KR20230068832A - 트리아진 유도체 및 이의 용도 - Google Patents

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양철수
민선준
김경민
이다은
이은비
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한양대학교 에리카산학협력단
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Abstract

본 발명은 Rv3364c에서 SNX9의 BAR 도메인과 직접 결합할 수 있는 영역을 확인하고 상기 영역의 구조를 모사한 화합물을 가상 스크리닝 후 제조하였다. 제작된 트리아진 유도체는 SNX9와 결합하여 TLR4 매개 염증반응을 조절할 수 있을뿐만 아니라 항균활성을 나타낸다. 나아가 본 발명의 트리아진 유도체는 상기 Rv3364c 유래 펩타이드보다 현저하게 우수한 패혈증 치료 효과를 나타내었는바, 결핵균 감염 질환의 예방 및 치료와 함께 패혈증과 패혈증 쇼크의 예방 및 치료 용도에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

트리아진 유도체 및 이의 용도{TRIAZINE DERIVATIVES AND USE THEREOF}
본 발명은 SNX9와 상호작용에 필수적인 Rv3364c 유래의 펩타이드 구조 및 기능과 유사한 구조 및 기능을 갖는 삼치환 트리아진 유도체와 상기 트리아진 유도체의 패혈증 치료 용도 등에 관한 것이다.
박테리아 항원은 숙주 면역 방어와 박테리아가 숙주 면역으로부터 피하거나, 스스로를 보호하도록 하는 메커니즘 사이의 상호작용을 유발한다. 이러한 숙주-병원체 상호작용은 세포 내 병원체에 의해 매우 복잡한데, 예로서 결핵의 원인인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)이 있다. 결핵균의 세린 단백질분해효소 억제제(serine protease inhibitor)로 알려진 Rv3364c는 결핵균에 노출된 대식세포에 높은 수준으로 발현되고, 결핵균 및 대식세포의 배양 상층액과 용해물에서 강하게 발현되는 항원이다. Rv3364c는 Roadblock/LC7 도메인을 포함하며 진핵생물의 외부/내부 편모 디네인(outer/inner flagellar dynein), Myxoccus xanthus의 세포질 디네인 (cytoplasmic dynein)과 연관되어 있으며, 상기 각 디네인의 구조와 기능 조절 역할을 수행한다. 또한 Rv3364c 효과 단백질(effector protein)은 대식세포의 세포막에 세린 프로테아제 카뎁신 G (serine protease cathepsin G)와 결합하여 이의 효소적 활성과 그 하위 반응경로에 있는 카스파아제(caspase-1) 의존적 세포사멸을 억제한다. 그러나, Rv3364c와 숙주세포와의 상호작용의 이해는 아직 미흡한 실정이며, 대식세포와 Rv3364c 사이의 상호관계를 이해하는 것은 효과적인 감염병 치료 전략 수립에 중대한 기여를 할 것으로 기대된다.
패혈증(sepsis)은 감염에 대한 숙주의 반응이 조절되지 않아 일어나는 생명과 관련된 장기 기능 장애로 정의된다. 패혈증에 걸리면 병원체에 의해 시작된 면역반응이 항상성을 유지하지 못하고, 과도한 염증과 세균 증식이 지속되는 병리학적 증후군을 일으키게 된다. 패혈증의 사망률은 25%에 가까우며, 높은 발생률과 사망률 때문에 세계적으로 이에 대한 비용 지출이 상당한 상태이다. 패혈증의 발병에 대한 이해 수준은 높아졌지만, 아직 표적 치료 방법에 대한 부분은 미흡한 상태이다.
한편, 펩타이드와 단백질은 치료제로서 큰 잠재력을 가지고 있다. 현재, 작은 크기의 소분자 약물이 대부분의 제약시장을 차지하고 있는데 이들과 같은 전형적인 소분자 약물과 비교하여, 펩타이드 및 단백질은 표적 특이성을 가져 부작용과 독성이 적고, 비천연 아미노산을 이용하여 쉽게 최적화할 수 있다는 장점이 있다. 치료를 목적으로 한 펩타이드와 단백질이 지속적으로 연구되고 있음에도 불구하고, 전신에 걸친 안정성과 특정 부위에 전달을 증가시키는 방법이 논의되고 있다. 그리고 세포에 침투하는 펩타이드의 표적 특이성의 결여는 임상 개발에서 주요 장애물로 남아있다.
EMBO Molecular Medicine 2020, vol.12, issue12: e12497 "Mycobacterium tuberculosis Rv2626c-derived peptide as a therapeutic agent for sepsis"
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 SNX9와 상호작용에 필수적인 Rv3364c 유래의 펩타이드를 제공하고, 상기 펩타이드를 포함하는 패혈증 개선, 예방, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 SNX9와 상호작용에 필수적인 Rv3364c 유래의 펩타이드 구조 및 기능과 유사한 구조 및 기능을 갖는 트리아진 유도체와, 상기 트리아진 유도체를 포함하는 패혈증 개선, 예방 또는 치료용 조성물 제공을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 Rv3364c 유래의 펩타이드를 패혈증 치료용 펩타이드로서 제공한다.
본 발명에서 상기 Rv3364c 유래 펩타이드는 Rv3364c에서 SNX9와 상호작용에 관여하는 영역의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 SNX9와 상호작용에 관여하는 영역의 최소 범위는 Rv3364c 단백질의 12-17 a.a 아미노산 서열(서열번호 14)이다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 패혈증 치료용 펩타이드는 12번째 및 17번째 아미노 잔기(W12 및 F17)의 기능적 성질에 영향을 미치지 아니한다면 그 N-말단 및/또는 C-말단에 추가의 아미노산을 하나 또는 2 이상 포함할 수 있으며, 상응되는 의미에서 상기 패혈증 치료 용도에 제공되는 Rv3364c 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 패혈증 치료용 펩타이드는 상기 Rv3364c 유래 펩타이드의 N-말단에 세포투과 펩타이드가 연결된 것일 수 있으며, 상기 세포투과 펩타이드는 HIV-TAT (서열번호 15), TAT (서열번호 16), dNP2 (서열번호 17), VP22 (서열번호 18), MPG (서열번호 19), PEP-1 (서열번호 20), EB1 (서열번호 21), transportan (서열번호 22), p-Antp (서열번호 23), hCT(18-32)(서열번호 24), KLA (서열번호 25) 및 올리고아르기닌 (서열번호 26)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 패혈증 예방 또는 치료 약제의 제조를 위한 상기 펩타이드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Rv3364c 유래 펩타이드와 그 구조 및 기능이 유사한 하기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서
R'은 H이고,
R1은 H, F, Cl, OCH3, CF3, CH3, 또는 t-Bu이고,
R2는
Figure pat00002
,
Figure pat00003
,
Figure pat00004
,
Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
,
Figure pat00009
,
Figure pat00010
,
Figure pat00011
,
Figure pat00012
, 또는
Figure pat00013
이다.
상기 트리아진 유도체는 바람직하게는 하기 화학식 8g로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 8g]
Figure pat00014
.
또한, 본 발명은 상기 트리아진 유도체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 트리아진 유도체는 SNX9의 BAR 도메인과 결합하는 것일 수 있으며, 상기 트리아진 유도체는 초기 엔도솜에서 SNX9와 p47phox의 결합을 방해하여 ROS 생성을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 트리아진 유도체는 대식세포에 우선적으로 작용하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 트리아진 유도체는 TNF-α 및/또는 IL-6의 생성을 억제할 수 있으며, TLR4 매개 염증반응을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 트리아진 유도체는 NADPH 산화효소 활성화를 억제하는 것일 수 있으며, 항균 활성을 나타내는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 트리아진 유도체를 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 식물 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 트리아진 유도체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 패혈증 예방 또는 치료 약제 제조를 위한 상기 트리아진 유도체의 용도를 제공한다.
본 발명자들은 결핵균 유래 Rv3364c 단백질이 숙주의 SNX9와 반응함을 확인하고, SNX9와 직접 상호작용하는 영역을 확인하여 SNX9의 BAR 도메인과 직접 결합할 수 있는 Rv3364c 유래 펩타이드를 제작하였다. 이어서, 본 발명자들은 상기 Rv3364c 유래 펩타이드의 구조를 기초로 이와 유사한 기능을 갖는 트리아진 유도체를 제작하고, 제작된 트리아진 유도체가 상기 펩타이드와 동일하게 작용하되 보다 효과적으로 TLR4 매개 염증반응을 조절하여 패혈증을 치료할 수 있으며 나아가 항균활성이 있음을 확인하였는바, 본 발명의 트리아진 유도체는 결핵균 감염 질환의 예방 및 치료와 함께 패혈증과 패혈증 쇼크의 예방 및 치료 용도에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b은 CDI HuProt?? Human Proteome Microarray에서 rRv3364c와 잠재적으로 상호작용할 것으로 예상되는 후보 단백질을 선별한 결과이다. 각 도면은 양성반응을 보여주는 단백질 어레이의 섹션을 나타낸다. 532nm 에서의 신호는 대조군보다 rRv3364c 그룹에서 보다 강하게 나타났다.
도 2는 생체 내에서 rRv3364c와 상호작용하는 단백질을 선별하기 위하여 BMDM 세포와 HEK293T 세포에 rRv3364c를 처리하고 공동면역침강을 수행하여 상호작용 단백질을 확인한 결과이다. 구체적으로 (A)는 1μg/ml rRv3364c의 처리 시간을 달리한 BMDM 세포를 수확하고 αHis로 면역침강(Immunoprecipitation: IP)를 수행하고 αSNX9, αYEATS4, αZBTB46 및 αEGFLAM를 사용하여 면역블롯(immunoblot: IB)을 수행한 결과이다. WCL을 IB에 αHis 또는 αActin와 함께 사용하였다. (B)는 293T 세포에 Flag-Rv3364c와 Myc-tagged SNX9, YEATS4, ZBTB46 또는 αEGFLAM을 공동-형질감염(co-transfection)하고 αFlag (왼쪽) 또는 αMyc (오른쪽)으로 IP 수행 후 αMyc 또는 αFlag을 사용하여 IB를 수행한 결과이다. WCL을 IB에 αHis 또는 αActin와 함께 사용하였다.
도 3a 및 도 3b는 세포 내에서 rRv3364c의 위치를 확인한 결과이다.
도 3a는 1μg/ml rRv3364c의 처리 시간을 달리한 Raw264.7를 핵과 세포질로 분획하고 αHis로 IP를 진행한 후 αSNX9 또는 αYEATS4를 IB를 진행한 결과이다. WCLs를 IB에 αSNX9, αYEATS4 또는 αHis를 함께 사용하였다.
도 3b는 1μg/ml rRv3364c의 처리 시간을 달리한 BMDM 세포에 His-rRv3364c (Alexa Fluor 568)와 SNX9 또는 YEATS4 (Alexa Fluor 488) 항체를 이용하여 면역형강을 수행한 결가이다. DAPI(파란색)은 핵을 염색한 것이고, 눈금 막대는 10μm이다.
도 4 및 도 5는 Rv3364c가 SNX9 및 YEATS4와 상호작용하는 영역을 확인한 결과이다.
도 4는 10 a.a 길이의 Rv3364c 유래 펩타이드를 설계하고 그 N-말단에 Tat 펩타이드가 융합한 Tat-rRv3364c 펩타이드를 제작한 후 각 Tat-rRv3364c 펩타이드가 rRv3364c와 SNX9(A) 및 YEATS4(C)의 결합을 방해하는 정도를 확인하여 Rv3364c에서 각 단백질과 상호작용하는 영역을 확인한 결과이다. 구체적으로, Flag-Rv3364c와 함께 Myc-SNX9로 형질감염한 293 세포에 12시간 동안 Tat-Rv3364c 펩타이드(5μM)를 처리하고 αFlag로 IP를 수행한 후, αMyc으로 IB를 수행한 결과이다. WCLs는 IB에 αMyc, αFlag, αActin과 함께 사용했다. 그리고, 타겟과 반응성이 높은 Tat-Rv3364c 펩타이드의 농도를 달리한 세포에서 면역침강 및 면역블롯을 수행하였다(B 및 D).
도 5는 SNX9와 상호작용에 필수적인 rRv3364c 단백질의 영역을 탐색한 결과이다.
도 6은 rRv3364c 단백질과 상호작용하는 SNX9의 영역을 탐색한 결과이다. 구체적으로, 야생형 SNX9의 각 도메인을 분리한 펩티이드를 설계하고(A) 239T 세포에 Flag-rRv3364c와 함께 Myc-SNX9 펩타이드를 공동 형질감염시킨 후 αFlag (B) 또는 αMyc (C)와 함께 IP를 수행한 후, IB를 αMyc (B) 또는 αFlag (C)와 함께 수행한 결과이다.
도 7은 Rv3364c가 SNX9 및 YEATS4와 상호작용하는 영역과 세포 내 위치를 나타낸 모식도이다.
도 8a 내지 도 8d는 대식세포에서 Rv3364c가 SNX9와 상호작용하여 TRL4 매개 염증반응을 조절할 수 있음을 확인한 결과이다.
구체적으로, 도 8a는 WT, TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/-, TRIF-/-, IRAK1-/-, TRAF6-/-, 및 TBK1-/- 마우스의 DMBM 세포에 1μg/ml rRv3364c 또는 rVector을 18시간 동안 처리하고 그 배양 상층액을 수확하여 ELISA를 통해 TNF-α, IL-6, IL-12p40, 및 IL-10의 수준을 측정한 결과이다.
도 8b는 SNX9-/- 마우스의 DMBM 세포에 1μg/ml rRv3364c 또는 rVector을 18시간 동안 처리하고 그 배양 상층액을 수확하여 ELISA를 통해 TNF-α, IL-6, IL-12p40, 및 IL-10의 수준을 측정한 결과이다.
도 8c는 SNX9+/+ 또는 SNX9-/- 마우스의 BMDM 세포에 TAT-Rv3364c 펩타이드(12WLVSKF17) (1, 5, 10μM)로 1시간 동안 전처리하고, 100ng/ml LPS로 18시간 동안 차극 후에 그 배양 상층액을 수확하여 ELISA를 통해 사이토카인의 발현 수준을 확인한 것이고, 도 8d는 세포를 채취하여 AKT, MAPK (ERK, p38, JNK), IκBα의 인산화 형태와 전체 IκBα를 IB를 통해 확인한 결과이다.
