이고, B는 정제한 결핵균 유래 rRv2626c 펩타이드(16 및 36 kDa)를 SDS-PAGE 및 면역블롯팅으로 확인한 결과이며, C는 대식세포에 rRv2626c 펩타이드를 처리한 후 세포독성 수준을 측정한 결과이다.
도 2는 대식세포에 rRv2626c 펩타이드를 처리한 후 공초점 현미경(A) 및 세포내 분획 분석(B)으로 rRv2626c의 세포내 분포 위치를 확인한 결과이다.
도 3에서 A는 대식세포에 rRv2626c 펩타이드를 처리한 후 사이토카인 생성 정도를 확인한 결과이고, B는 TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/-, TRIF-/-, IRAK1-/-, TRAF6-/-, 또는 TBK1-/- 대식세포에 rRv2626c 펩타이드를 처리한 후 사이토카인 생성 정도를 확인한 결과이며, C는 TLR2-/- 또는 TLR4-/- 대식세포에 rRv2626c 펩타이드를 처리한 후 세포내 이입 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 대식세포에 리포폴리사카라이드(LPS)(A) 또는 Pam2CSK4(B)를 처리하여 염증 반응을 유도한 후 rRv2626c 펩타이드를 처리하여 염증성 사이토카인의 생성 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 LPS를 처리한 대식세포에 rRv2626c 펩타이드를 처리하여 대식세포의 염증 반응에 관여하는 신호 분자들의 활성화 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 rRv2626c 펩타이드의 세포내 결합 파트너를 확인한 결과이다.
도 7은 rRv2626c 펩타이드와 TRAF6의 결합 여부를 HEK 293T 세포(A) 및 THP-1 세포(B)에서 면역침전으로 확인한 결과이다.
도 8은 rRv2626c 펩타이드와 TRAF6의 세포내 위치를 대식세포에서 확인한 결과이다.
도 9에서 A는 TRAF6와 상호작용하는 rRv2626c 펩타이드의 도메인을 확인한 결과이고, B는 rRv2626c 펩타이드의 CBS2 도메인에서 TRAF6와의 상호작용에 필수적인 아미노산 서열을 확인한 결과이다.
도 10에서 A는 rRv2626c와의 상호작용에 관여하는 TRAF6의 도메인을 확인한 결과이고, B는 rRv2626c와 TRAF6의 상호작용을 개략적으로 나타낸다.
도 11은 rRv2626c에 의한 TRAF6의 유비퀴틴화 상태 변화를 HA-유비퀴틴(HA-Ub), 리신(K)48-연결 유비퀴틴(K48-Ub) 및 K63-연결 유비퀴틴(K63-Ub)으로 확인한 결과이다.
도 12는 rRv2626c(A) 또는 Tat-CBS2(123-131)(B)에 의한 TRAF6의 유비퀴틴화 상태 변화를 K48-Ub 및 K63-Ub으로 확인한 결과이다.
도 13에서 A는 본 발명의 일 예에서 설계한 세포 투과 펩타이드-터프신-rRv2626c 접합체의 구조를 나타내고, B는 Rv2626c-CA (활성 구조 형태) 및 Rv2626c-DN (TRAF6 결합 능력 손실 형태) 펩타이드를 정제한 결과이며, C는 Rv2626c-CA 및 Rv2626c-DN 펩타이드의 세포독성 여부를 확인한 결과이다.
도 14는 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도한 대식세포에 Rv2626c-CA 또는 Rv2626c-DN 펩타이드를 처리하여 염증성 사이토카인의 생성 수준을 확인한 결과이다.
도 15는 LPS를 처리한 대식세포에 Rv2626c-CA 또는 Rv2626c-DN 펩타이드를 처리한 후 TRAF6와의 결합 여부 및 TRAF6의 유비퀴틴화 상태를 확인한 결과이다.
도 16은 패혈증을 유도한 마우스에 다른 용량의 rRv2626c-CA 또는 Rv2626c-DN 펩타이드를 투여한 후 사망률 변화를 확인한 결과이다.
도 17은 패혈증을 유도한 마우스에 다른 용량의 rRv2626c-CA 또는 Rv2626c-DN 펩타이드를 투여한 후 혈청 내 사이토카인 수준을 확인한 결과이다.
도 18은 패혈증을 유도한 마우스에 다른 용량의 rRv2626c-CA 또는 Rv2626c-DN 펩타이드를 투여한 후 조직 검사를 수행한 결과이다.
도 19는 패혈증을 유도한 마우스에 다른 용량의 rRv2626c-CA 또는 Rv2626c-DN 펩타이드를 투여한 후 비장세포에서 TRAF6와의 결합 여부 및 TRAF6의 유비퀴틴화 상태를 확인한 결과이다.
도 20은 패혈증을 유도한 마우스에 형광 rRv2626c-CA 펩타이드를 투여한 후 생체 내 분포 및 체류 시간을 확인한 결과이다.
도 21은 패혈증을 유도한 마우스에 rRv2626c-CA 펩타이드를 투여한 후 폐, 간 및 비장에서 rRv2626c-CA 펩타이드가 흡수된 세포 유형을 확인한 결과이다.
도 22는 패혈증을 유도한 마우스에 rRv2626c-CA 펩타이드를 투여한 후 폐, 간 및 비장에서 면역침전으로 rRv2626c-CA 펩타이드가 흡수된 세포 유형을 확인한 결과이다.
도 23은 패혈증을 유도한 마우스에 rRv2626c-CA 펩타이드를 투여한 후 혈액과 복막액에서 박테리아 콜로니 수의 변화(A), 및 박테리아 사멸 정도(B)를 확인한 결과이다.