도 9는 LPS 자극 하에서 SNX9와 p47phox의 상호작용과 Tat-rRv3364c (12-17 a.a) 펩타이드가 엔도솜 내의 ROS 생성을 억제함을 확인한 결과이다. 구체적으로 (A)는 BMDM과 THP-1을 TAt-Rv3364c 펩타이드 (12WLVSKF17) (1, 5, 10μM)로 1시간 동안 전처리하고 100ng/ml LPS 또는 30분으로 자극한 후 αSNX9로 IP를 수행한 후 αp47phox로 IB를 진행한 결과와(위) NADPH 산화효소의 활성을 확인한 결과이다(아래). (B)는 BMDM을 TAT-Rv3364c 펩타이드 (12WLVSKF17) (1, 5, 10μM)로 1시간 동안 전처리하고, 100ng/ml LPS 또는 30분으로 자극한 후, αSNX9로 IP를 수행한 후, αp22phox, αp67phox, αp91phox와 함께 IB를 수행한 결과이다. WCL는 αp22phox, αp67phox, αp91phox 또는 αActin와 함께 IB에 사용하였다.
도 10는 엔도솜의 구획을 sucrose flotation gradient assay으로 원심분리 및 정제하고 면역형광현미경 단계를 수행하여 엔도솜 내의 SNX9의 이동을 추적하고 엔도솜 내에서 신호전달 및 분자의 동적을 관찰한 결과이다.
구체적으로, 도 10a의 위는 엔도솜 sucrose flotation gradient assay을 사용하여 SNX9+/+ 또는 SNX9-/- 쥐의 BMDM의 동등한 부피 분량을 각 구배 구획에서 SDS-PAGE로 분리하고 IB를 통해 조사한 결과이다: Rab5와 EEA1 (EE 마커), Rab7 (LE 마커), LAMP1 (LE 및 리소솜 마커), Histone H3 (핵 마커). 도 10a의 아래는 Tat-Rv3364c 펩타이드 (12WLVSKF17) (5μM)로 1시간 동안 전처리하고 100ng/ml LPS로 30분 동안 자극한 Raw 264.7 또는 BMDM을 SNX9 (Alexa Fluor 488) 또는 p47phox (Alexa Fluor 568)에 대한 항체로 면역염색한 결과이다. 도면의 눈금막대는 10 μm를 표시한다.
도 10b는 SNX9+/+ 또는 SNX9-/- 마우스의 BMDM에서 sucrose flotation gradient을 사용하여 엔도솜 막 분포를 분석한 결과로, 동등 부피 분량을 각 구배 구획에서 SDS-PAGE로 분리하고 IB를 통해 조사했다: Rab5와 EEA1 (EE 마커), Rab7 (LE 마커), LAMP1 (LE 및 리소솜 마커), Histone H3 (핵 마커).
도 10c는 TAT-Rv3364c 펩타이드 (12WLVSKF17) (5μM)로 1시간 동안 전처리하고 100ng/ml LPS로 30분 동안 자극한 Raw264.7 또는 BMDM을 SNX9(Alexa Fluor 488) 또는 p47phox(Alexa Fluor 568)에 대한 항체로 면역염색한 결과이다. 도면의 눈금막대는 10 μm를 표시한다.
도 11의 (A)는 p47phox 도메인 구조의 개략과(위) p47phox와 Myc-SNX9 및 p47phox의 각 도메인을 293T 세포에 공동 형질감염하고, αV5 또는 αMyc으로 IP를 수행한 후 αMyc, αV5 또는 αactin와 함께 IB를 수행한 결과이다. (B)는 p47phox와 Myc-SNX9 및 p47phox의 각 도메인을 293T 세포에 공동 형질감염하고, αV5 또는 αMyc으로 IP를 수행한 후 αMyc, αV5 또는 αactin와 함께 IB를 수행한 결과이다.
도 12는 293T 세포에 V5-p47phox와 Myc-SNX9을 Flag-Rv3364c (1, 5, 10μg)와 함께 12시간동안 공동 감염하고, αMyc (왼쪽) 또는 αV5 (오른쪽)로 IP를 수행한 후, αMyc, αV5, αFlag 또는 αactin과 함께 IB를 수행한 결과이다.
도 13은 rRv3364c에 의해 매개되는 TLR 신호 경로의 조절에 대한 모식도이다. Rv3364c 유래 펩타이드 12WLVSKF17는 SNX9의 BAR 도메인과 직접적으로 상호작용하여 LPS 자극하에 유도되는 초기 엔도솜에서 SNX9와 p47phox의 상호작용을 억제함으로서 ROS 생성과 염증성 사이토카인의 발현 수준을 감소시킬 수 있다.
도 14a는 Rv3364c 유래 펩타이드 모사의 화합물 스크리닝을 위한 플로우 차트(flow chart)이다.
도 14b는 Rv3364c 유래 펩타이드에 대한 Pharmacophore mapping이다. hydrogen bond acceptor (HBA)은 녹색, hydrogen bond donor (HBD)은 보라색, 고리 방향족(ring aromatic: RA)은 주황색, hydrophobic (Hy)은 하늘색으로 표시하였다.
도 14c는 Pharmacophore와 적합점수 방적식이다.
도 14d는 in vitro 스크리닝을 통해 확보한 hit compound의 구조이다.
도 15는 hit compound 2에서 기능성 향상을 위하여 아릴기 4 또는 6-위치에 상이한 치환기를 함유하는 다양한 삼치환 트리아진 유도체 합성의 모식도이다.
도 16은 DATPT가 SNX9-p47phox 상호작용 및 ROS 매개 염증 반응을 억제함을 확인한 도면이다. 구체적으로, (A) 및 (B)는 각각 DMDM 세포 또는 THP-1 세포에 DATPT (1, 5, 10 μM)를 1시간 동안 전처리하고 100 ng/ml LPS로 30분 동안 자극한 후 αSNX9 또는 αp47phox로 IP를 수행한 후 αp47phox 또는 αSNX9로 IB를 수행한 결과이다. (C)는 sucrose flotation gradient을 사용하여 엔도솜 막 분포를 분석한 결과로, 동등 부피 분량을 각 구배 구획에서 SDS-PAGE로 분리하고 IB를 통해 조사했다: Rab5와 EEA1 (EE 마커), Rab7 (LE 마커), LAMP1 (LE 및 리소솜 마커), Histone H3 (핵 마커). (D)는 DAPTP로 1시간 동안 전처리한 BMDMs 및 THP-1 세포를 100 ng/ml LPS로 30분 또는 18시간 동안 자극한 뒤 NADPH 산화효소의 활성을 확인한 결과이고, (E)는 ELISA를 통해 TNF-α 및 IL-6의 수준을 측정한 결과이다. (F)는 DATPT와 함께 배양한 BMDM 세포의 시간 경과에 따른 생존율과(왼쪽) 상기 세포에서 SNX9 및 p47phox의 발현 수준을 확인한 결과이다(오른쪽).
도 17은 CLP 유도의 다균성 패혈증 유도 동물모델에서 DATPT 투여에 따른 효과를 확인한 것이다.
도 17a는 DATPT 농도를 달리하여 투여한 CLP 유도 패혈증 동물모델의 10일 동안의 생존율을 모니터링한 결과이고, 도 17b는 Tat-Rv3364c 펩타이드를 투여한 CLP 유도 패혈증 동물모델의 10일 동안의 생존율을 모니터링한 결과이다. 각 그룹은 n=20이고, 각 데이터는 2개의 독립적 실험 결과의 평균값을 나타낸다.
도 17c는 CLP 유도 패혈증 동물모델에 DATPT를 투여하고 30시간 경과 후 혈청 내 사이토카인 수준을 측정한 결과이고, 도 17d는 비장, 간, 및 폐 조직의 H&E(hematoxylin and eosin) 염색 결과와 조직학적 점수를 비교한 그래프이다(n=10). 또한, 도 17e는 비장세포(splenocytes)에서 αSNX9 또는 αp47phox로 IP를 수행한 후 αp47phox 또는 αSNX9로 IB를 수행한 결과이다.
도 17f는 CLP 유도 패혈증 모델에서 0, 6, 12, 24, 48, 72 및 96시간 간격으로 FL-DATPT(DATPT/Cy5.5)을 복강 투여하고 IVIS spectrum-chromatography CT 시스템을 이용한 생체 내 이미지이다.
도 17g는 FL-DATPT을 처리한 CLP 유도 패혈증 모델에서 FACS 분석을 통해 F4/80+ 및 CD68+ 대식세포와 CD3+ T 세포 및 CD19+ B 세포의 위치를 확인하고 비장 및 폐의 대식세포에 우선적으로 DATPT가 작용함을 확인한 결과이다.
도 18은 DATPT의 살균 활성을 확인한 것으로서, (A)는 CLP 유도 패혈증 모델에 DATPT 투여 30 시간 경과 후 박테리아 콜로니 수를 확인한 것이고(n=10), (B)는 박테리아를 37℃에서 DATPT (1, 10, 50 μg/ml)을 포함하는 LB 배지에 배양하고 OD600를 측정한 결과이며, (C)는 DATPT를 처리 20시간 후 박테리아 세포 내 및 세포 외 ATP 수준을 측정한 결과이다.
본 발명자들은 숙주의 방어 매커니즘 작용을 방해하는 결핵균의 효과 단백질(effector protein)을 발견하고, 숙주 세포 내에서 결핵균 유래 단백질의 분자적 작용을 확인하였다. 예를들어, Rv2626c는 TRAF6(TNF Receptor-Associated Factor 6)의 RING 도메인(N-말단)과 직접적으로 결합하여 TRAF6의 라이신63-유비퀴틴화를 방지함으로써 TLR4 면역 반응을 억제하는 것을 확인하였다. 재조합 Rv2626c-CA 펩타이드는 CLP 유도 패혈증 마우스 모델에서 유의한 치료 효과를 나타내었다. 또한, 결핵균의 분비단백질인 MPT63이 TBK1 및 p47phox와 상호작용하고 MPT64가 TBK1 및 HK2와 상호작용을 확인하고 상기 각 분비단백질의 상호작용 모티프(motif)를 조합한 재조합 MPT 단백질을 제조하여 대식세포 내에서 시험관 내 및 생체 내 결핵균의 수 감소를 촉진함을 확인하였다.
본 출원발명은 이전 연구의 계속으로 결핵균 유래의 Rv3364c 단백질의 숙주세포 내 분자와의 상호작용을 확인하고, 숙주의 방어 매커니즘 작용에 방해 기작을 파악하여 이를 역으로 이용하여 Rv3364c 유래의 펩타이드를 패혈증 치료 용도에 제공하는 것이다.
먼저 본 발명자들은 Rv3364c가 숙주세포에서 상호작용하는 인자를 확인하기 위하여 무세포 시스템에서 단백질과 상호작용 여부를 맞춤형 단백질 결합 분석을 통해 확인하고 Rv3364c와 상호작용할 것으로 예측되는 118개 후보 단백질을 선정하였으며, 각 후보 단백질과 Rv3364c의 친화력(affinity)을 확인하여 SNX9 (sorting nexin 9), YEATS4 (YEATS domain-containing protein 4), ZBTB46 (zinc finger and BTB domain-containing 46), 및 EGFLAM (EGF-like Fibronectin type III and Laminin G domains)의 총 4 종의 단백질을 선별하였다. 이어서, 생체 내에서도 상호작용하는지 확인하기 위하여 세포 내에서 공동면역침강법을 수행하여 상기 4종 단백질과 Rv3364c의 상호작용을 확인한 결과 최종적으로 SNX9 및 YEATS4을 선별할 수 있었다(실험결과 1).
SNX9은 지질 이중층과 결합하여 세포 내 이입 (endocytosis)에 중요한 역할을 수행하며 박테리아 감염과 염증 반응에 중요한 신호전달 인자로 기능한다. 본 발명자들은 SNX9 결합에 관여하는 Rv3364c의 모티프(motif)를 탐색하고자 Rv3364c를 10개 아미노산을 갖는 펩타이드로 조각하여 각 펩타이드의 N-말단에 세포 투과를 위한 HIV-1 Tat 단백질의 세포투과 도메인, 즉 트랜스덕션 도메인을 융합하여 총 13종의 Tat-Rv3364c 펩타이드를 제작하고 SNX9와 상호작용을 관찰하였다. 그 결과 Tat-Rv3364c (11DWLVSKFARE20) 펩타이드가 SNX9와 Rv3364c의 결합을 차단하였는바, Rv3364c의 11-20 a.a가 SNX9와 결합에 관여하는 영역임을 확인하였으며, 그 중에서도 특히 Rv3364c의 12-17 a.a 영역이 SNX9와의 상호작용에 필수적인 영역임을 확인하였다(실험결과 2).
이어서, 본 발명자들은 Tat-Rv3364c (12WLVSKF17) 펩타이드가 SNX9와의 상호작용을 통해 숙주세포 내의 면역반응에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. rRv3364c가 대식세포에서 TLR4 매개 염증반응을 유도하는 것과 달리 Tat-Rv3364c (12WLVSKF17) 펩타이드는 TLR4 매개의 염증반응을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 Tat-WLVSKF는 TLR4 리간드 유도의 PI3K, MAPK, 및 NF-?B 신호 경로를 차단하는 음성 조절제(negative modulator)로 기능함을 확인하였다(실험결과 3).
나아가, 본 발명자들은 세포 내 이입(endocytosis)에 관여하는 SNX9의 기능으로부터 엔도솜에서 Tat-WLVSKF의 작용을 확인하고자 하였다. LPS 자극 하에서 SNX9는 초기 엔도솜에서 p47phox과 상호작용하여 ROS 생성 및 염증반응을 유도한다. 한편, Tat-WLVSKF은 초기 엔도솜에서 SNX9와 p47phox의 결합을 차단하여 ROS 생성 및 염증반응을 억제함을 확인하였다(실험결과 4).
본 발명자들은 결핵균의 Rv3364c 단백질이 SNX9와 상호작용하는 모티프를 이용하여 SNX9 이후에 TLR4 매개 염증반응을 차단할 수 있음을 확인하고, 상기 SNX9와 상호작용하는 Rv3364c의 영역 (12-17 a.a.)으로 이루어지거나 이를 포함하는 펩타이드를 패혈증 치료 용도로 제공하고자 한다.
본 발명에서 패혈증 치료 용도로 제공하는 Rv3364c 유래 펩타이드는 Rv3364c 단백질의 12-17 아미노산 영역을 포함하고, 소수성 무극성 곁사슬을 가진 W12와 F17 아미노산의 기능적 성질에 영향을 미치지 아니한다면 그 N-말단 및/또는 C-말단에 추가의 아미노산을 하나 또는 2 이상 포함할 수 있으며, 상기 Rv3364c 단백질의 12-17 아미노산 영역을 포함하는 펩타이드는 Rv3364 단백질을 조각내어 획득하거나 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 유전공학적 방법 등에 의해 제조할 수 있다.
본 명세서에서 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단의 순서로 나열되어 있으며, 본 발명의 SNX9와 상호작용하는 Rv3364c 유래 펩타이드를 구성하는 아미노산은 각각 독립적으로 L-형태 또는 D-형태일 수 있으며, 각 아미노산은 아미노산 유사체, 방사선 라벨링 아미노산, 또는 형광 태그 아미노산일 수 있다.
또한, 본 발명의 Rv3364c 유래 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 아미노(N-) 말단 또는 카르복시(C-) 말단의 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체 내 투여 시의 증가된 반감기를 가질 수 있다.
한편, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드는 세포 투과성을 높이기 위하여 상술한 Rv3364c 유래 펩타이드의 N-말단에 세포투과 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPP)는 HIV-TAT (서열번호 15), TAT (서열번호 16), dNP2 (서열번호 17), VP22 (서열번호 18), MPG (서열번호 19), PEP-1 (서열번호 20), EB1 (서열번호 21), transportan (서열번호 22), p-Antp (서열번호 23), hCT(18-32)(서열번호 24), KLA (서열번호 25) 및 올리고아르기닌 (서열번호 26)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 HIV-TAT 서열(GRKKRRQRRRPG; 서열번호 15)이 사용될 수 있다. 상기 HIV-TAT 서열은 인간 면역결핍 바이러스-1 (Human immunodeficiency virus-1)에서 유래한 서열로 양전하를 갖는 아미노산이 높은 빈도로 존재한다.
또한, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드의 아미노 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 보호기가 결합될 수 있으며, 펩타이드의 카르복시 말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH2), 아자이드(-NHNH2) 등으로 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드의 말단 또는 아미노산의 R-잔기(R-group)에 지방산(fatty acids), 당사슬(oligosaccharides chains), 모든 나노입자(골드입자, 리포솜, 헤파린, 하이드로젤 등), 아미노산, 담체 단백질(carrier proteins) 등을 결합할 수 있다. 상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 역가(potency)와 안정성을 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 생체 내(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(상온, 냉장, 냉동 보관 시 저장 안정성 포함)도 의미한다.
본 발명은 SNX9와 상호작용하는 Rv3364c 영역(12-17a.a)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 패혈증 치료용 펩타이드를 제공한다.
펩타이드 아날로그의 치료제는 생체 내에서 효소에 의한 분해와 짧은 반감기가 문제이다. 이에, 본 발명자들은 상기 Rv3364c 유래 펩타이드를 기반으로 동일한 기능을 갖는 소분자를 개발하고자 상기 펩타이드의 알파-헬릭스 2차 구조를 기초로 가상 스크리닝 결과 182개 화합물을 선별하고, 상기 화합물의 생물학적 테스트를 통해 TNF-α와 IL-6 억제 활성이 높은 트리아진 유도체(hit compound 2)를 선정하였다(실험결과 5).
이어서, 본 발명자들은 선정된 트리아진 유도체의 기능성을 향상시키기 위하여 다양한 유도체를 합성하고 이의 사이토카인 생성 억제율과 ROS 생성에 기여하는 NADPH 산화 효소 억제율을 확인하였다. 그 결과, 합성된 트리아진 유도체는 모두 TNF-α와 IL-6의 생성 억제 효과를 나타내었으나, 특히 화합물 8g에서 현저하게 우수한 사이토카인 생성 억제 효과와 NADPH 산화효소 억제 활성을 확인하였다(실험결과 6). 사이토카인 생성 및 NADPH 산화효소 억제 활성이 가장 높은 화합물 8g는 DATPT로 명명하였다.
이어서, 본 발명자들은 DATPT가 Rv3364c 유래 펩타이드와 유사한 생물학적 약리 프로파일을 갖는지 확인한 결과, DATPT는 Rv3364c 유래 펩타이드와 동일하게 용량 의존적으로 초기 엔도솜에서 p47phox와 SNX9의 상호작용을 현저하게 감소시켰을 뿐만 아니라, 상기 펩타이드보다 500배 낮은 농도에서 이와 동일한 효과를 나타내었다(실험결과 7).
나아가, DATPT는 체내에서 높은 안정성을 갖고 복강 내 투여한 마우스에의 혈액 내에서 안정적으로 유지되었는바, 약물로서 적절한 시험관내 안정성 및 PK 특성을 가짐을 알 수 있었다(실험결과 8).
본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 DATPT가 CLP로 유도한 패혈증 동물모델에서 효과적으로 염증성 및 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하여 마우스의 생존율을 증가시킴을 확인하였으며, DATPT는 Rv3364c 유패 펩타이드보다 약 2,000배 우수한 효과를 나타내었다. 또한, DATPT는 특히 대식세포에 우선적으로 작용하며 72시간 동안 체내에서 유지됨을 확인하였다(실험결과 9). 또한, DATPT를 투여한 CLP 유도 패혈증 마우스는 혈액 및 복막액에서 박테리아 콜로니 수가 현저하게 감소하였으며, 이는 DATPT 자체의 살균 활성에 의한 것임을 확인하였다(실험결과 10).
이에, 본 발명자들은 SNX9와 상호작용하는 Rv3364c 유래 펩타이드 모사의 하기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체를 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00015
상기 화학식 1에서
R1은 H, F, Cl, OCH3, CF3, CH3, 또는 t-Bu이고,
R2는
Figure pat00016
,
Figure pat00017
,
Figure pat00018
,
Figure pat00019
,
Figure pat00020
,
Figure pat00021
,
Figure pat00022
,
Figure pat00023
,
Figure pat00024
,
Figure pat00025
,
Figure pat00026
, 또는
Figure pat00027
이다.
본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드 및/또는 신규 트리아진 유도체는 임상 투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드를 의약품으로 사용하는 경우, 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
즉, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드 및/또는 신규 트리아진 유도체는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드 및/또는 신규 트리아진 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합되어 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드 및/또는 신규 트리아진 유도체는 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여(single dose)로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여(multiple dose)에 의해 장기간 투여될 수 있다. 상기 투여 형태, 기간은 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 패혈증 치료용 펩타이드 및/또는 신규 트리아진 유도체는 패혈증 치료 효과가 우수하므로 패혈증 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 상기 패혈증 치료용 펩타이드 및/또는 신규 트리아진 유도체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있으며, 상기 상기 개체는 패혈증을 유발하는 원인균에 감염되거나 감염이 의심되는 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간 또는 가축일 수 있다.
상기 패혈증 치료용 약학적 조성물은 이미 설명한 패혈증 치료용 펩타이드 및/또는 트리아진 유도체를 유효성분으로 포함하므로 중복되는 내용은 기재를 생략한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 펩타이드, 트리아진 유도체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 투여로 패혈증의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, "유효 성분으로 함유"라는 용어는 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량과 횟수는 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
따라서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 펩타이드 및/또는 트리아진 유도체가 유효 성분으로 함유되는 한, 약학적으로 허용 가능한 다양한 담체를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여용의 경우에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있고, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여용의 경우에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수도 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 패혈증 치료용 펩타이드 및/또는 트리아진 유도체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 상기 패혈증 치료용 펩타이드 및/또는 트리아진 유도체를 사용하므로 이 둘 사이에 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서 상기 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 유효성분인 패혈증 치료용 펩타이드 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에서는 아미노산 서열을 IUPAC-IUB 명명법에 따라 아래와 같이 약어로 기재하였다.
아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 글루타민(Gln, Q), 아스파라진(Asp, N), 메티오닌(Met, M), 루신(Leu, L), 이소루신(Ile, I), 발린(Val, V), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 시스테인(Cys, C), 아스파르트산(Asp, D) 글루탐산(Glu, E), 노르루신(Nle)
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실험 방법 및 재료]
1. 마우스 및 세포 배양
야생형 C57BL/6 마우스를 샘타코 바이오 코리아(경기도, 대한민국)로부터 구입하였다. 1차 골수-유래 대식세포(primary bone marrow-derived macrophages, BMDMs)는 C57BL/6 마우스로부터 분리하여 M-CSF (R&D Systems, 416-ML)가 첨가된 DMEM에서 3일 내지 5일 동안 배양하였다. C57BL/6 마우스의 BMDM 세포(TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/-, TRIF-/-, IRAK1-/-, TRAF6-/-, 및 TBK1-/-)는 이철호 박사님(Laboratory Animal Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology; 대전, 대한민국)로부터 제공받았으며, SNX9-/- C57BL/6 쥐는 Zhigang Xu 박사님(Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cells and Developmental Biology, Shandong University, Jinan, P.R. China)으로부터 제공받아 실험을 진행하였다.
10% FBS (Gibco), 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 비필수 아미노산(nonessential amino acids), 페니실린 G(penicillin G) (100IU/ml), 스트렙토마이신(streptomycin) (100IU/ml)을 함유한 DMEM에 HEK293T (ATCC-11268; American Type Culture Collection) 및 RAW264.7 (ATCC TIB-71)을 배양하였다. 인간 단핵구 THP-1(ATCC TIB-202) 세포는 10% FBS로 보충된 RPMI 1640/글루타맥스(glutamax)에서 배양시키고, 24시간 동안 20nM PMA (Sigma-Aldrich)로 처리하여 대식세포로 분화를 유도한 후 PBS로 3회 세척하였다. 제조사의 지침에 따라 293T에서 인산칼슘(Clontech)을 사용하여 일시적 형질감염(transient transfection)을 수행하였다.
2. 재조합 단백질 제작
재조합 Rv3364c(rRv3364c) 단백질을 제조하기 위하여 MTB H37Rv 균주 Rv3364c (GenBank accession no. NP_217881) 염기서열을 제조사에서 권장하는 프로토콜에 따라 N-말단 6xHis 태그를 사용하여 pRSFDuet-1 벡터(Novagen)에 클로닝하고 대장균 BL21(DE3)pLysS 균주에서 발현 유도, 수확, 및 정제하였다. 정제한 rRv3364c를 투과성 셀룰로오스 막으로 투석하고 Limulus amebocyte lysate assay (BioWhittaker)로 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS) 오염을 테스트하였다. 이하 실험은 rRv3364c 및 돌연변이 단백질을 20 pg/ml 이하 농도로 함유하였다. 정제된 rRv3364c (13kDa)는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 면역블롯팅을 통해 검증하여 사용하였으며, 대식세포에서 유의한 rRv3364c 유도 세포독성은 관찰되지 않았다.
3. 시약 및 항체
LPS (Escherichia coli O111:B4)는 Invivogen으로부터 구입하였다. phospho-(Ser473)-AKT, phospho-(Thr202/Tyr204)-p42/44, phospho-(Thr180/Tyr182)-p38, phospho-(Thr183/Tyr185)-SAPK/JNK, 및 phospho-(Ser32/36)-I
Figure pat00028
B-α 특이적 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다. SNX9 (ab181856), YEATS4, (ab50963), ZBTB46 (ab277100), 및 EGFLAM (ab101398) 특이적 항체는 Abcam plc에서 구입하였다. I
Figure pat00029
B-α (C-21), p22phox (FL-195), gp91phox (H-60), p47phox (H-195), p67phox (H-300), Lamin B1 (B-10), Tubulin (5F131), CD68 (KP1), F4/80 (BM8), CD3 (PC3/188A), CD19 (SJ25-C1), His (His17), Flag (D-8), V5(H-9), Myc (9E10), 및 Actin (I-19)에 특이적인 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다.
4. 플라스미드 설계
SNX9, YEATS4, ZBTB46, 및 EGFLAM 플라스미드는 Addgene에서 구입하였다. 전장(full-length) p47phox와 이의 돌연변이를 암호화하는 플라스미드는 이전의 연구와 동일하게 제작하였다(Biomaterials 2016, 89, 1-13). SNX9의 서로 다른 영역(1-595, 1-250, 250-361, 및 392-595)을 클로닝한 플라스미드는 전장 SNX9 cDNA으로부터 각 영역을 PCR로 증폭하여 pEF-IRES-Puro 발현 백터의 BamHI 및 NotI 영역 사이에 서브클로닝하여 제작하였다. 모든 플라스미드의 염기서열은 ABI PRISM 377 automatic DNA sequencer를 이용하여 확인하였다.
5. 펩타이드
Tat-결합 Rv3364c 펩타이드는 세포에서 비정상적인 반응을 피하기 위해 Peptron(대한민국)에서 합성하여 아세테이트 염 형태로 정제하였다. 각 펩타이드의 아미노산 서열은 표 1에 기재하였다. Limulus amebocyte lysate assay (BioWhitaker)을 이용하여 내독소 함량을 측정하였으며, 이하 실험에서 이용된 펩타이드는 3-5 pg/㎖ 농도로 포함되어 있다.
Rv3364c 펩타이드 아미노산 서열 서열번호
Rv3364c(1-10 aa) MKARLPDSPL 1
Rv3364c(11-20 aa) DWLVSKFARE 2
Rv3364c(21-30 aa) VPGVAHALLV 3
Rv3364c(31-40 aa) SVDGLPVAAS 4
Rv3364c(41-50 aa) EHLPRERADQ 5
Rv3364c(51-60 aa) LAAVTSGLAS 6
Rv3364c(61-70 aa) LAGGAAQLFD 7
Rv3364c(71-80 aa) GGQVLQSVVE 8
Rv3364c(81-90 aa) MQNGYLLLMQ 9
Rv3364c(91-100 aa) VGDGSALAAL 10
Rv3364c(101-110 aa) AATGCDIGQI 11
Rv3364c(111-120 aa) GYEMAILVER 12
Rv3364c(121-130 aa) VGGVVQSCRR 13
6. HuProt?? 마이크로어레이를 이용하여 rRv3364c 결합 단백질의 식별
rRv3364c와 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 20,000개 이상의 전장 재조합 인간 단백질을 포함하는 human protein microarrays (CDI Labs, USA)를 이용하였다. 구체적으로 단백질 마이크로어레이는 차단 완충액 (2% BSA in PBS, 0.1% in 20)으로 2시간 동안 처리하였다. 3μg의 바이오티닐레이드(biotinylated)를 4℃에서 8시간 동안 상기 마이크로어레이에 처리하였다. 이어서, 각 어레이를 4℃에서 1시간 동안 1μg의 스트렙트아비딘 형광 Alexa Fluor 532nm로 처리하였다. 마이크로어레이 결과는 GenePix 4100A 마이크로어레이 레이저 스캐너 (Molecular Devices, USA)를 이용하여 검출하였다.
7. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
제조업체의 권장 프로토콜에 따라서 BD OptEIA ELISA set(BD Pharmingen)을 이용하여 세포 배양 상층액 및 취 혈청에서 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-18, IL-12p40 및 IL-10)을 측정하였다. 모든 실험은
8. CLP 유도 패혈증 동물 제작 및 박테리아 계수
6주령의 C57BL/6 암컷 마우스(Samtako Bio, 경기도, 한국)에 맹장 결찰 및 천자(Cecal ligation and puncture, CLP)를 수행하였다. 구체적으로, 마우스를 펜토탈 나트륨(pentothal sodium) (50 ㎎/㎏, i.p.)으로 마취시키고, 작은 복부 중간선 절개를 수행하여 맹장을 노출시켰다. 그런 다음 맹장을 회맹판(ileocecal valve) 아래에 연결하고 22-게이지 바늘로 표면을 두 번 뚫고 복부를 봉합하였다. 마우스의 생존율은 10일 동안 매일 확인하였다. CLP 수행 후 12시간 및 24시간 후 마우스에 PBS, 진통제 (1.5 mg/kg nalbuphine; Sigma-Aldrich), 및 항생제 칵테일을 복강주사하였다. 상기 항생제 칵테일은 100 μl PBS에 세프트리악손(ceftriaxone) (25 mg/kg; Sigma-Aldrich) 및 메트로니다졸(metronidazole) (12.5 mg/kg; Sigma-Aldrich)을 포함한다. 대조군(Sham)으로는 결찰 및 구멍을 뚫지 않고 맹장 노출 수술만 수행한 마우스를 이용하였다.
박테리아 수는 다음과 같이 확인하였다. CLP 수행 후 정해진 시간에 마우스의 심장 구멍 또는 복막 세첵액으로 혈액을 수집하고, 수집한 혈액을 연속 희석하였다. 이후 각 희석액 5μl를 혈액 한천 플레이트(blood agar plate)에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 박테리아 수는 전체 복막 세척액 또는 혈액 당 콜로니 형성 단위(colony-forming units: CFU)를 계수하는 것으로 계산하였다.
모든 동물은 병원체가 없는 환경에서 사육하였으며, 모든 실험절차는 한양대학교 동물모호 및 이용위원회(protocol 2020-0060)의 검토 및 승인하에 수행하였다. CLP 수행 이후 진통제, 항생제, 및 수액의 투여는 "Minimum Quality Threshold in Pre-Clinical Sepsis Studies"에 정의된 국제지침에 따라 수행하였다.
9. 조직학적 분석
조직 분석을 위해 마우스의 비장, 간 및 폐를 10% 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 넣어두었다. 파라핀 섹션(4 ㎛)을 절단하고, 헤마토자일린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 조직병리학적 점수(0 내지 4)는 치료군에 대한 사전 지식 없이 조직 내 염증 세포의 수와 분포 및 염증의 중증도에 기초하여 병리학자가 각 장기 섹션을 독립적으로 채점하였다.
10. 생체 내 이미지
DATPT에 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합된 Cy5.5 염료를 첨가하여 FL-DATPT을 제조하였다. CLP 마우스에 FL-DATPT 복강투여(i.p)하였다. FL-DATPT 투여 후 마우스를 서로 다른 시점에 희생시키고 주요 장기를 절제한 후 IVIS Spectrum-CT in vivo imaging system (PerkinElmer, Inc.)을 이용하여 이미지화하여 조직내의 생체 분포를 관찰하였다.
11. 삼치환 트라아진 유도체 합성
11-1. General procedures
모든 반응은 질소 분위기에서 오븐 건조된 유리용기에서 수행되었다. 시판되는 모든 시약은 추가 정제 없이 구입하여 사용했다. 용매 및 기체를 표준 절차에 따라 건조시켰다. 회전 증발기를 사용하여 감압하에 유기 용매를 증발시켰다. 반응 후 실리카겔(0.25mm)로 미리 코팅된 유리판을 사용하여 TLC(Analytical thin layer chromatography) 분석을 수행했다. TLC 플레이트는 UV 광선(UV)에 노출시켜 가시화한 다음 KMnO4 또는 p-anisaldehyde 염색 후 핫 플레이트에서 잠시 가열하여 가시화하였다. 표시된 용매와 함께 실리카겔 60(230-400 메쉬, Merck)을 사용하여 플래시 컬럼 크로마토그래피를 수행했다. 1H 및 13C 스펙트럼은 Bruker 400 NMR 분광계에서 기록하였다. 1H NMR 스펙트럼은 화학적 이동, 다중도(s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선, m = 다중선), 통합 및 커플링 상수(J)(헤르츠(Hz))로 표시하였다. 1H NMR 화학적 이동은 CDCl3(7.26ppm) 또는 MeOH-d4(3.31ppm)에 대해 보고된다. 13C NMR은 CDCl3(77.0ppm) 또는 MeOH-d4(49.0ppm)의 중심선에 대해 기록되었다. HPLC 순도 분석은 UV 검출기가 254 및 280 nm로 설정된 Themo Dionex Ultimate 3000 시스템에서 수행하였다. 샘플을 25.8℃로 유지된 YMC-Triart 4.6 x 250mm, 5.0μm, C18 컬럼에 주입(10μL)했습니다. 30분 내에 30% B(MeCN)의 등용매 용리액을 추가로 5분 동안 펌핑한 후 A가 0.1% TFA가 포함된 H2O 또는 H2O인 상태에서 30% B를 펌핑했다(Method A). 30분 내에 50% B의 등용매 용리액은 A가 단지 H2O인 상태에서 또 다른 5분 동안 50% B를 펌핑했다(Method B). 유속은 1.0mL/분이었다.
11-1-1. tert-Butyl (2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (4).
2,2'-(ethylenedioxy) bis(ethylamine) (1.015 g, 6.848 mmol)을 교반 막대가 장착된 250mL 둥근 바닥 플라스크에서 무수 CH2Cl2 (34 mL)에 용해시켰다. 별도의 di-tert-butyl dicarbonate (0.393 mL, 1.712 mmol)를 무수 CH2Cl2 (34 mL)에 용해시켰다. 후자의 용액을 250mL 플라스크에 적가하고 실온에서 밤새 반응하도록 두었다. 이를 포화 수성 NaHCO3로켄칭하고 CH2Cl2 (3 x 50 mL)로 추출하였다. 혼합 유기상 무수 MgSO4로 건조하고 진공상태에서 농축하여 표적 화합물(0.42 g, 99%)을 무색 오일로 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.13 (br s, 1H, NH), 3.63-3.49 (m, 8H), 3.31 (q, J = 4.9 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H).
11-1-2. tert-Butyl (2-(2-(2-((4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carba mate (5).
Cyanuric chloride 3 (245 mg, 1.33 mmol)을 0 ℃에서 무수 THF (6.51 mL)에 용해시키고 N,N-diisopropylethylamine (464 μL, 2.67 mmol)을 반응 용액에 첨가하였다 tert-Butyl(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate 4 (364 mg, 1.46 mmol)를 무수 THF (6.5 mL)에 용해시키고 혼합물에 천천히 첨가하였다. 반응 용액을 0 ℃에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 이를 포화 수성 NaHCO3로 켄칭하고 EtOAc (3 x 50 mL)로 추출하였다. 유기상을 무수 MgSO4로 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 조생성물(crude product)은 실리카 크로마토그래피(EtOAc:n-hexane = 3:2)로 정제하여 표적 화합물 5(490 mg, 91%)을 황색 점성 오일 형태로 수득하였다
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.67 (s, 4H), 3.66--3.62 (m, 4H), 3.59-3.52 (m, 2H), 3.34 (m, 2H), 1.43 (s, 9H).
11-1-3. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-chloro-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (6).
tert-butyl (2-(2-(2-((4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl) carbamate 5 (380 mg, 0.96 mmol)이 포함된 무수 THF (47.90 mL) 용액에 TEA (147 μL, 1.05 mmol)을 첨가하였다. Tetrahydrofurfurylamine (104 μL, 1.05 mmol)을 혼합물에 천천히 첨가하엿다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 2시간 동안 교반하였다. 조생성물을 실리카겔 실리카겔 상에서 플래시 크로마토그래피 (EtOAc:n-hexane = 3:1)로 정제하여 표적 화합물 6을 백색 고체 형태로 수득하였다 (337 mg, 76%).
1H-NMR (a mixture of tautomers, 400 MHz, CDCl3) δ 4.06 (m, 1H), 3.86 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.74 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.66-3.29 (m, 12H), 3.22 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.03-1.85 (m, 3H), 1.64 (m, 1H), 1.43 (s, 9H). 13C-NMR (a mixture of tautomers, 100 MHz, MeOH-d 4) δ 170.1, 169.4, 167.1, 166.9, 158.3, 79.9, 78.9, 78.7, 78.6, 71.3, 71.2, 71.0, 70.6, 70.3, 69.0, 41.5, 41.4, 41.3, 41.2, 29.8, 28.8, 26.5.
11-2. Boc-protected aminotriazines 합성 (화합물 7a-g).
11-2-1. tert-Butyl(2-(2-(2-((4-phenyl-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (7a).
tert-butyl (2-(2-(2-((4-chloro-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy) ethyl)carbamate 6 (41 mg, 0.08 mmol)을 포함하는 toluene/H2O/ethanol (1.4 mL, 5:1:1) 용액에 4-tert-butylphenylboronic acid (20 mg, 0.17 mmol) 및 Na2CO3 (35 mg, 0.33 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 아르곤(argon)으로 버블링하였다. Tetrakis(triphenylphosphine) palladium (95 mg, 0.08 mmol)을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 110 ℃에서 밤새 교반하였다. 반응 완료 후 (monitored by TLC), 이를 H2O로 켄칭하고, ethyl acetate (3 x 50 mL)로 추출하고 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4 로 건조시키고 진공상태에서 농축하였다. 조생성물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피 (EtOAc:n-hexane:CHCl3 = 3:1:1)로 정제하여 표적 화합물 2를 황색 점착성 오일 (yellow sticky oil) 형태로 수득하였다 (33 mg, 78%).
1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.32-8.21 (m, 2H), 7.74 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 7.63 Hz, 2H), 4.21-4.12 (m, 1H), 3.93 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 3.82-3.64 (m, 13H), 3.18-3.06 (m, 2H), 2.10-1.91 (m, 3H), 1.77-1.65 (m, 1H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d4) δ 162.4, 135.6, 135.4, 130.6, 130.3, 129.5, 129.3, 78.2, 71.5, 71.4, 69.8, 69.2, 67.9, 46.0, 42.2, 40.7, 29.9, 26.6. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C25H38N6O5: 503.29; found: 503.3.
11-2-2. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-fluorophenyl)-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5 -triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (7b).
Yield: 58%, yellow sticky oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.47-8.23 (m, 2H), 7.15 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 4.11 (s, 1H), 3.88 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.74 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.71-3.60 (m, 9H), 3.50 (t, J = 5.5 Hz, 3H), 3.23 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 2.03-1.83 (m, 3H), 1.70 (m, 1H), 1.41 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d4) δ 269.5, 166.1, 157.0, 140.1, 133.4, 133.2, 130.2, 114.6, 114.4, 78.7, 78.0, 77.7, 69.9, 69.7, 69.4, 67.7, 44.0, 40.0, 39.9, 28.4, 27.4, 25.2. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C25H37FN6O5: 521.28; found: 521.3.
11-2-3. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-chlorophenyl)-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (7c).
Yield: 79%, yellow sticky oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.46-8.19 (m, 2H), 7.44 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.12 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.91 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 3.76 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.73-3.56 (m, 9H), 3.55-3.49 (m, 3H), 3.23 (t, J = 5.5Hz, 2H), 2.08-1.86 (m, 3H), 1.76-1.65 (m, 1H), 1.41 (s, 9H). LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C25H37ClN6O5: 537.25; found: 537.3.
11-2-4. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-6-(4-(trifluoromethyl) phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (7d).
Yield: 80%, yellow sticky oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.52-8.36 (m, 2H), 7.93 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.16 (m, 1H), 3.93 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.87-3.62 (m, 13H), 3.12 (br s, 2H), 2.10-1.93 (m, 3H), 1.77-1.66 (m, 1H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d4) δ 161.6, 138.0, 135.3, 134.6, 130.6, 130.3, 127.1, 126.3, 78.3, 71.8, 71.7, 70.3, 69.5, 68.2, 46.7, 42.8, 41.2, 30.2, 26.9. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C26H37F3N6O5: 571.28; found: 571.3.
11-2-5. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-6-(p-tolyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (7e).
Yield: 60%, yellow sticky oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.30-8.06 (m, 2H), 7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.17-4.06 (m, 1H), 3.95-3.87 (m, 1H), 3.76 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 3.72-3.57 (m, 9H), 3.57-3.48 (m, 3H), 3.23 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.08-1.86 (m, 3H), 1.71 (s, 1H), 1.41 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d4) δ 171.9, 167.6, 167.4, 158.4, 142.8, 135.7, 129.8, 129.3, 80.0, 79.3, 79.1, 71.3, 71.1, 70.7, 69.0, 45.3, 41.4, 41.3, 29.8, 28.8, 26.6, 21.5. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C26H40N6O5: 517.31; found: 517.3.
11-2-6. tert-Butyl(2-(2-(2-((4-(4-methoxyphenyl)-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (7f).
Yield: 75%, yellow sticky oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.26 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 8.8 Hz, 1H) 6.98 (dd, J = 8.8, 8.8 Hz, 2H), 4.17-4.07 (m, 1H), 3.90 (q, J = 6.1 Hz, 1H), 3.87-3.83 (m, 3H), 3.77 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 3.72-3.43 (m, 12H), 3.23 (t, J = 10.7 Hz, 2H), 2.07-1.87 (m, 3H), 1.77-1.60 (m, 1H), 1.41 (s, 9H). LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C26H40N6O6: 533.30; found: 533.3.
11-2-7. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (7g).