도 24는 패혈증을 유도한 마우스에 rRv2626c-CA 펩타이드를 투여한 후 비장 및 폐에 모집된 면역세포의 수를 확인한 결과이다.
도 25는 패혈증을 유도한 마우스에 rRv2626c-CA 펩타이드를 투여한 후 비장 및 폐에 모집된 대식세포의 유형을 확인한 결과이다.
도 26은 TRAF6를 발현하는 대식세포에 rRv2626c-CA를 처리한 후 식균 수용체-A (scavenger receptor-A, SR-A), Fc 수용체(FcR), 선천 면역 수용체(TLR2 및 TLR4), 및 호중구 수용체 (Neuropilin-1(NRP1) 및 CXCR2)의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 27은 rRv2626c에 의해 매개되는 TLR 신호 전달 경로의 조절 기작 및 이를 통한 패혈증 치료 기작을 개략적으로 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 마우스 및 세포 배양
야생형 C57BL/6 마우스를 샘타코 바이오 코리아(경기도, 대한민국)로부터 구입하였다. 일차 골수-유래 대식세포(primary bone marrow-derived macrophages, BMDMs)는 C57BL/6 마우스로부터 분리하여 M-CSF (R&D Systems, 416-ML)가 첨가된 DMEM에서 3일 내지 5일 동안 배양하였다. C57BL/6 마우스의 BMDM (TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/-, TRIF-/-, IRAK1-/-, TRAF6-/-, 및 TBK1-/-)은 이철호 박사님(Laboratory Animal Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology; 대전, 대한민국)로부터 제공 받아 실험을 진행하였다. HEK293T (ATCC-11268; American Type Culture Collection), RAW264.7 (ATCC TIB-71) 및 THP-1 (ATCC-TIB-202) 세포는 10% FBS (Gibco, 미국), 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate), 비필수 아미노산 (nonessential amino acids), 페니실린 G (100 IU/㎖), 및 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖)이 첨가된 DMEM 또는 RPMI1640 (Gibco)에서 배양하였다. 제조사의 지시에 따라, 293T에서 칼슘 포스페이트(calcium phosphate; Clonetech, 미국)을 사용하여 일시적으로 형질주입(transfection)을 수행하였다. RAW264.7 및 THP-1의 안정화 세포주(stable cell line)는 리포펙타민 3000 (Invitrogen, 미국) 및 G418 (400-800 ㎍/㎖)을 이용한 표준 선택 방법을 사용하여 형질주입으로 생성하였다.
2. 재조합 단백질 제작
재조합 MTB H37Rv 균주의 Rv2626c (GenBank accession no. NP_217142.1) 및 CPP-Tuftsin-Rv2626c CBS2 (aa 123-131) 단백질, Rv2626c 아미노산 (1-143) 및 CPP 서열 (GRKKRRQRRRPQ), 대식세포 표적 서열 (TKPR), 및 CBS2 (LPEHAIVQF)를 얻기 위하여 회사에서 권장하는 권장하는 프로토콜에 따라 N-말단 6xHis 태그를 사용하여 pRSFDuet-1 벡터 (Novagen)에 상기 서열을 각각 클로닝하였다. 이후 상기 벡터를 Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS에 도입하고, 발현을 유도하여 재조합 단백질을 회수 및 정제하였다. 정제한 rRv2626c는 투과성 셀룰로스 막으로 투석하고, Limulus amebocyte lysate assay (BioWhittaker)로 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS) 오염을 테스트하였다. 본 발명에서 실험한 rGRA7 단백질은 LPS를 20 pg/㎖ 미만으로 함유한다.
3. 시약 및 항체
LPS (Escherichia coli O111:B4) 및 BLP (Escherichia coli Braun Lipoprotein) (Pam2CSK4)는 Invivogen으로부터 구입하였다. phospho-(Ser473)-AKT, phospho-(Thr202/Tyr204)-p42/44, phospho-(Thr180/Tyr182)-p38, phospho-(Thr183/Tyr185)-SAPK/JNK, phospho-(Ser32/36)-IκB-α, K63-Poly-Ub (D7A11), 및 K48-Poly-Ub (D9D5) 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다. IκB-α (C-21), TRAF6 (H-274), Lamin B1 (B-10), Tubulin (5F131), CD68 (KP1), F4/80 (BM8), CD3 (PC3/188A), CD19 (SJ25-C1), Ub (P4D1), His (His17), HA (12CA5), Flag (D-8), GST(B-14), Myc (9E10), 및 Actin (I-19) 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였다.
4. 플라스미드 설계
HA-태그 유비퀴틴 (Ub), K48-관련(linkage) 특이적 유비퀴틴 (K48-Ub), 및 K63-관련 특이적 유비퀴틴 (K63-Ub) 플라스미드는 Addgene으로부터 구입하였다. TRAF6 전체를 포함하는 플라스미드 및 변형 플라스미드는 선행문헌(Infect Immun 84: 339-50)에 기재되어 있다. Rv2626c (1-143, 8-65, 73-131, 표 1 참고)의 서로 다른 영역을 암호화하는 플라스미드는 PCR 증폭에 의해 전체 길이 Rv2626c cDNA에서 증폭시키고, BamHI와 NotI 사이에 N-말단 GST 에피토프 태그를 코딩하는 pEBG 유도체에 서브클로닝(sub-cloning)하여 생성하였다. 모든 플라스미드는 포유류 세포에서 과도하고 안정적인 발현을 위하여 pEBG-GST 포유류 융합 벡터 및 pEF-IRES-Puro 발현 벡터에서 유래되었다. 모든 플라스미드 서열은 원래 서열과 100% 일치하는지 확인하기 위해 ABI PRISM 377 automatic DNA sequencer로 분석하였다. 도 1의 A에 pET-23b (-) 벡터에서 클로닝된 Rv2626c의 개략도를 나타내었다.