Yield: 82%, yellow sticky oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.26-8.08 (m, 2H), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.17-4.07 (m, 1H), 3.91 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 3.76 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.72-3.46 (m, 12H), 3.26-3.19 (m, 2H), 2.08-1.86 (m, 3H), 1.76-1.64 (m, 1H), 1.41 (s, 9H), 1.36 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 172.0, 168.9, 168.6, 167.6, 158.5, 129.2, 126,1, 80.1, 71.3, 71.1, 70.7, 69.0, 45.3, 41.4, 35.7, 31.7, 29.8, 28.7, 26.6. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C29H46N6O5: 559.35; found: 559.4.
11-2-8. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-6-(4-(trifluoromethoxy) phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (2').
Yield: 68%, yellow sticky oil. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.38 (m, 2H), 7.24 (s, 2H), 4.09-3.88 (m, 2H), 3,80-3.56 (m, 13H), 3.35 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 2.06-1.92 (m, 4H), 1.42 (s, 9H).
11-3. Boc-protecting group의 제거 (화합물 8a, 8c, 8d, 및 8e).
11-3-1. 2-(2-(2-((4-Phenyl-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (8a).
아르곤 하에 빙수조로 냉각된 자기 교반 막대가 장착된 10mL 둥근 바닥 플라스크에서 HCl (486 μL, 4 M in dioxane) 용액과 tert-butyl(2-(2-(2-((4-phenyl-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy) ethyl) carb amate (7a) (12.2 mg, 0.023 mmol)이 포함된 MeOH (0.5 mL) 용액을 혼합하였다. 빙수(ice-bath)를 제거하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 계속 교반하였다. 반응 완료 후 (monitored by TLC), 잔류물을 건조 에틸 에테르로 세척하고 수상에서 생성물을 수집하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하여 표적 화합물을 분홍색 염 형태로 수득하였다 (7.9 mg, 74%).
1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.32-8.21 (m, 2H), 7.74 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 7.63 Hz, 2H), 4.21-4.12 (m, 1H), 3.93 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 3.82-3.64 (m, 13H), 3.18-3.06 (m, 2H), 2.10-1.91 (m, 3H), 1.77-1.65 (m, 1H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d4) δ 162.4, 135.6, 135.4, 130.6, 130.3, 129.5, 129.3, 78.2, 71.5, 71.4, 69.8, 69.2, 67.9, 46.0, 42.2, 40.7, 29.9, 26.6. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C20H31N6O3: 403.25; found: 403.2. HPLC: purity 98%, t R = 1.9 min.
11-3-2. 2-(2-(2-((4-(4-Chlorophenyl)-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (8c).
Yield: 23%, pink solid. 1H-NMR (a mixture of tautomers, 400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.43-8.20 (m, 2H), 7.69-7.54 (m, 2H), 4.26-4.11 (m, 1H), 4.01-3.89 (m, 1H), 3.85-3.60 (m, 13H), 3.21-3.07 (m, 2H), 2.10-1.88 (m, 3H), 1.83-1.63 (m, 1H). 13C-NMR (a mixture of tautomers, 100 MHz, MeOH-d4) δ 148.1, 139.0, 135.9, 130.9, 130.8, 129.8, 129.7, 79.0, 71.4, 70.6, 69.1, 67.9, 45.8, 41.6, 40.7, 30.7, 30.5, 29.8, 26.6. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C20H30ClN6O3: 437.21; found: 437.2. HPLC: purity 97%, t R = 9.0 min.
11-3-3. 2-(2-(2-((4-(((Tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-6-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (8d).
Yield: 62%, white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.58-8.37 (m, 2H), 7.71 (s, 2H), 4.16-4.05 (m, 1H), 3.89 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 3.80-3.44 (m, 13H), 3.22 (s, 2H), 2.08-1.85 (m, 3H), 1.74-1.61 (m, 1H), 1.41 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH- d4) δ 161.6, 138.0, 135.3, 134.6, 130.6, 130.3, 127.1, 126.3, 78.3, 71.8, 71.7, 70.3, 69.5, 68.2, 46.7, 42.8, 41.2, 30.2, 26.9. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C21H30F3N6O3: 471.23; found: 471.2. HPLC: purity 100%, t R = 1.6 min.
11-3-4. 2-(2-(2-((4-(((Tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-6-(p-tolyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (8e).
Yield: 99%, pink solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.30-8.06 (m, 2H), 7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.17-4.06 (m, 1H), 3.95-3.87 (m, 1H), 3.76 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 3.72-3.57 (m, 9H), 3.57-3.48 (m, 3H), 3.23 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.08-1.86 (m, 3H), 1.71 (s, 1H), 1.41 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d4) δ 171.9, 167.6, 167.4, 158.4, 142.8, 135.7, 129.8, 129.3, 80.0, 79.3, 79.1, 71.3, 71.1, 70.7, 69.0, 45.3, 41.4, 41.3, 29.8, 28.8, 26.6, 21.5. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C21H33N6O3: 417.26; found: 417.2. HPLC: purity 99%, t R = 2.1 min.
11-3-5. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (8g, DATPT).
Yield: 37%, pink solid. 1H-NMR (a mixture of tautomers, 400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.30-8.16 (m, 2H), 7.51 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.25-4.13 (m, 1H), 3.94 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 3.89-3.60 (m, 13H), 3.16 (t, J = 3.9 Hz, 2H), 2.13-1.93 (m, 3H), 1.80-1.68 (m, 1H), 1.39 (s, 9H). 13C-NMR (a mixture of tautomers, 100 MHz, MeOH-d 4) 161.7, 159.9, 159.6, 129.5, 129.2, 127.3(2 carbons), 78.0, 77.9, 71.4,71.3, 69.8, 69.2, 69.8, 46.5, 46.0, 45.4, 42.5, 42.2, 41.7, 40.8, 36.0, 31.3, 29.8, 29.6, 26.6, 26.5. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C24H39N6O3: 459.31; found: 459.3. HPLC: purity 99%, t R = 3.6 min.
11-4. trazine 합성 (화합물 8b, 8f 및 2).
11-4-1. 2-(2-(2-((4-(((Tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-6-(4-(trifluoromethoxy)phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium trifluoroacetate (2).
tert-butyl (2-(2-(2-((4-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-6-(4-(trifluoro-methoxy)phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (2') (327 mg, 0.559 mmol)이 포함된 CH2Cl2 (5.59 mL) 용액에 trifluoroacetic acid (2.14 ml, 27.9 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 (monitored by TLC), 반응 혼합물을 감압 하에 농축하여 표적화합물 2를 백색 고체 형태로 수득하였다 (309 mg, 98%).
1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) 8.42-8.23 (m, 2H), 7.52 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 4.16 (s, 1H), 3.93 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 3.85-3.60 (m, 13H), 3.13 (s, 2H), 2.08-1.86 (m, 3H), 1.76-1.65 (m, 1H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d4) δ 159.8, 153.2, 130.9, 130.8 (2 carbons), 130.5, 128.1, 76.9, 70.3, 70.2, 68.6, 68.0, 66.7, 45.0, 41.1, 39.6, 28.7, 25.4. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C21H30F3N6O4: 487.23; found: 487.2. HPLC: purity 98%, t R = 8.2 min.
11-4-2. 2-(2-(2-((4-(4-Fluorophenyl)-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium trifluoroacetate (8b).
Yield: quant., white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.36-8.20 (m, 2H), 7.34 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 4.15 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 3.91 (q, J = 8.0 Hz, 1H), 3.86-3.58 (m, 13H), 3.11 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.10-1.89 (m, 3H), 1.77-1.64 (m, 1H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 169.1, 166.6, 161.6, 132.4, 132.3, 117.5, 117.3, 78.2, 71.6, 71.5, 69.9, 69.3, 68.0, 46.2, 42.3, 40.9, 30.0, 26.7. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C20H30FN6O3: 421.24; found: 421.2. HPLC: purity 97%, t R = 2.0 min.
11-4-3. 2-(2-(2-((4-(4-Methoxyphenyl)-6-(((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium trifluoroacetate (8f).
Yield: 45%, white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.15 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.14 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.16 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.92 (m, 4H), 3.85-3.60 (m, 13H), 3.13 (br s, 2H), 2.11-1.92 (m, 3H), 1.68 (m, 1H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 169.3, 166.3, 131.9, 131.6, 122.2, 119.7, 115.7, 78.2, 71.6, 71.5, 70.0, 69.3, 68.0, 56.4, 46.1, 42.2, 40.9, 29.9, 26.7. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C21H33N6O4: 433.26; found: 433.2. HPLC: purity 98%, t R = 3.9 min.
11-5. tert-Butyl(2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-chloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy) ethoxy) ethyl)carbamate (9).
tert-butyl (2-(2-(2-((4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl) carbamate (5) (39.4 mg, 0.10 mmol)이 포함된 toluene/H2O (2.0 mL, 2:1) 용액에 4-tert-butylphenylboronic acid (17.7 mg, 0.10 mmol) 및 Na2CO3 (31.6 mg, 0.30 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 아르곤으로 버블링하였다. Tetrakis(triphenylphosphine)palladium (11 mg, 0.01 mmol)을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 50 ℃에서 밤새 교반하였다. 반응 완료 후 (monitored by TLC), H2O로 켄칭하고, ethyl acetate (3 x 50 mL)로 추출한 후 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4 로 건조하고 감압농축하였다. 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:n-hexane = 1:2)로 정제하여 표적 화합물 9를 황색 점착성 오일 형태로 수득하였다 (32.1 mg, 66%).
1H-NMR (a mixture of tautomers, 400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.29 (dd, J = 13.9 Hz, J = 8.5 Hz, 2H), 7.52 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 3.73 (m, 2H), 3.70-3.58(m, 6H), 3.50 (m, 2H), 3.21 (m, 2H), 1.41(s, 9H), 1.35(d, J = 3.3 Hz, 9H). 13C-NMR (a mixture of tautomers, 100 MHz, MeOH-d 4) δ 173.7, 173.2, 172.1,171.5, 167.8, 167.6, 158.4, 157.7, 157.5, 133.6, 133.4, 129.9, 129.7, 126.6 (2 carbon), 80.0, 71.4, 71.3, 71.1, 70.3, 41.9, 41.7, 41.2, 35.9 (2 carbons), 31.5, 28.7. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C24H37ClN5O4: 494.25; found: 494.2.
11-6. Boc-protected triazines 합성 (화합물 10a-k).
11-6-1. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(benzylamino)-6-(4-(tert-butyl)phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy) ethoxy)ethyl)carbamate (10a).
tert-butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-chloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (9) (21.6 mg, 0.044 mmol)을 포함하는 무수 THF (438 μL) 용액에 TEA (5.0 μL, 0.048 mmol)을 첨가하였다. 혼합물에 Benzylamine (9.6 μL, 0.088 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 60 ℃에서 2시간 동안 교반한 후 이를 H2O로 켄칭하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출 및 염수 세척하였다. 유기상을 무수 MgSO4 로 건조시키고 감압농축하였다. 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:n-hexane = 1:1)로 정제하여 표적 화합물 10a 을 무색 오일 형태로 수득하였다(18.2 mg, 74%).
1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.32-8.12 (m, 2H), 7.46 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.41-7.33 (m, 2H), 7.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.21 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.74-4.56 (m, 2H), 3.73-3.44 (m, 10H), 3.21 (s, 2H), 1.40 (s, 9H), 1.34 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 172.0, 167.5, 158.4, 155.9, 141.3, 135.4, 129.4, 129.1, 128.4, 127.9, 126.1, 80.1, 71.2, 71.1, 45.3, 41.4, 41.3, 35.7, 31.7, 28.7. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C31H45N6O4: 565.34; found: 565.4.
11-6-2. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-((4-fluorobenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (10b).
Yield: 78%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.36-8.07 (m, 2H), 7.44 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.40-7.26 (m, 2H), 6.99 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 4.70-4.47 (m, 2H), 3.74-3.41 (m, 10H), 3.26-3.13 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.32 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 171.9, 167.4, 164.4, 162.0, 158.3, 155.9, 137.2, 130.2, 129.1, 126.1, 116.1, 115.9, 80.0, 71.2, 71.0, 70.6, 44.6, 41.4, 41.2, 35.7, 31.7, 28.8. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C31H44FN6O4: 583.33; found: 583.4.
11-6-3. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-((4-chlorobenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (10c).
Yield: 87%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.32-8.11(m, 2H), 7.46 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.40-7.24(m, 4H), 4.70-4.51(m, 2H), 3.72-3.45(m, 10H), 3.24-3.16(m, 2H), 1.39(s, 9H), 1.34(s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 171.9, 167.5, 158.4, 155.9, 133.6, 129.9, 129.4, 129.1, 126.1, 80.0, 71.2, 71.0, 70.5, 44.6, 41.3, 41.2, 35.7, 31.6, 28.7. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C31H44ClN6O4: 598.30; found: 599.3.
11-6-4. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-((4-methylbenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (10d).
Yield: 97%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.34-8.10 (m, 2H), 7.46 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.30-7.17 (m, 2H), 7.10 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.70-4.48 (m, 2H), 3.76-3.43 (m, 10H), 3.27-3.13 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 1.39 (s, 9H), 1.34 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 171.9, 167.4, 158.4, 155.9, 137.5, 135.5, 130.0, 129.2, 129.1, 128.4, 126.1, 80.0, 71.2, 71.0, 70.6, 45.0, 41.4, 41.3, 35.7, 31.6, 28.7, 21.1. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C32H47N6O4: 579.36; found: 579.4.
11-6-5. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-((4-(tert-butyl)benzyl)amino)-6-(4-(tert-butyl)phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl) amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (10e).
Yield: 85%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.36-8.10 (m, 2H), 7.45 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.36-7.21 (m, 4H), 4.69-4.50 (m, 2H), 3.73-3.42 (m, 10H), 3.25-3.13 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.33 (s, 9H), 1.28 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 172.0, 167.5, 158.4, 155.9, 150.9, 129.1, 128.2, 126.3, 126.1, 80.0, 71.3, 71.1, 70.7, 45.0, 41.3, 35.7, 35.3, 31.8, 31.7, 30.7, 28.8.
11-6-6. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-((3-fluorobenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (10f).