5. 펩타이드
Tat-연결 Rv2626c 펩타이드는 세포에서 비정상적인 반응을 피하기 위해 Peptron(대한민국)에서 합성하여 아세테이트 염 형태로 정제하였다. 각 펩타이드의 아미노산 서열은 표 1에 기재하였다. Limulus amebocyte lysate assay (BioWhittaker)로 측정한 LPS 농도는 실험에 사용한 펩타이드에 3-5 pg/㎖ 미만으로 포함된다.
명칭 서열 (From N to C)
Tat RRRQRRKKRGY
Tat-Rv2626c-(73-131) RRRQRRKKRGY-G-LARDSIYYVDANASIQEMLNVMEEHQVRRVPVISEHRLVGIVTEADIARHLPEHAIVQF
Tat-Rv2626c-(73-82) RRRQRRKKRGY-G-LARDSIYYVD
Tat-Rv2626c-(83-92) RRRQRRKKRGY-G-ANASIQEMLN
Tat-Rv2626c-(93-102) RRRQRRKKRGY-G-VMEEHQVRRV
Tat-Rv2626c-(103-112) RRRQRRKKRGY-G-PVISEHRLVG
Tat-Rv2626c-(113-122) RRRQRRKKRGY-G-IVTEADIARH
Tat-Rv2626c-(123-131) RRRQRRKKRGY-G-LPEHAIVQF
Tat-Rv2626c-(E125K) RRRQRRKKRGY-G-LPKHAIVQF
Tat-Rv2626c-(E125Q) RRRQRRKKRGY-G-LPQHAIVQF
Tat-Rv2626c-(H126D) RRRQRRKKRGY-G-LPEDAIVQF
Tat-Rv2626c-(H126Q) RRRQRRKKRGY-G-LPEQAIVQF
6. GST 침강(pulldown), 면역블롯 및 면역침전 실험
세포를 회수하고, 1%(v/v) 농도의 프로테아제 억제제(Roche)가 첨가된 NP-40 완충액(50 mM HEPES, pH 7.4,150 mM NaCl, 1 mM EDTA)으로 세포를 용해시켰다. 원심 분리 후, 상청액을 단백질 A/G 비드와 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 전처리한 용해물을 글루타치온-결합 세파로스 비드(Amersham Biosciences)의 50% 현탁액과 혼합하여 4℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 침전물을 용해 완충액으로 광범위하게 세척하였다. 글루타치온 비드에 결합된 단백질을 5분 동안 끓여서 SDS 로딩 버퍼로 용출하였다.
면역침전을 위해, 세포를 회수하여 프로테아제 억제제가 추가된 NP-40 버퍼로 세포를 용해시켰다. 세포 용해물과 단백질 A/G 아가로스 비드를 4℃에서 1시간 동안 반응시켜 불필요한 반응을 사전제거(pre-clearing)하였다. 이후, 세포 용해물 1 ㎖에 항체 1-4 ㎍을 첨가하여 4℃에서 8 내지 12시간 동안 반응시키고, 단백질 A/G 아가로스 비드를 6시간 동안 처리하였다. 이후 면역침전물을 용해 완충액으로 세척하고, 5분 동안 끓여서 SDS 로딩 버퍼로 용출하였다.
면역블롯팅을 위해, 폴리펩타이드를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)으로 변성시키고, PVDF 막(Bio-Rad)으로 이동시켰다. 상기 PVDF 막을 특정 항체와 반응시킨 후 항체 결합을 화학 발광 (ECL; Millipore)에 의해 시각화하고, Vilber chemiluminescence analyzer (Fusion SL 3; Vilber Lourmat)로 신호를 검출하였다.
7. 단백질 정제 및 질량 분석
rRv2626c와 결합하는 단백질을 확인하기 위해, THP-1 세포에 rRv2626c를 30분 동안 처리하거나 처리하지 않은 후 프로테아제 저해제가 첨가된 NP-40 완충액으로 세포를 용해시켰다. 원심분리 후 상청액을 단백질 A/G 비드와 40℃에서 2시간 동안 반응시켜 사전제거를 수행하였다. 사전제거된 세포 용해물을 아가로스 비드와 접합된 α-His 항체와 4℃에서 4시간 동안 혼합하였다. 이후 침전물을 용해 완충액으로 세척하고, 비드에 결합된 단백질을 용출시킨 후 Nupage 4-12% Bis-Tris gradient 겔 (Invitrogen)에서 분리하였다. 은 염색 (Invitrogen) 후에, 이온-트랩 질량 분석 (ion-trap mass spectrometry) 방법으로 특정 단백질 밴드를 추출하였고, 탠덤 질량 분석 (tandem mass spectrometry) 방법 및 데이터 베이스 검색으로 아미노산 서열을 결정하였다.
8. 정량 RT-PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction)
RNeasy RNA 추출 Mini-Kit (Qiagen)로 세포에서 총 RNA를 추출하였다. Enzynomix kit (Enzynomix)로 cDNA를 합성하고 유전자 특이적 프라이머 세트 (Bioneer) 및 SYBR Green PCR Master Mix (Roche)로 정량 PCR을 수행하였다. 제조사의 지시에 따라 QuantStudio ™ 3 (ABI)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 데이터는 β-actin의 발현으로 정규화되었다. 델타-델타 Ct 방법을 사용하여 상대적인 발현량을 계산하였다. 프라이머의 서열은 표 2에 기재하였다.