Yield: 90%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.32-8.13 (m, 2H), 7.46 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.30 (q, J = 6.4 Hz, 1H), 7.24-7.04 (m, 2H), 6.94 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 4.73-4.56 (m, 2H), 3.74-3.45 (m, 10H), 3.26-3.15 (m, 2H), 1.39(s, 9H), 1.34 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 167.6, 165.6, 163.2, 158.4, 155.9, 135.6, 131.1, 131.0, 129.1, 126.1, 124.0, 115.1, 114.9, 114.6, 114.4, 80.1, 71.2, 71.1, 70.6, 44.8, 41.4, 41.3, 35.7, 31.7, 28.7. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C31H44ClN6O4: 583.33; found: 583.3.
11-6-7. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-((3-chlorobenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (10g).
Yield: 84%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.32-8.11 (m, 2H), 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.41-7.17 (m, 4H), 4.69-4.52 (m, 2H), 3.74-3.42 (m, 10H), 3.25-3.13 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.33 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 172.0, 167.5, 158.4, 155.9, 143.9, 135.6, 135.3, 135.2, 130.9, 129.1, 128.4, 127.9, 126.7, 126.1, 80.1, 71.2, 71.1, 70.6, 44.8, 41.4, 41.3, 35.7, 31.7, 28.7. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C31H44ClN6O4: 599.30; found: 599.3.
11-6-8. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-((3-methylbenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (10h).
Yield: 79%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.39-8.10 (m, 2H), 7.47 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.28-7.10 (m, 3H), 7.03 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.70-4.51 (m, 2H), 3.74-3.45 (m, 10H), 3.25-3.17 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.34 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 172.0, 167.5, 158.4, 155.9, 148.9, 141.1, 139.1, 135.6, 135.4, 134.6, 129.3, 128.6, 126.1, 125.4, 80.0, 71.2, 71.0, 70.7, 45.3, 41.4, 41.3, 35.7, 31.6, 28.7, 21.5. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C32H47N6O4: 579.36; found: 579.4.
11-6-9. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-(phenethylamino)-1,3,5-triazin-2-yl) amino)ethoxy) ethoxy)ethyl)carbamate (10i).
Yield: 66%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.38-8.06 (m, 2H), 7.47 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.30-7.22 (m, 4H), 7.21-7.15 (m, 1H), 3.50 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.21 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.97-2.85 (m, 2H), 1.40 (s, 9H), 1.35 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 171.9, 167.5, 162.1, 158.4, 155.9, 140.9, 135.6, 129.9, 129.5, 129.1, 127.3, 126.1, 80.1, 71.3, 71.1, 70.8, 43.4, 41.4, 41.3, 36.9, 35.7, 31.7, 28.7. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C32H47N6O4: 579.36; found: 579.4.
11-6-10. tert-Butyl (2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-(((tetrahydro-2H-pyran-2-yl) methyl) amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (10j).
Yield: 54%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.36-8.09 (m, 2H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.98 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.77-3.44 (m, 14H), 3.22 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 1.92-1.82 (m, 1H), 1.75-1.63 (m, 1H), 1.63-1.50 (m, 3H), 1.41 (s, 9H), 1.36 (s, 9H), 1.29 (s, 1H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 172.0, 167.4, 164.6, 158.4, 129.1, 126.1, 80.1, 78.0, 71.3, 71.1, 70.7, 69.4, 46.6, 41.4, 41.3, 35.7, 31.7, 30.7, 30.5, 28.8, 27.2, 24.2. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C30H49N6O5: 572.37; found: 573.4.
11-6-11. tert-Butyl(2-(2-(2-((4-(4-(tert-butyl)phenyl)-6-((furan-2-ylmethyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl) amino) ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (10k).
Yield: 63%, colorless oil. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.36-8.11 (m, 2H), 7.48 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.41 (s, 1H), 6.33 (s, 1H), 6.27 (s, 1H), 4.71-4.54 (m, 2H), 3.73-3.57 (m, 8H), 3.50 (t, J = 5.4 Hz, 2H),3.21 (s, 2H), 1.40 (s, 9H), 1.35 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 166.4, 148.2, 137.4, 127.7, 124.7, 122.1, 121.3, 78.7, 69.9, 69.7, 45.4, 40.1, 39.9, 34.3, 30.2, 27.4.
11-7. triazine 합성 (화합물 11a-k).
11-7-1. 2-(2-(2-((4-(Benzylamino)-6-(4-(tert-butyl)phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy) ethoxy)ethan -1-aminium chloride (11a).
아르곤 하에 빙수조로 냉각된 자기 교반 막대가 장착된 10mL 둥근 바닥 플라스크에서 HCl (500 μL, 1M in diethyl ether) tert-butyl (2-(2-(2-((4-(benzylamino)-6-(4-(tert-butyl)phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy) ethoxy)ethyl)carbamate 10a (14.1 mg, 0.025 mmol)이 포함된 MeOH (500 μL) 용액을 혼합하였다. 빙수(ice-bath)를 제거하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 계속 교반하였다.반응 완료 후 (monitored by TLC), 반응 혼합물을 감압 농축하여 표적 화합물 11a를 백색 염 형태로 수득하였다 (12.6 mg, 100%).
1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.30-8.16 (m, 2H), 7.71-7.59 (m, 2H), 7.46-7.33 (m, 4H), 7.32-7.25 (m, 1H), 4.82-4.70 (m, 2H), 3.87-3.62 (m, 10H), 3.17-3.04 (m, 2H), 1.37 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 162.4, 159.8, 138.8, 129.8, 129.5, 129.3, 128.8, 128.7 (2 carbons), 127.7, 127.4, 71.4, 71.3, 69.7, 67.9, 46.0, 42.1, 40.7, 36.2, 31.4. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C26H37N6O2: 465.30; found: 465.3. HPLC: purity 98%, t R = 4.7 min.
11-7-2. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-((4-fluorobenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy) ethoxy)ethan-1-aminium chloride (11b).
Yield: 92%, white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.37-8.17 (m, 2H), 7.73-7.60 (m, 2H), 7.52-7.38 (m, 2H), 7.15-7.03 (m, 2H), 4.80-4.67 (m, 2H), 3.87-3.65 (m, 10H), 3.19-3.06 (m, 2H), 1.42-1.34 (m, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 163.6 (d, 1 J = 243 Hz), 162.3, 159.8, 134.8 (d, 4 J = 3 Hz), 130.8 (d, 3 J = 8 Hz), 129.6, 129.3, 127.5 (d, 2 J = 23 Hz), 127.4, 116.5, 116.3, 71.5, 71.4, 69.7, 67.9, 45.3, 42.1, 40.7, 36.2, 31.4. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C26H36FN6O2: 483.29; found: 483.3. HPLC: purity 99%, t R = 19.1 min.
11-7-3. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-((4-chlorobenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy) ethoxy)ethan-1-aminium chloride (11c).
Yield: 96%, white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.27-8.16 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.44-7.34 (m, 4H), 4.82-4.67 (m, 2H), 3.87-3.59 (m, 10H), 3.21-3.04 (m, 2H), 1.37 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 164.5, 159.9, 137.7, 134.4, 130.4, 130.3, 129.8, 129.5, 129.3, 127.7, 127.4, 71.4, 71.3, 69.7, 67.9, 45.3, 42.1, 40.7, 36.2, 31.4. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C26H36ClN6O2: 499.26; found: 499.3. HPLC: purity 98%, t R = 5.7 min.
11-7-4. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-((4-methylbenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl) amino) ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (11d).
Yield: 96%, white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.36-8.16 (m, 2H), 7.74-7.59 (m, 2H), 7.28 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 4.79-4.61 (m, 2H), 3.90-3.61 (m, 10H), 3.18-3.04 (m, 2H), 2.32 (s, 3H), 1.41-1.32 (m, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 162.2, 160.1, 159.8, 138.5, 135.6, 130.3, 129.5, 129.3, 128.8, 127.7, 127.4, 71.5, 71.3, 69.7, 67.9, 45.8, 42.1, 40.7, 36.2, 31.4, 21.2. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C27H39N6O2: 479.31; found: 479.3. HPLC: purity 96%, t R = 12.4 min
11-7-5. 2-(2-(2-((4-((4-(tert-Butyl)benzyl)amino)-6-(4-(tert-butyl)phenyl)-1,3,5-triazin-2-yl) amino) ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (11e).
Yield: quant, white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.29-8.17 (m, 2H), 7.71-7.62 (m, 2H), 7.41 (d, J =8.3, 2H), 7.33 (d, J =8.2, 1H), 4.80-4.65 (m, 2H), 3.88-3.63 (m, 10H), 3.17-3.05 (m, 2H), 1.40-1.35 (m, 9H), 1.32-1.29 (m, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 162.3, 159.8, 151.8, 135.7, 129.5, 129.3, 128.6, 127.7, 127.4(2 carbons), 126.6, 71.5, 71.3, 69.8, 67.9, 45.7, 42.1, 40.7, 36.2, 35.4, 31.8, 31.4. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C30H42N6O2: 521.36; found: 521.4. HPLC: purity 96%, t R = 8.4 min.
11-7-6. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-((3-fluorobenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy) ethoxy)ethan-1-aminium chloride (11f).
Yield: 95%, pink solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.32-8.15 (m, 2H), 7.71-7.59 (m, 2H), 7.43-7.33 (m, 1H), 7.23 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.07-6.98 (m, 1H), 4.82-4.71 (m, 2H), 3.89-3.59 (m, 10H), 3.19-3.03 (m, 2H), 1.37 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 164.4 (d, 1 J = 243 Hz), 162.6, 159.8, 141.8 (d, 3 J = 7 Hz), 131.6 (d, 3 J = 8 Hz), 129.5, 129.3, 127.8, 127.4, 124.5(d, 4 J = 3 Hz), 115.4 (d, 2 J = 22 Hz), 115.3 (d, 2 J = 21 Hz), 71.5, 71.4, 69.7, 67.9, 45.4, 42.1, 40.7, 36.2, 31.4. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C21H30F3N6O3: 483.29; found: 483.3. HPLC: purity 96%, t R = 5.0 min.
11-7-7. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-((3-chlorobenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy) ethoxy)ethan-1-aminium chloride (11g).
Yield: 96%, white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.29-8.17 (m, 2H), 7.65 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.50-7.40 (m, 1H), 7.39-7.26 (m, 3H), 4.80-4.66 (m, 2H), 3.87-3.59 (m, 10H), 3.19-3.04 (m, 2H), 1.36 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 162.4, 159.8, 141.3, 135.4, 131.3, 129.6, 129.3, 128.8, 128.7, 127.7, 127.4, 127.2, 71.5, 71.4, 69.7, 67.9, 45.5, 42.2, 40.8, 36.2, 31.3. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C27H36ClN6O2: 499.26; found: 499.3. HPLC: purity 97%, t R = 12.9 min.
11-7-8. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-((3-methylbenzyl)amino)-1,3,5-triazin-2yl)amino) ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (11h).
Yield: quant., white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.36-8.12 (m, 2H), 7.65 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.29-7.16 (m, 3H), 7.11 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 4.78-4.64 (m, 2H), 3.86-3.61 (m, 10H), 3.16-3.04 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.36 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 162.3, 159.8, 139.5, 138.6, 129.7, 129.5, 129.4, 129.3(2 carbons), 127.7, 127.4, 125.8, 71.5, 71.4, 69.8, 68.0, 46.0, 42.2, 40.8, 36.2, 31.4, 21.5. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C27H39N6O2: 479.31; found: 479.3. HPLC: purity 96%, t R = 5.4 min.
11-7-9. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-(phenethylamino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino) ethoxy)ethoxy) ethan-1-aminium chloride (11i).
Yield: 88%, white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.29-8.17 (m, 2H), 7.71-7.61 (m, 2H), 7.34-7.15 (m, 5H), 3.97-3.56 (m, 14H), 3.17-3.06 (m, 2H), 2.97 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 162.1, 159.9, 159.7, 139.9, 129.9, 129.6, 129.5, 129.2, 127.7, 127.6, 127.3, 73.5, 71.5, 71.3, 69.8, 67.9, 43.9, 42.0, 40.7, 36.1 (2 carbons), 31.3. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C27H39N6O2: 479.31; found: 479.3. HPLC: purity 96%, t R = 5.3 min.
11-7-10. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-(((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (11j).
Yield: 84%, white solid. 1H-NMR (400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.38-8.09 (m, 2H), 7.83-7.59 (m, 2H), 4.06-3.95 (m, 1H), 3.88-3.45 (m, 14H), 3.21-3.04 (m, 2H), 2.00-1.84 (m, 1H), 1.74-1.52 (m, 4H), 1.38 (s, 10H). 13C-NMR (100 MHz, MeOH-d 4) δ 162.6, 159.7, 129.4, 129.3(2 carbons), 129.1, 127.4, 76.9, 71.4 (2 carbons), 69.8, 69.5, 67.9, 47.1, 42.1, 40.7, 36.2, 31.4, 30.3, 27.0, 24.0. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C25H41N6O3: 473.32; found: 473.3. HPLC: purity 99%, t R = 13.0 min.
11-7-11. 2-(2-(2-((4-(4-(tert-Butyl)phenyl)-6-((furan-2-ylmethyl)amino)-1,3,5-triazin-2-yl) amino)ethoxy) ethoxy)ethan-1-aminium chloride (11k).
Yield: 99.6 %, greenish solid. 1H-NMR (a mixture of tautomers, 400 MHz, MeOH-d 4) δ 8.38-8.06 (m, 2H), 8.31-7.56 (m, 2H), 7.54-7.35 (m, 1H), 6.52-6.26 (m, 2H), 4.85-4.58 (m, 2H), 4.00-3.52 (m, 10H), 3.21-2.94 (m, 2H), 1.34 (s, 9H). 13C-NMR (a mixture of tautomers, 100 MHz, MeOH-d 4) δ 161.0, 158.3, 150.4, 142.8, 128.5, 128.2, 128.0, 126.4, 126.2, 110.4, 108.3, 70.9, 70.5, 70.4, 69.3, 68.9, 67.4, 67.1, 41.2, 40.0, 38.3, 34.8, 30.2, 30.1. LRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd. for C24H35N6O3: 455.28; found: 455.3. HPLC: purity 97%, t R = 3.6 min.
12. 통계 분석
모든 데이터는 다중 비교를 위해 Bonferroni 조정 또는 ANOVA와 함께 Student's t-test를 사용하여 분석하였고, 평균±SD로 기재하였다. 통계 분석은 SPSS (Version 12.0) 통계 소프트웨어 프로그램 (SPSS, Chicago, IL, USA)으로 수행하였다. 차이는 p <0.05에서 유의한 것으로 간주되었다. 생존률은 GraphPad Prism (버전 5.0, La Jolla, CA, USA)을 사용하였으며, 비교를 위해 log-rank (Mantele-Cox) 테스트를 사용하여 Kaplan 및 Meier의 제품 제한 방법으로 데이터를 그래프화하고 분석하였다.