유전자 서열
mCD86 Forward gcacgtctaagcaaggtcac
Reverse catatgccacacaccatccg
miNOS Forward ccccgctactactccatcag
Reverse ccactgacacttcgcacaaa
mCD163 Forward tgtgaccatgctgaggatgt
Reverse ctcgaccaatggcactgatg
mArg1 Forward ctgagctttgatgtcgacgg
Reverse tcctctgctgtcttcccaag
mβ-Actin Forward aagtgtgacgttgacatc
Reverse gatccacatctgctggaagg
9. 공초점 형광 현미경
면역 형광 분석은 공초점 형광 현미경으로 수행하였다. 세포를 PBS에 용해된 4% (w/v) 파라포름 알데히드로 커버 슬립에 고정시키고, 세포를 0.25%(v/v) Triton X-100 함유 PBS로 25℃에서 10분 동안 투과시켰다. TRAF6 또는 His는 1/100으로 희석한 1차 항체와 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 검출하였다. 세척 후, 형광 표지된 이차 항체와 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (모델 LSM 800; Zeiss)으로 슬라이드를 확인하였다.
10. 세포 분류
세포기질(cytosol)과 미토콘드리아(mitochondria)는 Mitochondria Fractionation Kit (Active Motif, 40015)로 분리하였다. 세포 내 분획화된 단백질은 2% SDS를 함유하는 완충액에 용해시키고, 2x 환원 샘플 버퍼로 끓인 후 SDS-PAGE에 사용하였다.
11. MTT 분석
각 실험군의 세포를 지정된 시간 동안 배양한 후, 5 ㎎/㎖의 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 배지에 첨가하여 추가로 4시간 동안 배양하였다. 모든 배지를 제거하고 동일한 부피의 DMSO (dimethyl sulfoxide) 용액을 첨가하여 15분 동안 포르마잔(formazan)을 용해시켰다. UV/VIS 분광 광도계로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 생존력을 확인하였다.
12. 유세포 분석
유세포 분석 데이터는 FACSCanto (BD Biosciences, San Diego, CA)에서 수집하여 FlowJo software(Tree Star, Ashland, OR)로 분석하였다. 세포 표면 단백질의 발현 여부를 확인하기 세포와 mAb를 4℃에서 20분 내지 30분 동안 반응시키고, 세포를 Cytofix/Cytoperm Solution (BD Biosciences)으로 고정시켰다. 사용한 mAb 클론은 다음과 같다: NK1.1 (PK136, eBioscience), LY6G (1A8-Ly6g, eBioscience), SR-A (PSL204, eBioscience), FcR (MAR-1, eBioscience), TLR2 (6C2, eBioscience), TLR4 (HTA125, eBioscience), NRP1 (3DS304M, eBioscience) 및 CXCR2 (eBio5E8-C7-F10, 5E8-C7-F10, eBioscience).
13. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
제조업체가 권장한 과정에 따라 BD OptEIA ELISA set(BD Pharmingen)로 세포 배양 상청액과 마우스 혈청에서 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-12p40 및 IL-10의 수준을 확인하였다.
14. 패혈증 유도 및 박테리아 수 확인
6주령의 C57BL/6 암컷 마우스(샘타코 바이오)에 맹장 결찰 및 천자(Cecal ligation and puncture, CLP)를 수행하였다. 구체적으로, 마우스를 펜토탈 나트륨 (50 ㎎/㎏, i.p.)으로 마취시키고, 작은 복부 중간선 절개를 수행하여 맹장을 노출시켰다. 그런 다음 맹장을 회맹판(ileocecal valve) 아래에 연결하고 22-게이지 바늘로 표면을 두 번 뚫고 복부를 봉합하였다. 마우스의 생존율은 7일 동안 매일 확인하였고, 모든 동물은 병원체가 없는 환경에서 사육하였다.
박테리아 수는 다음과 같이 확인하였다. 혈액 및 복막 세척액을 CLP 후 정해진 시간에 심장 구멍을 통하여 마우스로부터 수집하고, 혈액을 연속적으로 희석시켰다. 이후 각각의 희석액 5 ㎕을 혈액 한천 플레이트에 도말하여 박테리아를 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 박테리아 수는 전체 복막 세척액 또는 혈액 당 콜로니 형성 단위를 계수하는 것으로 계산하였다.
15. 조직 분석
조직 분석을 위해 마우스의 비장, 간 및 폐를 10% 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 넣어두었다. 파라핀 섹션(4 ㎛)을 절단하고, 헤마토자일린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 조직병리학적 점수(0 내지 4)는 치료군에 대한 사전 지식 없이 조직 내 염증 세포의 수와 분포 및 염증의 중증도에 기초하여 병리학자가 각 장기 섹션을 독립적으로 채점하였다.
16. 생체 내 이미지
rRv2626c-CA/Cy5.5는 rRv2626c-CA에 스트렙트아비딘-결합 Cy5.5 염료를 첨가하여 준비하였고, rRv2626c-CA/Cy5.5는 복강내 주사(intraperitoneal injection, i.p)로 CLP 마우스에 투여하였다. 조직 생체 분포를 연구하기 위해 투여 후 다른 시간대에 마우스를 희생시키고, 주요 기관을 IVIS Spectrum-CT 생체 내 이미징 시스템 (PerkinElmer, Inc.)으로 이미지화하였다.