[실험 결과]
1. Rv3364c와 SNX9 및 YEATS4의 직접 상호작용 확인
rRv3364c는 대식세포의 막단백질인 카뎁신 G(cathepsin G)와 결합하여 그 효소적 활성을 억제하고 그 하위 단계인 카스파아제-1 의존적 세포사멸 활성화를 억제한다. rRv3364c가 숙주세포에서 상호작용하는 인자를 확인하기 위하여 무세포 시스템에서 특정 단백질과 상호작용 여부를 관찰하였다. 상호작용 단백질을 식별하기 위하여 맞춤형 단백질 결합 분석을 사용하였으며, rRv3364c와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 후보 단백질을 선별하였다. rRv3364c과 결합이 예상되는 118개 후보 단백질 중에서 SNX9 (sorting nexin 9), YEATS4 (YEATS domain-containing protein 4), ZBTB46 (zinc finger and BTB domain-containing 46), 및 EGFLAM (EGF-like Fibronectin type III and Laminin G domains)가 rRv3364c와 높은 친화력을 나타내었다(도 1a 및 1b). 도 1a에서 친화도 점수 (A score)는 중복된 두 지점의 정규화된 신호 강도이고, 특이도 점수 (B score)는 단백질의 친화도 점수와 그 옆에 랭크된 단백질의 차이이다.
일시적으로 (15-30분) 대식세포와 HEK293T 세포에서 공동면역침강법을 수행하여 생체 내에서 rRv3364c와 상호작용하는 단백질을 분석한 결과 rRv3364c는 ZBTB46 및 EGFLAM와는 달리 내재성 및 외재성 SNX9 및 YEATS4와 강하게 상호작용함을 확인할 수 있었다(도 2).
SNX9은 지질 이중층과 결합하여 세포 내 이입 (endocytosis)와 YEATS4의 핵으로 이동을 조절하는 바, 대식세포에서 rRv3364c의 세포 내 위치를 확인을 위하여 세포 분획 (fractionation) 및 면역 염색 (immunostaining) 분석을 수행하였다. 그 결과, rRv3364c는 초기에 SNC9와 세포질에서 결합하고 이후에 핵으로 이동하여 YEATS4와 결합함을 확인할 수 있었다(도 3a 및 도 3b). 상기 결과로부터 rRv3364c가 세포질에서 SNX9와 핵에서 YEATS4와 시간 의존적 방식으로 직접 상호작용함을 알 수 있다.
2. SNX9 또는 YEATS4와 상호작용에 필수적인 Rv3364c의 영역 확인
다음으로 SNX9 또는 YEATS4와의 상호작용에 관여하는 Rv3364c의 펩타이드 서열을 확인하고자 하였다. Rv3364c을 10 a.a. 길이로 자른 Rv3364c 유래 펩타이드를 설계하고(표 1), 세포 내 이동과 단백질 분해 방지를 위하여 HIV-1 Tat 단백질의 트랜스덕션 도메인(transduction domain)을 윱합시켜 레트로 인버소 (retro-inverso) 펩타이드 (Tat-Rv3364c peptide)를 형성하였다. 이어서, HEK293T 세포에서 상기 펩타이드 조각과 SNX9 및 YEATS4와의 상호작용을 확인하였다.
그 결과, Tat-Rv3364c (11DWLVSKFARE20) 펩타이드는 SNX9와 Rv3364c의 상호작용을 차단할 수 있고, Tat-Rv3364c (1MKARLPDSPL10)는 YEATS4와 Rv3364c의 상호작용을 차단할 수 있었으며, 이러한 작용에 Tat 펩타이드는 영향이 없음을 확인할 수 있었다(도 4). 그리고, SNX9와 상호작용에 필수적인 최소 펩타이드는 (12WLVSKF17 : 서열번호 14)으로 소수성 무극성 곁사슬을 가진 W12와 F17 아미노산이 SNX9와의 상호작용에 필수적임을 알 수 있었다(도 5).
이어서, SNX9의 다양한 절단 돌연변이를 제작하고 Rv3364c와 상호작용하는 SNX9의 도메인을 확인한 결과 Rv3364c는 BAR(Bin-Amphiphysin-Rvs) 도메인을 통해 SNX9와 상호작용함을 알 수 있었다(도 6). 상기 결과로부터 Rv3364c는 세포질에서 12-17 a.a. 펩타이드(서열번호 14)가 SNX9의 N-말단을 통해 BAR 도메인을 특이적으로 표적하고, 핵에서 1-10 a.a. 펩타이드가 YEATS4와 상호작용함을 알 수 있다(도 7).
3. WLVSKF 펩타이드의 SNX9와 상호작용을 통한 TLR4 신호경로의 음성적 조절기능 확인
대식세포에서 ELISA를 이용하여 rRv3364c 유도의 사이토카인 생성 수준을 측정하였다.
rRv3364c는 TLR4/MyD88/TRAF6/TBK1-IRAK1 경로를 통하여 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, 및 IL-12p40) 및 항염증성 사이토카인(IL-10) 생성을 촉진함을 확인하였다(도 8a). 또한, SNX9+/+ 대식세포와 비교하여 SNX9-/- 대식세포에서 rRv3364c 유도의 염증성 사이토카인 생성이 유의하게 감소하였다(도 8b). 상기로부터 대식세포에서 rRv3364c에 의해 TLR4-SNX9 의존성 염증반응이 유도됨을 알 수 있다.
이어서, TLR 매개의 염증신호 경로에서 SNX9와 상호작용하는 rRv3364c 펩타이드(12WLVSKF17)의 역할을 확인하기 위하여, Tat-Rv3364c 펩타이드인 Tat-WLVSKF가 LPS/TLR에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 생성을 억제하는지 확인하였다. 그 결과, SNX9-/- 대식세포에서와 달리 SNX9+/+ 대식세포에서는 Tat-WLVSKF에 의하여 TLR4 매개의 염증성 사이토카인의 생성이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 8c).
상기로부터 rRv3364c는 세포 내에서 TLR4 신호 경로를 조절한다고 가정하고, 이를 검증하기 위하여 대식세포에서 LPS 유도 염증성 신호 전달에 관여하는 PI3K, MAPK 및 NF-κB의 활성화에 Tat-WLVSKF이 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, SNX9-/- 대식세포에서와는 달리 Tat-WLVSKF 전처리는 SNX9+/+ 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 AKT, MAPK, 및 IκBα의 인산화와 IκBα의 분해를 억제함을 확인하였다(도 8d). 상기 결과는 Tat-WLVSKF가 TLR4 리간드 유도의 PI3K, MAPK, 및 NF-κB 신호 경로 활성화를 억제하는 음성 조절제 역할을 수행하여 대식세포에서 염증성 사이토카인 생성을 억제함을 의미한다.
4. WLVSKF 펩타이드의 엔도솜에서 p47phox와 상호 작용하는 SNX9의 BAR 도메인 억제 활성 확인
NADPH 산화효소(NOX) 유도의 ROS 생성은 TLR4 매개 면역반응에 필수적이다. 특히, 세포질의 NOX 서브유닛인 p47phox는 감염 시 혈장막에서 PX (Phox homology) 도메인을 통해 이동하여 NOX 서브유닛과 결합한다. SNX9의 PX 도메인은 다양한 phosphoinositides과 반응하며 세포 내 도입 (endocytosis)에 중요한 역할을 수행한다.
이하, LPS 자극 하에서 SNX9와 p47phox의 상호작용 여부와 Tat-WLVSKF이 엔도솜의 ROS 생산에 영향을 미치는지 여부를 확인하고자 하였다. 그 결과, LPS 유도하에 SNX9은 p47phox와 특이적으로 결합하였고, 이러한 SNX9와 p47phox의 상호작용은 Tat-WLVSKF에 의해 억제됨을 확인하였다. 또한, 마우스 및 인간 대식세포에서 NOX의 활성과 ROS 생성은 Tat-WLVSKF 용량 의존적으로 현저하게 감소하였다(도 9).
또한, 엔도솜의 구획을 sucrose flotation gradient assay으로 원심분리 및 정제하고 면역형광현미경 단계를 수행하여 엔도솜 내의 SNX9의 이동을 추적하고 엔도솜 내에서 신호전달 및 분자의 동적을 관찰하였다. 그 결과, LPS 유도의 SNX9와 p47phox의 결합은 초기 엔도솜에서 확인되었으며 후기 엔도솜에서는 관찰되지 않았고, 초기 엔도솜에서 LPS 유도의 SNX9와 p47phox의 결합은 Tat-WLVSKF에 의해 억제됨을 확인하였다(도 10a 내지 10c).
이어서, HEK293T 세포에서 다양한 p47phox의 절단된 형태와 SNX9를 이용한 맵핑을 통해 p47phox의 PX 도메인은 SNX9의 BAR 도메인과 결합에 필수적임을 확인하였다(도 11). 또한, Rv3364c 구조를 사용한 경쟁 분석 결과, HEK293T 세포에서 Rv3364c의 양이 증가함에 따라 SNX9와 p47phox 사이의 상호작용이 감소함을 확인하였다(도 12). 상기 결과로부터, SNX9는 초기 엔도솜에서 p47phox의 PX 도메인간의 결합을 통해서 ROS 매개 염증 반응의 필수적 양성 조절자이며, Tat-WLVSKF은 초기 엔도솜에서 SNX9와 p47phox의 결합을 차단하여 ROS 매개 염증반응을 억제함을 알 수 있다. 궁극적으로 Rv3364c 유래의 Tat-WLVSKF 펩타이드는 대식세포에서 LPS/TLR4 매개 면역반응을 특이적으로 억제하여 강력한 염증 조절자로서 기능할 수 있음을 알 수 있다(도 13).
5. 가상 스크리닝 및 세포 기반 기능 분석
펩타이드 아날로그의 치료제는 생체 내에서 효소에 의한 분해와 짧은 반감기가 문제이다. 이에, SNX9와 상호작용하는 Rv3364c 유래 펩타이드(12WLVSKF17) 기반의 소분자를 개발하고자 하였다(도 14a).
먼저, Rv3364c 펩타이드 (12WLVSKF17) 구조의 상동성 모델링을 구축하기 위하여 Streptomyces a. Roadblock/LC7 도메인 (PDB ID: 3LEQ)의 크리스탈 구조를 템플릿으로 사용하였다. Streptomyces a. Roadblock/LC7 도메인은 Rv3364c의 결합 영역(binding region)과 39% 상동성을 갖는다. 12WLVSKF17 펩타이드를 템플릿의 알파-헬릭스 2차 구조와 정렬하였다. 이 구조는 디스커버리 스튜디오 (DS) 2018 소프트웨어에서 구현된 MODELER 자동모델에 의해 구축되었다 (DAASTOL SYSTEMES, 2017). 알파-헬릭스 펩타이드의 약리학적 특성은 도 14b와 같다. 말단 영역의 2개 곁사슬 (W12 및 F17)와 중간 영역의 중추 원자(backbone atoms)이 주요 약리하적 특성을 나타내는 것으로 간주하였다. 이를 확인하기 위하여, 상기 말단의 2개 주요 곁사슬(W12 및 F17)의 적합 점수(fitting score)를 도 14c와 같이 정의하고, 이 모델을 기준으로 약 53만개의 KCB(Korean Chemical Bank)에서 2,500개의 화합물을 회수하였다.
KCB에서 회수한 2,500개 화합물의 1차 스크리닝을 수행하였다. 구체적으로, FitValue와 점수가 각각 3과 60보다 큰 1,255개의 화합물을 걸러냈다. 다시 600개의 화합물을 maximum dissimilarity method로 선별하였다. 이 중에서 생물평가를 통해 상위 200개 화합물을 최종 선정하고, 5 μM LPS로 자극한 세포에 각 화합물을 처리하여 TNF-α 및 IL-6 생성 억제 활성을 확인하여, 화합물 1(compound 1)을 최초 hit compound로 스크리닝 하였다(도 14d).
화합물 1의 구조를 상동모델에서 약리학적 특성과 비교하였을 때, 두 개의 기능군과 링커 길이 사이의 결합체가 억제 활성에 결정적인 요인이 될 것으로 밝혀졌다. 두 단자 기능 그룹 사이의 적절한 링커 거리가 9에서 13 원자 길이여야 한다고 가정했다. 이에, 두 번째 가상 스크리닝을 위해 양 말단에 방향족 고리가 있는 9-원자 링커를 보유한 일련의 화합물 (990개 화합물)을 조사하였다. 추가로, 일 말단의 방향족 고리를 제거한 아민 유도체 (80가지 화합물)를 포함하였다. 이종성을 극대화하기 위해 1,070개 화합물의 클러스터 결과, 최종적으로 182개의 다양한 유도체를 선정되었다. 생물학적 테스트 결과, nonpeptidyl inhibitor로서 트리아진(triazine) 아날로그 (hit compound 2)가 1μM 농도에서 TNF-α와 IL-6의 높은 억제 %값을 나타냈다(도 14d).
6. 삼치환 트라아진 유도체 합성 및 최적화
Hit compound 2의 가능성을 향상시키기 위하여 아릴기의 4-위치에 상이한 치환기를 함유하는 일련의 2,4-diamino-6-aryl-1,3,5-triazine 유도체 8a-g를 합성하였다. 도 15에 Method A에 나타낸 바와 같이, 시아누르산(cyanuric acid) 3과 Boc-protected amine 4의 친핵성 방향족 치환(SNAr) 반응으로 2-아미노트리아진(2-aminotriazine) 5를 얻었고, 이를 테트라히드로푸란-2-일메틸 아민(tetrahydrofuran-2-ylmethyl amine)과 연속적으로 SNAr 반응시켜 이치환된 트리아진(disubstituted triazine) 6을 합성하였다. 이어서, 다양한 아릴보론산(arylboronic acid)과 이치환된 트리아진 6의 스즈키 반응에 이어 산 촉매 가수분해로 삼치환된 트리아진(trisubstituted triazines) 8a-g 세트를 수득하였다.