17. 통계 분석
모든 데이터는 다중 비교를 위해 Bonferroni 조정 또는 ANOVA와 함께 Student's t-test를 사용하여 분석하였고, 평균±SD로 기재하였다. 통계 분석은 SPSS (Version 12.0) 통계 소프트웨어 프로그램 (SPSS, Chicago, IL, USA)으로 수행하였다. 차이는 p <0.05에서 유의한 것으로 간주되었다. 생존을 위해, GraphPad Prism (버전 5.0, La Jolla, CA, USA)을 사용한 비교를 위해 로그-랭크 (Mantele-Cox) 테스트를 사용하여 Kaplan 및 Meier의 제품 제한 방법으로 데이터를 그래프화하고 분석하였다.
실험 결과
1. 대식세포에서 rRv2626c는 TLR 신호 경로를 통하여 염증 반응을 조절한다.
대식세포의 초기 면역 반응에서 Rv2626c의 역할을 시험하기 위해 His 태그가 달린 rRv2626c를 제작하였다. 정제된 rRv2626c(16, 36 kDa)는 SDS-PAGE 및 면역블롯팅으로 확인하였다 (도 1의 B). 대식세포에서 rRv2626c로 유도한 세포 독성은 큰 차이를 보이지 않았다 (도 1의 C). 또한, 공초점 현미경 분석과 세포 분획 분석 결과를 통해 rRv2626c가 대식세포의 세포질에 분포하는 것을 확인하였다 (도 2의 A 및 B).
이전 연구에서 본 발명자들은 rRv2626c가 세포 표면에 붙고, 대식세포 안에 위치하여 NF-kB를 조절하고, 사이토카인의 생성을 촉진하는 것을 확인하였다. 그래서 대식세포에서 rRv2626c의 기능적 영향을 알아보기 위해, rRv2626c에 의해 유도된 사이토카인의 생성량을 ELISA로 확인하였다.
확인 결과, rRv2626c는 전염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-6 및 IL-12p40)의 생성은 감소시키고, 항염증성 사이토카인 (IL-10)의 생성은 증가시켰다 (도 3의 A 및 B). 이는 TLR2-MyD88-TRAF6-IRAK1 경로에 의존적이며, TRIF-의존적(TBK1) 경로에 의한 것은 아니었다. 또한, rRv2626c는 대식세포 안으로 이입(internalization)되었으며 his-태그 rRv2626c는 rRv2626c가 처리된 TLR2-/- BMDMs의 세포 용해물에서만 검출되지 않았다 (도 3의 C). 이러한 결과는 rRv2626c가 TLR2를 통하여 대식세포 안으로 이입되고, TLR2-MyD88에 의존적인 경로가 rRv2626c에 의해 매개되는 염증 반응에서 중요하다는 것을 시사한다.
2. rRv2626c는 대식세포에서 TLR 매개 염증 반응을 억제한다.
TLR-매개 염증 신호 경로에서 Rv2626c의 기능적 역할을 확인하기 위해, Rv2626c가 TLR4 (LPS) 또는 TLR2/6 (Pam2CSK4)에 의해 유도된 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는지 조사하였다. 확인 결과, rRv2626c는 TLR-매개 전염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-6 및 IL-12p40)의 생성을 약화시켰고, 반대로 항염증성 사이토카인 (IL-10)의 생성을 촉진하였다 (도 4). 상기 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 rRv2626c가 TLR2를 통해 대식세포로 들어가고, 세포 내 rRv2626c가 TLR 리간드에 의해 유도된 신호 전달 경로를 조절하기 위해 임의의 기능을 수행할 것이라는 가설을 세웠다.
PI3K, MAPK, NF-?B 신호경로는 LPS가 유도하는 대식세포의 염증 신호에 관여하는 것으로 이미 알려져 있기 때문에, 이들 경로에서 신호 단백질의 활성화가 rRv2626c에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하였다. 그 결과, LPS에 의해 유도된 AKT, MAPK 및 IκBα의 인산화와 IκBα의 분해가 rRv2626c의 전처리에 의해 억제되는 것을 확인하였다 (도 5). 종합적으로, 이러한 결과는 rRv2626c가 PI3K, MAPK, NF-?B 신호경로에서 TLR 리간드에 의해 유도된 활성화를 억제하는 조절자 역할을 하여 전염증성 사이토카인 생산을 억제하고 대식세포에서의 항염증성 사이토카인 생산을 촉진한다는 것을 시사한다.
3. Rv2626c는 TRAF6와 상호 작용한다.
본 발명자들은 rRv2626c가 선천적인 면역 신호 분자와의 결합을 통해 LPS에 의해 유도된 TLR 신호 경로를 조절할 것이라는 가설을 세웠다. rRv2626c의 결합 파트너를 확인하기 위해, THP-1 세포에 his-태그 rVector 또는 rRv2626c를 처리하여 배양하고 his-아가로스 비드로 공동-면역침전을 수행하였다.
질량 분석 결과, TLR2 (100 kDa), IRAK1 (80 kDa), RIP1 (70 kDa), TRAF6 (60 kDa), MAPK11 (41 kDa) 및 TOLLIP (32kDa)를 포함하여 rRv2626c와 결합할 것으로 예상되는 여러 내인성 단백질을 확인할 수 있었다 (도 6). 293T 세포(TRAF6 이소성 발현) 및 대식세포에서의 면역침전 결과는 rRv2626c가 TRAF6와 일시적(30분 내지 60분)이긴 하지만 강하게 상호작용한다는 것을 보여준다 (도 7). 또한, rRv2626c 및 TRAF6의 공초점 현미경 이미지에 따르면 rRv2626c는 주로 대식세포의 세포질에서 내인성 TRAF6와 함께 위치하였다 (도 8). 이러한 결과는 rRv2626c가 내인성 및 이소성 수준 모두에서 TLR 신호 전달 경로의 신호 전달 분자인 TRAF6과 직접적으로 상호 작용한다는 것을 암시한다.