합성된 8a-g 의 트리아진 유도체의 사이토카인 생성 억제율(%)은 화합물 3과 비교하여증가하였다. 사이토카인 억제에 대한 치환기 효과는 말단 방향족고리의 4번 위치에 methyl, methoxy, tert-butyl 등의 전자공여기를 갖는 화합물이 다른 화합물보다 높은 억제 활성을 보였다. 특히, 4-tert-부틸로 치환된 페닐트리아진 8g은 TNF-α와 IL-6 생성 모두에 대해 가장 높은 억제효과를 나타냈다. cyctokine assay 외에도 ROS 생성을 담당하는 NADPH oxidase에 대한 화합물의 억제 활성을 확인할 수 있었다. 종합하면, 화합물 8g는 10nM 농도에서 NADPH oxidase를 유의하게 억제하였다. 이에, 화합물 8g를 추가 최적화를 위한 잠재적인 리드로 선택하였다.
8g의 테트라히드로푸릴기(tetrahydrofuryl group)를 다양한 단일치환된 페닐 또는 헤테로고리로 대체하여 기존의 페닐 부분에 tert-부틸기가 고정된 두 번째 시리즈의 트리아진 유도체 11a-k를 합성하여 6-위치에서 치환기의 생물학적 활성을 조사하였다(도 15, Method B). Method A의 반응 순서를 변경하여 중간체 5는 Suzuki 커플링, SNAr 및 가수분해를 통해 다양한 트리아진 11a-k으로 전환되었다. 화합물 11a-k 10nM의 농도에서 TNF-α 및 IL-6 생성 및 NADPH 산화효소 활성화 억제 활성을 평가하였다. 대부분의 화합물에서 화합물 8g와 유사한 IL-6 생성 억제 활성을 확인할 수 있었으나, LPS 자극하에 세포에서 TNF-α 생성 억제 활성을 갖는 화합물은 11e 및 11g 뿐이었다. 이어서, NADPH oxidase 억제 활성에서는 화합물 8g와 유사하거나 그보다 우수한 억제 활성을 나타내는 화합물은 없었다. 이에, 최종적으로 화합물 8g (2,4-diamino-6-(4-tert-butylphenyl)-1,3,5-trazine: DATPT)를 Rv3364c 유래 펩타이드 모사의 소분자로 선정하였다.
각 트리아진 유도체의 생물학적 활성을 평가 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
compds R1 R2 % Inhibition (10 nM)
TNF-α IL-6 NADPH oxidase
2 OCF3 0.93±5.43 6.66±8.32 38.44±2.35
8a H 10.56±2.34 26.67±3.56 30.73±4.41
8b F 5.12±5.42 33.35±2.79 23.02±3.39
8c Cl 25.34±4.38 33.33±5.41 30.73±7.86
8d CF3 10.05±0.98 23.39±3.41 46.15±3.45
8e CH3 50.11±2.68 50.03±6.54 40.00±5.56
8f OCH3 10.06±3.73 50.06±4.32 38.44±5.31
8g t-Bu 60.82±6.11 66.66±4.59 56.98±4.43
11a Ph 0.68±5.63 50.02±7.12 38.54±5.14
11b 4-F-Ph 30.08±1.04 53.33±2.16 46.15±3.57
11c 4-Cl-Ph 15.22±8.32 50.02±0.89 38.44±4.13
11d 4-CH3-Ph 35.92±5.67 33.33±1.11 15.32±3.04
11e 4-t-Bu-Ph 55.17±3.45 46.66±4.18 38.44±6.73
11f 3-F-Ph 35.56±4.46 46.67±5.23 38.46±7.24
11g 3-Cl-Ph 50.11±6.73 43.33±6.41 41.53±5.56
11h 3-CH3-Ph 25.34±9.12 56.67±3.06 41.56±9.44
11i PhCH2 25.28±7.39 40.17±5.42 23.02±5.67
11j tetrahydropyran-2-yl 10.41±4.39 56.67±3.79 46.15±5.13
11k furan-2-yl 15.56±6.21 40.14±3.56 44.68±5.29
7. DATPT의 SNX9-p47phox 상호작용 및 ROS 매개의 염증 반응 억제 활성 확인
이어서, 최종 선정된 DATPT (8g)가 Rv3364c 유래 펩타이드와 유사한 약리학적 생물학적 프로파일을 갖는지 여부를 확인하였다.
DATPT는 용량 의존적으로 p47phox와 SNX9의 상호작용을 억제하였다(도 16a-b). 또한, Tat-WLVSKF 펩타이드와 동일하게, LPS 유도의 초기 엔도솜에서 SNX9와 p47phox의 상호작용은 DATPT의 처리로 현저하게 감소하였다(도 16c). 나아가, DATPT는 NOX의 활성과 사이토카인의 생성을 억제하였다(도 16d-e). 놀랍게도, DATPT는 Tat-WLVSKF의 IC50(5μM)보다 500배 낮은 IC50(10nM)을 나타냈다 (도 16d-e). 한편, DATPT는 BMDM 및 THP-1 세포에서 독성을 나타내지 아니하였으며, SNX9 또는 p47phox의 발현 수준에 영향을 미치지 아니하였다(도 16f). 이로부터, DATPT가 엔도솜에서 SNX9-p47phox 상호작용을 억제하여 강력한 염증 조절제로 기능함을 알 수 있었다.
8. 시험관 내에서 DATPT의 안정성 및 약동학(pharmacokinetics) 확인
이어서, DATPT의 체외 대사 안정성 및 약동학 파라미터를 조사하고 그 결과를 표 3에 요약하였다.
DATPT는 인간 혈장(human plasma)와 인간 간 마이크로솜(human liver microsomes: HLM)에 처리 30분 후에서 각각 100% 및 93%가 유지되었다. 이로부터 DATPT가 혈장과 마이크로솜 내에서 높은 안정성을 가짐을 알 수 있었다. DATPT의 5종 CYP isoenzyems 억제 활성 평가를 통해 DDI (drug-drug interation)의 독성을 확인하였다. 그 결과, DATPT는 5종 CYP isoymes의 활성을 크게 감소시키지 않았다. 수컷 C57BL/6 마우스에서 복강내 투여에 대한 TIPTP의 약동학적 매개변수를 관찰하였다. AUC 값 및 반감기는 DATPT가 효과적인 약물 농도로 혈액 내에서 잘 유지되었음을 나타내어 DATPT가 생체 내 실험에 적합함을 시사한다. 전반적으로, DATPT가 약리학적 활성뿐만 아니라 시험관내 안정성 및 PK 특성을 포함하는 적절한 약물 유사 특성을 가지고 있음을 확인하였다.
Stability(% remaining after 30 min) CYP
(% of control activity @ 10 μM)		 PK parameters
(ip, 1 mg/kg, mice (n = 5))
Plasma HLM 3A4 2D6 2C19 2C9 1A2 T max (h) C-max (ng/mL) AUClast (ng·h/mL) T 1/2 (h)
DATPT (8g) >100 93.0 85.1 >100 91.3 81.7 72.6 0.17 ± 0.0 135.97
± 30.27		 209.18
± 38.83		 1.06 ± 0.09
T max, time to reach
AUClast, total area under the plasma concentration-time curve from time zero to last measured time
C max, peak plasma concentration
9. 생체 내에서 DATPT의 패혈증 치료 효과 확인
이어서, CLP 유도의 패혈증 마우스에서 DATPT의 효과를 확인하고자 하였다. CLP 처리의 패혈증 유도 마우스에 0, 1, 및 2 시간 후에 DATPT를 복강 내 주사하였다. 그 결과, SNX9+/+ 마우스에서 100~1000 μg/kg 용량의 DATPT를 처리하는 경우 생존율이 70%까지 증가하였으며, DATPT 처리 용량에 의존적으로 마우스의 생존율이 증가함을 확인할 수 있었다.
한편, SNX9-/- 마우스(medium survival, 24 h)는 SNX9+/+ 마우스(medium survival, 72 h)와 비교하여 생존율이 낮았다(도 17a, 왼쪽 그래프). 또한, SNX9-/- 마우스에서 DATPT 처리에 따른 유의한 생존율 증가는 확인할 수 없었다(도 17a, 오른쪽 그래프). 놀랍게도, DATPT(IC50: 10 μg/kg)는 Tat-WLVSKF 펩타이드(IC50: 20 mg/kg)보다 약 2,000배 효과적이었다(도 17a-b).
DATPT 투여한 CLP 유도 패혈증 마우스에서 TNF-α, IL-6, IL-1
Figure pat00030
, IL-18, and IL-12p40 및 IL-10의 유의한 혈청 농도 감소를 확인하였다(도 17c). 사이토카인의 감소와 함께 H&E 염색을 통해 면역세포의 침윤 감소와 폐, 간, 및 비장 등 장기의 손상 감소를 확인할 수 있었다(도 17d).
또한, DATPT는 생체 내에서도 SNX9와 p47phox 사이의 상호작용을 현저하게 감소시키고 비장세포에서 ROS 생성을 감소시켰다(도 17e). 도 17f는 FL-DATPT(Cy5.5와 접합된 DATPT)의 투여 후 마우스에서 DATPT의 생체분포를 나타낸다. FL-DATPT는 72시간 동안 체내에 유지되었으며, 6시간과 12시간에 간에서 최고 농도에 도달했다. DATPT의 조직 특이적 분포는 T 및 B 세포 대신 폐, 간 및 비장에서 대식세포에 국한되었습니다(도 17g). 상기 결과는 DATPT는 생체 내에서 안정적이고 상당한 시간 동안 체내에서 순환하며, 대식세포 우선적으로 작용하여 다균성 패혈증 치료에 탁월한 치료제로 제공될 수 있음을 시사한다.
10. DATPT의 항균 활성 확인
CLP에 의한 마우스의 사망률은 말초혈액 및 복막액에 박테리아 콜로니 수와 양의 상관관계가 있다. CPL-마우스에 DATPT를 복강 주사한 경우 말초혈액 및 복막액에 박테리아 콜로니 수가 현저하게 감소함을 확인하였다(도 18A). 나아가 DATPT는 시간 및 용량 의존적으로 박테리아를 직접적으로 제거함을 확인하였다(도 18B).
항균제는 숙주에 미치는 영향이 없거나 거의 없이 미생물만을 선택적으로 죽이거나 그 성장을 억제해야한다. 항균제는 주로 세포질막을 표적으로 하여 원핵세포에 대한 선택적 독성을 나타낸다. DATPT는 세포질막을 가로질러 세포의 막 전위와 이온 구배를 파괴시켜 항균 활성을 나타내는 것으로 보인다. DATPT가 세포 내 ATP 농도에 미치는 영향을 결정하기 위하여 DATPT로 20시간 동안 처리한 세포의 외부 및 총 ATP 수준을 측정하였다. 세포 내부의 ATP 수준은 총 ATP 수준에서 외부 ATP 수준을 뺀 값으로 결정하였다. 그 결과, DATPT 처리 농도 증가는 세균 세포의 ATP 수준을 낮추고 외부 ATP 농도를 증가시켰으며, 이는 ATP의 세포 내 가수분해가 세균 세포 내부 ATP 감소의 주요 원인임을 시사한다(도 18C). 상기로부터 DATPT가 세포 내 ATP를 고갈시켜 살균 활성을 나타내고 다균성 패혈증 치료에 적용할 수 있음을 알 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> TRIAZINE DERIVATIVES AND USE THEREOF <130> APC-2021-0776 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(1-10 aa) <400> 1 Met Lys Ala Arg Leu Pro Asp Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(11-20 aa) <400> 2 Asp Trp Leu Val Ser Lys Phe Ala Arg Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(21-30 aa) <400> 3 Val Pro Gly Val Ala His Ala Leu Leu Val 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(31-40 aa) <400> 4 Ser Val Asp Gly Leu Pro Val Ala Ala Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(41-50 aa) <400> 5 Glu His Leu Pro Arg Glu Arg Ala Asp Gln 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(51-60 aa) <400> 6 Leu Ala Ala Val Thr Ser Gly Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(61-70 aa) <400> 7 Leu Ala Gly Gly Ala Ala Gln Leu Phe Asp 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(71-80 aa) <400> 8 Gly Gly Gln Val Leu Gln Ser Val Val Glu 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(81-90 aa) <400> 9 Met Gln Asn Gly Tyr Leu Leu Leu Met Gln 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(101-110 aa) <400> 10 Val Gly Asp Gly Ser Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(101-110 aa) <400> 11 Ala Ala Thr Gly Cys Asp Ile Gly Gln Ile 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(111-120 aa) <400> 12 Gly Tyr Glu Met Ala Ile Leu Val Glu Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(121-130 aa) <400> 13 Val Gly Gly Val Val Gln Ser Cys Arg Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv3364c(12-17 aa) <400> 14 Trp Leu Val Ser Lys Phe 1 5 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-TAT <400> 15 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 16 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dNP2 <400> 17 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 20 <210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP22 <400> 18 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 19 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MPG <400> 19 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP-1 <400> 20 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Cys 20 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EB1 <400> 21 Leu Ile Lys Leu Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys 20 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transportan <400> 22 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p-Antp <400> 23 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCT(18-32) <400> 24 Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro 1 5 10 15 <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KLA <400> 25 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligoarginine <400> 26 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체:
    [화학식 1]
    Figure pat00031

    상기 화학식 1에서
    R'은 H이고,
    R1은 H, F, Cl, OCH3, CF3, CH3, 또는 t-Bu이고,
    R2는
    Figure pat00032
    ,
    Figure pat00033
    ,
    Figure pat00034
    ,
    Figure pat00035
    ,
    Figure pat00036
    ,
    Figure pat00037
    ,
    Figure pat00038
    ,
    Figure pat00039
    ,
    Figure pat00040
    ,
    Figure pat00041
    ,
    Figure pat00042
    , 또는
    Figure pat00043
    이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 트리아진 유도체는 하기 화학식 8g로 표시되는 화합물인 것인, 트리아진 유도체:
    [화학식 8g]
    Figure pat00044
    .
  3. 제1항의 트리아진 유도체를 유효성분으로 포함하는, 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 트리아진 유도체는 대식세포에서 SNX9의 BAR 도메인과 결합하는 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 트리아진 유도체는 초기 엔도솜에서 SNX9와 p47phox의 결합을 방해하여 ROS 생성을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 트리아진 유도체는 TNF-α 및 IL-6 생성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 트리아진 유도체는 NADPH 산화효소 활성화를 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 트리아진 유도체는 항균 활성을 나타내는 것인, 약학적 조성물.
  9. 제1항의 트리아진 유도체를 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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EMBO Molecular Medicine 2020, vol.12, issue12: e12497 "Mycobacterium tuberculosis Rv2626c-derived peptide as a therapeutic agent for sepsis"

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