4. Rv2626c의 CBS2 도메인은 TRAF6의 N-말단 영역과 상호 작용하고 TRAF6의 폴리-유비퀴틴화(poly-ubiquitination)를 약화시킨다.
HEK 293T 세포에서 Rv2626c의 어느 도메인이 TRAF6와 상호작용하는지 확인한 결과, Rv2626c의 CBS2 도메인과 TRAF6가 결합하는 것을 확인하였다 (도 9의 A).
또한, TRAF6와의 상호 작용을 매개하는 Rv2626c의 세부 영역을 찾기 위해 CBS2 도메인의 9-10개 아미노산 서열 유닛을 설계하고, 단백질 분해 방지를 위해 Rv2626c의 9-10개 아미노산 서열에 레트로-인버소 (retro-inverso) 펩타이드인 HIV-1 Tat 서열을 추가하여 복수개의 Tat-CBS2 펩타이드를 제작하였다. 이 펩타이드로 293T 세포에서 TRAF6와 상호 작용을 하는 Rv2626c의 최소 잔기를 확인하였다.
실험 결과, Tat-CBS2 (123LPEHAIVQF131) 펩타이드가 TRAF6과 Rv2626c 상호 작용을 효과적으로 차단하는 반면, Tat 펩타이드 자체는 차단할 수 없는 것으로 나타났다 (도 9의 B). 특히, CBS2의 9개 아미노산 (123LPEHAIVQF131)에서 전기적으로 대전된 곁사슬을 갖는 125EH126 아미노산은 TRAF6과의 상호 작용에 필수적이고 최소한의 상호 작용에 중요하였다. 또한 Rv2626c의 다양한 절단 돌연변이와 TRAF6와의 상세 매핑을 통해 Rv2626c와의 상호작용에는 TRAF6의 RING 도메인이 필요한 것으로 확인되었다(도 10의 A). 종합적으로, 상기 결과는 Rv2626c가 CBS2 도메인(aa 123-131), 특히 CBS2 도메인의 하위 지역을 통해 TRAF6 N-말단 RING 도메인과 직접 연관되어 있음을 나타낸다 (도 10의 B).
TRAF6의 폴리-유비퀴틴화가 TRAF6 및 하위(downstream) 신호 전달 경로의 활성화에 중요하므로 Rv2626c와 TRAF6의 상호 작용이 TRAF6의 유비퀴틴화 상태를 조절하는지 조사하였다.
웨스턴 블롯팅 결과, HA-유비퀴틴(HA-Ub)의 발현이 Flag-TRAF6의 폴리-유비퀴틴화를 야기하고, 이러한 TRAF6의 유비퀴틴화는 처리 농도에 의존적인 방식으로 Rv2626c 발현에 의해 약화되는 것을 확인하였다 (도 11의 A).
K48-연결 유비퀴틴화(ubiquitination)는 유비퀴틴 기질의 프로테아좀 분해를 매개하는 반면, K63-연결 유비퀴틴화는 NF-κB와 하위에 위치한 신호 전달 경로의 활성화에 필수적이라는 사실이 알려져 있다. Rv2626c에 의해 조절되는 유비퀴틴 사슬의 유형을 결정하기 위해 HA 태그가 달린 리신48-연결 유비퀴틴(K48-linked ubiquitin, K48-Ub) 및 K63-연결 유비퀴틴(K63-Ub) 플라스미드를 사용하여 면역침전을 수행하였다.
그 결과, K48-Ub 및 K63-Ub의 과발현이 각각의 유비퀴틴 결합을 통해 TRAF6에서 유비퀴틴화를 유도하는 것을 확인하였다 (도 11의 B 및 C). 또한, Rv2626c의 처리 농도가 증가하더라도 K48-Ub 사슬에는 별 영향이 없었으나, K63-Ub 사슬은 Rv2626c의 처리 농도에 의존적인 방식으로 강력하게 억제되었다 (도 12). 이러한 결과는 Rv2626c와 TRAF6가 결합하고, Rv2626c가 TRAF6와 하위 신호 전달 경로의 활성화를 조절하는 TRAF6의 K63-Ub의 폴리-유비퀴틴화를 억제한다는 것을 의미한다.
5. 터프신-연결 Rv2626c 펩타이드는 대식세포를 표적하도록 설계되었다.
비장에서 IgG의 단백질 분해 산물인 289-292 아미노산 잔기로부터 유래된 4개의 천연 면역 조절 펩타이드(Thr-Lys-Pro-Arg)인 터프신(tuftsin)은 포식 작용 자극 인자로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 대식세포의 표적 및 면역반응 조절을 위해 Rv2626c의 123-131번 아미노산을 포함하는 세포-투과 펩타이드/터프신 접합 Rv2626c 펩타이드를 설계하였다 (도 13의 A).
대식세포에서 Rv2626c-CA (활성 구조 형태) 및 Rv2626c-DN (TRAF6 결합 능력 손실 형태, E125Q 및 H126Q 변이 포함) 펩타이드의 기능을 평가하기 위해, his 태그가 달린 rRv2626c-CA 및 Rv2626c-DN을 박테리아에서 생산하여 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 rRv2626c-CA와 Rv2626c-DN은 약 10 kDa 크기로 SDS-PAGE와 면역블롯팅으로 확인하였다 (도 13의 B). MTT 분석으로 확인한 결과, BMDM에서 대조군(rVehicle)과 비교하여 rRv2626c-CA 및 Rv2626c-DN의 유의미한 세포 독성 차이는 관찰되지 않았다 (도 13의 C).
또한, rRv2626c-CA가 rRv2626c의 약물학적, 생물학적 프로파일을 모방할 수 있는지 확인하였다. 확인 결과, rRv2626c 단독 활성과 일치하게, rRv2626c-CA 또한 대식세포에서 처리 농도 의존적 방식으로 염증 반응을 조절하였다. 놀랍게도, rRv2626c-CA는 10 ng/㎖의 IC50 값을 나타내 rRv2626c-WT의 IC50인 2.5 ㎍/㎖에 비해 250배 증가한 수치를 나타냈다 (도 14). 또한, rRv2626c-CA의 처리는 Rv2626c를 발현하는 세포에서 LPS에 의해 유도된 내인성 TRAF6와 Rv2626c의 상호작용과 TRAF6의 폴리 유비퀴틴화를 급격하게 억제시켰다 (도 15). 특히, 대식세포에 rRv2626c-DN (TRAF6 결합 손실)을 처리한 실험군 또는 대조군(rVehicle; 터프신 처리)에서는 염증 반응과 TRAF6 결합 및 폴리유비퀴틴화에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다 (도 14 및 도 15). 따라서 rRv2626c-CA는 대식세포 표적 면역 반응에 대해 선택적이고 강력한 염증 조절자 역할을 한다.
6. rRv2626c-CA는 전신 패혈증으로부터 마우스를 보호한다.
본 발명자들은 rRv2626c-CA가 여러 미생물이 유발한 패혈증으로부터 마우스를 보호하는지 조사하였다.
먼저, 마우스에서 CLP에 의한 사망률에 대한 rRv2626c-CA의 효능을 시험하였다. CLP 마우스에 0, 6, 12 및 18시간 후에 복강 내 주사를 통해 rRv2626c-CA를 4회 처리한 결과, 처리 용량에 의존적으로 사망률이 감소하였다. 특히, 마우스에 100 ㎍/㎏의 용량으로 rRv2626c-CA를 투여하면 마우스의 90%가 죽지 않았다. 놀랍게도, rRv2626c-CA는 20 ㎍/㎏의 IC50 값을 가졌으며, 이는 rRv2626c-WT (CPP+rRv2626c full length)의 IC50 값보다 1000배 높은 수치이다 (도 16의 A 및 B). rRv2626c-DN (TRAF6 결합 손실) 투여군 또는 대조군(rVehicle; 터프신 처리)은 생존 그래프에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다 (도 16의 C).
사망률 데이터 값과 일치하게, TNF-a, IL-6, IL-1β, IL-12p40와 같은 전-염증성 사이토카인의 혈청 농도는 rRv2626-CA를 투여한 마우스에서 크게 낮아졌다. 그러나 IL-10의 농도는 rRv2626c-CA를 투여한 마우스에서 크게 증가하였다 (도 17). 이러한 경향은 H&E 염색에서도 유사하게 나타나서 rRv2626c-CA를 투여한 마우스에서는 면역세포의 침윤이 적고 폐, 간, 비장의 손상이 감소하는 것을 확인하였다 (도 18).
다음으로, rRv2626c-CA가 생체 내(in vivo) 약리적 활성을 가지고 있는지 확인하였다. TRAF6 결합 여부의 생체내 검출 및 이의 유비퀴티화 활성은 치명적인 염증성 질환을 치료하기 위한 후보 약물 발굴에서 rRv2626c-CA의 평가에 중요할 수 있다.
생체 외(in vitro) 데이터(도 12)와 일치하게 rRv2626c-CA는 TRAF6와 상호작용하고, 비장세포에서 TRAF6의 유비퀴틴화 수준을 감소시켰다 (도 19의 A). 형광 rRv2626c-CA (rRv2626c-CA/Cy5.5)를 투여한 후 마우스의 체내에서 생체 내 분포와 약물 동태학을 확인한 결과, rRv2626c-CA/Cy5.5는 72시간 동안 몸 안에 머물러 있고, 투여 18시간, 24시간 후에 간에서 가장 높은 농도로 관찰되었다 (도 20). 또한 치료용 rRv2626c-CA의 조직 분포는 폐, 간, 비장의 T 세포와 B 세포가 아니라 대식세포 안이었다 (도 21 및 도 22). 종합하면, 이러한 결과는 rRv2626c-CA가 체내에서 빨리 분해되지 않고 상당한 시간 동안 순환하며, 대식세포를 대상으로 CLP에 의해 유도된 패혈증을 개선하는 치료제로서 잠재력을 가지고 있다는 것이다.
7. rRv2626c-CA는 박테리아 제거를 향상시킨다.
CLP에 의한 치사율은 말초 혈액 및 복막액에서 박테리아의 콜로니 수와 양의 상관 관계가 있다. 이를 확인하기 위해 CLP 마우스에 rRv2626c-CA를 복강 내 주사로 투여한 결과, 복막액 및 혈액 모두에서 박테리아의 콜로니 수가 크게 감소하였다 (도 23의 A). 그러나 rRv2626c-CA의 박테리아에 대한 직접적인 사멸 효과는 관찰되지 않았다 (도 23의 B).
패혈증 모델에서 살균 효과가 주로 호중구의 모집에 의해 매개되는 것으로 보고되었기 때문에, CLP에 의해 유도된 패혈증 모델에서 rRv2626c-CA가 면역 세포들의 모집을 증가시키는지 조사하였다. rRv2626c-CA 투여군에서는 비장 및 폐에 모집된 대식세포의 수가 유의미하게 증가하였지만, 대조군(rVehicle) 및 rRv2626c-DN 투여군에서는 대식세포의 수가 증가하지 않았다 (도 24). 특히, rRv2626c-CA에 의한 대식세포 모집은 2형 대식세포를 증가시키고, 1형 대식세포를 감소시켰다 (도 25).
rRv2626c-CA가 대식세포 모집에 어떻게 기여하는지 알아보기 위해, 대식세포에서 TRAF6의 존재 아래 식균 수용체-A (scavenger receptor-A, SR-A), Fc 수용체, 선천 면역 수용체(TLR2, TLR4), 호중구 수용체 (Neuropilin-1 및 CXCR2)의 발현을 확인하였다. 확인 결과, rRv2626c-CA는 식균 수용체-A 및 Fc 수용체의 발현을 증가시켰다 (도 26). 이러한 결과는 rRv2626c-CA에 의해 유도된 2형 대식세포의 분화 및 모집, 강화된 식균 작용에 의한 항균 효과와 식균 작용을 강력하게 시사한다.
지금까지의 실험 결과를 통하여 본 발명자들은 다음 사실을 확인하였다: (1) 2개의 전기적으로 하전된 잔기를 포함하는 Rv2626c C-말단의 아미노산 123-131 서열이 Rv2626c와 TRAF6의 결합에 필요하다. (2) Rv2626c는 TRAF6의 RING 도메인과 상호 작용하고 TRAF6의 K63-연결 폴리유비퀴틴화를 억제함으로써 대식세포에서 TLR4 염증 신호 전달을 억제한다. (3) 생체 외, 생체 내에서 대식세포를 표적화하는 터프신-결합 Rv2626c 펩타이드 (123LPEHAIVQF131)를 설계 및 발현시켰으며, (4) 새로 개발한 rRv2626c-CA는 rRv2626c-WT와 비교하여 상당히 개선된 효능 및 선택성을 보였다. (5) rRv2626c-CA는 2형 대식세포의 분화 및 모집과 강화된 포식 작용으로 패혈증을 유도하는 박테리아를 효과적으로 제거한다. (6) rRv2626c-CA는 여러 미생물의 감염으로부터 마우스를 보호하였으며, 이는 본 발명의 rRv2626c-CA가 패혈증 및 기타 미생물 매개 질환 치료에 적합한 치료제로 사용될 수 있음을 의미한다.
도 27에 rRv2626c에 의해 매개되는 TLR 신호 전달 경로의 조절 기작 및 이를 통한 패혈증 치료 기작을 도시하였다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> PEPTIDE FOR TREATING SEPSIS DERIVED FROM RV2626C PROTEIN OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS <130> P23U22C2192_P20231041DP <140> 10-2020-0144321 <141> 2020-11-02 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 Leu Pro Glu His Ala Ile Val Gln Phe 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tuftsin <400> 2 Thr Lys Pro Arg 1 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-Tat <400> 3 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP-GG-Tuftsin-GG-CBS2 <400> 4 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln Gly Gly Thr Lys 1 5 10 15 Pro Arg Gly Gly Leu Pro Glu His Ala Ile Val Gln Phe 20 25 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dNP2 <400> 6 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 20 <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP22 <400> 7 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MPG <400> 8 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP-1 <400> 9 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Cys 20 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EB1 <400> 10 Leu Ile Lys Leu Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys 20 <210> 11 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transportan <400> 11 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p-Antp <400> 12 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCT(18-32) <400> 13 Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro 1 5 10 15 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KLA <400> 14 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligoarginine <400> 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 16 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide liker <400> 16 Gly Gly 166 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide liker <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide liker <400> 18 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv2626c CBS2(123-131) MUTANT <400> 19 Leu Pro Gln Gln Ala Ile Val Gln Phe 1 5

Claims (6)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 세포 투과 펩타이드;
    상기 세포 투과 펩타이드의 C-말단에 연결된 터프신 펩타이드(서열번호 2); 및
    상기 터프신 펩타이드의 C-말단에 연결되고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열이 1회 내지 5회 반복된 패혈증 치료용 펩타이드;로 이루어진 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포 투과 펩타이드는 HIV-TAT (서열번호 3), TAT (서열번호 5), dNP2 (서열번호 6), VP22 (서열번호 7), MPG (서열번호 8), PEP-1 (서열번호 9), EB1 (서열번호 10), transportan (서열번호 11), p-Antp (서열번호 12), hCT(18-32)(서열번호 13), KLA (서열번호 14) 및 올리고아르기닌 (서열번호 15)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 터프신 펩타이드는 1회 내지 20회 반복해서 포함되는 것인, 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 세포 투과 펩타이드, 패혈증 치료용 펩타이드 및 터프신 펩타이드 각각은 GG (서열번호 16), (GGGGS)n (n=1-5) (서열번호 17) 및 (EAAAK)n (n=1-5) (서열번호 18)로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드 링커로 서로 연결되는 것인, 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 패혈증 치료용 펩타이드 또는 패혈증 치료용 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 패혈증 치료용 융합 펩타이드는 세포 투과 펩타이드; 상기 세포 투과 펩타이드의 C-말단에 연결된 터프신 펩타이드(서열번호 2); 및 상기 터프신 펩타이드의 C-말단에 연결되고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열이 1회 내지 5회 반복된 패혈증 치료용 펩타이드로 이루어진 것인, 패혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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